分类号: Q78编号: 生物化学大实验实验论文
指导教师：张彦桃
学生：孙雨傲
专业：生物工程
年级：2012级
2015年8 月24 日
目录
生化大实验实验论文 (3)
摘要 (3)
背景 (4)
材料与方法过程 (4)
结果与分析 (12)
致谢 (15)
感想 (16)
参考文献 (16)
生化大实验实验论文
摘要
碱性磷酸酶是一种磷酸单酯酶，广泛存在于人体组织和体液中。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。已发现有AKP1、AKP2、AKP3、AKP4、AKP5与AKP6六种同功酶。其中第1、2、6种均来自肝脏，第3
种来自骨细胞，第4种产生于胎盘及癌细胞，而第5种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。本实验中使用我们在应用基础研究中建立的表达重组His-BAP的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株，在IPTG的诱导下表达有活性的重组His-BAP并通过SDS-PAGE和Western-blotting进行鉴定目的基因在菌体内的正常表达，从而学习在生物工程上游阶段完成后通过生化手段对所获取产物进行分离鉴定的方法。
关键词：碱性磷酸酶酶活力层析
The report of Biochemical experiment
ABSTRACT
Bacterial alkaline phosphatase (BAP) is a phosphomonoesterase, which is widely distributed in human tissue and body fluids. This enzyme is demonstrated to catalyze the breakage of the 5’ phosphate group so as to transform 5’ end of DNA strand into 5’-OH. Also, previous study has already illustrated that BAP is not a single enzyme, on the contrary, it is a series of isoenzyme, namely AKP AKP2 AKP3 AKP4 AKP5 AKP6, among which AKP1 AKP2 AKP6 are from liver. AKP3 is from osteocyte. AKP4 arise from placental cells and cancer cellsepithelial cell of intestinal villi. In our experiment, we’ll try to use Ecoli. BL21(DE3), which carries with a His tag by genetic recombination technology, to identify the normal expression of the target gene by SDS-PAGE and western blotting. In this way, we can learn some methods by which we could isolate and identify the product of bioengineering.
Key words: Bacterial alkaline phosphatase (BAP) Enzyme activity Chromatography
背景
将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在E. coli中表达。先让宿主菌生长，阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG（异丙基硫代-β-D—半乳糖），阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE检测（本实验Ⅱ）或做Western-blotting，用抗体识别之。
碱性磷酸酶是适于在pH约9-10的条件下水解许多非特异性磷酸单脂而使磷酸游离的磷酸脂酶的总称。它是一种底物专一性低的磷酸单酯酶,是分子生物学中常用的工具酶之一。它的作用是催化核酸分子脱掉5'磷酸基团，从而使DNA(或RNA)片段的5'-Pi末端转换成5'-OH末端，这也就是所谓的核酸分子的脱磷酸作用。而提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究。碱性磷酸酶有两种来源:一种是从大肠杆菌种纯化出来的，叫做细菌碱性磷酸酶(bacterial alkaline phosphatase , 简称BAP)；另一种是从小牛肠中纯化出来的，叫做小牛碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase , 简称CIP)。关于碱性磷酸酶的活性测定原理，实验手册的其它章节将有介绍。本实验中使用我们在应用基础研究中建立的表达重组His-BAP的大肠杆菌BL21(DE3)工程菌株，在IPTG的诱导下表达有活性的重组His-BAP并通过SDS-PAGE和Western-blotting进行鉴定。
材料与方法过程
1.材料
1.1试剂与实验用品及仪器
1）层析标准蛋白
牛血清蛋白、糜蛋白酶、蓝色葡聚糖2000、缓冲液Buffer A、标准蛋白溶液，GE ?KTA Start蛋白核酸自动分离仪、葡聚糖G-75凝胶层析柱缓冲液Buffer、标准蛋白溶液。
2）BAP的诱导表达
玻璃搅棒，超净工作台，恒温水浴摇床，高速冷冻离心机，全自动高压灭菌锅，紫外分光光度计， LB（含50 ug/mL Amp）液体培养基，0.1mol/L IPTG，2×SDS 上样缓冲液
3）亲和层析纯化
超净工作台、恒温水浴摇床、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、超声波细胞粉碎机、层析柱、分步收集器、破碎缓冲液、临洗缓冲液、洗脱缓冲液、100 mg/mL 的溶菌酶、0.5 M IPTG、8 M 尿素。
4）SDS-PAGE检测表达蛋白
5ⅹ电极缓冲液、30%丙烯酰胺混合液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、10%SDS、10%过硫酸铵、2ⅹ样品缓冲液、甲醇、乙酸溶液、染色液、脱色液、TEMED，5）Western blot
电泳凝胶、一抗、酶标二抗伯乐半干转移系统、凝胶成像系统、水平摇床、乳胶手套、镊子、二氯聚偏二乙烯膜（PVDF膜）、转移缓冲液（1ⅹ）、TBS缓冲液、TBST缓冲液（1ⅹ）、去离子蒸馏水、100%甲醇、封闭液、一（二）抗封闭液（1：
1000）、二氨基联苯胺（DAB）、过氧化氢（H
2O
2）
7）活力和比活力的测定
纯化前的可溶性蛋白、纯化后的可溶性蛋白、BAP标准品（1 U/ L）、可见分光光度计、电热恒温水浴、紫外分光光度计、底物溶液、超纯水、0.5 mol/L NaOH 1.2 菌种
BL21（DE3）大肠杆菌工程菌株
1.3 常用溶液的配制
（1）缓冲液Buffer A： 50mM Tris-HCl 0.2M NaCl 0.5mM EDTA pH 8.5 （2）标准蛋白溶液：用Buffer A 配制标准蛋白溶液（浓度为5mg/ ml）和蓝色葡聚糖A（2 mg/ ml）。
（3）破碎缓冲液（起始缓冲液）: 50 mM Tris－HCl, 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA，pH 8.5
（4）临洗缓冲液: 50 mM Tris－HCl, 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA，30 mM 咪
唑 pH 8.5
（5）洗脱缓冲液: 50 mM Tris－HCl, 200 mM NaCl, 0.5 mM EDTA，300 mM 咪唑
（6）5ⅹ电极缓冲液：Tris3.78g、甘氨酸23.5g、加水到250ml溶解，使用时稀释5倍。
（7）30%丙烯酰胺混合液：29g丙烯酰胺和1g N,N-亚甲双丙烯酰胺溶于水，定溶至100ml。用0.45um滤膜过滤，存于棕色瓶中，于4℃保存，pH值不大于7.0。（8）分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris(pH 8.8)：9.08gTris溶于40ml水中，以4 mol/L 调至pH 8.8，加水至50mL，于4℃保存。
（9）浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris(pH 6.8)：6.08gTris溶于40ml水中，以4 mol/L 调至pH 6.8，加水至50mL，于4℃保存。
（10）10%SDS：10g电泳级SDS加水900mL，加热到68℃助溶，浓盐酸调至pH7.2定容1L，分装备用。
（11）10%过硫酸铵：4℃保存，一周内用完。
（12）2ⅹ样品缓冲液：含有0.1 mol/L Tris(pH 6.8)，0.2 mol/L二硫苏糖醇（DTT），4%SDS，0.2%溴酚蓝，20%甘油。
（13）甲醇、乙酸溶液：将900mL甲醇：水（500 mL和400mL水）与100mL 乙酸混合。
（14）染色液:在每100mL甲醇、乙酸溶液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250，用Whatman1号滤纸过滤除去颗粒物。
（15）脱色液：乙醇：乙酸：水=25：10：65
（16）TEMED
（17）转移缓冲液（1ⅹ）：48mMoL/L Tris，39mMoL/L甘氨酸，0.037% SDS，20%甲醇。
（18）TBS缓冲液（1ⅹ）：20mMoLTris-HCl,150mMoLNaCl,pH7.5。
（19）TBST缓冲液（1ⅹ）: 20mMoLTris-HCl,150mMoLNaCl,0.05% Tween20,pH7.5。（20）封闭液：5mL TBST+0.25g脱脂奶粉。一（二）抗封闭液（1：:1000）（21）底物溶液：PNPP 5mmol/L，Tris-HCl（PH 10.0）100mmol/L，MgCl2 1mmol/L
2方法与过程
2.1 分子筛层析分离标准蛋白
（1）凝胶的处理
葡聚糖G-75是以干粉保存的，因此使用前必须将干凝胶浸泡于缓冲液（0.025M氯化钾－0.2M乙酸溶液）充分溶胀，溶胀过程中需不时搅拌，但要过于用力，以防止颗粒破碎，待葡聚糖下沉后，倾去上清液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的缓冲液的pH值相近时为止。
（2）装柱
把层析柱垂直固定在自动蛋白核酸分离层析仪上，倒入缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡，将葡聚糖G-75倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至3 mL/10 min，待缓冲液快接近介质面时，继续倒入介质，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的介质形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，至柱床体积不变且顶端约2cm为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于介质床表面，以免在加样时打乱介质层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。装好的介质用缓冲液平衡，至流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止，通常需过夜。（注意：任何时候都不能使柱内的液面低于凝胶表面。）
（3）联机
将装好的柱子与核酸蛋白自动层析仪通过硅胶管等相连通，调整流速为0.3 mL/min，并对核酸蛋白检测仪进行设置。调整T＝100，0.5A=0，仪器预热至少1小时。
（4）上样
葡聚糖2000上样，取2.5 mg分子量为68 KDa的牛血清白蛋白，2.5 mg分子量为为25 KDa的糜蛋白酶溶于1 mL缓冲液中，将柱的上端打开，用吸管将介质上面的缓冲液吸出，沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱介质表层。样品进入柱床中，快要进完时，加2-3mL缓冲液冲洗柱壁，随即封闭柱子，开始以6-7
滴每分钟的流速洗脱。
（5）标准曲线的绘制
根据两种标准蛋白洗脱峰的位置计算洗脱体积，以两种标准蛋白分子量的对数值为横坐标，洗脱体积为纵坐标，两点作一条直线。
（6）接菌：5ml LB+5ul Amp+10ul菌液，摇床培养。
2.2 菌种扩培与层析
（1）菌种的扩培：在锥形瓶中加入5mL LB培养基、5μL 氨苄青霉素、5μL菌液。置入摇床中摇菌过夜。
（2）配制LB培养基10瓶，每瓶50mL，加入5μL氨苄青霉素和之前的菌液1.5μL，上摇床（200rpm）扩培
（3）从摇瓶中取样，稀释3倍，测光密度（OD=0.138），OD值满足=0.5后在每瓶中加入IPTG 50μL诱导，置入摇床中摇菌（200rpm）
（4）平衡亲和层析柱：打开层析柱上下盖，待乙醇滴出后，用超纯水洗柱，超纯水10ml，洗完后再用10ml Buffer A平衡，平衡后封上下盖，待用。
（5）扩培的菌在摇床中培养1h后，在超净工作台中加入500ul0.1mol/L的IPTG，加入后在摇床中诱导5个小时，诱导好的菌保菌1ml，标记“总蛋白”放入4℃冰箱保存，将剩余菌液倒入50ml离心管，5000rpm，15min，离心，弃上清。加入5ml Buffer A吹吸菌体，5000rpm，10min，弃上清，再加入5ml Buffer A缓冲液，50ul溶菌酶，混匀后，30℃温浴15min。水浴后将5ml菌液分装于10个1.5ml 离心管，每管500ul；将10管菌进行超声破碎，60％功率超声处理2.5 min，超声4 sec间隔12 sec；再用40％功率超声处理2.5 min，超声4 sec间隔12 sec。破碎后放4℃，2000rpm，离心10min，吸取上清液，两管合为一管，4℃，12000rpm 离心10min。离心完成后，沉淀为细菌包涵体，欲纯化包涵体蛋白，沉淀即用破碎缓冲液冲洗两次，将1mL裂解液对应的包涵体溶于500 L 8 M/L尿素中。上清为可溶性蛋白，将上清再次于4 ℃12000 rpm离心10 min，进一步除去杂质。（6）除用于亲和层析纯化外，于4°C保存至少1mL可溶性蛋白粗提液用于碱性磷酸酶活力和比活力，其余可溶性蛋白过亲和层析柱。
（7）镍柱亲和层析纯化可溶性蛋白：将亲和层析介质用5柱体积ddH2O冲洗。
用5柱体积起始缓冲液进行平衡柱子；将5-10mL的可溶性蛋白样品上柱，并反复过柱3次；用含30mM 咪唑的wash buffer冲洗约10-12柱体积，用3 mL含有300 Mm 咪唑的elution buffer洗脱目的蛋白，每500 L收集1管，收集6管，标记1、2、3、4、5、6，4℃过夜，留待测定碱性磷酸酶活力和比活力之用。洗柱。
2.3 SDS-PAGE
（1）取昨天亲和层析纯化的酶液，从2、3号中取300μL的样品保留，再从2、3、包涵体中取50μL加入等体积上样缓冲液。煮沸5min。保存的1ml的菌液离心吸上清，100ul上样缓冲液悬浮，100℃煮5min。取一套电泳装置，组装，按以下比例配制分离胶：
①准备好玻璃板，置于电泳模盘之上。
②配制分离胶（10 mL）：
混匀后加入两玻璃板中间，并在胶面上加入1ml超纯水，静置约30min，等胶凝聚后倾斜倒出超纯水，用滤纸吸出残液。
（2）配制浓缩胶：
混匀后加入到玻璃板间，并插入梳子，待凝固后小心的拔出梳子，除去封
条，将电泳板缓慢放入电泳槽中，排除下方气泡，除去当中的气泡。在电泳槽中注入适量1X电泳缓冲液。
（4）按以下顺序点样：
样品各加10ul，接通电源，60V恒压电泳，当样品进入分离胶时，调节电压使恒定在90V，当溴酚蓝泳出凝胶时，10分钟后切断电源停止电泳。
（5）将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下胶，弃去浓缩胶，将分离胶用考马斯亮蓝染色液染色，染色15min，脱色至有清晰的电泳条带出现，蒸馏水中漂洗至背景清亮。在凝胶成像系统中分析特异条带的位置和分子量，（期间换脱色液2-3此），蒸馏水中漂洗至背景清亮（一般要过夜）。
（6）在凝胶成像系统中分析特异条带的位置和分子量。
2.4 蛋白质印迹
（1）取出凝胶，切去浓缩胶，分离胶做适当裁剪标记，用灭菌去离子水冲洗，然后放入转移缓冲液中浸泡平衡。
（2）戴乳胶手套将PVDF膜裁剪成和需印记凝胶相似而略大的小块，用100%甲醇处理15s，然后放入转移缓冲液中平衡30min。
（3）厚滤纸2块放入转移缓冲液中浸泡30min，在转移缓冲液中浸湿，然后按以下顺序组装转移装置：阴极－滤纸－凝胶－PVDF膜－滤纸－阳极。
（4）25V转移15 min。
（5）卸除装置，取出PVDF膜置于干燥滤纸上上片刻，但勿使膜变干，然后转移到去离子水中漂洗。
（6）将膜根据预染Marker指示裁剪出目的条带所在的位置，转移至10 ml离心管中，加入5mL封闭液（5mL TBST+0.25g脱脂奶粉），摇床上室温封闭2h。（7）找一干净的盒子，洗净，在底部铺上两层滤纸，用超纯水润湿，铺上封口膜，在封口膜上加上含有1ul一抗的1ml封闭液，排除气泡，将膜的正面与封闭
液接触，4℃过夜一抗孵育。
（8）将一抗过夜孵育的膜用TBS漂洗3次，每次10min（摇床上）。用含有2ul 二抗的1ml封闭液对膜进行二抗孵育，摇床上1.5-2h。
（9）孵育完成后，将膜用TBS缓冲液漂洗三次，每次10min（摇床上）。（10）取1片DAB片溶于37℃预热的10mL灭菌去离子水中，用前加入30％的H2O2 33uL，即终浓度为0.1％。将膜置于平皿中，倒入上述显色液，暗处显色5min，条带清晰后用灭菌去离子水终止反应，漂洗一遍，凝胶影像系统中迅速记录结果。
2.5酶活力测定
（1）酶活力测定共5个样，如下：
5个样都以超纯水补为1ml。
（2）取5个试管，按上表中的顺序对应标为1—5号，并在5个试管中各加入2ml酶底物溶液，然后将1—8号离心管中1ml样品加入对应管中混匀，37℃水浴5min后加入NaOH 0.025mol/L终止反应，在可见分光光度计中测量OD410，计算3次测量的平均值。参照BAP标准品（1U/μL）计算各样品的酶活力。
2.6酶浓度测定
（1）总共3个样：总蛋白、亲和层析样5-2、亲和层析样5-3
（2）测OD260和OD280的值：
（3）测定结果：总蛋白：11.15 亲和层析样5-2：3.78 亲和层析样5-3：4.91 （3）计算公式如下：
酶活力单位数=（OD410样品×稀释倍数）/（OD410标准品×稀释倍数）×标准品的活力单位
酶的比活力=酶活力单位数/mg蛋白
Mg蛋白=蛋白浓度（mg/ml）×蛋白体积
酶纯化倍数=纯化后的比活力/纯化前的比活力×100%
结果与分析
1分子筛层析分离标准蛋白
已知数据列如下表：11KD=15.6ml 68KD=23.2ml
带入方程 Ve=-blogM+C 解得b=9.75;c=29.84 即Ve=-9.75logM+29.84
由上图中所示，给出了曲线所符合的公式以及拟合度。通过这个公式，只要测出样品的洗脱体积，便可以较精确的计算出蛋白样品的分子量。
已知Ve BAP=14ml 带入上述方程解得BAP分子量为42.13KDa
2 SDS-PAGE
Marker 总蛋白5-3 包涵体5-2
结果分析：
图示箭头处为目的蛋白的条带，由对总蛋白条带的比较可以看出，层析分离的效果是很明显的。通过上图可以看出：
1.电泳带有明显的拖尾现象。可能的原因：分离胶和浓缩胶的配制存在问题；
跑胶的过程中温度过高导致样品的部分降解。
2.在点样孔的附近出现了明显的线状条带。分析可能的原因是出现了所谓的“鬼
带”：鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。
处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。
3蛋白质印迹
Marker 总蛋白5-3 包涵体5-2
实验结果分析：
1.从跑胶结果看，条带清晰度不高，有明显的拖尾。可能的原因是跑胶温度过
高导致样品降解。
2.背景较大，可能原因是显色时间过长或是一抗、二抗过多导致产生较多的杂
蛋白非特异结合。也可能是由于在孵育过程中，封闭液的封闭效果较差，导致PVDF膜结合了较多的一抗或二抗等。
4酶活力测定
根据公式：
酶活力单位数=（OD410样品×稀释倍数）/（OD410标准品×稀释倍数）×标准品的活力单位，
酶的比活力=酶活力单位数/mg蛋白
Mg蛋白=蛋白浓度（mg/ml）×蛋白体积
以总蛋白为例：
酶活力单位数=（0.907×20）/（2.190×1000）×1（U/μl）=8.283（U/ml）
Mg蛋白=11.5mg/ml×20μl=0.230mg
酶的比活力=8.283/0.23=36.013
计算得到如下表格：
由于酶纯化倍数=纯化后的比活力/纯化前的比活力×100%
酶的纯化倍数=83.060/36.013×100% =230.64%
实验结果分析：
1.与层析前相比，酶的比活力有明显的提高，这可能是由于在层析过程中使酶
的浓度增加，导致比活力升高。
2.在层析样5-3和5-2的比较中可以发现，层析后期的蛋白浓度和酶的比活力
均高于前期
致谢
首先感谢内蒙古大学本科基础实验中心的张彦桃老师在实验过程中对我组实验耐心认真的指导，在实验过程中遇到了许多困难，但张老师总会不厌其烦地指出并纠正我们的失误。其次要感谢五组全体同学的努力，有了大家的一起努力和付出，我们的实验才能够在短短四天里顺利的完成。最后还要感谢全体生物工程班的同学，组间的相互指导帮助是我们实验成功的重要因素。
感想
通过这次实验，一方面我们再次重温了之前在《微生物发酵工程》、《生物物质分离》、《仪器分析》里学过的理论知识，另一方面，这次实验能将理论知识与实际操作完美结合，是一个理论应用于实际的过程。在这个过程中，我们更加深刻地了解到用生化方法分析鉴定生物工程产品的重要意义。此外在今后的科研道路上，我会更加注重实验的细节，因为细节决定成败。
参考文献
生物学实验教程.滕利荣，孟庆繁.北京：科学出版社，2008，
现代生化教程.郭勇.北京：科学出版社，2004，
生物化学技术原理及应用.赵永芳.北京：科学出版社，2002。