作者单位:430030武汉,华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科
通讯作者:刘念,Email:liunian1973@https://www.doczj.com/doc/d214984542.html, #冠心病研究#
兔陈旧性心肌梗死心室肌中神经纤维的
形态学变化及增生对室颤阈值的影响
刘念牛惠燕周强阮燕菲卜军李泱张存泰陆再英
=摘要>目的研究神经纤维在兔陈旧性心肌梗死(HM I)心室肌中的分布及形态学改变,并观
察HM I兔中神经纤维的过度增生对室颤阈值的影响,为阐明自主神经在HM I心律失常和猝死中的
作用提供实验依据。方法30只兔随机分为三组:(1)HM I组结扎冠状动脉左回旋支;(2)神经生长
因子组结扎左回旋支并通过颈部皮下置管于左侧星状神经节,给予神经生长因子400U@30d;(3)
假手术组开胸但不结扎冠状动脉和皮下置管。3个月后三组动物均进行室颤阈值测定,免疫组化法
研究兔心室肌中S-100蛋白和酪胺酸羟化酶(T H)的分布和密度。结果假手术组心室肌中的神经
纤维呈非均态分布,HM I组心室肌神经分布紊乱。HM I组存在神经纤维再生和增生,特别是梗死周
边区,具有特殊的表型,以T H阳性染色为主。神经生长因子组神经纤维密度明显较假手术组和
HM I组增高(P<0105),其室颤阈值为(7100?1104)V,较HM I组和假手术组的(9116?1123)V和
(13131?2112)V明显降低(P<0105)。结论HM I心室肌中神经分布紊乱,存在神经再生和增生,
以TH阳性染色为主,心肌梗死后过度的神经纤维增生可进一步促进梗死心脏的电不稳定性。
=关键词>心肌梗塞;神经纤维;心室颤动;阈值
Morphology of nerve fibers and the eff ect of nerve proliferation on ventricular fibrillation threshold in
rabbit ventricle with healed myocardial inf arction LI U Nian,NI U Hui-yan,Z H O U Qiang,RUA N Yan-
f ei,PU Jun,LI Yang,ZHAN G Cun-tai,L U Zai-ying.De p artment of Car diology,Ton gj i H osp ital,Tongj i
Medica l College,H uazhong University of Science and Technology,Wuhan430030,China
Cor r esponding author:L I U N ian,Email:liunian1973@https://www.doczj.com/doc/d214984542.html,
=Abstract>Objective T o investig ate the distributio n and mor pho logy of nerve fibers in rabbit heart
w ith healed myocardial infarction(HM I)and the effect of ex cess nerve proliferation in r abbit w ith HM I on
v entricular fibrillation threshold so as to provide exper imental data for the effects of autonomic nerve system
on arrhythmia and sudden death in HM I.Methods T hirty rabbits w er e randomly assig ned three groups:
HM I g roup,ligation of the circumflex coronary;N GF group,ligation of the cir cumflex coronar y and
polyethylene pipe placed to left satellite ganglio n in subcutis of neck for administration of nerv e g rowth
factor(N GF)400U@30d;sham group,thoracotomy but no co norary lig atio n and w ithout subcutaneous
polyethylene pipe.T hr ee months after oper atio n,vent ricular fibrillation threshold(VFT)was measur ed and
t he distribution and density of S-100protein and tyr osine hydro xylase(TH)in v entricle were detected with
immuno histochemical technique.Results T he distr ibution of nerv e fibers in ventricle of sham group w as
inhomogeneous,w hich became more chaotic in HM I group.T her e were ner ve regeneration and
proliferation in HM I group,especially in infr acted bor der zone,wher e the nerve fibers possessed special
modality and was immunor eactive to TH mainly.T he nerve fibers density in N GF group w as higher than
t hose in sham group and HM I group(P<0105).V FT o f NGF group was(7100?1104)V,w hich
decreased significantly compared with those of HM I group and sham group,(9116?1123)V and(13131
?2112)V r espectiv ely(P<0105).Conclusion T he di stribution of nerve fibers in ventricle of HM I
g roup w as chaotic.T here were regeneration and prolifer at ion of ner ve fibers in HM I g roup,which were
immunor eactive to T H mainly.Excess nerve pr oliferation might facilitate the electr ical unsteadiness in
healed myocar dial infarct ion fur ther.
=Key words>M yocardial infarction;Nerve fibers;V entricular fibrillation;T hreshold
目前对心肌梗死超过2个月,心肌瘢痕已充分
形成的心室肌中神经纤维的分布研究尚少,并且对
这种心肌梗死后再生、特别是增生的神经纤维对梗
死心肌电生理的影响尚不清楚[1]。
本研究应用标记有髓神经纤维的抗S-100抗体和标记肾上腺素能神经纤维的抗酪氨酸羟化酶(ty rosine hydroxylase,TH)抗体,对兔陈旧性心肌梗死(healed m yocardial infarction,HM I)心室肌中神经纤维的分布进行研究,旨在为心肌梗死慢性期中自主神经对心肌细胞电生理的影响提供形态学依据。为观察自主神经增生对心肌梗死后心肌电生理的影响,本实验通过左侧星状神经节注射神经生长因子(nerve grow th factor,NGF)促进兔H MI心脏的神经过度增生,观察神经过度增生与室颤阈值关系,为进一步阐明自主神经增生在H MI心律失常和猝死中的作用提供更有力的依据。
材料与方法
1.动物模型的建立:日本大耳兔30只,雌雄不拘,体重115~210kg,均取自华中科技大学同济医学院实验动物饲养所,随机分为:HM I组10只、NGF组10只、假手术(sham-operation,Sham)组10只。HM I组结扎冠状动脉左回旋支中下1/3处,造成急性心肌梗死模型;NGF组亦行上述冠状动脉结扎术,并行颈部正中切口,放置直径115mm的聚乙烯管于左侧星状神经节处,另一端经皮下隧道于颈背部穿出,供注射NGF用;Sham组开胸但不结扎冠状动脉和颈部置管。术后三组均肌注青霉素3d。NGF组于术后立即通过聚乙烯管给予NGF400U 30d(北京圣日医药科技发展公司)。三组动物术后普食喂养。
2.室颤阈值的测定:术后3个月,实验兔3%戊巴比妥钠静脉麻醉,心电监护,气管插管接呼吸机,开胸,缝制心包吊床。双极起搏电极,直径013 mm,两针相距013cm,在心肌梗死兔梗死苍白色边缘2m m处,刺入2mm深,Sham组起搏电极放置于心脏的相应部位。用XD-2A心脏诊疗仪(苏州东方电子仪器厂生产)取间断刺激(100Hz,每次持续刺激1s),强度从1V开始,每次按递增015V的方法通过起搏电极刺激心脏,以引起心室颤动的最低强度为室颤阈值。
3.心肌组织中S-100蛋白和TH表达的免疫组化检测:室颤阈值测定后,肝素500IU/kg静脉推注,快速取下心脏,大体形态学测量,后用生理盐水行主动脉逆行灌流5min,10%甲醛逆行灌流10 min,置于10%的甲醛液中固定4~6h,NGF组和HM I组分别取左室游离壁包括梗死区(infarcted zone,IZ)、梗死周边区(infarcted border zone,IBZ)和非梗死区(non-infarcted zone,NIZ),Sham组取相应部位心肌,进行石蜡包埋,垂直于心外膜切片,厚度3~4L m,硅化玻片装载组织。一抗为抗小鼠S-100蛋白抗体(1B400,博士德)和抗TH抗体(1B200, Sigm a),ABC Kit购自北京中山公司,参照试剂盒提供的步骤进行染色,苏木精轻度复染(部分切片)、脱水、透明、封片,光镜观察。阴性对照用正常非免疫血清代替一抗,余步骤同上。
4.观察指标:(1)基础改变包括心率、心重/体重、左室代偿区厚度、心肌梗死范围,沿左心室长轴将心室水平切为间隔0125cm的心肌环,计算心肌环梗死长度占全部心肌环长度的比率,作为心肌梗死的范围;(2)神经纤维形态、分布和密度参照Cao 等[2]的方法,分别选取神经纤维分布最多的3个高倍镜视野(@200),计算神经纤维的数目,神经纤维密度为总神经纤维的个数与检查视野数的比值;(3)室颤阈值。
5.统计学分析:数据用均数?标准差(
x?s)表示,F-test进行多组之间均数的比较。
结果
1.基础变化(表1):HM I组和NGF组的心率、心重/体重、左室代偿区厚度较Sham组明显增加(P<0105)。HM I组和NGF组的梗死面积分别为(1712?314)%和(1618?313)%,属于范围较小的心肌梗死。HM I组与NGF组之间,心率、心重/体重、左室代偿区厚度、梗死面积差异无显著性(P> 0105)。
表1Sham组、HM I组和N GF组基础变化(
x?s)
组别
(只)
心率
(次/min)
心脏重量/
体重
(g/kg)
左室代偿
区壁厚度
(mm)
梗死面积
(%)
H M I组(10)
256?
32*
3.42?
0.15*
7.44?
0.51*
17.2?
3.4
NGF组(10)
266?
25*
3.58?
0.19*
7.80?
0.51*
16.8?
3.3 Sham组(10)
226?
26
2.76?
0.15
5.84?
0.48
0注:HM I:陈旧性心肌梗死;NGF:神经生长因子;Sham:假手术。HM I组和NGF组与对照组比较,*P<0.05
2.神经纤维分布和密度(表2):Sham组中S-100蛋白阳性和TH阳性的神经纤维呈非均态的分布,脏层、血管旁以及在心肌束间的结缔组织中分布
注:1A:S ham 组神经纤维较正常;1B 、HM I 组神经纤维较Sham 增加;1C:NGF 组神经纤维较紊乱
图1 TH 阳性的神经纤维(DAB @200)
较多,并且成束状。在心肌细胞之间,可见纤细的神经纤维末梢广泛分布,与心肌细胞走行的方向一致,有时中间有膨起。相邻连续切片中,S -100蛋白抗体和TH 抗体标记同一神经纤维结构。HM I 组中,除了上述表现外,在梗死心肌与存活心肌相互交错的IBZ,神经纤维成束状或聚集成网丛状分布,偶呈扭曲样走行,其直径明显较心肌细胞间的神经纤维更粗,数目更多,大多呈TH 阳性染色,神经纤维行走方向与瘢痕组织中心肌纤维的方向一致。IZ 中岛状存活心肌周围未见神经纤维分布。H MI 组的神经纤维密度较Sham 组有所增加,NGF 组的神经纤维密度较Sham 组和HM I 组增加明显(P <0105)(图1),三组中TH 阳性纤维均占S -100阳性纤维的绝大多数。对照实验的切片反应呈阴性。
表2 Sham 组、HM I 组和NG F 组的神经纤维密度
组别 S -100TH TH /S -100(%)
HM I 组19.27?3.4315.83?4.2882.1NGF 组37.68?6.31*
33.28?4.72*88.3S ham 组
15.43?2.63
11.32?4.02
73.4
注:NGF 组与HM I 组和对照组比较,*P <0.05
3.室颤阈值:NGF 组的室颤阈值为(7100?1104)V,较HM I 组和Sham 组的(9116?1123)V 和(13131?2112)V 明显降低(P <0105),H MI 组和Sham 组的室颤阈值之间亦差异有显著性(P <0105)。
讨
论
心脏中神经大多为有髓神经纤维,S -100蛋白阳性表达可代表心脏中绝大多数自主神经纤维分布
的状况;酪氨酸羟化酶分布在肾上腺素能神经轴突的胞质中,其阳性表达可代表交感神经在心脏中的分布。本研究Sham 组中神经纤维呈明显非均态分布,心外膜和心外膜下的冠状动脉和冠状静脉周围分布较多,沿血管走向,由粗变细直至心肌细胞之间。在相邻的连续切片中,可见S -100蛋白抗体和
TH 抗体标记同一神经纤维结构,TH 阳性的神经纤维数目仅略少于S -100蛋白阳性的神经纤维,表明心室肌中主要为肾上腺素能神经支配,这与Nori 等[3]的研究一致。HM I 心室肌中的神经纤维具有独特的形态和分布,特别是在IBZ,相对而言其纤维更粗,数量更多,神经纤维可单独存在或聚集成网丛状结构,空间分布紊乱。神经纤维的定量分析表明在HM I 的心脏中神经纤维的分布是增加的,不仅指IBZ,而且包括NIZ 。虽然我们未进行心肌梗死后神经纤维的动态观察或新生神经纤维标志物染色,但结合以往的文献报道[3,4],我们认为:1神经纤维在正常心室肌中呈非均态的分布;oH MI 心室肌中神经纤维呈更紊乱的分布;?HM I 存在神经再生和增生,并且以交感神经为主,具有独特的表型。
心肌梗死后存在神经纤维的再生和增生,它与心律失常之间到底存在着什么样的关系是一个值得研究的课题。有报道[2]应用NGF 促进犬心肌梗死合并三度房室传导阻滞心脏的神经纤维增生,发现可大大增加动物的猝死率。我们的研究显示,心肌梗死兔左侧星状神经节注射NGF 有明显的促进心脏局部交感神经增生的作用,其室颤阈值较单纯心肌梗死组有显著性的下降,这表明心肌梗死的心室肌中,如果有交感神经纤维的过度增生,则可进一步促进梗死心脏的电不稳定性,导致恶性心律失常和
猝死的发生。Cao等[5]对51例心脏移植患者的病变心脏进行组织学研究,发现在心肌组织中可见到大量的神经纤维呈不均一性地增生,大多数为交感神经起源。根据是否发生恶性室性心动过速或猝死分为心律失常组与对照组,发现心律失常组的神经纤维密度和神经纤维总长度比对照组有显著性增加。结合本实验的结果,说明心肌梗死后心室肌都存在神经纤维的再生和增生,而神经纤维增生越明显,促进恶性室性心律失常和猝死的可能性越大,究竟心肌梗死后神经增生如何对已发生重塑的心肌细胞的电生理产生影响,则有待进一步的研究。
对于心肌梗死后心原性猝死的预防一直是临床工作的重点与难点,目前对于心肌梗死后的猝死预防主要针对心肌重塑,以及电重塑的干预。心肌梗死后心脏神经纤维存在着变性、坏死、再生、增生的动态演变过程,并且组织形态与正常的神经纤维不一样,具有独特的表型,我们认为心肌梗死后心脏神经的演化过程同心肌细胞与间质细胞一样也是一种组织重塑。神经重塑的存在,提出了一个新的课题,如能在心肌梗死的早期采取积极的手段来干预神经再生重塑,使心脏神经的再生和增生达到合适的水平,而不是过度增生,可能对心肌梗死后猝死的预防起到更积极的作用。
参考文献
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5Cao JM,Fishbein M C,Han JB,et al.Relati onship betw een regional cardiac hyperinnervati on and ventricular arrhythmi a.Circulation, 2000,101:1960-1969.
(收稿日期:2003-06-16)
(本文编辑:诸永康)
心血管病诊疗指南研读班招生启事
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