中国医科大学
硕士学位论文
大蒜素对人胃癌细胞SGC-7901及BGC-823 G<,2>/M期阻滞作用及
其调节机制的研究
姓名：柳星
申请学位级别：硕士
专业：肿瘤学
指导教师：袁媛
20050501
中国医科大学研究生学位论文独创性声明
本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
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论文作者签名：塑２圭日期：。蝴ｆ．Ｆ．矽中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书
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大蒜素对人胃癌细胞ＳＧＣ一７９０１及ＢＧＣ一８２３Ｇ２／Ｍ
期阻滞作用及其调节机制的研究
刖嚣
细胞周期是细胞一次分裂结束后到下一次分裂结柬的时间，分为四期：Ｇ。期，Ｓ期，Ｇ２期及Ｍ期。而Ｇ。期则是细胞休眠期。细胞周期有三个调控点，分别是Ｇ。一Ｇ。、Ｇ。一ｓ和Ｇ：一Ｍ，其中Ｇ，一Ｓ和Ｇ：一‘Ｍ最为重要。细胞周期能否启动进行细胞增殖，主要的调控点在Ｇ，期，它是细胞周期的驱动机制。Ｇ。期检测点能防止ＤＮＡ受损的细胞进入Ｓ期的复制。Ｇ。期阻滞中，主要包括两大网络调控机制：（１）以ＰＲｂ为主的网络调控机制；（２）以Ｐ５３为主的调控机制。Ｇ：一Ｍ期是细胞周期的监控机制，其能确保细胞复制的忠实性。Ｇ：期检测点能防止受损的ＤＮＡ和未完成复制的ＤＮＡ进入有丝分裂。Ｇ：期向Ｍ期的转变涉及到细胞分裂，完成一个细胞向两个细胞的转化，故Ｇ２一Ｍ期阻滞显得更为重要。目前Ｇ：一Ｍ期阻滞的机制不完全清楚。在真核细胞中，正常细胞Ｇ２一Ｍ进程由细胞周期蛋白Ｂ（ｃｙｃｌｉｎＢ）一Ｐ３４ｃｄｃ２复合物调控。在Ｇ：后期，二者结合形成有丝分裂促进因子（ＭＰＦ），进而诱导一系列底物磷酸化，引导细胞的有丝分裂。目前对Ｇ，／Ｍ期阻滞的研究主要集中在ｃｙｃｌｉｎＢ和ｃｄｃ２上。研究表明，Ｇ：／Ｍ期阻滞还可能与下列途径有关：（１）一些Ｐ５３靶基因被证实诱导了Ｇ２期阻滞，其中ｃｄｃ２是必不可少的。（２）Ｐ５３还可以通过其他不影响ｃｄｃ２的靶基因引起Ｇ：期阻滞。（３）Ｂｃｌ一２磷酸化在Ｇ：／Ｍ期阻滞中的作用。（４）ｃｙｃｌｉｎｇ可能与Ｇ：／Ｍ期检查点的调控有关。（５）Ｐ１５的过表达使Ｇ：／Ｍ期发生阻滞。
大蒜素化学名是二烯丙基三硫化物，具有多种生物活性，有抗真菌、抗细菌及降血酯、降血压、防治动脉粥样硬化等心血管疾病的作用，并具有良好的抗癌、防癌作用。大蒜素的抗肿瘤机制为阻断致癌物的合成、抗突变、抗畸变；直接杀伤；抑制肿瘤细胞增殖；诱导细胞周期特异性阻滞；诱导凋亡；调节机体免疫功能；对抗肿瘤药物的增敏作用和抗耐药等。Ｆｉｌｏｍｅｎｉｅｔａｌ研究发现大蒜素能使神经母细胞ＳＨ—ＳＹＳＹ停滞于Ｇ：／Ｍ期。ｗｕｅｔａｌ
研究亦发现大蒜素能使人肝癌细胞（ｊ５）阻滞于Ｇ２／Ｍ期，并呈明显的时间、剂量依赖性。Ｗｏｎｇｅｔａｌ等从大蒜等植物中提取有机硫化物（ＯＳＣｓ），研究ＯＳＣｓ与生长抑制活性的关系时发现：ＯＳＣｓ能阻滞人类白血病细胞于Ｇ，／Ｍ期。研究结果显示，大蒜素确实有很好的抗肿瘤作用，并提示了大蒜素抗肿瘤作用是通过多个途径完成的。
国内外对大蒜素抑制肿瘤细胞增殖，使之停滞于Ｇ２／Ｍ期的报道虽然很多，但是从机制方面探讨大蒜素如何使肿瘤细胞停滞于Ｇ２／Ｍ期，目前尚无报道。
本实验应用ＭＴｒ法及流式细胞仪，深入研究大蒜素对肿瘤细胞的抑制作用以及对肿瘤细胞周期的影响。并通过免疫组化等技术，检测在Ｇ，／Ｍ期调控中起重要作用的ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白和ｃｄｃ２蛋白的表达水平，探讨大蒜素对肿瘤细胞周期阻滞的作用机理。从而更好地指导临床用药，即大蒜素协同Ｇ：／Ｍ期特异性化疗药物，以期达到更好的抗肿瘤作用。
实验方法
将人胃癌转移淋巴结细胞系ＳＧＣ一７９０１、人胃低分化腺癌细胞系ＢＧＣ一８２３两种肿瘤细胞在培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。用ＭＴｒ法测定细胞增殖抑制率及药物的ＩＣ。：以大蒜素浓度为横坐标，以细胞抑制率为纵坐标，绘制细胞增殖抑制曲线，并测定药物半数抑制浓度（ＩＣ。）。以下式计算实验组细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率＝（１一实验组光密度值／对照组光密度值）×１００％。通过流式细胞仪检测ＩＣ，。浓度的大蒜素对人胃癌细胞株ＳＧＣ一７９０１和ＢＧＣ一８２３细胞周期的影响。应用免疫组化染色检测ｃｙｃｌｉｎＢ和ｃｄｃ２蛋白表达：培养细胞分别加入ＭＴｒ法测得的７２ｈＩＣ，。浓度大蒜素，作用２４ｈ后收集细胞，同时设立不加处理的对照组，显微镜下观察结果。判断标准：以细胞核、细胞浆呈清晰棕黄色颗粒为阳性细胞。
实验结果
１．大蒜素对两种胃癌细胞生长的抑制作用对照组细胞呈正常的对数生长，大蒜素对ＳＧＣ一７９０１和ＢＧＣ一８２３两种细胞的生长均有明显的抑
制作用，且呈浓度依赖性。大蒜素抑制ＳＧＣ一７９０１细胞增殖５０％的药物浓度（ＩＣ，。）：７２ｈ为２３ｕｇ／ｍｌ；大蒜素抑制ＢＧＣ一８２３细胞增殖５０％的药物浓度（｛Ｃ５０）：７２ｈ为３５ｕｇ／ｍｌ。
２．大蒜素对两种胃癌细胞周期的影响ＳＧＣ一７９０１细胞和ＢＧＣ一８２３细胞在ＩＣ∞浓度大蒜素诱导２４ｈ、４８ｈ后收集，流式细胞仪检测，结果显示两种细胞的细胞周期均发生了明显的变化，主要表现为Ｇ。／Ｇ，期细胞减少，Ｇ２／Ｍ期细胞增多，ｓ期细胞无明显变化，提示两种胃癌细胞经大蒜素处理后细胞周期阻滞于Ｇ２／Ｍ期。与对照组相比，Ｐ＜０．０１。
３．ｃｄｃ２和ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白表达的免疫组化结果未经大蒜素处理的两种细胞，ｃｄｃ２和ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白表达均为阳性表达。经大蒜素处理后，ｃｄｃ２和ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白表达下降。ＳＧＣ一７９０１细胞经２３ｕｇ／ｍｌ大蒜索处理后，ｃｄｃ２蛋白相对阳性表达率为８７．２％；ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白相对阳性表达率为５９．３％。ＢＧＣ一８２３细胞ｃｄｃ２蛋白在３５ｕｇ／ｒｎｌ大蒜素作用后，相对阳性表达率为８４．４％；ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白相对阳性表达率为６２．８％。与对照组相比，Ｐ＜０．０１。
结论
大蒜素可以抑制人胃癌细胞株ＳＧＣ一７９０１、ＢＧＣ一８２３的增殖，且随着大蒜素浓度的增大，抑制率逐渐增高。通过流式细胞仪的检测，ＩＣ，。浓度的大蒜素使人胃癌细胞株ＳＧＣ一７９０１、ＢＧＣ一８２３停滞于Ｇ：／Ｍ期。应用免疫组化染色检测ＳＧＣ一７９０１和ＢＧＣ一８２３两种细胞ｃｄｃ２和ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白表达，未经大蒜素处理的两种细胞，ｃｄｃ２和ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白表达均为阳性表达，大蒜素处理后，ｃｄｃ２和ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白表达下降。
关键词
大蒜素，ＳＧＣ－７９０１，ＢＧＣ一８２３，Ｇ２／Ｍ期阻滞，ｃｄｃ２，ｃｙｃｌｉｎＢ
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ｐｅｎｄａｎｔｃｄｅ２．（３）Ｂｃｌ－２ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｃａｎｌｅａｄｔｏＧ２一Ｍｐｈａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．（４）ＣｙｃｌｉｎＧｉｓｐｒｏｂａｂｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｔ｝ｌｅＧ２一Ｍｃｈｅｃｋａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｐｏｉｎｔ．（５）Ｐ１５ＣａｎｎｏｔｏｎｌｙｉｎｈｉｂｉｔＧ２ｔｏＭ，ｂｕｔａｌｓｏｏｖｅｒ—ｅｘｐｒｅｓｓｏｆＰ１５ｃａｌｌｉｎｈｉｂｉｔＧ２ｔｏＭ．
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大蒜素对人胃癌细胞ＳＧＣ一７９０１及ＢＧＣ一８２３
Ｇ２／Ｍ期阻滞作用及其调节机制的研究
前言
细胞周期是细胞一次分裂结束后到下一次分裂结束的时间，分为四期：Ｇ。期（ＤＮＡ合成前期），ｓ期（ＤＮＡ合成期），Ｇ：期（ＤＮＡ合成后期）及Ｍ期（有丝分裂期）。而Ｇ０期则是细胞休眠期。细胞周期有三个调控点，分别是Ｇ０一ｃ，、Ｇ。一Ｓ和Ｇ２一Ｍ，其中Ｇ。一ｓ和Ｇ２一Ｍ最为重要。细胞周期髓否启动进行细胞增殖，主要的调控点在Ｇ。期，它决定细胞能否通过Ｇ，期，进入Ｓ期，它是细胞周期的驱动机制。Ｇ。期检测点能防止ＤＮＡ受损的细胞进入Ｓ期的复制。Ｇ。期阻滞中，主要包括两大网络调控机制：（１）以ＰＲｂ为主的网络调控机制；（２）以Ｐ５３为主的调控机制。’Ｇ：一Ｍ期是细胞周期的监控机制，其能确保细胞复制的忠实性，Ｇ：期检测点能防止受损的ＤＮＡ和未完成复制的ＤＮＡ进入有丝分裂。Ｇ：期向Ｍ期的转变涉及到细胞分裂，包括胞质分裂和核ＤＮＡ分裂，完成一个细胞向两个细胞的转化。在肿瘤细胞，其会以几何倍数增长，故Ｇ２一Ｍ期阻滞显得更为重要。目前Ｇ２一Ｍ期阻滞的机制不完全清楚。在真核细胞中，正常细胞Ｇ：一Ｍ进程由细胞周期蛋白Ｂ（ｃｙｃｌｉｎＢ）一Ｐ３４ｃｄｃ２复合物调控。Ｐ３４ｃｄｃ２是ｃｄｃ２基因编码的３４ＫＤ的周期蛋白依赖激酶，ｃｙｃｌｉｎＢ是调节亚基。在Ｇ：后期，二者结合形成有丝分裂促进因子（ＭＰＦ）、然后ｃｄｃ２蛋白Ｎ端Ｔｈｒｌ４和Ｔｙｔｌ５脱磷酸化，Ｔｈｒｌ６１磷酸化，从而被活化而具激酶活性，进而诱导一系列底物磷酸化，引导核膜崩解、染色质凝聚等有丝分裂所具有的变化。目前对Ｇ２／Ｍ期阻滞的研究主要集中在ｃｙｃｌｉｎＢ和Ｐ３４ｃｄｃ２上。研究表明，Ｇ２／Ｍ期阻滞还可能与下列途径有关：（１）一些Ｐ５３靶基因被证实诱导了Ｇ２期阻滞。１）５３调控的Ｇｚ／Ｍ期转换机制中，ｃｄｃ２对于进入有丝分裂是必不可少的，Ｐ５３通过其三个转录靶分子Ｐ２１、１４—３—３８、Ｇａｄｄ４５使Ｇ：期发生了阻滞；（２）Ｐ５３还可以通过其他不影响ｏｄｅ２的靶基因引起Ｇ２期阻滞：１３９９和ＭＣＧｌ０都是通过非依赖ｃｄｃ２引起的Ｇ：期阻滞；（３）Ｂｅｌ—２磷酸化在Ｇ２／Ｍ期阻滞中的作用，目前尚
元定论；（４）ｃｙｃｌｉｎＧ可能与ＧＪＭ期检查点的调控有关；（５）Ｐ１５不仅阻滞了细胞Ｇ：／Ｍ期的过渡，而且Ｐ１５的过表达也使Ｇ：／Ｍ期发生阻滞。
大蒜素（ｄｉａＵｙｌｔｒｉｓｕｌｆｉｄｅ，Ａｌｌｉｃｉｎ）又名大蒜新素，化学名二烯丙基三硫化物，是从大蒜球茎中分离出的一种化合物，有多种生物活性，有抗真菌、抗细菌及降血酯、降血压、防治动脉粥样硬化等心血管疾病的作用，并具有良好的抗癌、防癌作用。研究结果显示，大蒜素确实有很好的抗肿瘤作用。目前对大蒜素抗肿瘤作用机制的研究很多，提示了大蒜素抗肿瘤作用是通过多个途径完成的。大蒜素的抗肿瘤机制主要表现为阻断致癌物的合成、抗突变、抗畸变；直接杀伤；抑制肿瘤细胞增殖；诱导细胞周期特异性阻滞；诱导凋亡；调节机体免疫功能；对抗肿瘤药物的增敏作用和抗耐药等。Ｆｉｌｏｍ．ｅｎｉｅｔａｌ研究发现大蒜素能使神经母细胞ＳＨ—ＳＹＳＹ停滞于Ｇ，／Ｍ期。Ｗｕｅｔａｌ研究亦发现大蒜素能使人肝癌细胞（Ｊ５）阻滞于Ｇ：／Ｍ期，并呈明显的时间、剂量依赖性。Ｗｏｎｇｅｔａｌ等从大蒜等植物中提取有机硫化物（ＯＳＣｓ）．研究ＯＳＣｓ与生长抑制活性的关系时发现：ＯＳＣｓ能阻滞人类白血病细胞于Ｇ２／Ｍ期。
国内外对大蒜素抑制肿瘤细胞周期，使之停滞于Ｇ２／Ｍ期的报道虽然很多，但是从机制方面探讨大蒜素如何使肿瘤细胞停滞于Ｇ２／Ｍ期，目前尚无报道。
本实验应用ＭＴｒ法及流式细胞仪，深入研究大蒜素对肿瘤细胞的抑制作用以及对肿瘤细胞周期的影响。并通过免疫组化等技术，检测在Ｇ：／Ｍ期调控中起重要作用的ｃｄｃ２蛋白和ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白的表达水平，探讨大蒜素对肿瘤细胞周期阻滞的作用机理。从而更好地指导临床用药，即大蒜素协同Ｇ：／Ｍ期特异性化疗药物治疗肿瘤，有望提高疗效。
实验方法
１．材料：人胃癌转移淋巴结细胞系ＳＧＣ一７９０１、人胃低分化腺癌细胞系ＢＧＣ一８２３由中国医科大学细胞生物学教研室提供。大蒜素注射液购自上海禾丰制药有限公司（３０ｍｇ／支）；
２．主要试剂和来源：ＭＴｒ购自Ｓｉｇｍａ公司；碘化丙啶（ＰＩ），Ｒｎａｓｅ为Ｆｌｕｋａ公司产品；流式细胞仪型号１ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂ．ＤＵＳＡ）；即用型鼠单克隆抗体Ｆ３４ｃｄｃ２，ＳＰ试剂盒，ＤＡＢ试剂盒，抗原修复液Ⅱ，胰酶消化液均购自福
州迈新公司；即用型鼠单克隆抗体ｃｙｃｌｉｎＢ购自武汉博士德公司。
３．实验方法：
３．１细胞培养：将两种细胞用含有１０％小牛血清的ＲＰＭｌｌ６４０培养液，于３７０Ｃ，５％ＣＯ：培养箱中培养，每２～３天传代１次，取对数生长期细胞用于实验。
３．２ＭＴｒ法测定细胞增殖抑制率及药物的Ｉｃ，。：将两种细胞密度分别调整至５Ｘ１０４／ｍＬ，接种于９６孔板，每孔加细胞悬液１００ｕＬ。用不同浓度大蒜素处理细胞，设立不加任何处理因素的对照组。每个浓度３个复孔，将培养板置于３７０ｃ含５％Ｃ０２的培养箱中孵育７２ｈ，取出细胞培养板，每孔加４０ｕｌＭＴｒ（用无血清ＲＰＭｌｌ６４０培养液配成１ｍｇ／ｍＬ）３７０Ｃ温育４ｈ，取出离心１０００—１２００转／分钟，吸去上清，加入５０ｕｌＤＭＳＯ，用混悬仪混匀并用酶标仪在５７０１７１处测定每孔光密度。以大蒜素浓度为横坐标，以细胞抑制率为纵坐标，蔓．制细胞增殖抑制曲线，并测定药物半数抑制浓度（ＩＣ５０）。以下式计算实验组细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率＝（１一实验组光密度值／对照组光密度值）Ｘ１００％。
３．３应用流式细胞仪分析细胞周期：取生长状态良好的细胞，接种在大方瓶中，培养至密度达６０—７０％时，加入ＭＴｒ法测得的７２ｈＩＣ。浓度大蒜素，培养２４ｈ后，收集细胞。收集的细胞以ｌｏＢＳ洗三次后，以７０％乙醇４。Ｃ固定过夜，１０００ｒｐｍ离心５分钟，弃去乙醇，ＰＢＳ洗三次，加入ｔｏ¨．ｇ／ｒａｔ的Ｒｎａｓｅ予３７０Ｃ消化３０分钟，加入５０斗ｇ／ｍｔ的ＰＩ于４０Ｃ染色１ｈ，流式细胞仪（ＦＣＭ）检测，应用前向散射光（ＦＳＣ）和侧向散射光（ＳＳＣ）选取细胞，以第二通道（ＦＩ＿２一Ｈ）测定ＤＮＡ含量，采用ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ进行细胞周期各期的百分比分析，每组实验重复５次。
３．４免疫组化染色检测ｏｄｅ２和ｅｙｅｌｉｎＢ蛋白表达：培养细胞分别加入Ｍａｒ法测得的７２ｈＩＣ∞浓度的大蒜素，作用２４ｈ后收集细胞，同时设立不加处理的对照组。应用细胞爬片方法制成细胞涂片，行常规ｓＰ免疫组化染色，ＤＡＢ显色试剂盒显色，苏木素复染，显微镜下观察结果。判断标准：以细胞核、细胞浆呈清晰棕黄色颗粒为阳性细胞。高倍视野下查２００个细胞，分别计算阳性细胞百分比，并换算成治疗组占对照组阳性细胞的相对百分比。
４．统计学处理：两样本均数间的比较分别采用ｔ检验。
图５大蒜素对ＢＧＣ一８２３细胞周期的影响
３．ｃｄｃ２和ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白的表达：未经大蒜素处理的两种细胞，ｃｄｃ２和ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白表达均为阳性表达。经大蒜素处理后，ｃｄｃ２和ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白表达下降。ＳＧＣ一７９０１细胞经２３ｕｇ／ｍｌ大蒜素处理后，ｃｄｃ２蛋白相对阳性表达率为８７．２％；ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白相对阳性表达率为５９．３％。ＢＧＣ一８２３细胞ｃｄｃ２蛋白在３５ｕｇ／ｍｌ大蒜素作用后，相对阳性表达率为８４．４％；ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白相对阳性表达率为６２．８％。与对照组相比，Ｐ＜Ｏ．０ｔ。（见图６、７、８、９）
图６２３ｕｇ／ｍｌ大蒜素作用ＳＧＣ－７９０１后ｃｄｃ２和ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白相对阳性表达盎
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图７３５ｕｇ／ｍｌ大蒜素作用ＢＧＣ－８２３后ｏｄｅ２和ｅｙｅｌｉｎＢ蛋白相对阳性表达窒
Ａ．Ｓ—Ｐ免疫组化法ＳＧＣ一７９０１细胞ｃｄｃ２—对照组，习ｃ２蛋百翌阳性表达４００×
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Ｂ．Ｓ—Ｐ免疫组化法ＳＧＣ一７９０１细胞ｃｄｃ２经２３ｕｇ／ｍｔ大蒜素处理后，ｃｄｃ２蛋白表达下降４００ｘ
Ｃ．Ｓ—Ｐ免疫组化法ＳＧＣ一７９０１细胞ｃｙｃｌｉｎＢ对照组，ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白呈阳性表达４００×
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Ｄ．ｓ—Ｐ免疫组化法ＳＧＣ一７９０１细胞ｃｙｃｌｉｎＢ经２３ｕｇ／ｍｌ大蒜素处理后，ｃｙ—ｃｌｉｎＢ蛋白表达下降４００×
图８ＳＧＣ一７９０１细胞ｃｄｃ２及ｃｙｃｌｉｎＢ蛋白表达的免疫组化图（Ａ，Ｂ＋Ｃ，Ｄ）
Ｅ．Ｓ—Ｐ免疫组化法ＢＧＣ一８２３细胞ｃｄｃ２对照组，ｃｄｃ２蛋白呈阳性表达４００Ｘ
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