实验十三质粒DNA的提取与鉴定
一实验目的
1.了解分光光度计测定DNA含量的原理和方法。
2.熟悉质粒的基本特性及质粒DNA提取的基本原理。
3.掌握碱变性法提取质粒DNA的基本操作过程。
二实验原理
质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。
质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA复性。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。所以，SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境就会变性。然后，用酸性乙酸钾中和溶液碱性使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA由于分子巨大在短时间内难以复性。离心后，质粒DNA将留在上清中，染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。
测定DNA浓度的方法有两种：一是利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；一是利用溴化乙锭荧光强度法测定样品中溴化乙锭发射的荧光强度来计算核酸的含量。（1）紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm处的吸收峰即可对DNA进行定量。一般在中性pH环境条件下进行测定，此方法常用于测定比较纯净的DNA样品。（2）溴化乙锭荧光强度法：溴化乙锭能与DNA结合并嵌入双链中，当受紫外光照射时会激发产生荧光，且荧光的强度与DNA含量成正比。
三药品器材
一器材
1.电泳仪（包括直流电源整流器和电泳槽两部分）
2.台式离心机与高压灭菌锅
3.超净工作台、摇床和各式加样枪
二试剂
1.溶液Ⅰ
50mmol/L葡萄糖
10mmol/L EDTA，20mmol/L
20mMTris-HCl pH8.0
100mg/ml RNase A（抽质粒时现加）
溶液Ⅰ可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf/in2（6.859×104Pa）高压下蒸汽灭菌15分钟，40C冰箱贮存（注：不能将RNase A加入溶液Ⅰ中一起灭菌，RNase A用时现加）。
2.溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L NaOH贮存液现用现稀解）
1%SDS（临用前用10mol/L SDS贮存液现用现稀解）
3.溶液Ⅲ
60mL 5mol/L 醋酸钾，5ml 冰醋酸，28.5mL H2O
4.TE缓冲液
10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA（pH8.0）
5.100%乙醇，70％乙醇
6.上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚兰，40％(W/V)蔗糖水溶液或30％的甘油
7.5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液
445 mmol/L Tris碱， 445 mmol/L 硼酸盐， 10 mmol/L EDTA
称取54g Tris碱、27.5g 硼酸溶于500ml蒸馏水中，加入20 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）混匀，补加蒸馏水至1000ml，40C冰箱贮存。
8.5×Tris-乙酸（TAE）缓冲液
2mol/L Tris碱，1mol/L 乙酸，100 mmol/L EDTA
称取242g Tris碱溶于500ml蒸馏水中，加入57.1 ml冰乙酸（17.4 mol/L）及200ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）混匀，补加蒸馏水至1000ml，40C冰箱贮存。
三材料
1.含有质粒大肠杆菌
2.琼脂糖
四实验方法
一、质粒DNA的提取
1.培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37℃振荡培养12～16小时，到细菌对数生长期即可收获;
2.取3ml细菌培养液（分2次，每次1.5ml）于Eppendorf
管中，10，000 × g离心1分钟，弃上清液（尽可能完全）；
3.加入100ul冰预冷的溶液Ⅰ，剧烈振荡使细胞完全重悬；
4.加入200ul新配制的溶液Ⅱ，快速颠倒4次，轻轻混合，将离心管放置于冰上；
5.加入150ul冰预冷的溶液Ⅲ，温和振荡10秒钟使溶液Ⅲ均匀地分散在细菌裂解物中，置冰浴放置3～5分钟；
6.12，000 × g 离心5分钟，将上清液移入另一离心管中；
7.加等量酚：氯仿，振荡混匀，用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管；
8.加2倍体积的 100％乙醇混匀，于室温净置5分钟沉淀双链DNA；
9.用台式高速离心机
于40C、12000r/min离心5min；
10.小心倒弃上清，将离心管倒置于滤纸上将剩余液体滴尽；
11.用1ml70％乙醇于40C洗涤双链DNA沉淀，按步骤11去上清，在空气中使沉淀干燥10分钟；
12.取50ul含胰Rnase A（20ug/ml）无Dnase的TE重新溶解质粒DNA，于-200C冰箱贮存备用。
二、质粒DNA含量测定
1.取2ul提取的质粒DNA，加入98ul蒸馏水对待测DNA样品进行1:50倍(或更高倍数的稀释);
2.蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。
3.加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50mg /ml双链DNA，33mg /ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染
4.记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下:
dsDNA=50×(OD260) × 稀释倍数（注：浓度单位为mg /ml）
三、质粒DNA的琼脂糖电泳
1.琼脂糖凝胶的制备:称取05g琼脂糖，置于三角瓶中，加入50ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一个小烧杯等，将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂糖溶解。
2.胶板的制备:取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条(宽约1cm)，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，小心地倒入有机玻璃内槽，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的电泳槽中使用。
3.加样:用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个加样头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约15～20 ul。在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入6ul 的 1 kb DNA ladder （50ng/ul ）。
4.电泳（带上手套操作）:加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；建议在80～100V的电压下电泳；当溴酚兰移动到距离胶板下沿约1cm处停止电泳；将凝胶放入溴化乙啶（EB）工作液（0.5ug/ml左右）中染色约20min。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm（两电极间的距离）。电泳温度视需要而定，对大分子的分离，以低温较好，也可在室温下进行。在琼脂糖凝胶浓度低于0.5%时，由于胶太稀，最好在4℃进行电泳以增加凝胶硬度。
5.观察与拍照:在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。紫外光激发30s左右，肉眼可观察到清晰的条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。拍照电泳图谱时，可采用快速凝胶成象系统。
五注意事项:
1.收获细菌应在其对数生长期，此时细菌生长活跃，死菌较少，质粒产量高。
2.质粒提取过程中，溶液Ⅱ应现用现配，不亦贮存。
3.在质粒提取的整个过程中都应特别注意DNase污染，防止质粒DNA被DNase水解。
4.质粒提取过程复杂，在抽质粒前一定要充分作好准备，将器具、离心管、枪头等消毒。
5.质粒DNA进行琼脂糖凝胶电泳时，要特别注意EB的使用，因为EB是一种诱变剂，有致癌作用，操作时戴塑料或乳胶手套。
六思考题:
1.质粒抽提用具、试剂为何要高压灭菌？
2.溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的作用是什么？
3.质粒抽提取过程为何要防止DNA酶污染？
4.细菌收获的最佳时期是什么时期？
5.质粒DNA电泳时为何要加EB？为何又要特别小心？
6.质粒DNA的电泳图谱为何有时只有1条带谱，有时又有2～3条带谱？为什么？
质粒DNA的提取和纯化实验报告
实验一、质粒DNA的提取和纯化 一、实验目的： 1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。 2、初步了解DNA纯化的原理。 二、实验原理 1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 三、实验步骤 1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管） 2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。 3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体） 4、重复一次第三步的过程 5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1 100微升，剧烈震荡打散菌体
质粒DNA的提取与鉴定 实验日期2020年5月14日室温25°C 成绩 一、实验报告摘要 【实验题目】 质粒DNA的提取与琼脂凝胶电泳鉴定 【实验目的】 1、掌握质粒提取原理和各种试剂的作用。 2、掌握琼脂糖凝胶电泳原理和操作。 二、实验原理 1、质粒： 质粒是独立存在于染色体外，能自主复制并能稳定遗传的一种环装双链DNA，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。细菌质粒是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内利用宿主细胞的复制机构复制质粒自身的DNA 2、琼脂糖凝胶电泳： 琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法之一，该技术操作简便，快速。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kb的DNA。此外，直接用低浓度的核酸染料进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。琼脂糖凝胶通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。 三、操作要点：
（1）质粒DNA的提取 1、收取细菌：将4mL细菌培养液分为2次加入2mL的塑料离心管(子弹头)内，每次以12000r/min离心1min(注意平衡)弃去上清液。 2、加入100uL用冰预冷的溶液I，用移液枪将细菌沉淀打散成为悬浮液。(溶液I放置冰中) 3、加入200uL溶液II，盖紧盖口，翻转离心管5次，充分混合内容物，避免振荡，将离心管置于冰上。 4、加入150uL用冰预冷的溶液III，盖紧盖口，翻转离心管，温和摇匀直至粘稠状的细菌裂解物出现，置于冰上5分钟。(溶液放置冰中) 5、用微量离心机12000r/min离心5分钟。取上清液移到另一离心管。 6、加入等量的酚:氯仿(1:1)混合液，轻轻混匀，12000r/min离心7分钟，将上清液收集到新的离心管中。 7、加入2倍体积100%乙醇沉淀DNA，轻轻混匀，1200 0r/min离心5分钟，弃去上清液，倒置在滤纸上干燥，漓尽液体。 8、用1m170%乙醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空气干燥10min。 9、用50uL的无菌水溶解质粒DNA 。 （2）琼脂凝胶电泳分离鉴定 1，制胶。将电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中熔化，混匀，冷却至55°C，加入EB染料，倒入已封好的凝胶灌制平台上，插上样品梳。 2.加入10u1的6x加样缓冲液到DNA样品，混匀，然后用移液器取50u1样品加入样品孔中。(不要漫出加样孔) 3.接通电极，在120V电压下进行电泳20min-30min 。 4.当加样缓冲液中的溴酚兰迁移至足够分离DNA片段 的距离时，关闭电源。 5.已染色的凝胶可以直接在紫外透射仪上观察或照相 四、实验结果： 成功分离DNA片段，能看到超螺旋质粒和单缺口质粒的条带。
DNA的粗提取与鉴定 一、选择题共15小题。 1．有时候，由于实验材料用品所限而需要设法替代。下列各项中正确的是（） A. 做植物细胞有丝分裂实验时，可用蒜叶代替洋葱 B. 做植物细胞质壁分离和复原实验时，可用30%的食盐溶液代替30%的蔗糖溶液 C. 做叶绿体色素提取和分离实验时，可用乙醇代替丙酮 D. 做DNA粗提取与鉴定实验时，可用新鲜猪血代替鸡血 2．在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是 A．稀释血液，冲洗样品B．使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出C．使血细胞破裂、增大DNA溶解量D．使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA 3、下列操作中，对DNA 的提取量影响较小的是 A ．使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA 等核物质 B ．搅拌时，要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动 C ．在析出DNA 黏稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中黏稠物不再增加 D ．在用酒精沉淀DNA 时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却 4．在实验中，有两次DNA的沉淀析出，其依据的原理是 ①DNA在NaCl的物质的量浓度为0.14 mol/L时溶解度最低②DNA在冷却的体积分数为95%的酒精中能沉淀析出 A．两次都是①B．两次都是② C．第一次是①，第二次是②D．第一次是②，第二次是① 5．向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是 A．加快溶解DNA的速度B．加快溶解杂质的速度 C．减少DNA的溶解度，加快DNA析出D．减少杂质的溶解度，加快杂质的析出6．对三次过滤的叙述中，不正确的是 A．第一次过滤后，核物质存在于滤出的固体物中 B．第二次过滤后，使用多层纱布，DNA存在于纱布上的黏稠物中 C．第三次过滤后，DNA存在于滤液中，可进一步除去非DNA物质 D．上述B、C均正确 9．在此实验中，具有和蛋白水解酶相似作用的物质是 A．蒸馏水B．NaCl溶液C．NaOH溶液D．盐酸10、在DNA提取实验中有三次过滤： （１）过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液（２）过滤含粘稠物的0.14mol/LＮaCl溶液（３）过滤溶解有ＤＮＡ的２mol/LＮaCl溶液以上三次过滤分别为了获得 Ａ、含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含ＤＮＡ的滤液 Ｂ、含核物质的滤液、滤液中ＤＮＡ粘稠物、含ＤＮＡ的滤液 Ｃ、含核物质的滤液、滤液中ＤＮＡ粘稠物、纱布上的ＤＮＡ Ｄ、含较纯的ＤＮＡ滤液、纱布上的粘稠物、含ＤＮＡ的滤液 11 ．在“DNA 的粗提取实验”中，有两次DNA 的沉淀析出，其依据的原理是 ①DNA 在物质的量浓度为0 . 14mol / L 的氯化钠中的溶解度最低 ②DNA 在冷却的体积分数为95 ％的酒精中能沉淀析出 A ．两次都是① B ．第一次是①，第二次是② C．两次都是② D ．第一次是②，第二次是① 12. DNA 的粗提取和鉴定实验，与下列哪项原理无关 A . DNA 在0.14mol / L NaCl 溶液中的溶解度最低 B . DNA 易被龙胆紫染成紫色 C ．在DNA 溶液中加入二苯胺，加热后产生蓝色 D ．加入95 ％的冷酒精，DNA 会从溶液中析出
分子生物学实验报告 题目：质粒DNA的提取、纯化与鉴定 姓名：学号：班级：时间： 一、实验目的： 1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 二、实验原理： 1.质粒DNA的提取——碱变性提取法： 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。 2.凝胶电泳进行DNA分离纯化： 电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可
实验DNA的粗提取与鉴定 目的要求 1.了解实验原理。 2.学会DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。 3．通过本实验培养实验操作能力和观察能力。 实验原理 1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14mOl／L时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 注意事项 1.步骤3析出含DNA的黏稠物中，蒸馏水要沿烧杯内壁缓缓加入，不能一次快速倒入。 2.实验中有多个步骤都要用玻璃棒进行搅拌，但是在不同的步骤中玻璃棒的用法不同。 实验用具 鸡血细胞液（5～10mL）；体积分数为95％的冷酒精，蒸馏水，质量浓度为0．1g／mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2mol／L和0．015mol／L的NaCl溶液，二苯胺试剂；烧杯（100mL，1个，50mL，500mL，各2个），漏斗，试管（20mL，2个），玻璃棒，滴管，量筒（100mL，1个），纱布，镊子，滤纸，铁架台，铁环，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，试管夹。 课时安排一课时 课前准备 制备鸡血细胞液，方法是：将质量浓度为0.1g／mL的柠檬酸钠溶液100mL，置于500mL烧怀中，注入新鲜的鸡血（约180mL），用玻璃棒搅拌，使其充分混合，以免凝血。静置于冰箱内一天，使血细胞自行沉淀。（也可以用离心机离心2 min（转速1000转/分）。用吸管吸去上清液。 板书（提前写好） DNA的粗提取与鉴定
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）1 2.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA恢复活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。 3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被
一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳 二、实验原理： 1.质粒DNA的提取： 质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。 （1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理： 碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。 （2）四种溶液作用及原理： ①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉，从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。另外也可保证溶菌酶活性。 ②Solution II的作用：提供碱性条件，pH高达12.6，使大肠杆菌瞬间裂解，促使染色体DNA和质粒DNA变性。所含离子型表面活性剂十二烷基酸钠（SDS）可使细胞膜、核膜发生破裂，充分溶解膜蛋白。同时，磺酸基与蛋白质形成复合物而变形沉淀。 ③Solution III的作用：为KAc-HAc缓冲液。该溶液所含有的高浓度钾离子与溶液体系中的十二烷基磺酸钠发生反应形成十二烷基磺酸钾，从而将与之结合的绝大部分大肠杆菌蛋白质以及很长的基因组DNA一起沉淀，与质粒分离开来；另外溶液III所含有的醋酸中和溶液Ⅱ的强碱性，使pH降至中性，因为长时间的碱性条件会打断DNA；基因组DNA一旦发生断裂，只要是50-100kb大小的片段，就没有办法再被PDS共沉淀，这样就跟质粒DNA共存了。而且在整个质粒DNA 的提取过程中，沉淀DNA时用无水乙醇及在高盐、低温条件下进行都是为了用化学或物理手段将基因组DNA分子和蛋白质发生变性、在体系中的溶解度降低，较充分的分离提纯出实验所需的质粒DNA
实验十一 DNA 的粗提取与鉴定 教学目的 1． 初步掌握DNA 粗提取和鉴定的方法。 2． 观察提取出来的DNA 物质。 实验原理 1． DNA 在NaCl 溶液中的溶解度是随NaCl 的浓度变化而改变的。DNA 在0．14mol/L 的NaCl 溶液中的溶解度最低，据此可使溶解于NaCl 溶液中的DNA 析出。 2． DNA 不溶于酒精溶液，但细胞中某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的DNA 。 3． DNA ＋二苯胺??→?沸水浴蓝色（用于DNA 的鉴定） 实验步骤 1．材料制备 0.1G/ml 柠檬酸钠100ml 500ml 烧杯→玻璃棒搅拌→1000r/min 离心2min →吸去上清液→ 活鸡血180ml 即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天使鸡血细胞自行沉淀） 2．方法步骤 取血细胞液5-10ml ＋20ml 蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速搅拌 （1）提取血细胞核物质 纱布过滤，滤液中含DNA 和其他核物质，如蛋白质 原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞破裂 （2）溶解核内DNA ：滤液＋2mol/L NaCl 溶液40ml ，玻璃棒沿一个方向搅拌 （3）析出含DNA 的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl 溶液相当于稀释到0．14mol/L ） （4）滤取含DNA 的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA 的粘稠物留在纱布上 （5）（纱布上的）DNA 粘稠物再溶解： 20ml2mol/L NaCl 溶液 50ml 烧杯， 上述粘稠物 缓慢搅拌3 min （6）过滤含DNA 的2mol/L NaCl 溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA （7）提取含杂质较少的DNA ：上述溶液＋95%酒精，缓慢搅拌，出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝装物卷起。 （8）DNA 鉴定： 实验关键： 本实验成功的关键是获取较纯净的DNA ，因此应注意： 1．充分搅拌鸡血细胞液。DNA 存在于鸡血细胞核中。将鸡血细胞与蒸馏水混合以后，应用 玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使血细胞加速破裂，并释放出DNA 2．沉淀DNA 必须用冷酒精。实验前必须准备好大量95%的酒精，并在冰箱中（5℃以下）至少存放24小时。 3．正确搅拌含有悬浮物的溶液。在第（3）、（5）步骤，玻璃棒不要直插烧杯底部，且搅拌
DNA 的粗提取与鉴定 实验目标 初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。 实验原理 DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。当氧化钠的物质的量浓度为0. 14 ml/L时DNA的容解度最低。利用这原理，可以使溶解在氧化钠溶液中的DNA析出。 DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原 理,可以进步提取出含杂质较少的DNA。 DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色,因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 实验器具 鸡血细胞液(5~ 10 mL)。 铁架台、铁环、镊子、三角架、酒精灯、石棉网、载玻片、玻璃棒、滤纸、滴管、量筒(100 mL,1个)、烧杯(100 mL,1个;50mL,500 mL各2个)、试管(20 mL,2个)、漏斗试管夹、纱布。 体积分数为95%的冷酒精溶液(实验前置于冰箱内冷却24 h)蒸馏水、质量浓度为 0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液、物质的量浓度分别为2 mol/L和0.015 mol/L 的氯化钠溶液、二苯胺试剂。 实验探究与过程 实验前需要制备鸡血细胞液(由教师完成),制备的方法是:取质量依度为0.1gml 的柠檬酸钠济液(抗凝剂)100 ml,置于500 ml烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血(约 180mt)注人烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。然后，将血液倒人离心管内,用1000 r/min(转每分)的离心机离心2 min,此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时,用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。(如果没有离心机，可以将烧杯中的血液置于冰箱内，静置天,使血细胞自行沉淀。) 1.提取鸡血细胞的细胞核物质 将制备好的鸡血细胞液5~10 mL,注人到50 ml,烧杯中。向烧杯中加人燕馏水探 20 m,同时用坡璃棒沿一个方向快速搅拌5 min ，使血细胞加速破裂。然后,用放有纱布的漏斗将血细胞液过德至500ml,的烧杯中,取其滤液。 2.溶解细胞核内的DNA 将物质的量浓度为2 mol/L的氯化钠溶液40 mL加人到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1 min, 使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。 3.析出含DNA的黏稠物
姓名宿智新学院生命科学学院班级 11级生工2班科目分子生物学实验学号 201100140155 第 8 组 质粒DNA的提取、纯化与鉴定 摘要：本实验利用碱变法从大肠杆菌DH5α（E.coli DH5α）中提取pUC19质粒，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。同时通过对质粒DNA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DNA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。 关键词：碱变法质粒电泳 实验目的： 1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。 2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。 3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。 4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。 5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。 实验原理： 1.质粒DNA的提取——碱变性提取法： 提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。 碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。 在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH值4.6的KAc(或NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。
DNA的粗提取与鉴定 （2012江苏）18. 下列关于“DNA 粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是（） A. 洗涤剂能瓦解细胞膜并增加 DNA 在 NaCl 溶液中的溶解度 B. 将 DNA 丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝 C. 常温下菜花匀浆中有些酶类会影响 DNA 的提取 D. 用玻棒缓慢搅拌滤液会导致 DNA 获得量减少 【答案】C 【解析】洗涤剂能够瓦解细胞膜，但不能增加DNA的溶解度，A错；将 DNA 丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴中变蓝，不需要冷却，B错；常温下菜花匀浆中有些酶类可破坏DNA，而影响DNA的提取，C正确；用玻棒缓慢搅拌滤液并不影响DNA的含量，而在粗提取时，缓慢撑拌有利于DNA附着，D错【试题点评】本题主要是对实验内容的考查，主要是涉及“DNA 粗提取与鉴定实验”这一实验中的原理、方法和操作步骤等内容。属于实验考查中比较基础的内容。 （2011江苏）19．在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，相关叙述正确的是A．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14 mol/L，滤去析出物 B．调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质 C．将丝状物溶解在2 mol/L NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色 D．用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同 【答案】B （2010江苏）32．(7分)某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下： 材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份．每份l0 g。剪碎后分成两组，一组置于20℃、另一组置于—20℃条件下保存24 h。 DNA粗提取： 第一步：将上述材料分别放人研钵中，各加入l5 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤．取滤液备用。 第二步：先向6只小烧杯中分别注人10mL滤液，再加人20 mL体积分数为95％的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。 第三步：取6支试管，分别加入等量的2 mol／L NaCl溶液溶解上述絮状物。 DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂。混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅,结果如下表。
实验二十一质粒DNA的提取、酶切与鉴定 一、质粒DNA的提取 [原理]分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 [试剂] 1.溶液I： 50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mmol/L Tris-HCl pH8.0;用前加溶菌酶4mg/ml。 2.溶液II： 200mmol/L NaOH 、1% SDS。 3.溶液III： pH4.8醋酸钾缓冲液（60 ml 5mol/L 醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml 蒸馏水） 4.TE缓冲液pH8.0 5.含RNaseA的TE缓冲液：TE缓冲液含20μg/ml RNaseA。 6.苯酚：氯仿（1：1，v/v）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使体积分数为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24：1（v/v）。 7.1×LB溶液 8.100μg/ml氨苄青霉素 [器材] 1.TGL-16型台式高速离心机
2.1.5ml塑料离心管 3.离心管架 4.微量移液器 5.常用玻璃器皿 [操作步骤] 1.培养细菌将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的1×LB中，37℃培养过夜。 2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10 000r/min离心lmin，去掉上清液。加入150μl溶液I，充分混匀，在室温下放置10min。 3.加入200μl新配制的溶液II，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置2min。 4.加入150μl冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置10min。 5.用台式高速离心机，10 000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中。 6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v），振荡混匀，转速10 000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。 7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加0.5ml 70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。 9.加入50μl含RNase A 20μg/ml的TE缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解待用或置-20℃备用。 二、质粒DNA 的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定 [原理]限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。 Ⅱ型限制性内切酶，具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的
ＤＮA的粗提取与鉴定实验 一、实验原理 ①DNA主要存在于细胞核 ②DNA在NaCl溶液中的溶解度,是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为０.１4mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理,可以使溶解在NaCl溶液中的DNA 析出。 ③DNＡ不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的ＤＮＡ。 ⑷ＤNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DＮA的试剂。 二、实验材料和用具 鸡血细胞液(５~10ｍl）;体积分数为95%的冷酒精溶液(实验前置于冰箱内冷却24ｈ）;蒸馏水；质量浓度为0．1g/ml的柠檬酸纳溶液；质量的浓度分别为2mol/L和0．015mｏｌ/L 的氯化纳溶液(新教材不要求0、015的浓度了，都是用的2mｏｌ/Ｌ)；二苯胺试剂;铁架台;镊子;水浴锅;玻璃棒;滤纸;滴管;量筒（１0０ml,一个）；烧杯；(1０0０ｍl，一个，５0ml、100 mｌ、500ｍl各二个）;试管(20ｍｌ,二个）;漏斗;试管夹;纱布。 三、课前准备鸡血细胞液 取质量浓度为０．1g／ｍl的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）1０0ml,置于5００ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ｍｌ）,同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合,以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。(也可以将血液倒入离心管内,用100０r/min(转每分)的离心机离心2miｎ,血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。 四、方法步骤 ①提取鸡血细胞的细胞核物质 将制备好的鸡血细胞液５mL～10mL,注入到５0 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20ｍL，同时用玻璃棒充分搅拌5 ｍin，使血细胞加速破裂。然后，用放有1-2层纱布的漏斗将血细胞液过滤至1０0０mＬ。取其滤液。 ②溶解细胞核内的ＤNA 将氯化钠的物质的量浓度为２mol/L的溶液40ｍL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀,这时DＮA在溶液中呈溶解状态。
【实验】DNA的粗提取与鉴定 一、实验原理 1.DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl浓度的不同而不同。当NaCl的浓度为0．14mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。 2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的其他许多物质溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取含杂质较少的DNA。 3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色；DNA还有遇甲基绿溶液被染成蓝绿色的特性。上述两种方法均可用于鉴定DNA的存在。 二、材料用具 鸡血细胞液；铁架台，铁环，镊子，三脚架，酒精灯，石棉网，载玻片，玻璃棒，滤纸，滴管，量筒（100mL，1个），烧杯（100mL，1个，50mL、500mL各2个），试管（20mL，2个），漏斗，试管夹，纱布；体积分数为95%的酒精溶液（实验前置于冰箱内24h），蒸馏水，质量浓度为0.1g/mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2mol/L 和0.015mol/L的氯化钠溶液，二苯胺试剂 1.从鸡血细胞核中提取的物质是DNA吗？ 在鸡血细胞中加入蒸馏水，并且搅拌，利用渗透作用原理使鸡血细胞破裂，搅拌进一步促进了鸡血细胞的破裂，于是释放出其中的DNA，当然也有少量的RNA，还的蛋白质。因此，释放出的物质是DNA、RNA和蛋白质的混合物，不仅仅只有DNA。 2.怎样提高血细胞因低渗而破裂的效率？ 血细胞的细胞膜对低渗溶液有一定的抵抗能力，这称为渗透脆性。一般而言，血细胞与蒸馏水相混合而使血细胞处于极度的低渗环境之中，细胞因大量失水而致最终破裂并释放出胞内物（包括细胞核）。为促进细胞在低渗条件下破裂，可以辅以快速而有力的搅拌，使之受机械震荡而更易破裂。
质粒 DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定 一、实验目的 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法； 3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。 二、实验原理 1.PCR(多聚酶链式反应 ) 在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA ，使目的 DNA 按 2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A. 变性：加热反应系统至95℃，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链。 B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（ 35－70℃, 一般低于模板 Tm 值的 5℃ 左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链。 C. 延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq 酶作用下，以dNTP 为原料，引物为复 制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒 DNA 的提取与制备 (1). 碱裂解法： 染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异： A. 高碱性条件下，染色体DNA 和质粒 DNA 均变性；
B. 当以高盐缓冲液调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2). 离心层析柱： A. 硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA ，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。 3.质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 : DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰 C. A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反应DNA 的纯度； A260/A280=1.8DNA 纯净 A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质 A260/A280>1.8含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。 4.质粒 DNA 的酶切鉴定： 限制性内切酶是DNA 重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与 一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA 序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并 在结合位点切割双链DNA 。
DNA的粗提取与鉴定实验 一、教学背景分析 【教材分析】 生物体的性状之所以能够遗传给后代，是由于生物体内具有DNA或RNA这些遗传物质。通过必修2《遗传与进化》的学习，学生已经学习了证明DNA是主要的遗传物质的实验证据。那么DNA究竟是什么样的呢？本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理，使学生对DNA有一定的感性认识。 “DNA的粗提取与鉴定实验”在《普通高中生物课程标准》和《考试大纲》对实验内容考查的要求中属D级要求，新课标强调能力培养，高考对实验能力的考核比重也逐年加大。学生通过本次实验探究活动，可进一步提高动手能力和创新能力。 【学情分析】 通过必修2《遗传与进化》的学习，学生已经了解了证明DNA是主要的遗传物质的实验证据，知道生物体的形状之所以能够遗传给后代，是由于生物体内具有DNA或RNA这些遗传物质。通过本课题的学习，使学生对DNA有一定的感性认识。 二、教学目标 【知识目标】 本实验通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，理解DNA粗提取方法以及DNA鉴定的原理内容。 【能力目标】 1.实验中能运用已有的知识，选择实验材料用具； 2.通过具体的材料，学生尝试课题研究，体验科学探究的一般过程。 3.初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法 4.在对实验原理、步骤的理解和分析过程中发展学生的科学思维。 5.熟悉粗提取生物大分子的的一般性方法 【情感态度与价值观目标】 1.通过小组之间的分工合作，逐渐养成协作精神； 2.通过科学与数学的整合，逐渐形成简约、严谨的思维品质；