广州中医药大学
博士学位论文
溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜TLRs/NF-κB通路的作用
姓名：李红
申请学位级别：博士
专业：中西医结合基础
指导教师：王汝俊
20070401
溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜ＴＬＲｓ／ＮＦ－ＫＢ通路的作用
第一部分文献研究
１ＴＬＲｓ／Ｎ卜＇ｃＢ通路研究进展
１．１关于Ｔｏｌｌ样受体
Ｔｏｌｌ样受体（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＴＬＲｓ）是近十多年来发现的天然免疫受体，它使人类重新认识并定位了机体天然免疫系统在免疫始动环节及调控中重要作用，因而被誉为“免疫学领域的重大突破”“１。该受体族作为机体炎性反应链的启动蛋白，从源头为炎症性疾病的发病机理的研究提供了新的方向。
１．１．１ＴＬＲｓ的发现
１９８８年Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ等。１在果蝇中发现了一类属于Ｉ型跨膜蛋白的受体，称之为Ｔ０１１样受体。它是果蝇胚胎发育过程中必须的成分蛋白，调节果蝇的背腹部体轴的发育，另外还参与成年果蝇的免疫防御功能。当微生物侵入时，通过ＴＬＲｓ的识别和胞内信号的转导，分泌果蝇素和杀菌肽等物质发挥抗真菌免疫应答作用。１９９４年Ｎｏｍｕｒｉａ等。１发现在哺乳动物有一种与果蝇Ｔｏｌｌ蛋白相似的蛋白，１９９６年Ｔａｇｕｃｈｉ等“１从人体染色体４Ｐ１４基因组中成功克隆一种果蝇ｄＴｏｌｌ蛋白的同源物ＴＩＬ，１９９７年Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ等。１证实另一种Ｔｅｌｌ样蛋白（ｈＴｏｌｌ）可刺激人和其他哺乳动物的适应性免疫系统，将其命名为ＴＬＲ４。至今已经鉴定出的人ＴＬＲｓ家族成员有１１个“。１，并被证明可以识别各种病原体相关分子模式（ｐａｔｈｏｇｅｎ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｔｅｒｎｓ，Ｐ／ＷＰｓ）…。１．１．２ＴＬＲｓ的结构
ＴＬＲ家族成员均属于Ｉ型跨膜受体蛋白，有三个主要区组成，可分为胞膜外区、跨膜区（即富含半胱氨酸的功能区）和胞内区三部分。人ＴＬＲ家族成员的蛋白质结构如图１‘“。
图１人ＴＬＲ家族成员的蛋白质结构示意图
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负责活化的ＮＦ－－１ｃＢ进入核内行使功能。有活性的ＮＦ－－１（Ｂ是同型或异型Ｒｅｌ二聚体组成的转录因子，通常ＮＦｌｃＢ是指ｐ６５／ｐ５０二聚体，只有ｐ６５的Ｃ一末端才具有促进转录活性结合位点。
图２ＮＦｌｃＢ家族各成员的结构图
（１ｉｎｄ）Ｒｅｌｈｏｍｏｌｏｇｙｄｏｍａｉｎ；ＣｒＡＤ）ｔｘａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ；（旧ｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒｄｏｍａｉｎｏｎＩＫＫａ／８ａｎｄＲｅＩ－Ｂ；（ＧＲＲ）ｇｉｙｃｉｎｅ－ｒｉｃｈｒｅｇｉｏｎ；
１．２．３ＮＦ—ｘＢ的活化
细胞在静息状态下，ＮＦ－ｗ。Ｂ与ＩＫＢｓ结合成无活性三聚体，被“囚禁”在细胞质中，当上游刺激因子如ＴＮＦ－ａ、ＩＬ—ｌｐ、氧化剂、脂多糖（ＬＰＳ）等与ＴＬＲｓ结合再与受体相关因子形成复合物，该复合物将ＮＦ－ｒ．Ｂ诱导激酶（ＮＦ－ＫＢｉｎｄｕｃｉｎｇｋｉｎａｓｅ，ＮＩＫ）激活，激活的ＮＩＫ将ＩＫＢ激酶（ＩＫＢｋｉｎａｓｅ，ＩＫＫ）磷酸化而激活，活化的ＩＫＫ再使ＩＫＢ磷酸化进而泛素化，最后被２６Ｓ蛋白酶体降解，从而使ＮＦ－?ｃＢ的抑制解除嘲，其ＤＮＡ结合位点和核定位信号暴露，获得自由的ＮＦ－－ＫＢ迅速从细胞质易位到细胞核，并与基因上ＫＢ位点发生特异性结合，从而促进有关基因的转录。“。ＮＦ－ＩｃＢ的核转移是其激活过程中的关键步骤““。ＮＦｌｃＢ的失活是新合成的ＩＫＢ进入细胞核中与ＮＦ—ｒ，Ｂ－ＤＮＡ序列复合体中的ＮＦ－ＫＢ结合，降低二者的亲和力，使ＮＦ－ｘＢ从顺式作用元件上解离，新形成的三聚体又回到细胞质中等待重新激活嗌１。
１．３ＴＬＲｓ介导的ＴＬＲｓ／ＮＦ—ＫＢ传导通路
ＴＬＲｓ介导免疫的信号转导途径中的ＴＬＲｓ／ＮＦ＿ＫＢ通路已基本阐明，在目前受到广泛关注。ＴＬＲｓ通过ＬＲＲ识别配体，信号被转换跨膜到ＴＩＲ区，后者激活相关接头蛋白，激活的接头蛋白继而诱导相应的信号转换级联反应，最终导致ＮＦ—ＫＢ的活化，ＴＬＲｓ和它们的信号通路如图３㈣。
已经报道的ＴＬＲ接头蛋白近来扩展为５个：ＭｙＤ８８，ＴＩＲＡＰ／Ｉｌａｌ，ＴＲＩＦ／ＴＩＣＡＭ—ｌ，ＴＰ，ＡＭ／ＴＩＣＡＨ－２，和Ｓ＾ＲＭ／ＭｙｄＳ８㈨。不同的接头蛋白和ＴＬＲ亚型之间有明显的特异性。ｇｙｄ８８是ＴＬＲ５，６，７和８传导信号所需要的单独的接头蛋白，但ＴＲＩＰ是ＴＬＲ３需要的
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赞结是对溃疡性结肠炎是鼠结肠粘膜ＴＬＲｓ／ＮＦ—ＫＢ通路的作用
单独的接头蛋白，ＴＬＲ２和ＴＬＲＩ或ＴＬＲ６的异二聚体通过Ｍｙｄ８８传导信号，但另需要ＴＩＲＡＰ的存在。ＴＬＲ４与接头蛋白的联合似乎最复杂，通过Ｍｙｄ８８和ＴＩＲＡＰ传导信号，与ＴＬＲ２类似，但也可通过ＴＲＩＦ和ＴＲ删即Ｍｙｄ８８非依赖的途径传导信号。１。
图３ＴＬＲ和它们的信号通路
现将Ｍｙｄ８８一依赖性途径和非依赖途径分述如下：
１．３．１Ｍｙｄ８８一依赖性途径’
除了ＴＬＲ３，所有的受体募集Ｍｙｄ８８汹１，Ｍｙｄ８８分子Ｃ末端具有ＴＩＲ功能域，Ｎ末端具有死亡结构域（ＤＤ），ＴＩＲ功能域负责介导Ｍｙｄ８８与ＴＬＲｓ和ＩＬ－ＩＲ结合，而ＤＤ负责募集含有ＤＤ的的激酶ＩＲＡＫｓ汹１。Ｍｙｄ８８便与ＩＲＡＫ家族ＩＲＡＫ－Ｉ～４相联系㈣，ＩＲＡＫ—ｌ补充到与Ｔｏｌｌ作用蛋白（Ｔｏｌｌ—ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，Ｔｏｌｌｉｐ）组成联合体的咐ｄ８８上…。ＩＲＡＥ—Ｍｙｄ８８联合触动了ＩＲＡｌ（一ｌ通过其自身或其它激酶如ＩＲＡＫ一４的高度磷酸化㈨，而这个导致了ＩＲＡＫ—ｌ从Ｍｙｄ８８和Ｔｏｌｌｉｐ分裂并与下游接头～
ＴＲＡＦ．６相互作用””。ＩＲＡＫｌ与ＩＲＡＫ４是ＴＬＲｓ和ＩＬ一１Ｒ激活ＮＦ－ＫＢ信号途径的关键分子㈨。ＴＲＡＦ－６可以刺激转录生长因子一１３活化激酶（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ—Ｂ（ＴＧＦ—ＩＳ）一ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｋｉｎａｓｅ，ＴＡＫ—１），ＴＡＫ—ｌ可促进下游ＩＩ（Ｉ【ｓ：ＩＩ（Ｉ（ａ和ＩＫＫＢ的活化，ＩＫＫｓ可直接磷酸化ＩＫＢ家族，磷酸化后的ＩＫＢ被Ｅ３泛素连接酶选择性泛素化，然后被２６Ｓ蛋白酶体识别并迅速降解。这使ＮＦ—ＫＢ能够转录到细胞核内，并在核内引发促炎蛋白和共刺激分子过多的基因编码““。除了ＴＬＲ３，上述通路被所有ＴＬＲｓ普遍使用以活化ＮＦ－ＫＢ，并被称为Ｍｙｄ８８依赖性途径。”。
１．３．２Ｍｙｄ８８一非依赖性途径
ＴＬＲ３以Ｍｙｄ８８一非依赖性途径发信号。有趣的是，在Ｍｙｄ８８缺乏的小鼠，ＴＬＲ４配体ＬＰＳ仍能触动ＮＦ—ＫＢ的激活，虽然与野生种细胞相比，速度稍慢，但是在这些小
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鼠中其它ＴＬＲ不能有效地活化ＮＦ－ＫＢ…３。虽然Ｍｙｄ８８缺乏的小鼠在对ＬＰＳ的应答中不能产生促炎细胞因子比如ＴＮＦ、ＩＬ－Ｉ、ＩＬ一６和Ｉ卜１２，但是却保持了产生干扰素（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｇａｍｍａ，ＩＦＮ）诱导基因和共刺激分子的能力和树突状细胞的成熟…１。这些研究说明ＬＰＳ信号通路有两个：一个是Ｍｙｄ８８－依赖性通路，它能促进ＮＦ－ＫＢ的快速激活和促炎分子的产生，另一个是Ｍｙｄ８８非依赖性通路（也被ＴＬＲ３使用），它能介导ＮＦ－ＫＢ的慢速激活和ＩＦＮ诱导基因和共刺激分子的产生。通过ＴＬＲ３和ＴＬＲ４调节ＩＲＦｓ和ＮＦ—ＫＢ见图４“１。
图４通过ＴＬＲ３和ＴＬＲ４调节ｌＲＦｓ和ＮＦ－Ｋ８
第二个含ＴＩＲ功能域的接头分子是Ｍｙｄ８８样接头蛋白（Ｍｙｄ８８ａｄａｐｔｏｒ—ｌｉｋｅ，Ｍａｌ），也称为含ＴＩＲ功能域的接头蛋白（ＴＩＲｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｄａｐｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎ，ＴＩＲＡＰ）嘲。然而Ｍａｌ敲除的小鼠显示出这种接头不负责Ｍｙｄ８８非依赖信号，相反在Ｍｙｄ８８与ＴＬＲ２和ＴＬＲ４之间搭起了一座桥梁…。后来的研究证明含ＴＩＲ功能域的诱导ＩＦＮ—Ｂ接头（ＴＩＲｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｄａｐｔｏｒ—ｉｎｄｕｃｉｎｇＩＦＮ—Ｂ，ＴＲＩＦ），也被称为含ＴＩＲ接头分子（ＴＩＲ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｄａｐｔｏｒｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＴＩＣＡＭ）一１是Ｍｙｄ８８非依赖通路中的关键调节剂。ＴＲＩＦ敲除的小鼠不能显示出ＭｙＤ８８非依赖的ＮＦ—ｇＢ激活，并不对ＬＰＳ或ＴＬＲ３配体应答，但注意到ＩＦＮ诱导基因的表达。”。ＴＲＩＦ与ＴＬＲ３的ＴＩＲ域直接作用嘲并调节信号，但是另一个包含ＴＩＲ功能域的接头一ＴＲＩＦ相关接头分子（ＴＩＲｄｏｍａｉｎ—ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｄａｐｔｏｒＴＲＩＦ—ｒｅｌａｔｅｄａｄａｐｔｏｒｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＴＲＡＭ），也称为ＴＩＣＡＭ一２，在ＴＬＲ４和ＴＲＩＦ之间成为桥梁接头…１。如Ｍｙｄ８８依赖通路所述，ＴＲＩＦ与下游的接头ＴＲＡＦ一６相互作用。ＴＲＩＦ还能与激酶受体作用蛋白一１（ｋｉｎｓｅ