大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要 求检测的项目。在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠 菌群平板计数法的注意事项。 方法选择 相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标 此处不再赘述。因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。 培养基的要求 平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min即可使用。特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。但值得注意 的是，VRBA需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。 稀释度的确定 国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。什么样的稀释度是合适的呢这要根据计数来决定。计数环节要求选择菌落数在15CFU-150CFU的平板进行计数，
粪大肠菌群测定复习试题 一、填空题 1.地表水环境质量标准(GHZB1—1999)中，对环境质量卫生指标粪大肠菌群项目作出明确规定：Ⅰ类水质标准值为；Ⅱ类水质标准值为；Ⅲ类水质标准值为；Ⅳ类水质标准值为，Ⅴ类水质标准值为。 答：≤200个/L；≤1000个/L；≤2000个/L；≤5000个/L；≤10000个/L。 2.粪大肠菌群是一部分，用粪大肠菌群作为卫生学指标比用 更有。目前，粪大肠菌群被认为是受粪便污染的最实用的。 答：总大肠菌群；总大肠菌群；代表性；指示菌。 3.检测粪大肠菌群时作发酵试验用的培养基，是由、、 、等配制而成的，调节pH为，应在 灭菌。 答：蛋白胨；牛肉浸膏；乳糖；氯化钠；7.2-7.4；115℃；20min。 4.农田灌溉水质标准(GB5084—92)中，根据农作物的需求状况，将灌溉水质按灌溉作物分为三类：水作、旱作和蔬菜。其生物指标粪大肠菌群标准值定为 。 答：≤10000个/L。 5.为了区别存在于中的大肠菌群和存在于的大肠菌群,可将培养_ __ _____，在此种条件下仍能_____ 并使____________ _，则称为粪大肠菌群。 答：自然环境；温血动物肠道内；温度提高到44℃；生长；发酵乳糖产酸产气。 6.进行复发酵试验时，用3mm 或灭菌棒将转接到 培养液中。在培养。培养后观察发酵管 表明确信。
答：接种环；培养物；EC；44±0.5℃水浴下，24±2h；产气；试验阳性。 7.在污水综合排放标准(GB8978—1996)中，把医院、兽医院及医疗机构含病原体污水的粪大肠菌群分为三级标准：一级标准值；二级标准值；三级标准值。而传染病、结核病医院污水的粪大肠菌群三级标准值分别为：、、。 答：500个/L；1000个/L；5000个/L；100个/L；500个/L；1000个/L。8.EC培养液的配比是：胰胨，乳糖，氯化钠，磷酸二氢钾，胆盐三号，磷酸氢二钾，溶解于蒸馏水中。在 15min，灭菌后应为。 答：20g；5g；5g；1.5g；1.5g；4g；1000mL；121℃灭菌；pH；6.9。 二、问答题 1.粪大肠菌群的涵义是什么？ 答：指一群需氧及兼性厌氧在44.5℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.控制粪大肠菌群指标值的意义是什么？ 答：为了人体健康卫生的要求。 3.粪大肠菌群测定有几种方法？通常用哪种方法？ 答：有三种：多管发酵法、滤膜法、延迟培养法。用多管发酵法。 4.简诉测定粪大肠菌群多管发酵法的操作步骤？ 答：测定分二个步骤进行：量取若干经稀释的水样，接种乳糖蛋白胨培养液，进行初发酵试验：在37±0.5℃下培养24±2h，产酸和产气的发酵管表明试验阳性，再将表明试验阳性的发酵管中的培养物转接到EC培养液中，进行复发酵试验，在44±0.5℃水浴下培养24±2h，发酵管产气表明确信试验阳性。 5.在何种情况下用多少三倍浓度的培养基接种？ 答：接种体积为10ml时，试管内应装入有3倍浓度乳糖蛋白胨培养液5ml。 6.什么叫兼性厌氧细菌？ 答：氧存在或不存在的条件下均能繁殖的细菌。
学院：环境科学与工程学院班级：11级环境科学（2）班 姓名：李宝携学号：3111007398 实验3 多管发酵法检测水中的大肠菌群 一、实验目的 （1）了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义。 （2）学习检测水中大肠菌群的方法。 二、实验原理 大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。 大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。 多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。当发酵产酸时，溴甲酚紫可由紫色变为黄色，乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。 三、实验材料 1、水样 中心湖湖水 2、试剂 三倍浓缩乳酸蛋白胨培养液 3、仪器及其他用品 试管、发酵管、烧杯、量筒、移液枪、高压灭菌锅 四、操作过程 1、取16支发酵管，其中5支加入5mL三倍乳糖蛋白胨培养液。取35mL三倍乳糖蛋白胨培养液于烧杯中，量取70mL水进行稀释，将三倍乳糖蛋白胨培养液稀释成一倍的乳酸蛋白胨培养液，分别取10mL一倍的乳酸蛋白胨培养液与10支试管中，最后，1支加入9ml自来水。 2、完成后包装好，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min左右。 3、灭菌完毕，冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1ml水样。取1mL的水样于装有9mL自来水的试管中，混合摇匀，并分别移1mL于另外的5支10mL的试管中。 4、将各试管充分混均，包装完成，将其置于37℃恒温箱中培养24h。 5、取出培养液，观察试管的颜色及其中的气泡数并记录数据。 6、观察完毕，清洗仪器并整理数据。
大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系及介绍 相互关系 大肠菌群（总大肠菌群） >粪大肠菌群&耐热大肠菌群> 大肠杆菌 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 二、总大肠菌群
所谓总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 三、耐热大肠菌群与粪大肠菌群的比较 北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。一般欧洲学者认为，“粪大肠菌群”的提法不太科学，耐热大肠菌群的范围比粪大肠菌群范围大。 耐热大肠菌群的卫生学意义 作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。 作为粪便污染指标菌，耐热大肠菌群与大肠菌群、大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等）和食物中毒者。因此，食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。
GB/ 肥料中粪大肠菌群的测定 1 范围 本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法。 2 定义 粪大肠菌群 fecal coliforms 系指一群在℃±℃条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）。 3 设备和材料（内容略） 4 培养基和试剂 培养基：遵照附录A的规定。 革兰氏染色液：遵照附录B的规定（略）。 5 检验步骤 样品稀释 在无菌操作下称取样品g或吸取样品10mL，加入到带玻璃珠的90 mL无菌水中，置于摇床上200 r/min 充分振荡30min，即成10-1稀释液。 用无菌移液管吸取 mL上述稀释液加入到45 mL无菌水中，混匀成10-2稀释液。这样依次稀释，分别得到10-3，10-4等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）。 乳糖发酵试验 选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置℃±℃恒温水浴或隔水式培养箱内，培养24h±2h。如果所有乳糖胆盐发酵管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性；如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按进行。 分离培养 从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36℃±1℃条件下培养18h～24h。 证实试验 从分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色。染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性；如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置℃±℃条件下培养24h ±2h。观察产气情况，不产气为粪大肠菌群阴性；产气为粪大肠菌群阳性。 结果 证实实验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。 附录 A （规范性附录） 培养基 乳糖胆盐发酵培养基 蛋白胨g 猪胆盐g 乳糖g %溴甲酚紫水溶液m L 蒸馏水1000m L
大肠菌群计数实验 MPN计数法 一、设备和材料 250ML锥形瓶3个 100ML烧杯1个 250ML量筒1个 1000ML烧杯1个 15*150mm试管3个 1ML刻度吸管4个 18*180mm试管20个杜氏小管 玻璃棒1个接种环1个 剪刀1把药匙2个 均质器天平（感量0.1g） 电炉洗耳球 二、实验准备 1、配制培养基： LST培养基的配制： 用天平称取17.8gLST培养基于锥形瓶中 加入500ML蒸馏水 加热煮沸至完全溶解 分装于装有杜氏小管的大试管中，每管10ML，共10管高温灭菌备用 BGLB培养基的配制： 用天平称取20gBGLB培养基于锥形瓶中 加入500ML蒸馏水
加热煮沸至完全溶解 分装于装有杜氏小管的大试管中，每管10ML，高温灭菌备用 2、生理盐水 取4.25g氯化钠于大烧杯中 加入500ML蒸馏水溶解 取225ML生理盐水于锥形瓶中 分别取9ML生理盐水于3只小试管中 将分装好的生理盐水进行高温灭菌 3、灭菌：将均质杯、100ML烧杯、刻度吸管、剪刀、接种环、洗耳球高温灭菌备用 三、取样 在提交的产品中随机抽取三箱，从每箱中随机抽取未打开包装的产品1袋~3袋，抽取不低于250g的样品作为微生物指标检验试样。 四、检验程序
五、操作步骤 初发酵试验 1、称取25g 样品，放人盛有225m生理盐水的无菌均质杯内，8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。 2、用1ml无菌吸管吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 3、换一只新的1ml无菌吸管吸取1:100样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，使其混合均匀，制成1:1000 的样品匀液。 4、将三个连续稀释梯度的样品原液在进行10倍递增稀释时，吸取1 ml样品匀液于LST肉汤，每个稀释度接种三管。 5、同时做一组空白，在一支LST肉汤中接种1ml生理盐水。 6、 36℃±1℃培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤
粪大肠菌群的测定 1 卫生学意义 粪大肠菌群测定的卫生学意义：一、与大肠菌群相比，粪大肠菌群在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群的存在表明食品近期内可能直接或间接的受到了粪便的污染；二、作为粪便污染指标评价食品的卫生状况，推断食品中肠道致病菌污染的可能性；三、常用做贝类和贝类养殖用水的卫生指标。 2 检验方法 2.1 术语与定义 一群在44.5℃培养24h-48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 卫生学概念，又称为耐热大肠菌群，主要是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属等。 2.2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： （1）恒温培养箱：36℃±1℃。 （2）冰箱：2℃～5℃。 （3）恒温水浴箱：46℃±1℃。 （4）天平：感量0.1g。 （5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 （6）无菌锥形瓶：容量500mL。 （7）无菌培养皿：直径90mm。 （8）pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 2.3 培养基和试剂 （1）月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0g；氯化钠：5.0g；乳糖：5.0g；磷酸氢 二钾（K 2HPO 4 ）：2.75g；磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）：2.75g；月桂基硫酸钠：0.1g； 蒸馏水：1000mL；pH：6.8±0.2 2）制法：将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。 （2）EC肉汤（E.coli，BGLB）： 1）成分：胰蛋白胨或胰酪胨：20.0 g；3号胆盐或混合胆盐：1.5 g；乳糖： 5.0g；磷酸氢二钾（K 2HPO 4 ）：4.0g；磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）：1.5g；氯化钠：5.0g；
粪大肠菌群多管发酵法 1、培养基、试剂与仪器 本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。 单倍乳糖蛋白胨培养液： 称取23.0g乳糖蛋白胨营养液于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每试管约8ml（先用移液管吸取7ml至试管中，再用滴管吸取营养液放至小玻璃管中，直至营养液溢出。注意小玻璃管中不能有气泡，若出现气泡，应将气泡排出后再注入营养液。），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 EC 培养液： 称取37.0gEC肉汤于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每管8ml（操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。 培养基的存放 在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。 验所需仪器 超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、酒精灯、天平、电炉、500ml广口瓶、烧杯、玻璃棒、玻璃发酵管、试管架、移液管、移液枪、接种环2步骤 前期准备 器皿灭菌（高压蒸汽灭菌）：所用采集水样的广口瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头等器皿均需放入高压锅灭菌。 广口瓶：将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖，用牛皮纸、报纸等防潮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好，用绳子绑好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
玻璃试管（已经装好营养液）、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头：用牛皮纸、报纸等防潮纸将其包裹好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。 采样：采取水样时，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中，约距水面10~15cm处，拔瓶盖，瓶口朝水流方向，使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖，将采样瓶从水中取出。如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直到充满水样为止。采好水样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。 采好的水样，应迅速运往实验室，进行检验，一般从取样到检验不宜超过 2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。 4.2 水样接种量 将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。 相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。使用的水样量可参考下表1。(根据实验经验，经过紫外消毒的水样取0.1mL、0.01mL、0.001mL体积进行检测，可根据水样的洁净度适当调整取样体积。) 表1 接种用水量参考表 如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1mL 或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。 4.3 初发酵试验 将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37℃±0.5℃下培养24h±2h。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。 4.4 复发酵试验
实验一食品中大肠菌群的测定
大肠菌群(M.R.N.)的测定 一、实验目的： （1）了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义 （2）学习并掌握大肠菌群的检验原理和方法，以判别食品的卫生质量 二、实验原理： 大肠菌群系指一群能在37℃经24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the mo st probable number-简称MPN）表示。最近似数（most probable number-简称M PN）法是一种将样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。将3个稀释梯度的检样稀释液接种于9支或15支试管培养基中，每个稀释度接种3支或5支。经培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可得到原样品中微生物的估计数量。M PN测定方法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数。 三、材料 1、样品 乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 2、菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 产气肠杆菌（Enterobacteria aerogenes）
3、培养基及试剂 单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA) 4、其它设备和材料 温箱(36土1)℃、水浴锅(44土0.5)℃、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。 四、实验步骤 (一)检验程序 大肠菌群检验程序见图 (二)操作步骤
肥料中粪大肠菌群的测定 一：前期准备 一次性帽子、口罩、脚套 1， 移液管10ml 量筒100ml ｝ 玻璃珠 三角瓶 培养皿 2， 乳糖胆盐发酵培养基（用于乳糖发酵） 乳糖发酵培养基（用于复发酵） 伊红美蓝培养基（用于分离培养） } 121℃，15min 无菌水 } 121℃，15min 二：实验过程 无菌条件下进行： 10.0g 固体样品/10ml 液体样品 ↓ 三角瓶（带玻璃珠，90ml 无菌水）1:10=10-1 ↓ 200r/min 振荡30min ↓ 吸取10-1—5ml ，加入45ml 无菌水（提前准备）1:100=10-2 ↓ 吸取吸取10-2—5ml ，加入45ml 无菌水（提前准备）1:1000=10-3 ↓ ……依次稀释得到10-4，10-5等浓度稀释液（每个稀释度必须更换无菌移液管） ↓ 选取三个连续适宜稀释液，分别吸取1.0ml 加入到乳糖胆盐发酵管内（装有乳糖胆盐发酵培 养基）（每一稀释度接种3支发酵管） ↓ 培养箱45℃，24h ↓ 结果：产酸，颜色变；产气，导管有气泡 不产酸，不产气，为粪大肠菌群阴性 ↓ 分离培养：从产酸产气或只产酸的发酵管中挑取发酵液在伊红美蓝培养基平板上划线 ↓ 培养箱36℃，18-24h ↓ 证实实验：从平板上挑取可以菌落，进行革兰氏染色。 结果：染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性 ↓ 革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中（装有乳糖发酵培养基） ↓ 培养箱44.5℃，24h ↓ 结果，不产气为粪大肠菌群阴性，产气为粪大肠菌群阳性 ↓ 证实为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN 检索表，得出每克（毫 升）肥料样品中的粪大肠菌群数 ｝160℃，4h ｝115℃，15min
职业教育环境监测与治理技术专业教学资源库 《环境监测》练习题 1 《粪大肠菌群的测定》练习题 备注：每题后面的简单、一般、困难是指题目的难易程度。 一、选择题 1.EC 培养液的配比是：胰胨20g ，乳糖5g ，氯化钠5g ，磷酸二氢钾1.5g ，胆盐三号1.5g ，磷酸氢二钾4g ，溶解于1000mL 蒸馏水中。在( C )℃灭菌15min ，灭菌后pH 为6.9。（一般） A 、37 B 、115 C 、121 D 、165 2.检测粪大肠菌群时作发酵试验用的培养基，是由蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠等配制而成的，调节pH 为( B )，应在115℃灭菌20min 。（一般） A 、5.2-5.4 B 、7.2-7.4 C 、9.2-9.4 D 、12.2-12.4 二、判断题 1.粪大肠菌群是总大肠菌群一部分，用粪大肠菌群作为卫生学指标比用总大肠菌群更有代表性。目前，粪大肠菌群被认为是受粪便污染的最实用的指示菌。（√）（一般） 2.为了区别存在于自然环境中的大肠菌群和存在于温血动物肠道内的大肠菌群,可将培养温度提高到44℃，在此种条件下仍能生长并使发酵乳糖产酸产气，则称为粪大肠菌群。（√）（一般） 3.进行复发酵试验时，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。在44±0.5℃水浴下培养24±2h 。培养后观察发酵管产气表明确信试验阴性。（×）（困难） 三、问答题 1.简述粪大肠菌群指标的含义及常用测定方法。（一般） 答案：（1）粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便，在44.5℃温度下能生长并发酵乳酸产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。（2）粪大肠菌群指标常用的测定方法为多管发酵法，它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
一．填空题 1.总大肠菌群多管发酵法测定的步骤分为____________、_____________和______________。 2.粪大肠菌群多管发酵法的初发酵试验，是将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中，在____℃培养____h，产酸产气则为阳性。 二、判断题 1.总大肠菌群测定时，如果不能实现常规的检验步骤，例如水样运输途中不能保证所要求的温度，或采样后不能在允许的时间内进行检验等，都可采用延迟培养法。（） 2.对受污染严重的水体样品，如果在初发酵中未发现产气，则应将其培养到48h，然后再进一步证实有无大肠菌类细菌。( ) 3．如果粪大肠菌群测定的接种体积为10ml，则试管内应装有三倍乳糖蛋白胨培养液10m1，如接种量为1m1，则接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10m1中。( ) 4．粪大肠菌群多管发酵法的复发酵试验，是将培养物转接到EC培养液中，在35℃下培养24h。( ) 5．水中总大肠菌群和粪大肠杆菌的快速测定法，适用于医院污水、生活污水、垃圾渗滤液以及其他行业(如餐饮业、食品加工等)排入地表水中的污水。( ) 三、选择题 1．我国目前以为总大肠菌群的报告单位，MPN值再乘即为该体积水样中的总大肠菌群数。( ) A． 100m1， 10 B． 1 L， 1 C， 1 L， 10 四．简答题 1.简述多管发酵法测定水源水中总大肠菌群的初发酵操作步骤。 2.如果总大肠菌群和粪大肠菌群测定水样接种量不是10ml、1m1和0.1ml而是较低或较高三个浓度的水样，应如何计算总大肠菌群数或粪大肠菌群数?试写出计算公式。
答案 一．1.初发酵试验 平板分离 复发酵试验 2. 37 24 二．1.正确 2.正确 3.错误 4.错误 5.正确 三.1.C 四. 1.答案：(1)将水样做1∶10稀释。(2)在各装有5m1三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入10ml 水样；在各装有10m1乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入1ml 水样；在各装有10m1乳糖蛋白胨培养液的5个试管中(内有倒管)各加入1m1 1∶10的稀释的水样。(3)将各管充分混匀，置37℃恒温箱培养24h 。 2.答案：如果接种的水样量不是10m1、1m1和0.1m1，而是较低或较高的三个浓度的水样，可先查MPN 表求出MPN 指数，再经过下面的公式换算成每100m1的MPN 值。MPN 值乘以10，即为1L 水样中的总大肠菌群数(或粪大肠菌群数)。 ()()ml ml MPN MPN 接种量最大的一管 指数值10?=
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater ? Copyright 1999 by American Public Health Association, American Water Works Association, Water Environment Federation presence-absence (P-A) procedure.Can. J. Microbiol. 15:771. CLARK, J.A. & L.T. VLASSOFF . 1973. Relationships among pollution indicator bacteria isolated from raw water and distribution systems by the presence-absence (P-A) test. Health Lab. Sci.10:163. CLARK, J.A. 1980. The influence of increasing numbers of nonindicator organisms upon the detection of indicator organisms by the membrane filter and presence-absence tests. Can. J.Microbiol. 26: 827. CLARK, J.A., C.A. BURGER & L.E. SABATINOS . 1982. Characterization of indicator bacteria in municipal raw water, drinking water and new main water samples. Can. J. Microbiol.28:1002. JACOBS, N.J., W.L. ZEIGLER, F.C. REED, T.A. STUKEL & E.W. RICE . 1986. Comparison of membrane filter, multiple-fermentation-tube, and presence-absence techniques for detecting total coliforms in small community water systems. Appl. Environ. Microbiol. 51:1007. RICE, E.W., E.E. GELDREICH & E.J. READ . 1989. The presence-absence coliform test for monitoring drinking water quality. Pub. Health Rep. 104:54. 9221 E. Fecal Coliform Procedure Elevated-temperature tests for distinguishing organisms of the total coliform group that also belong to the fecal coliform group are described herein. Modifications in technical procedures,standardization of methods, and detailed studies of the fecal coliform group have established the value of this procedure. The test can be performed by one of the multiple-tube procedures described here or by membrane filter methods as described in Section 9222. The procedure using A-1 broth is a single-step method. The fecal coliform test (using EC medium) is applicable to investigations of drinking water,stream pollution, raw water sources, wastewater treatment systems, bathing waters, seawaters,and general water-quality monitoring. Prior enrichment in presumptive media is required for optimum recovery of fecal coliforms when using EC medium. The test using A-1 medium is applicable to source water, seawater, and treated wastewater. 1. Fecal Coliform Test (EC Medium) The fecal coliform test is used to distinguish those total coliform organisms that are fecal coliforms. Use EC medium or, for a more rapid test of the quality of shellfish waters, treated wastewaters, or source waters, use A-1 medium in a direct test. a. EC medium: Tryptose or trypticase 20.0g Lactose 5.0g Bile salts mixture or bile salts No. 3 1.5g Dipotassium hydrogen phosphate, K 2HPO 4 4.0g
粪大肠菌群的测定 1、半个月前配好初、复发酵所需培养液 2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口 3、操作 （1） 培养液 初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 10 g 牛肉浸膏 3 g 乳糖 5 g 氯化钠 5 g 蒸馏水 1000ml 调节PH 为7.2—7.4（NaOH ） 6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。 单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。 双月10个地表水，2个创业。共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。 创业的水一个月采两次水样 复发酵 EC 培养液 胰胨 20 g 乳糖 5 g 胆盐三号 1.5 g 磷酸氢二钾 4 g 磷酸二氢钾 1.5 g 氯化钠 5 g 蒸馏水 1000ml 充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。 三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml
（2）做样 初发酵： 地表水15根管为一个水样。5根为一组。第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。 （10、1、0.1的取样量） 创业，每个水样15根单倍。同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、 0.001ml。 将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。 观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。 复发酵： 呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。将阳性的试管中溶液接种（接种环）到EC培养液中，放在45℃±0.5℃的水浴锅中培养24h±2h。水浴锅液面应高于管中液面。 观察：产气（有气泡）则证实为阳性。记录阳性试管数，查表可得MPN值。 结果表示单位为：个/L
水中总大肠菌群的测定复习试题 （多管发酵法） 一、填空题 1.总大肠菌群主要包括有_________________________ 、_________________________ 、肠杆菌属、_____________________________ 等菌属的细菌。 答：埃希氏菌属；柠檬酸杆菌属；克雷伯氏菌属。 2.总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可适用于 ____________________ ，操作 ， 需要时间______________ 。 答：各种水样；较繁；较长。 3.配制乳糖蛋白胨培养液时，将 _____________ 、__________________ 、____________ 、氯化钠加热溶解于1000ml蒸馏水中，调节pH值为 _________________ ，再加入 _______________ 溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在_________ 答：蛋白胨；牛肉浸膏；乳糖；7.2?7.4 ；115；20；暗处。 4.平板分离：经初发酵试验培养h 后，发酵试管颜色变黄为_______________ ，小玻璃倒管内有__________ 为产气。 答：24；产酸；气泡。 5.配制伊红美蓝贮备培养基：先将 _______________ 加至900ml蒸馏水中，加热融化，然后加入_______________________ 及 _______________ ，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整pH值为__________________ 。趁热用脱脂棉或多层纱布过滤，再加入_______________ ，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器中，在____________ C灭菌min ，贮存 于___________ 备用。 答：琼脂；磷酸氢二钾；蛋白胨；7.2?7.4 ；115；20；冷暗处。 二、选择题 1.下列物质中________ 不是配制品红亚硫酸钠培养基所需要的。 A、蛋白胨；B琼脂；C溴甲酚紫乙醇溶液；D磷酸二氢钾 答：C 2.测定水源水中总大肠菌群时，将水样作 _________ 稀释。
BS ISO 4832:2006食品和动物饲料的微生物学大肠菌群计数水 平法--菌落计数技术 序 ISO是国际标准的全球性组织。准备国际标准这项工作通常由ISO技术联盟来完成。每一个团体成员负责各自的学科。与ISO有合作的国际性机构、政府与非政府机构，也有参与这项工作。ISO与国际电子组织（IEC）在电子标准化方面有着密切的合作关系。 国际性标准的起草原则在《ISO/IEC 细则》第三部分中有给出。 起草的国际性标准被技术委员会采用是通过全体成员投票决定的。发布一个国际性标准需要至少75％成员投赞成票。国际性标准ISO 4831 由ISO/IEC 34技术委员会（农产品，小组委员会SC9，微生物）起草的。 这个第三版的ISO 4832取代了ISO 4832:1991和ISO 5541-1:1986。主要的修改内容如下： ——在35℃下培养这个可选择的程序已被删除（见4.2）； ——引入使用亮绿乳糖胆汁培养基做确证实验（见5.4和9.4）。 考虑到本标准的上一个版本已被修改，已确认ISO 4832:1991的选择性方法不受影响。 绪论 由于食品与饲料的种类繁多，这个标准不一定适合某一类产品。在这种情况下，可使用不同的方法，但必须有绝对的技术上的理由。否则，要尽可能地完全遵循本标准。 当这个标准下一次回顾时，将会对这个标准的使用做数据统计，特殊产品偏离本标准使用也会做相关统计。 同一类产品的检测方法也有可能不统一，国际性标准和/或国家标准也不一定完全与本标准相符合。希望相关标准做回顾时，会遵循本标准做出相关的修改，以使只有已被证明的技术上的理由才能与本标准偏离。 本标准在技术上的描述没有ISO 4831那样精确，但大部分的微生物检测能根据本标准开展，每克或每毫升样品中含大数量的大肠菌群可使用本标准。此外，
收稿日期:2008-07-08 作者简介:高瑞坤(1963-),男,福建泉州人,工程师.参考文献: [4]Gitelson A,Mayo M,Yacobi Y Z,et al.The use of hi gh spectral radiometer data for detection of low chlorophyll concentrations in Lake Kinneret[J].J.Plank ton Res. 1994,16:993-10021 [5]Hoge F,Swift R.Ocean color spectral variability studies using solar induced chlorophyll fluorescence[J].Applied Optics.1987,26:18-21 [6]Iluz D,Yacobi Y Z,Gitelson A.Adaptation of an algori thm for chlorophyll-a es timation by optical data in the oligotrophic Gulf of Eilat[J].Int.J.Remote Sensing. 2003,24(5):1157-11631 [7]Schalles J F,Gitelson A,Yacobi Y Z,Kroenke A E. Chlorophyll esti mation using whole seasonal,remotely sensed high spectral-resolutiondata for an eutrophic lake [J].J.Phycol.1998,34:383-391 [8]Yacobi Y Z,Gi telson A,M ayo M.Remote sensing of chlorophyll in Lake Kinneret using high spectral resolution radiometer and Landsat TM:Spectral features of reflectance and algorithm development[J].J.Plankton Res.1995,17:2155-21731 水中粪大肠菌群快速检测方法-固定底物酶底物法 与多管发酵法的比较 高瑞坤1,汤琳2,付强3(1.厦门市环境监测中心站,福建厦门361004; 2.上海环境监测中心,上海200030;31中国环境监测总站,北京100012) 摘要:目的在于比较固定底物酶底物法与多管发酵法用于水中粪大肠菌群(耐热大肠菌群)的检测,使用科立得T M (Colilert R o)试剂和传统方法检测地表水、水源水及污水水样,比较固定底物酶底物法与多管发酵法用于水中粪大肠菌群(耐热大肠菌群)检测结果的一致性。结果表明,固定底物酶底物法与多管发酵法用于水中粪大肠菌群(耐热大肠菌群)检测结果具有一致性,固定底物酶底物法可以用作评价水质微生物污染的标准方法。 关键词:粪大肠菌群(耐热大肠菌群);固定底物酶底物法科立得TM(Colilert R o);多管发酵法;快速检测 中图分类号:X832文献标识码:A文章编号:1002-6002(2008)04-0039-03 Com parison between rapid detection m ethod of Defined Substrate Technology(DST)enzyme substrate technique and multiple-tube fermentation technique in water Fecal bacteria(Thermotoleerant coliform bacteria)detection GAO Ru-i kun1,et al(1.Xiamen Environ mental Monitoring Centre,Xiamen361004,China) Abstract:In order to compare bet ween rapid detection method of Defined Substrate Technology(DST)enzyme substrate technique and mul tiple-tube fermentation technique in water Fecal bacteria(Thermotoleerant coliform bacteria)detection,use科立得TM(Colilertò) and traditional method to test real water samples are included in this experiment.Results demonstrate that Defined Substrate Technology (DST)enzyme substrate technique shows equivalence with multiple-tube fermentation technique.It is suggested that Defined Substrate Technology(DST)enzyme substrate technique can be used as a standard method for water microbiological safety evaluation. Key words:Fecal bacteria(Thermotoleeran t coliform bacteria);Defined Substrate Technology(DST)enzyme substrate technique科立得TM(Colilert R o);Mul tiple-tube fermentation technique;Rapid detection 目前水中粪大肠杆菌群(耐热大肠菌群)检测方法主要有传统的滤膜法及多管发酵法,并且已经列入环保行业标准方法(HJ P T347-2007),此两种传统方法被国内环境检测部门广泛采用,但上述方法操作时间需2~5天,步骤较为繁琐,需验证试验,不能对水的卫生学状况做出快速评价,制约了其应用。且多管发酵法每毫升水样中最低检出限为2个粪大肠菌群,而固定底物酶底物法却能抑制200万个异样细菌,精确检测到1个粪大肠菌群。因此,采用快速简便且精确的检测方法 第24卷第4期2008年8月 中国环境监测 Environmental Monitoring i n China Vol.24No.4 Aug.2008