透析液细菌培养和内毒素监测执行流程
中国药典2010年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
血液透析用水及透析液标准 1、透析用水的标准：目前参照美国AAMI的透析用水标准。 2、定期评估透析用水： ?采用美国AAMI的透析用水标准，每月至少测定一次细菌数量和/或内毒素含量；定期测定无机物和有机物的含量。上述工作应由专人负责,定期记录。新安装的水处理系统或怀疑水处理系统有问题时应提高检测频度，如确定水处理设备存在问题而不能及时纠正时应停止使用。 3、水处理系统的保养和维护： （1）消毒：活性炭吸附之前的前级处理消毒可采用加氯的方法，溶度以0.3mg/L为宜。反渗膜及管道的消毒应严格根据生产厂商的要求进行,常用甲醛和过氧乙酸消毒,一般每月1次,夏季15-20天1次。内置于透析机内的滤器在每次透析结束后与透析机同时消毒。（2）滤罐和树脂的维护：为防治止细菌繁殖和杂质阻塞,滤器(砂滤,碳滤)和树脂应定期反冲。砂滤可每日或隔日反冲,每次15-30分钟,依水质优劣和用水量大小而定；活性碳无法通过冲洗再生(冲洗只能清除其中生长的细菌),一般每月冲洗1次即可,但如每毫升菌落计数超过200个则应增加冲洗次数。检测活性碳吸附效果的主要方法是测定水中的含氯量,如净化水中含氯量超标(氯>0.5mg/l),必须立即更换活性炭；软化罐中的离子交换树脂应每日再生,再生盐罐定期加盐,使盐液始终处于饱和状态，血液透析停止一周后,应充分冲洗,冲洗水应丢弃，停止使用6个月后更换其他的树脂。 （3）生物膜的预防和去除：生物膜的形成常见于储水箱水处理设备和透析机管路的缝隙及拐角处。由于生物膜一旦形成后极难去除,故重在预防。应尽量避免在水处理内出现下列情况：水流停滞,管路死腔或盲端,器材表面不平,形成锐角弯曲等。去垢剂可能对去除生物膜有效,也可试用次氯酸,氢氧化钠,过氧乙酸等。 4、透析液：透析液必须由浓缩液加反渗水配制。购买的浓缩透析液和透析粉剂必须有国家药品监督管理局颁发的注册证。浓缩液可以从厂家直接购买、或由具备浓缩液制备资格的医院制剂室配制 (必须有制剂许可证和透析液批准文号，只限于医院内部使用)。从厂家直接购买的透析粉剂由透析室或中心自行配置，但必须有专人负责，并进行核查签字登记。透析液的溶质浓度和细菌培养每批次至少测定一次，并登记归档。 二、水处理设备 水处理设备必须有国家药品监督管理局颁发的注册证方可投入临床使用。水处理设备应当在设备规定的环境下（包括温度、湿度、电压、供水压力）使用，以保证机器正常运行，供应充足的反渗水。
******有限公司 标准操作规程 目的 建立细菌内毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。 适用范围 所有原料、成品的细菌内毒素检查。 责任人 QC检验员 内容 1 简述 1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 1.2 细菌内毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.3 本规范适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 1.4 细菌内毒素的量用内毒素单位(EU)表示 1.5 细菌内毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 1.6 细菌内毒素工作标准品(WSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 1.7 凝胶法细菌内毒素检查用水(BET水)系指内毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于0.005Eu/ml。 1.8 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素
******有限公司 标准操作规程 的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。 1.10 检查法项为供试品细菌内毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。 2实验材料及用具 2.1 天平供试品称量用，感量为0.1mg以下。 2.2 电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能维持250℃以上至少一小时。 2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37土1℃保持一小时。 2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1℃以下。 2.5 旋涡混合器 2.6 鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号)及细菌内毒素检查用水(符合规定)。2.7 细菌内毒素国家标准品(NSE)，细菌内毒素工作标准品(WSE)，除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。 2.8 实验用具移液管(或刻度吸管，定量移液器)、凝集管(103 75mm)、三角瓶、小试管(163100mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250℃干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌内毒素方法。 2.9 试剂 75%乙醇、蒸馏水、5%重铬酸钾硫酸洗液。 3 操作方法 3.1 试验准备 3.1.1 洗液的配制配制铬酸洗液或其他适宜的细菌内毒素灭活剂。 3.1.2 玻璃器皿的洗涤将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。
医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法 中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布 一、定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应 的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。 用以代替家兔法对供试品进行热原初试。本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。其他产品可参照使用。 二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。 三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。 3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。 4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。 四、试验前准备 1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡 4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。 2、鲎试剂灵敏度测定 （1）试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。 （2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作 标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量
加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。取10mm×75mm试管若干 支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管 口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。 五、试验方法 1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。 2、浸提介质:无热原水。 3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。供试液贮存应不超过2h。 4、试验步骤:将鲎试剂和细菌内毒素工作标准品分别按标示量加入无热原水溶解。细菌内毒素工作标准品逐次稀释至0.5Eu/ml，供作阳性对热。取10mm×75mm试管6支，其中供试品管2支各加入0.1ml 内毒素工作标准品稀释液，阴性对照管2支各加入0.1ml无热原水，阳性对照管2支各加入0.1ml内毒素工作标准品稀释液，再逐一加入0.1ml鲎试剂溶解液。轻轻混匀试管内容物，封闭管口，垂直放入37±1℃水浴中保温60±2min，轻轻取出，观察结果。 5、结果判定 1)、将试管缓慢倒转180°，管内容物呈坚实凝胶者为阳性，记录为（+），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整者为阴性，记录为（-）。
透析液配置操作常规及流程 一、配制室 1．浓缩液配制室应位于透析室清洁区内相对独立区域，周围无污染原，保持环境清洁， 每班用紫外线消毒1 次。 2．浓缩液配制桶须标明容量刻度，应保持配制桶和容器清洁，定期消毒。 3．浓缩液配制桶及容器的清洁与消毒。 （1）浓缩液配制桶：每日用透析用水清洗 1 次；每周至少用消毒剂进行消毒1 次， 并用测试纸确认无残留消毒液。配制桶消毒时，须在桶外悬挂“消毒中”警示牌。 （2）浓缩液配制桶滤芯：每周至少更换 1 次。 （3）容器：应符合中华人民共和国药典、国家/ 行业标准中对药用塑料容器的规定。 用透析用水将容器内外冲洗干净，并在容器上标明更换日期，每周至少更换1 次或消毒1 次。 二、成分及浓度 透析液成分与人体内环境成分相似，主要有钠、钾、钙和镁四种阳离子，氯和碳酸 氢根两种阴离子，部分透析液含有葡萄糖，具体成分及浓度见表
碳酸氢盐透析液成分及浓度 成分浓度(mmol/L) 钠135 ～145 钾0 ～4 钙 1.25 ～1.75 镁0.5 ～0.75 氯100 ～115 醋酸根 2 ～ 4 碳酸氢根30 ～40 葡萄糖0 ～11 二氧化碳分压(mmHg) 40 ～110 pH 7.1 ～7.3 1．钠常用透析液钠离子浓度为135 ～145 mmol/L，少数特殊病情（如低钠血 症、高钠血症等）患者用低钠（钠离子浓度低于130 mmol/L）或高钠（钠离子浓度高于 145 mmol/L）透析液。 2．钾透析液钾离子浓度为0 ～ 4 mmol/L，常用钾浓度为 2 mmol/L，临床应依 据患者血钾浓度适当调整
3．钙终末期肾衰竭患者有低钙血症倾向。常用透析液钙离子浓度一般为1.5 mmol/ L；当患者患高钙血症时，透析液钙离子浓度调至1.25 mmol/L；当患者患低钙血症时， 透析液钙离子浓度调至1.75 mmol/L。 4．镁透析液镁浓度一般为0.5 ～0.75 mmol/L。 5．氯透析液浓度与细胞外液氯离子浓度相似，一般为100 ～115 mmol/L。 6．葡萄糖分含糖透析液（5.5 ～11 mmol/L）和无糖透析液两种。7．透析液碳酸氢盐透析液碳酸氢盐浓度为30 ～40 mmol/L。8．醋酸根浓缩液中常加入2 ～4 mmol/L 醋酸，调整透析液pH 值和防止CO2 跑掉。 三、配制 （一）制剂要求 1．透析液应由浓缩液（或干粉）加符合质控要求的透析用水配制。2．购买的浓缩液或干粉，应具有国家相关部门颁发的注册证、生产许可证或经营许 可证、卫生许可证。 3．医疗机构制剂室生产血液透析浓缩液应取得“医疗器械生产企业许可证”后按国 家相关部门制定的标准生产。 （二）人员要求
中国药典XXXX年版《细菌内毒素检查法》 ——凝胶法 凝胶法 凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。 鲎试剂灵敏度复核试验在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。 根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc). λc=1g-1(∑X/4)
式中 X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。 干扰试验按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C 的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es= 1g-1(∑Xs/4) Et= 1g-1(∑Xt/4) 式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es (包括0.5Es 和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD 的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备
细菌内毒素检查标准操作规程 1 简述 1.1 本规范适用于中国药典2005年版附录中细菌内毒素检查法一凝胶法和光度测定法。后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。当 测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 1.2 供试品细菌毒素限值的确定。 （一）药典中有规定的，按供试品各论中规定限值； （二）尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值： L=K/M 式中 L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。 K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/kg/h表示。其中注射剂，K=5EU/kg/h；放射性药品注射剂，K=2.5EU/kg/h；鞘内用注射剂， K=0.2EU/kg/h。 M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/kg/h、ml/kg/h、U/kg/h表示。药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人 均体重按60kg计算，注射时间小于1小时的按1小时计。按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用实际情况做必要调整，但需说明理由。 1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定 供试品的最大有效稀释倍数（MV D）按下式计算： MV D=C?L/λ L为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。当L以EU/ml表示时，C等于1.0ml/ml；当L的单位以EU/mg或EU/U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg/ml 或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MV D取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C: λ/L。
透析液及其回收率的测定 革兰阴性菌脂多糖检测试剂盒（显色法）即碱处理法 规范操作 1.目的 测定透析用水、透析液等样本内毒素含量，保证透析安全。同时对样品加入一定浓度的内毒素标准品进行回收率试验测定，保证试验结果的准确性。 2.授权操作人 经培训合格的微生物实验室检验人员。 3.实验原理 内毒素检测原理：革兰阴性菌脂多糖（内毒素）能激活反应主剂中的C因子、B因子、凝固酶原等，引起酶的级联反应，根据其引起的吸光度变化对革兰阴性脂多糖（内毒素）浓度进行定量测定。 样品回收率试验测定原理：仪器配套的一次性器具软件分别计算出样品溶液及含标准内毒素的样品溶液的内毒素含量Co和Ct，软件再自动按下式计算该试验条件下回收率R%。 R%=(Ct－Co)/λ×100% 其中Co为样品溶液内毒素实际测定值； Ct为含标准内毒素样品溶液的内毒素实际测定值； λ为样品溶液中加入的标准内毒素的浓度。 4．产品性能指标 4.1灵敏度0.01EU/ml 4.2精密度批间CV≤10%。 4.3准确性回收率75-125%。 4.4标准曲线范围0.1EU-10EU/ml。 4.5相关系数r绝对值≥0.980。 5.实验组成 5.1实验仪器及器具： MB-80微生物快速动态检测系统，配套软件：一次性器具检测系统3.7X 洁净工作台旋涡混合器 加样器（5-50μl，20~200μl，100~1000μl）
5.2实验耗材： 无热原吸头(100μL、200μL、1000μL) 无热原平底试管(塑料)无热源转移管 无热原1.5mL离心管或一次性真空采血管（4ml或5ml） 5.3实验试剂： 内毒素标准品（冻干品），3EU/支 内毒素检查用水 试剂盒组成：反应主剂、主剂溶解液、处理液A、处理液B、质控品和质控品溶解液。其中透析液测定只需要反应主剂与主剂溶解液两种组分即可。 6．工作环境 相对湿度：20%~80%； 温度控制：10~30℃； 电源电压：220V±10%，50Hz±2%。 7.样本采集及处理 7.1检测样本:R/O水、透析液、A原液、B原液等 7.2采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原转移管。 7.3样品采集标准 7.3.1供试液的制备[1]： 浓缩液，直接取样成供试液； 对干粉，称取样品5克，用细菌内毒素检查用水按使用说明配成浓缩液成供试 液。 取供试液按使用说明的比例混合，以细菌内毒素检查用水稀释后进行检测。 7.3.2用水标准[2] 应在透析装置和供水回路的连接处收集试样，取样点应在供水回路的末端或在混合室的入口处。 7.3.3《血液透析器复用操作规范》透析复用用水 采样位置：应在血液透析器与复用系统连接处或尽可能接近此处进行水质检 测。 检测时间：最初应每周检测一次，连续两次检测结果符合要求后，内毒素检 测应每3个月至少一次。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。 本试验操作过程应防止内毒素的污染。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。 细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。 细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公
细菌内毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人：
批准日期：年月日
目录 1 概述 1 2 验证目的及范围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5
1 概述 细菌内毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌内毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌内毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌内毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表
4 验证依据 《中华人民共和国药典》2015版1143 细菌内毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2 确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。 6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱
透析液配置室制度 1.购买的浓缩液或者干粉，需由国家相关部门颁发的注册证， 生产许可证或经营许可证，卫生许可证。 2.透析液必须用浓缩液或者干粉加符合标准的透析用水配制。 3.医疗机构制剂室应取得“医疗器械生产企业许可证”后按国 家相关部门制定的标准生产血液透析浓缩液，且只能限本医院内部使用。 4.透析室用干粉配置浓缩液（A,B液），应由经过培训的护士和 技术员操作，并做好配置记录和专人核实登记。 5.透析液配置应在清洁区内相对独立区域设置，周围无污染源， 干燥通风，室内整洁，每班对环境清洁消毒一次。 6.浓缩液配置桶须标明容量刻度，应保持配置桶和容器清洁， 每日用透析用水清洗一次，每周消毒一次，并有记录。 7.每周至少更换或消毒一次容器，消毒后备用容器应干燥保存。 8.透析液成分及浓度测定每月一次，检查记录。 9.浓缩B液配制应在配制后24小时内使用，B桶外标明配制时 间，当天未用完的B液应废弃。A液应在配制后一周内使用。 10.浓缩液配制桶滤芯，每周至少更换一次。 11.每月一次透析液细菌培养一次，要求细菌数＜200CFU/ml,透 析液内毒素至少3个月检测一次，内毒素＜2EU/ml.透析液的细菌内毒素每台透析机至少每年检测一次，登记并保留检验结果。
透析液配置流程 多人份的配制： 1.按照需要配液量，先注入所需的配液量的透析用水，水37°C 2.开启电源开关，开始搅拌，同时加入核对好数量的A或B透 析粉（A干粉15袋，B干粉15袋）并计时。 3.当液体搅拌清澈时，关闭电源开关。 4打开阀门开关，分装透析液至每个容器内。 5分装后立即用透析用水冲洗桶内。 单人份的配制： 取量杯一只，用透析用水将容器内外以及量杯冲洗干净，按成品干粉说明要求，将所需的干粉倒入容器内，加入所需透析用水的量，加盖后左右上下摇动容器，至干粉完全融化即可。
《细菌内毒素检查法》XX所1999年培训班考核试卷 得分_______________________ 姓名________ 单位__________________ 答题时间____ 年—月—R 一、填空题（20分） 1,热原检查法最早于____ 年首次收载于美国药典—版。中国药 典____ 年版开始收载热原检查法。 2,细菌内毒素检查法1980年USP ___ 版收载细菌内毒素检查法。 3,我国药品细菌内毒索检测的法定方法最早始于1988年，出卫生部 颁布试行，1991年转为正式部标准。__ 年中国药典1990年版第二増补 本收载，中国药典1995年版正式收载 4,中国药典1998年增补本自___ 起实施。 5,我国蛍试剂质量控制的法定方法最早于—年曲一卫生部颁布试行, 经修订后于1991年正式实施。 6,细菌内毒索检查用水系指与灵敏度为___ 或更高灵敏度的蛍试剂 ____ 小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。 7,卫生部在颁布该标准时，明确规定：“具冇___ 的賞试剂方可用 于细菌内毒素检查法”。 8,中国药典1998年增补本《细菌内毒索检查法》收载的方法系利用 与__________ 产生凝集反应的机理，以判断供试品中________ 是否符合 规定的一种方法。 9,细菌内内毒素试验所用器川L,需经处理，除去叮能存在的外源性内毒索，常用的方法是—°C干烤至少1小时，也可用其他适宜的方法。 10,细菌内毒素试验中细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准 品用_________ 溶解，在旋涡混合器上混合—分钟，然后制备成各种浓 度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合—秒钟。 11,______________________________________ 每批新的賞试剂在用于试验前都要进行 ____________________________ 。卷试剂灵敏 度定义为在检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的
细菌毒素检查验证方案文件编号：VP-QC-2015-06 起草人： 审核人： 批准人： 批准日期：年月日
目录 1 概述 1 2 验证目的及围 1 3 验证小组人员组成及职责 1 4 验证依据 2 5 验证前准备 2 6 验证的实施 2 7 偏差处理 5 8 验证数据及评估 5 9验证报告及评审 5 10 再验证及周期 5 11 验证文件及归档 5 12 附件 5
1 概述 细菌毒素检查法系利用鲎试剂来检测或量化由格兰阴性菌产生的细菌毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌毒素检查报告两种发放，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法，供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。公司自行制备的注射用水需进行细菌毒素的检查，本方案将采用凝胶法进行试验。 2 验证目的和方法 本验证方案适用于注射用水的细菌毒素的检查，通过对鲎试剂灵敏度复核试验、干扰试验及凝胶限度试验，建立该产品的细菌毒素检查方法，并对其有效性进行评价，确保检测方法的专属性、灵敏度，保证检测结果可符合质量标准要求。 3.验证小组人员组成及职责： 3.1验证小组由以下部门人员组成：质量部、QC、生产部。 3.2 验证小组组成及职责列表 4 验证依据 《中华人民国药典》2015版1143 细菌毒素检查法 5.验证前准备 5.1验证人员培训：验证报告起草人有责任在方案批准后（且在验证实施前）对本次验证相关人员进行培训。培训人员记录见附件1。 5.2确认仪器仪表设施经过确认和校验，并填写确认记录。
6 验证的实施 6.1实验材料及用具 6.1.1电子天平 6.1.2. 电热干燥箱 6.1.3. 恒温恒湿箱 6.1.4.水银温度计 6.1.5. 旋涡混合器 6.1.6. 鲎试剂（具有国家主管部门的批准文号） 6.1. 7.细菌毒素工作标准品(由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品) 6.1.8.细菌毒素检查用水：应符合灭菌注射用水标准，其毒素含量小于0.015EU/ml，且 对毒素试验无干扰作用。 6.1.9. 实验用具:移液管、凝集管、三角瓶、试管、试管架、洗耳球、时钟、75%酒精棉、剪刀、砂轮。 6.2实验准备 6.2.1玻璃器皿的洗涤将玻璃器皿放入铬酸洗液或其他热原灭活剂或清洗液中充分浸泡，然后取出将洗液空干，用自来水将残留洗液彻底洗净，再用蒸馏水反复冲洗三遍以上，空干后放入适宜的密闭金属容器中或用锡箔纸包好后再放入金属容器，放置入烤箱。
透析液和透析用水的水质质量监测制度 一、定人、定期做好水处理设备的维护与保养，并记录好每次维护和保养的内 容。每季度消毒一次，并监测消毒液残余量。 二、做好透析用水水质和透析液的监控： （一）电导率正常值约10μs/cm。 （二）纯水的p H 值应维持在5～7 的正常范围。 （三）细菌培养应每月1次，要求细菌数＜200 cfu/ml；采样部位为反渗水输水管路的末端。透析机每台透析机每年至少检测1次。 （四）内毒素检测至少每3个月1次，要求细菌数＜200 cfu/ml，内毒素＜2 EU/ml；采样部位同上。每台透析机每年至少检测1次。 （五）化学污染物情况至少每年测定1次，软水硬度及游离氯检测至少每周进行1次，参考2008 年美国A AMI 标准（见表1.1）。 三、透析液的溶质浓度和细菌培养：每批次至少测定1次，并登记归档。购买的浓缩透析液和透析粉剂要有国家药品监督管理局颁发的注册证，或浓缩液由具备浓缩液配制资格的医院制剂室配制（有制剂许可证和透析液批准文号，限于医院内部使用）。 表1.1 血液透析用水允许的化学污染物的最大浓度
反渗水、透析液生物学监测执行流程
下面是三个励志小故事，不需要的朋友可以下 载后编辑删除!!!谢谢！！！ 你可以哭泣，但不要忘了奔跑 2012年，我背着大包小包踏上了去往北京的火车，开启了北漂生涯。彼时，天气阴沉，不知何时会掉下雨滴，就像我未知的前方一样，让人担忧。 去北京的决定是突然而果决的，我在宿舍纠结了一天，然后在太阳逃离窗口的时候打电话告诉父母，我要到首都闯一闯。消息发出去之后，并没有预料之中的强烈反对，父亲只给我回了一个字：好。 就这样看似毫无忧虑的我，欣喜地踏上了北上的路。有些事情只有真正迈出第一步的时候，才会迎来恐惧。当我踏上北上的列车时，才惊觉对于北京，除了天安门、央视大楼这些着名建筑，我知之甚少。俗话说无知者无畏，可于我而言，这句话并不适用，因为在坐上火车那一刻，我就开始对未来胆战心惊，毫无底气。 火车开动之后，我的心情变得更加复杂而紧张，甚至一度心生退意。人类果然是一个无解的方程式，看似无畏的勇气背后不知藏下了多少怯懦和犹豫。 旁座的姐姐见我一人，开始和我有一搭没一搭地聊起了天。几分钟后，我们竟如同许久未见的好友一般，开始聊起了各自的生活。
透析液测定操作流程 1、打开仪器电源，预热30分钟，使仪器处于稳定状态（37℃）； 2、填写表头： “测定日期”默认为同电脑的系统时间相同 “数据文件名”与“测定日期”相同，可以改动； “检验员”填写操作者姓名； “试剂批号”与试剂盒上的批号一致；（必填） “试剂灵敏度”的填写为0.01EU/ml；（必填） 3、填写标本名称、稀释倍数（如果标本名称一样，一定要区分开（如透析液1、透析液2），否则软件会自动计算2个标本结果的平均值）。 4、确认试验方法为动态浊度法，然后点击“采集”（如图）
5、进行标本操作： （1）、样品预处理：原水，RO水，透析液不用预处理，可直接进行检测； A原液，B原液须用内毒素检测用水或处理液稀释40倍后进行检测 （2）、样品的检测：取样品0.2ml加入反应主试剂A中，待干粉完全溶解后完全转移至平底试管进行检测 6、试验结束，返回主界面，进入数据分析：
7、调入实验数据： 8、查看试验结果：
结果判断： （1）、《中华人民共和国医药行业标准》YY 0572-2005《血液透析和相关治疗用水》（ISO 13959：2002,MOD）用水标准 在水处理装置的输出端的细菌内毒素的含量≤1EU/ml；血液透析装置入口的输送点上细菌内毒素的含量≤5EU/ml； （2）、《中华人民共和国医药行业标准》YY 0598-2006《血液透析和相关治疗用浓缩物》（ISO 13958：2002,MOD）标准 浓缩物以细菌内毒素检查用水配成透析液后细菌内毒素的含量<0.5EU/ml； （3）、我国《血液透析器复用操作规范》透析复用用水标准 血液透析器透析复用用水内毒素含量≤2EU/ml； （4）、血液净化标准操作规程（2010 版） 透析用水的内毒素＜2 EU/ml；置换液内毒素＜0.03EU/ml； 9、打印试验结果： 点击功能键“打印”选择分组格式，即可打印。
细菌内毒素检查法标准操作规程 目的： 建立细菌内毒素检查的基本操作，为细菌内毒素检查人员提供正确的操作规程。 2.依据： 《中华人民共和国药典》2000年版二部。 3.范围： 本标准适用于细菌内毒素检查的操作。 4.职责： QC细菌内毒素检查人员对本标准的实施负责。 5.程序： 5.1. 定义： 5.1.1.细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理， 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 5.1.2.细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌精制得到的内毒素，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 5.1.3.细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定 其重量相当效价，每1ng工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU。细菌内毒素工作标准品用于试验中鲎试剂灵敏度复核干扰试验及设置的各种对照。 5.1.4.细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂24 小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。 5.2. 实验设备：电热干燥箱（50~300±1）℃、电热恒温水温箱。 实验用具：注射器(精度0.02ml)、针头、试管架、白胶布、砂轮、75%酒精棉球、金属直镊、注射器盒、时钟。 试剂：鲎试剂（其标示值用λ表示）、内毒素工作标准品、内毒素检查用水。 5.3. 用具除热原：试验中所用的试管、注射器、针头、金属直镊等冲洗干净，置电热干燥箱中（注射器、针头、金属直镊等放入注射器盒中封好，再放入干燥箱中），经250℃加热30分钟，除去热原。 5.4. 检查法：
细菌内毒素检测（凝胶法）标准操作 目的：规范细菌内毒素的检测操作，保证细胞质量。 范围：适用于所有从治疗中心发放的细胞（包括CIK、DC、干细胞等）内毒素限量检测。 责任人：质量检测人员 材料： 一、电热干燥箱除外源性内毒素用，温度应能达到180℃。 二、恒温水浴箱或适宜的恒温器（37℃±1℃）。 三、水银温度计，精度在1℃以下，量程不小于50℃。 四、旋涡混合器。 五、可调式移液器 六、0.25EU/ml鲎试剂。 七、细菌内毒素工作品。 八、凝胶法细菌内毒素检查用水。 九、实验用具无热原吸头（1000μl、200μl）、带铝盖的凝集管（10mm×75mm）、试管架、计时器、75%酒精棉球、封口膜、剪刀、镊子、砂轮。所用玻璃器皿使用前须经250℃干烤至少1小时或180℃干烤至少4小时。 操作方法 一、取样 1、细胞发放前3天，取细胞培养液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放（可存放多长时间）。 2、细胞发放当天，取细胞生理盐水混悬液约2ml，分装于2个带铝盖的凝集管中各约1ml左右，如不立即试验4℃存放。（可存放多长时间）。 3、取样应以无菌操作技术取样，所用器材在使用前应无热原或已去除热原。 二、鲎试剂灵敏度复核 鲎试剂灵敏度复核的目的是考察鲎试剂的灵敏度是否正确、考察检验人员操作方法是否正确及实验条件是否符合规定。 在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进
行鲎试剂灵敏度复核实验。 （一）实验操作 1、细菌内毒素工作品溶液的制备 取细菌内毒素工作品一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，然后用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，开启过程中应防止玻璃屑落入瓶内。 按照工作品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后用倍倍稀释方式进行稀释，即0.5ml各浓度工作品溶液+0.5ml检查用水（以下稀释方式同此法），制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液，即2.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。 2、待复核鲎试剂的准备 取0.1ml/支的鲎试剂18支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混合在一起，然后每0.1 ml分装到10mm×75mm凝集管中，要求至少分装18管备用。 3、加样 将已充分溶解的待复核鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分别加入0.1ml的2λ、λ、0.5λ和0.25λ的内毒素标准溶液；另2支（管）加入0.1ml检查用水。 4、加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，连同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温60±2分钟。 5、观察并记录结果。将试管架从水浴或适宜恒温器中轻轻取出，避免振动，将每管拿出缓缓倒转180°观察，管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，记录为（＋）；未形成凝胶或凝胶不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，记录为（－）。 （二）实验结果计算
GMP管理文件 一、引用标准：中华人民共和国S药典（2005年版）一部。 二、目的：本标准规定了细菌内毒素检查法标准操作规程。 三、适用范围：适用于细菌内素毒素的检查。 四、责任者：质检人员。 五、正文： 1、简述本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以供试吕中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。 细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。 细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。 细菌内毒素工作标准系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。 凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量含量小于ml的灭菌
注射用水。光度测定法用的细菌内毒素检查用水，其内毒素的含量应小于ml。 试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60分钟，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。 供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。一般要求供试品溶液的PH值在～的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的PH值，何使用酸、碱溶液或鲎试剂生产厂家推荐的适宜的缓冲液调节PH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。 最大有效稀释倍数（MVD）的确定最大有效稀释倍数是指在试验中供试品被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD： MVD＝Cl/λ C为供品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于ml，当L 以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀