两种书虱体内共生菌16S rRNA基因序列测定与分析1
王梓英，王进军*
西南大学植物保护学院, 昆虫学及害虫控制工程重点实验室，重庆 400715
E-mail：jjwang7008@https://www.doczj.com/doc/ec1092321.html,
摘要：采用特异性引物PCR扩增、克隆和测序获得嗜卷书虱和无色书虱共5个地理种群体内共生菌16S rRNA基因序列。通过同源关系分析证实三个嗜卷书虱地理种群体内的共生菌同源性较高，达99%以上。而两个无色书虱地理种群体内的共生菌同源性较低，仅76﹪。研究结果为研究书虱不同地理种群的遗传分化是否与共生菌协同进化提供了基础数据。
关键词：书虱，共生微生物，16S rRNA, 基因序列
1.引言
昆虫与微生物的共生是一种普遍存在的现象，目前已知与昆虫共生的微生物可大致分为三大类：细菌、酵母和立克次氏体。细菌和类细菌多存在于蜚蠊目、等翅目、半翅目、虱目、食毛目、鞘翅目和双翅目等昆虫体内；放线菌生活在吸血蝽体内；鞭毛虫和酵母菌常存在于蜚蠊和白蚁体内[1]，飞虱、蚜虫、烟草甲和药材甲等同翅目和鞘翅目昆虫体内存在多种类酵母菌[2-4]；沃尔巴克氏体(Wolbachia)是节肢动物体内发现的一种立克次氏体细菌，研究表明，大约有16％的昆虫感染了这种细菌。有学者指出自然界的感染率远远超过了这个数字，其是迄今为止已知的最为广泛存在的胞内共生菌之一，国内报道的最多的是在蚊虫[5-6]、果蝇[7]和飞虱[8-9]中发现这种立克次氏体细菌，虱啮属昆虫三色书虱体内也发现了有此细菌共生[10]。
虱啮属(Liposcelis)昆虫隶属于啮目(Psocoptera)、粉啮亚目(Troctomorpha)、虱啮科(Liposcelididae)、虱啮亚科(Liposcelidinae) [11]。啮目昆虫为昆虫纲中的一个小目，其体小，生境特殊，种类多，分布广泛，食性特殊，多数以苔藓、真菌的孢子为食，少数为仓储和书籍等的害虫和捕食蚜、蚧等害虫的天敌昆虫。而为害储粮和书籍的啮目昆虫多隶属于虱啮属。有些种类如嗜卷书虱(L. bostrychophila)等更是储粮害虫中的优势种群[12]。因此虱啮属昆虫是整个啮目昆虫中经济意义最重要的一个类群。
本研究利用特异性引物PCR扩增、克隆和测序获得虱啮属昆虫体内共生菌16S rRNA基因序列，分析其种系关系，为进一步探讨其传播方式及其与宿主的相互作用奠定基础。
2.材料与方法
2.1试虫
本研究所用书虱采集地见表1，试虫在实验室27±0.5℃、75%~80%RH、不予光照的条件下以全麦粉、酵母粉和脱脂奶粉（10∶1∶1）混合而成的饲料饲养并纯化种群。
1教育部博士点基金（20040625006）、教育部新世纪优秀人才支持计划（NCET-04-0854）及国家自然科学基金（30471173）资助项目
* 通讯作者 023-********， E-mail：jjwang7008@https://www.doczj.com/doc/ec1092321.html,。
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表1 试虫及其采集地
Table 1 Lipocelis species and collecting localities
种名Species 采集地
collecting localities
编号
code 重庆北碚 1 陕西西安 2
嗜卷书虱
L. bostrychophila
河南郑州 3
重庆铜梁 4
无色书虱
L. decolor河南郑州 5
2.2书虱啮总DNA的提取
用300μL DNA裂解液（100mM Tris-HCl, pH8.0, 50mM NaCl，50mM EDTA，1% SDS，0.15mM 精胺，0.5mM 亚精胺）把研磨好的书虱冲洗到1.5mL的离心管内，加入2μL蛋白酶K（20mg/mL），50℃水浴5h。用Tris饱和酚（pH8.0）和氯仿:异戊醇（24 : 1）各抽提2次，10000r/min离心10min，上清液中加入0.2倍体积的醋酸铵和两倍体积的无水乙醇，-20℃下沉淀2h后12000r/min离心10min，沉淀用70%乙醇洗涤5min后12000r/min离心5min，弃上清夜沉淀在4℃下晾干后加入20μL双蒸灭菌水溶解，以获得书虱的总DNA。
2.3PCR扩增
胞内共生菌16S rRNA基因的PCR扩增引物参照Weisburg等人[13]所设计的通用引物27F: 5’ AGAGTTTGATCMTGCTCAG 3’, 1513R: 5’ ACGGYTACCTTGTTACGA CTT 3’。反应体系25μL，包括1×PCR buffer（Promega）,0.5mM dNTP（Promega）, 1.5mM Mg2Cl (Promega), 2U Taq酶 (Promega), 上下游引物各0.5μM。扩增条件为94℃ 4min 预变性后,94℃ 1min, 52℃1min, 72℃ 1min,35个循环后72℃ 5min。引物由上海生工合成，PCR扩增所用试剂由Promega 公司生产。
2.4克隆及测序
共生菌16S rRNA基因PCR产物的回收采用上海华舜生物工程有限公司的DNA凝胶回收试剂盒，回收产物与pMD 18-T vector16℃连接30 min，再将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，然后按常规方法涂在预制好的含适量氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养12 h。通过蓝白斑筛选，挑选白色菌落，扩大培养后用碱裂解法提取纯化重组质粒DNA。挑选重组质粒用PCR方法和限制性酶酶切鉴定以获得阳性重组质粒。将经鉴定正确的重组子委托上海生物工程有限公司测序。DNA序列检索和同源性比较利用“BLAST”工具（NCBI 站点）。所得的序列用DNAMAN 软件进行同源性分析。
3.结果与分析
3.1 胞内共生微生物16S rRNA基因序列的PCR扩增
参照Weisburg等人所设计的通用引物从两种书虱5个种群中均检测出有微生物的共生，
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基因片段的长度约为1500bp, 与16S rRNA基因理论值大小相符（图1）。这两种书虱五个地里种群体内共生菌的16S rRNA基因序列在GenBank的登录号分别为DQ407743，
DQ407744，DQ407745，DQ407746和DQ407747。
测序结果表明河南郑州无色书虱体内的共生菌的16S rRNA基因序列长度为1514bp, 重庆铜梁无色书虱体内共生菌的16S rRNA基因序列长度为1512bp，其余三个嗜卷书虱地理种群体内共生菌的16S rRNA基因序列长度均为1462bp。同源性分析比较表明三个嗜卷书虱地理种群体内共生菌的16S rRNA基因同源性高达99﹪以上。两个无色书虱体内共生菌的16S rRNA基因同源性较低，仅为76%。采自河南郑州的无色书虱与嗜卷书虱三个地理种群体内的共生菌的16S rRNA基因同源性为78%（图2）。
另外，利用NCBI站点上的BLAST工具进行序列检索和同源性比较后发现三个嗜卷书虱地理种群体内共生菌的16S rRNA基因序列与属α-proteobacteria的Rickettsia及Wolbachia pipientis同源性较高，而河南郑州无色书虱体内共生菌的16S rRNA基因序列与Pseudolynchia canariensis同源性较高，其次与隶属于γ-proteobacteria的Pseudoalteromonas 属的细菌同源性较高。重庆铜梁无色书虱体内共生微生物的16S rRNA基因序列与乳球菌属细菌的同源性较高。
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4.讨论
嗜卷书虱三个地理种群体内共生菌的16S rRNA基因序列的长度一致，同源性达到99﹪以上，可以肯定是同一个种，至于其中的少数碱基不同，有可能是PCR扩增时的错配，也可能是不同的共生菌种群所致。由于16S rRNA基因序列比较保守，这需要研究进化更快的基因证实。嗜卷书虱三个地理种群体内共生菌的16S rRNA基因序列与Rickettsia及Wolbachia pipientis同源，有可能属于Wolbachia属，这尚需进一步研究证实。
嗜卷书虱和无色书虱是目前粮仓中的优势害虫种群，尤其是营孤雌生殖的嗜卷书虱，由于其繁殖极快，更是难于防治。已有学者证实Wolbachia参与了不少于40多个物种的孤雌生殖[14]，而嗜卷书虱的孤雌生殖也有可能与体内的微生物共生有关，但这还需要进一步的实验证明。无色书虱营两性生殖，本文中的无色书虱两个地理种群体内共生菌的种类及其对宿主的影响尚有待深入研究。
另外，在Wolbachia扩散的同时，能够带动与之相联系的其他细胞质因子，如线粒体等，在宿主群体中传播[15]。本研究的结果为进一步深入研究书虱地理种群的遗传分化与共生菌的协同进化提供了基础资料。
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16S rRNA gene sequences analysis of the bacterial
endosymbionts in two Liposcelis species (Psocoptera)
Ziying Wang, JinJun Wang
(Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering, College of Plant Protection,
Southwest University, Chongqing 400715, China)
Abstract
The 16S rRNA sequences of the bacterial endosymbionts from five geographic populations of two psocid species, Liposcelis bostrychophila and L. decolor was analyzed. The analysis showed that the sequence homology among three L. bostrychophila geography populations was great (>99%). However, the homology between two L. decolor geography populations was lower (76%). The current study has provided some basic data for investigation the evolution relationship between the endosymbionts and their hosts.
Keywords: psocids, endosymbionts, 16s rRNA, gene sequence
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