表达载体的构建方法及步骤
一、载体的选择及如何阅读质粒图谱
目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：
（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而
真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+
（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段
（4）P/E 启动子/增强子
（5）Terms 终止信号
（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目
的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：
【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：
（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载
体）；
（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr （试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。
如何阅读质粒图谱
第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）
第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。
（1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。
（3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。
（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活
（5）hygr 使潮霉素β失活。
第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些酶切位点以外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步：再看外源DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb 的外源DNA 片段。一般来说，外源DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转
化效率越低。
第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。
第六步：启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号
（1）启动子－促进DNA 转录的DNA 序列，这个DNA 区域常在基因或操纵子编码序列的上游，是DNA 分子上可以与RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。
（2）增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子－负增强子，负调控序列。
（3）核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD 序列。
（4）转录终止序列（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列，此位点down－stream 有一段GT 或T 富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA 的保守序列，此位点down－stream 有一段GT 或T 富丰区，这2部分共同构成poly（A）加尾信号。
质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA 链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.根据表达宿主不同，构建时所选择的载体也会不同。
二、目的基因的获得
一般来说，目的基因的获得有三种途径：
调取基因：根据目的基因的序列，设计引物从含有目的基因的cDNA中通过PCR的方法调取目的基因，链接到克隆载体挑取单克隆进行测序，以获得想要的基因片段，这种方法相对成本较低，但是调取到的基因往往含有突变，还有不同基因的表达丰度不同，转录本比较复杂，或是基因片段很长，这些情况都
很难调取到目的基因。
全基因合成：根据目的基因的DNA序列，直接设计合成目的基因。此方法准确性高，相对成本会高一些，个人操作比较困难，需要专业的合成公司完成。优点是可以合成难调取及人工改造的任何基因序列，同时可以进行密码子优化，提高目的基因在宿主内的表达量。
三、克隆构建
目前，克隆构建的方法多种多样，除了应用广泛的酶切链接以外，现在还有很多不依赖酶切位点的克隆构建方式。下面具体说一下双酶切方法构建载体的步骤。
实验材料
实验试剂
试剂名称生产厂家
载体pCDNA3.1 Transheep
大肠杆菌菌株DH5αTiangen
限制性内切酶Fermentas
T4连接酶Fermentas
质粒DNA小,大量抽提试剂盒Axygen
凝胶回收试剂盒Axygen
琼脂糖Biowest
DNA ladder Fermentas
（2）X基因慢病毒载体的构建
X基因基因由Transheep全基因合成，构建于载体PUC57中。
PUC57-X基因EcoRI/BamHI酶切结果：
Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder (从上至下依次为：3000bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp,
500bp, 250bp,100bp)
Lane2：PUC57-Neurod1 EcoRI/BamHI酶切产物
酶切完成后进行胶回收
2. 载体用pCDNA
3.1双酶切，酶切体系如下。
20ul酶切体系37度3小时
4ul pCDNA3.1载体（500 ng/ul）
1ul BamHI
1ul EcoRI
2ul 10×buffer
12 ul H2O
酶切完成后胶回收（见附录）
Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder (从上至下依次为：12000bp, 8000bp, 6000bp, 5000bp, 4000bp, 3000bp, 2500bp, 2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp)
Lane2：pcDNA3.1载体酶切回收产物
处理好的目的片段与载体连接反应体系：
6ul PCR 酶切回收片段（约50ng/ul）
1ul 酶切好的载体（约50ng/ul）
2ul ligase buffer
1ul T4ligase
10ul H2O
以上连接液在16℃过夜。
转化(感受态细胞: DH5a),具体步骤见附录转化部分。
抗性: Amp; 37℃，培养过夜
转化后X基因分别平板挑菌, 37℃250转/分钟摇菌14小时，PCR鉴定后，将阳性菌液送上海权阳生物技术有限公司测序。
X基因慢病毒载体单克隆菌落PCR鉴定（使用载体通用引物,PCR条带大小应
比实际大200bp左右）：
Lane1：GeneRay 1kb DNA Ladder
(从上至下依次为：2000bp, 1500bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp,100bp)
Lane2-4：X基因菌落鉴定PCR产物
一．CARP质粒的扩增与测序 1.CARP带有Flag标记的质粒的扩增（plasmid 载体） 试剂配置 LB培养基配方1000 ml: 胰蛋白胨TRYPTONE 10 g 酵母提取物YEAST EXTRACT 5 g NaCl 10 g 加去离子水950 ml用5 mol/l的NaOH（200ul）调pH 到7.0,灭菌 LB固体培养基（Ampicllin抗性）200 ml 胰蛋白胨TRYPTONE 2 g 酵母提取物YEAST EXTRACT 1 g NaCl 2 g Agarose 琼脂粉 3 g 加去离子水180 ml用5 mol/L的NaOH（40ul）调pH 到7.0,灭菌. 等温度降至55℃左右时，按终浓度5 μg/ml(200ul)加入氨苄青霉素，混匀，倒入到灭菌的平皿中，待凝固后，倒扣于4℃冰箱中备用。 DH5α感受态细胞的制备 1、LB培养基的平皿中挑取单克隆菌体接种到5 ml液体培养基中培养过夜。14-16h 2、稀释100倍，取0.5 ml菌液50 ml到LB培养基中，37℃振摇 3、2 h后，不断测定培养菌液的OD590值，当光吸收到达0.3－0.5时，取出菌液。 4、菌体用低温离心机2 000 rpm 4℃，10 min。 5、弃去上清，加入2ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； 6．4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 7．弃去上清，加入2ml预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮； 8.200ul分装保存-20摄氏度（-4摄氏度） CARP质粒转化大肠杆菌 1、－70℃储存的DH 5α感受态菌种一支放到冰上融化，刚融未融时，加入质粒DNA 10 ng左右，冰浴30 min.
原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达； 带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子 在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起
实验目的 1. 学习在实现DNA 体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对 载体和目的DNA 进行切割，产生利于连接的合适末端。 2. 学习设计构建重组DNA 分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA 酶切的操作。 3. 学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外DNA 分子的 技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl 2制备感受态细胞的方法。 5. 学习掌握热击法转化 E.coli 的原理和方法。 6. 学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 7. 学习并掌握使用Omaga 试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段。 实验原理： （一）限制性核酸内切酶的酶切反应 体外构建重组DNA 分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA 时不能得到完整的目的基因。其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。常用的酶切 方法有双酶切法和单酶切法两种。本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。 在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA 片段以相反方向插入载体分 子中，或目的DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。单酶
切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的 因素是反应温度和缓冲液的组成。在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进 行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。 酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA 数量要适当。另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA 的量，以及相应的所需酶的量。一般的，酶切0.2~1.0 μg的DNA 分子时，反应体积约为15~20 μg，DNA 的量越大，反应体积可按比例适当放大。酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h 完全酶解1μg 的pBR322 DNA 分子。如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应 总体积的10% 。因为限制性核酸内切酶一般是保存在50% 甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5% ，就会抑制酶的活性。 （二）载体与外源DNA 的连接反应 连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA 片段与载体分子连接的方法即DNA 分子体外重组技术主要依赖限制性核酸内切酶和DNA 连接酶催化完成的。DNA 连接酶催化两双链DNA 片段相邻的5’-磷酸和3’-OH 间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA 连接酶是来自T4 噬菌体的T4 DNA 连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。连接反应时，载体DNA 和外源DNA 的摩尔数之比控制在1:（1~3 ）之间，可以有效地解决DNA 多拷贝插入的现象。实际操作中，反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，平末端适当提高连接反应温度。反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速度增加，所需时间会相应减少，16℃下最常用的连接时间为12-16h 。 （三）感受态细胞的制备及质粒转化
表达载体的构建方法及步骤 令狐采学 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。 一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。 【2】.载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。 【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。 （5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与
构建目的基因的真核表达载体实战操作 最后更新：2010-5-16 阅读次数：451 【字体：小中大】 目的：构建目的基因的真核表达载体 一.PCR扩增得到目的片段 1.引物的设计与合成： 这里有很多血与泪的教训。我前后一共送过九个载体测序，其中居然有五个是引物出错。最后一次挑的两个克隆都是上游引物出错（此上游引物40个碱基），后来和这家引物公司交涉，他们拿走了我的板子，一次送了五个克隆测序，三个是上游引物出错，两个是正确的克隆，60％的出错率。 现在想想，有几点教训： (1)尽量避免长引物的合成。越长意味着出错的几率越大，哪家公司都这样 (2)选择一家质量可靠的公司，千万别在这省钱，引物再贵也花不了多少钱，可一轮构建下来，一测序发现引物错了，不知白扔了多少钱不说，那种心情实在是难以收拾 （3）一旦发现引物有问题，及时换公司，我就让他们拿回去又是纯化又是重新合成过，结果还是错，时间咱耽误不起 2.Pfu酶扩增： （1）扩增效率低的问题： 往往taq酶扩的很好，一换成pfu就是扩不出来。解决办法：a延长延伸时间(我1.2kb用3分15秒才扩出来)，并适当增加循环数;b多试几家的pfu，总有一家能扩出来;c多设计几对引物试试，总有一对能扩出来，因为pfu有外切活性，可否适当的延长引物的3’互补端；d构建中间载体：一旦用某一对引物能扩出来，把此目的片段连接t－easy中间载体，测序正确后，即可以此中间载体做pcr扩增的模板。实践证明以此中间载体为模板的pfu扩增效率远远高于以cDNA为模板。 （2）pfu保真性的问题： 即使是pfu，也会出错。现在各家公司都有号称高保真的pfu酶出售，价格不一。虽然都是pfu，但质量不不见得一样，在都能扩增出来的情况下，选择信誉好的公司的pfu。我用的是一家小公司的pfu，很便宜，100u才80块钱，但我1.2kb的片段却频频出错。所以万不可在酶上省那百十块钱，最后花了大钱不说，还浪费了时间精力。 3．cDNA模板的问题： 在pfu摸条件这一步往往要耗费大量cDNA模板，因此在开始要准备足够的cDNA。100ul，200ul都不为过。新提取的RNA证明很好的话，就再多逆转录几管，我的RNA在－80℃放了两个月再逆转录就扩增不出目的片段了。当然这其中可能有很多原因，酶的问题，RNA 的降解等等，但是当你做PCR做到很烦的时候，发现cDNA模板不够了，又重新养细胞提RNA是一件非常痛苦的事情。 二．酶切的问题： 用于构建的酶切一定要非常充分！ 新买回来的酶要分装，用于“酶切后回收”和“酶切鉴定”的酶要分开。因为用于“酶切鉴定”时，只要能切出来就行了，而用于“酶切后回收再做连接”的酶一定要保证切的充分，才能提高连接效率，更重要的是减少筛选时的麻烦！我有一段时间连挑了三十多个克隆都是空载体，当然一方面怪我没有做载体自连的阴性对照，及时发现这一问题，另一方面酶反复从冰箱拿出来活性下降酶切效率降低，导致大量的载体自身连接。我觉得内切酶这东西还是挺娇气的，所以还是建议大家新酶分装，用于“酶切鉴定”的可稍放松，用于“酶切后回收”的酶一定要尽量减少冻融次数，并尽量减少在室温放置的时间。 三．PCR产物直接酶切：
重组质粒的构建经验 [技巧] 重组质粒的构建经验~~~ 昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。 一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识，不赘述。 2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。 NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6 SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4
表达质粒的构建 一、表达载体的构建 表达载体是指具有宿主细胞基因表达所需调控元件，能使克隆的基因在宿主细胞内转录与翻译的载体。也就是说，克隆载体只是携带外源基因，使其在宿主细胞内扩增;表达载体不仅使外源基因扩增，还使其表达。外源基因在受体细胞内表达与否及表达水平受到许多因素(调控元件)的制约。 1、正确的阅读框架 外源基因编码区在插入表达质粒中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致。外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架中，从而表达融合蛋白，使外源蛋白与宿主蛋白相融合。 2、目的基因有效转录的启动子 启动子是DNA链上一段能与DNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。原核启动子是有两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成的，分别称为-35区和-10区。-35区序列为TTGACA，-10区的序列为TATAAT。两序列之间的最佳间距为17bp。可与RNA聚合酶结合，并指导该酶在正确的转录部位开始合成mRNA。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体必须用原核启动子带动真核基因在原核生物中转录。原核表达载体启动子的转录常常是可以控制的，一般情况下不转录，而受诱导剂诱导时就能转录，带动外源基因的高效表达。 (1) 大肠杆菌的lac启动子是乳糖操纵子的启动子，受lac I编码的阻遏蛋白调节控 制
(2) 大肠杆菌的trp启动子是色氨酸操纵子启动子，受trpR编码的阻遏蛋白 调节控 制 (3) tac启动子，由lac启动子的-10区和trp启动子的-35区融合而成，汇合了lac 和trp两者优点，是一个很强的启动子，受lac I编码的阻遏蛋白调节控制 (4) lacUV5启动子是经紫外线诱变改造的lac启动子，该启动子失去了CAP和cAMP 的证调控，只要有乳糖或IPTG存在时就能够启动转录 (5) 噬菌体的λP启动子是λ噬菌体左、右向启动子，是一个温度敏感的阻 遏蛋、LR 白受温度调控的很强的启动子 (6) T7噬菌体启动子，比大肠杆菌启动子强得多，并且十分专一，只被T7RNA 聚 合酶所识别。pET宿主是大肠杆菌BL21(DE3)，BL21(DE3)是一株带有由lacUV5 启动子控制的T7噬菌体RNA聚合酶基因的溶源菌。 3、转录终止子 为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因干扰表达载体的稳定性，一般要在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA转录终止子。否则合成的mRNA过长，不仅消耗细胞内的底物和能量，而且容易使mRNA形成妨碍翻译的二级结构。 4、mRNA有效翻译的SD序列 在原核生物中，mRNA分子上有两个核糖体结合位点也调节着mRNA的翻译，一个是起始密码(AUG或GUG)，另一个是位于起始密码上游3~11个核苷酸处的由3~9个核苷酸组成的一段保守序列AGGAGGU，称为SD序列。而核糖体和mRNA的结合是
?学术交流?pcDNA3-hN GFb真核表达载体的构建及其表达 邓兴力 杨智勇 董坚 王廷华 徐丹 冯忠堂 【摘要】 目的 构建人神经生长因子β(N GF-β)基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表 达。方法 以R T-PCR从人脑组织总RNA中扩增N GF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD2 NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和 western blot鉴定N GF-β在细胞内的表达。结果 R T-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒 pcDNA3-hN GFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人 N GF-βcDNA完全一致。将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明N GF-β及其 前体proN GF-β能在真核细胞中正确表达。结论 成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hN GFb, 为后续的研究奠定基础。 【关键词】 神经生长因子; 真核表达; 重组质粒; 转染 C onstru ction o f recombinant plasmid pcDN A32hNG Fb and its exp ression DEN G Xing2li,Yang Zhi2yong, DO N G J ian,et al. De partment of N eurosurgery,1st A f f iliated Hos pital of Kunming Medical College,Kunming650032,China 【Abstract】 Objective To construct the eukaryotic expression recombinant plasmid pcDNA3- hN GFb and investigate its expression in L929cells.Methods The cDNA of human nerve growth factor beta subunit(N GF-β)was amplified by R T-PCR from human brain tissue.By gene recombination technique,human N GF-βcDNA was inserted into eukaryotic expression vector pcDNA3.The recombi2 nant plasmid was verified with restriction enzyme digestion and DNA sequencing.Transfected the recom2 binant vector into L929cells with Lipofectamine2000transfection reagent.The expression of N GF-β was analyzed by immunocytochemistery as well as western blot.R esults The R T-PCR product is 750bp specific segment.By restriction enzyme digestion,the recombinant plasmid was digested into 750bp and5.2kb f ragments.DNA sequence result showed the750bp f ragment was identical with human N GF-βcDNA in GenBank.Immunocytochemistery and western blot showed the N GF-βwas expressed successfully in L929cells.Conclusions The recombinant plasmid pcDNA3-hN GFb was constructed successfully,which will provide the foundation for f urther research. 【K ey w ords】 Nerve growth factor(N GF);Eukaryotic expression;Recombinant plasmid;T ransfection 中图分类号:R741 文献标识码:A 文章编号:100926574(2008)022******* 神经生长因子(nerve growt h factor,N GF)是神经营养因子家族中最早被发现也是迄今为止研究得最为深入的细胞生长因子。N GF在体内首先以其前体的形式合成,随后在各种蛋白酶的作用下裂解为成熟体[1]。最近研究表明,N GF前体(p roN GF)具有与成熟N GF相反的生物学活性,其通过作用于p75N TR受体及sortilin受体介导包括神经细胞内的多种细胞凋亡[2-5]。本研究将构建人N GF-β基因真核表达质粒pcDNA3-hN GFb,并研究其在L929细胞中的表达情况,为进一步研究p roN GF的 作者单位:650032昆明医学院第一附属医院神经外科(邓兴力,杨志勇),生物治疗中心(董坚);昆明医学院神经科学研究所(王廷华、徐丹、冯忠堂) 作者简介:邓兴力(1979-),男,博士研究生。研究方向:细胞移植治疗帕金森病的研究。 通讯作者:冯忠堂 fzt@https://www.doczj.com/doc/d618487651.html, 生物学功能奠定实验基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒、细菌与脑组织 真核表达质粒载体pcDNA3由昆明医学院第一附属医院生物治疗研究中心保存;小鼠成纤维细胞系L929、E.coli D H5α由昆明医学院神经科学研究所保存;人脑肿瘤旁组织由昆明医学院第一附属医院神经外科提供。 1.1.2 主要试剂与工具酶 TRIzol,Lipofectamine 2000Reagent,G418,RPM I1640培养基,小牛血清(Invitrogen);Hind,xho,T4DNA Ligase,Calf In2 testine Alkaline Phosp hotase,First Strand cDNA Synt hesis K it,High Fidelity PCR Enzyme Mix(MB I Fermentas);凝胶回收试剂盒,DNA纯化试剂盒,质粒DNA提取试剂盒(OM EGA);DNA MA KER DL2000,DNA MA KERλ-Eco T14(Takara);6×
ALS相关基因蛋白表达载体的构建 材料:含有GST载体pGEX-6p-1的菌（约5kb）；SMN1d（大约1kb）和C9ORF72(大约1.5kb)基因；BamH1和EcoR1酶Cutsmart。 步骤： 一、目的基因的获得 1、引物设计 2、将含有目的基因的质粒进行PCR.( μl) 3、DNA电泳（1g琼脂糖/100m1XlTAE）以检测PCR产物。 0 1 2 3 4 5 6 7 8 4、跑胶并回收 5号和6号（SMN）共40μl全部加到一号孔中 7号和8号(C9ORF72)共40μl全部加到三号孔中 五号孔加5μlMarker
回收： 1、在紫外光下将目的带切下，放入两个EP管中 2、每管中加250μl Binding Buffer, 60℃,7分钟融化 3、将溶化后的胶加入到柱子中；10000xg 1min离心,弃液 4、加300μlBinding Buffer,10000xg 1min离心，弃液 5、加700μlSPW洗两次，10000xg 1min离心，弃液 6、12000xg，2min离心，挥干乙醇 7、超净台内吹2min 8、加30μlddH2O静置1min，10000xg 1min离心 9、重溶解一遍 二、质粒的获得： 1、扩大培养：将菌种接种(20μl)到含有AMP（5μl）的培养基(5ml)上， 37℃摇过夜。 2、提质粒： 1、收集50-100ml过夜培养的菌液10000rpm离心1分钟，尽量 吸除上清 2、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液Ⅰ，使用移液器 或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。 3、向离心管中加入250μl溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌 体充分裂解。注意：①翻转一定要温和，以免污染细菌基因组DNA。 ②作用时间不要超过2分钟，以免质粒受到破坏。 4、向离心管中加入350μl溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次， 充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
构建重组质粒基本方法 1.cDNA编码区片段的PCR扩增 50ul ×2 模版 1 5‘引物 1 3‘引物 1 dNTP 1 10×buffer 5 Taq 1 Milliq H2O 40 2．PCR产物纯化 1、加5倍体积的PB 2、将Spin柱放于2ml收集管上 3、加样液，14Krpm，离心1min 4、弃去排出液 5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min 6、弃去排出液,14Krpm,离心1min 7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中 8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm， 离心1min 3．双酶切 载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n 小时）： 4．双酶切后的载体用试剂盒割胶回收 1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）
2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解 3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中 4.加样液，14Krpm，离心1min 5.弃去排出液 6.加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min 7.弃去排出液,14Krpm,离心1min 8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中 9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2O),静置2min, 14Krpm， 离心1min 5．连接 上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。连接体系如下： 载体 2ul PCR 片段 6ul 10xT4 buffer 1ul T4 DNA ligase 1ul 6．转化 取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。将平板在37℃倒置培养过夜。挑取阳性克隆菌落转划到另一块含有100 ng/ml抗生素的LB平板上，并对之进行编号，37℃倒置培养过夜。 7．菌落原位PCR 挑取转划后长出的阳性克隆菌落，加入3ul细菌DNA提取液破细胞。将 细菌裂解液作为PCR模板，其他PCR组分及PCR条件同上。PCR产物在2% 凝胶上进行电泳分析。 8. QIAGEN试剂盒抽提质粒
重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。 蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。 1）促表达/促溶标签 2）信标标签
3）纯化标签 我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。 4）酶切位点 以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。 标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。 在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。所以其中其中还是有基本的技巧需要掌握。在这里决定将我的心得分享于大家，以期能提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。 在本帖及之后继帖中将以一段PCR获得基因，以NdeI和HindIII位点克隆进入质粒为例来系统剖析重组质粒的构建中基本策略与技巧。这作的经验积累与心得。所涉及内容如下： 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题 以上阐明上述问题同时，本人尽可能引入实验时会各种出现的问题予以说明。 一、克隆基因的酶切位点问题 1 对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识不赘述。这里对NdeI和HindIII 为例。 2 设计PCR引物时的保护碱基数目。这可能是初涉入未引起注意与重视问题。NdeI需加入6个以上的保护碱基，而HindIII则要三个就可以。 一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA 片段上。如NdeI就属这类。 下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数： NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6 SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4 XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4
案例分析：本人最初用NdeI酶，未注意到该问题，只与普通酶一样引入两个保护碱基，一个月内没有进展。后查文献得知症结所在，加下六个后，迎刃而解。大家引以为戒啊。 现在普通酶我都引入三个保护碱基，现在合成价格不贵，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重要实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。呵呵。 二、载体酶切的问题 1单切鉴定。这个问题实是简单，但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的，其中的各酶切位点状况如何，是否能被有效地切开，在实验开始之前对质粒载体很有作单切鉴定之必要。现在我每次构建之前，对所要用的酶切位点都作一一鉴定，比如要用到NdeI和HindIII，我就先对质粒该两个酶进行鉴定。有效地切开后，再将引物发出合成；若不能，就按“一”中原则进行调换。 2 质粒双切后对照连接。实验中这是连接步骤，但实质还是质粒酶切问题。一般情况下，都在通用缓冲液中进行双酶切，但两种酶在通用缓冲液中中酶切效率不一样，可能导致部分只是单切缺口的质粒片段存在，这样，连接的对照实验在不加入外源片段时，质粒就会自连，长出菌斑，这种情况下，质粒酶切片段是不可能用于下一步真正连接实验。 案例分析：本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒，对质粒进行双酶切后，直接就做连接，未上述两步鉴定，每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后，发现XhoI酶切位点损坏。又是一个月没有进展，浪费精力和药品。血的教训啊。因为当时没有注意到：单切质粒是一条带，双切质粒也是一条带，电泳行为上是一样的，分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿，呵呵。 案例分析：本实验室一个号称实验严谨的大博士，有KpnI和HindIII构建重组质粒，一个月未果，只得阴性斑，不得阳性斑，后怀疑KpnI酶失效。迁怒KpnI,在我不知情下扔掉实验室所满管KpnI酶。我得知后，问他做过上述两鉴定实验后，他支吾着说没有，反而责备本人不早说出问题原因所在。呵呵，他不自责自己只是闷头做实验，不早问，反倒咬一口解铃人。呵呵，你说冤不冤？版主你的类似的冤可能更多吧，辛苦了! 两星期前写了前两问题后，终于能抽时间写第三个问题，在做好前述两个方面工作后，这个问题相对简单。 三、连接时两片段浓度比问题 一般实验指导手册上都说质粒：片段＝1：3（摩尔比），在实际操作中我以为在1：5甚至1：10为宜。做好“一、二”，16℃10小时后，每次都能有效地连接上。当然还有感觉态问题，我们以前自己做，现在懒得做了，都用“天为时代公司”的产品，还不错（注明我不是天为公司内线，呵呵）。
重组表达质粒的构建——基因的克隆 长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。 选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。 原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种： 1）酶切连接 这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。 2）TA克隆 TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3′末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3′末端A正好匹配。这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3′末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。 3）TOPO克隆 TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。主要原理是在T载体的T碱基上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，其克隆效率提高数倍，并且操作极其简单，整个反应体系不需要在添加连接酶成分。如果在线性化平端载体上共价偶联一个DNA拓扑异构酶I分子，平端连接将不再是难题，如果再配合一个致死基因ccdB （Control of cell death）使用，凡是没有插入外源核酸序列的空载体自连，转入大肠杆菌可以正常表达ccdB蛋白，破坏细菌DNA gyrase(促旋酶)，造成细菌染色体降解而死亡；而插入外源核酸序列的会干扰ccdB蛋白的正常表达，细菌可以正常存活，平端克隆高背景问题这样得以完美解决。 4）Gateway技术 该技术所依赖的基础是lambda噬菌体的位点特异性重组反应。需要限制酶切回收、T4 Ligase连接；该方法一步就可以完成，只需要将基因克隆到入门载体（Entry Vector）,依赖载体上的特定的重组序列和重组酶，将外源基因克隆到具有相同重组序列的载体上；入门载体一般包含两个attL1和attL2,中间夹杂一个ccdB自杀基因，自连的空载体在转入大肠杆菌中都不会存活。入门载体构建成功之后，就可以轻松地将入门载体和目的载体质粒混合加入重组酶即可发生重组，生成所需要的融合质粒，当然还有一个副产品质粒。这种克隆方法适合于将一个基因批量化构建到不同载体系列中进行功能测试。这种技术也适合于大批量的文库构建，具体细节在此就不做赘述。 该技术主要的缺点是：该技术系统使用的酶非常昂贵，而且酶非常不稳定；其次，适合于gateway技术的载体非常少，只有一个厂家生产而且昂贵，来源受限；对于大片度（>10Kb）的效率很低，与传统的酶切-T4连接技术相比没有优势。 5）Infusion技术 这个是目前比较流行的克隆技术，可以任意载体任意基因片段快速实现多片段、长片段定点定向克隆，
几种新型植物基因表达载体的构建方法 摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。 关键词: Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法 基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。从1969 年Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到
重组质粒构建 生物学——屠仁军(新浪) 一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切 为了保证做连接反应时有足够的外源DNA片段，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10×buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。1ul体积太少，可以将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。6ul 15000bp的marker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。可对比marker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于确定连接反应时的用量。Image J软件可以做灰度分析。） 双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。回收完之后用同样的方法分析其浓度。（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量范围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。） 二、连接反应 载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16℃连接12-16h。 载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约1：3-1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。如果时间比较紧张，可以25℃连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul于16℃继续连接。 三、质粒转化到感受态大肠杆菌中 从-70℃中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。然后立即插入冰上，静置2min。（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。）在超净台中向EP管中加入700ul 无抗性LB培养