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羊成纤维细胞建系研究进展

羊成纤维细胞建系研究进展
羊成纤维细胞建系研究进展

现代畜牧兽医

2014年第12期

自从1997年Wilmut等[1]报道“Dolly”羊诞生以来,体细胞核移植技术成为生物技术试验研究的热点。此后,以不同动物不同组织来源的体细胞进行核移植均得到了后代,这些细胞包括颗粒/卵丘细胞[2-4]、乳腺细胞[1]、皮肤成纤维细胞[5]、输卵管和子宫上皮细胞[6]、耳成纤维细胞[7]、胎儿成纤维细胞[8]和淋巴细胞[9]等。目前,羊的克隆、转基因、干细胞等试验研究中,以成纤维细胞[10-12]和颗粒/卵丘细胞[10]居多。因此,皮肤成纤维细胞建系、保存、细胞生物学特性检测等技术研究成为动物克隆、转基因技术的基础,也成为珍稀濒临灭绝哺乳动物保种的有效技术手段。本文将羊皮肤成纤

维细胞建系技术研究现状进行总结如下。

1羊成纤维细胞建系培养

羊成纤维细胞一般采用组织块培养法和酶消化

法进行原代细胞培养。组织块贴壁培养法较胰酶消化法操作简便、不易污染,长出的细胞整齐便于选择。胰酶消化法要注意酶量、作用时间及酶处理温度,过度消化会对细胞造成较大伤害[13]。1.1原代细胞培养1.1.1

组织块培养法

吴帅帅等[14]培养云岭黑山羊

耳尖皮肤表明,组织块在培养液中培养9d后,向周围溢出细胞组织块的百分比分别是88.9%、88.0%和92.6%,成纤维细胞与上皮细胞之间有明显界

羊成纤维细胞建系研究进展

豆兴堂

(辽宁省家畜家禽遗传资源保存利用中心,辽宁

辽阳

111000)

摘要:本文总结了羊成纤维细胞建系及生物学特性检测技术,包括羊成纤维细胞原代、传代培养与纯化、冷冻

保存与复苏、细胞活力测定、生长曲线、染色体分析、同工酶分析、微生物检测等,并回顾了体细胞技术已经取得的成就,展望其在我国现代畜牧业中的应用前景。

关键词:羊;成纤维细胞;生物学特性中图分类号:S852.2

文献标识码:A

文章编号:1672-9692(2014)12-0054-05

The progression of study on goat and sheep fibroblast cell line construction

DouXingtang

(Liaoningprovincelivestock&poultryService,LiaoningLiaoyang

111000)

Abstract:Thistexthasgivenasummaryaboutgoatandsheepfibroblastcelllineconstruction

techniqueandbiologicalcharacteristicsdetection,includinginitialfibroblastcellculture,transferofcultureandpurification,cellcryopreservationandresuscitation,testingcellvitalforce,testingcellgrowthcurve,cellkaryotypeanalysis,etal.Theaimwastoreviewachieve-mentsofthetechniqueoffibroblastcelllineconstruction,andtolookintothefutureofitsus-inginmodernanimalhusbandry.

Key words:Goatandsheep;Fibroblastcell;Biologicalcharacteristics

收稿日期:2014-11-12作者简介:豆兴堂(1978-),男,硕士,高级畜牧师,研究方向为绒山羊繁育与胚胎工程。

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限,前者为梭形,迁移能力强,细胞间隙大,后者

为不规则的圆形或椭圆形,细胞之间没有空隙。郑聪颖[15]研究奶山羊胎儿成纤维细胞表明,组织块贴壁后,3d可见游离出少量细胞,成纤维细胞间隙较大,细胞形态多为三角形或呈不规则形。之后成纤维细胞迅速生长,组织块边缘周围的细胞部分为梭形或不规则形,7d后除个别组织块周围为铺路石状的上皮细胞外,绝大部分组织块周围都布满了大量梭形成纤维细胞,并向外延伸,9d后细胞铺满70%~80%。陈亮等[16]研究滩羊成纤维细胞表明,组织块贴壁后第4天即可见到细胞从组织块边缘向外生长,成纤维细胞和上皮细胞均有,随后迅速向外扩散,培养10d左右细胞可达到80%~90%汇合。三者研究都表明成纤维细胞为梭形,组织块培养3~4d可见细胞从组织块边缘向外生长,9~10d后细胞即可长满。组织块培养法已成功建立云岭黑山羊[14]、云南半细毛羊[17]、崂山奶山羊[18]、滩羊[16,19]等成纤维细胞系。

1.1.2酶消化法潘求真等[18]比较组织块法和酶消化法研究发现,消化培养法第2天就可见细胞贴壁生长,而组织块培养法3~5d才见到成纤维细胞从组织块周围游离出来,形成生长晕。同时成年组织常要消化2h以上,消化时间延长对细胞的伤害较大,降低了有活力细胞的产率。胎儿组织用消化法30~40min即可获得大量的解离细胞。但组织块培养法更简单易行,细胞均质性好;不足之处是原代培养所用时间较长。李裕强等[20]研究结果表明,组织块贴附培养和分散单细胞接种培养均能获得原代山羊皮肤细胞。酶消化法C(含15OIU/mL胶原酶I(Sigma)、10%NCS的DMEM,5%CO

、37℃、饱和湿度下静置培养消化10h)和D(含150IU/mL胶原酶Ⅰ、100IUm/L透明质酸酶(华美公司)的无血清

DMEM,37℃、5%CO

、饱和湿度下静置培养消化6h)均可获得高浓度的单细胞悬液,但C法所获细胞的贴壁效果更好。

因此,组织法和酶消化法均能成功培养羊耳部组织原代成纤维细胞。一般来说,组织法在原代细胞传代时也结合酶消化法来进行,胰蛋白酶-EDTA(0.15%胰蛋白酶,0.02%乙二胺四乙酸)(TE),温度37~38℃,作用2~10

min。

图1传代培养前细胞50×

Fig.1Fibroblast cell before transfer of culture

50×

图2正在消化中细胞100×

Fig.2Straggling fibroblast cell by T-E

100×

图3传代培养2d细胞100×

Fig.3Transfer of culture fibroblast cell2day

100×

图4传代培养细胞(相差IPH)50×

Fig.4Transfer of culture fibroblast cell(PCM IPH)50×注:图片均来自本实验室。

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1.2原代细胞传代培养与纯化原代细胞生长至80%汇合时,就应该对原代细胞进行传代与冻存,否则,由于细胞密度增大和营养成分代谢消耗会造成细胞损伤,甚至死亡。在传代培养过程中,根据上皮细胞和成纤维细胞对酶消化的敏感性不同及二者贴壁速度不同,掌握合适的消化时间,经2~3次传代即可将二者分离,获得纯化的成纤维细胞系。具体操作过程可参照吴帅帅等[14]、潘求真等[18]方法。

1.3成纤维细胞冻存与复苏据张元兴等[21]报道冷冻过程为:选择处于对数生长期的细胞,按常规方法消化细胞,用细胞冻存液(DMEM+10%FCS+10%DMSO)制成细胞悬液。调整细胞密度为1×106~3×106个细胞/mL,分装于1.5mL冻存管(每管中加1mL)中。细胞先在4℃冰箱中放置30~60min,然后转入-20℃,放置30min;再转入-80℃16~18h(或过夜);最后放入液氮中长期保存。将冻存管从液氮中取出,迅速投入42℃左右温水中,快速晃动使冻存管解冻,待细胞悬液完全融化后,将其转移至10mL离心管中,用细胞培养液稀释后,2000r/min离心5min,弃除上清液,相同条件再离心1次,弃除上清液。加入适当培养液稀释后,接种于24孔板中,38.5℃,5%CO

,饱和湿度培养箱中培养。

潘求真等[18]研究发现,用常规冻存方法冻存细胞中,DMSO和乙二醇的冻存率分别为70%~80%和60%~75%。DMSO的冻存效果较好,且细胞复苏后10~15h可见细胞贴壁。关伟军等[22]研究表明,DMSO+FBS冷冻液细胞冻存前和复苏后的平均活率分别为96.5%、94.6%,说明液氮冻存对细胞影响不大,冻存的各项条件对细胞损伤很小。

2羊成纤维细胞生物学特性检测

2.1细胞活力测定总细胞中活细胞所占的百分比叫细胞活力。复苏后的细胞要检查活力,了解冻存和复苏的效果。常用活力测定方法有台盼蓝(TB)排除检测[16]、溴化乙锭(EB)和碘化丙锭(PI)检测[14,17]等。TB法死细胞着蓝色,活细胞不着色。EB和PI法死细胞发橙红色荧光。关伟军等[23]报道TB染色法过程为:按1:2将细胞悬液和TB液混合,滴入细胞计数板。2min后显微镜下计数至少200个细胞数,分别统计死、活细胞数,计算活细胞百分比。EB和PI法为:取细胞悬液、EB和PI染液各0.5mL混匀,静置10~30min,荧光镜下计数,2h内荧光稳定。

2.2生长曲线生长曲线是观测细胞在一代生存期内增殖过程的重要指标,也是了解培养中细胞生长与死亡的动态变化最简单直观的方法。方法为:取对数生长期的细胞,调整细胞密度接种于培养板。从接种时间算起,每隔24h计数3孔内的细胞密度,算出平均值,共计7d。以培养时间(d)为横坐标,细胞密度为纵坐标做生长曲线。羊成纤维细胞生长曲线呈“S”型,经历潜伏生长期、指数生长期及平台期[14,16-17,19]。

2.3染色体分析染色体制备及核型分析步骤为:在对数生长期细胞中加入终浓度为0.25μg/mL秋水仙素培养2.5h,胰酶消化细胞制成细胞悬液,经1600r/min离心5min,弃上清。加入0.075mol/L氯化钾于室温下放置40min,离心弃上清。第一次固定时,加入5mL甲醇与冰乙酸的混合液(体积比为3‥1)(现用现配)固定30min。离心弃上清。再经第二、三次固定,方法同第一次。弃上清,留0.5~1.0mL制成细胞悬液,用100μL移液器吸取细胞悬液,滴在冰冷洁净的载玻片上,于75℃烤箱中干燥3h,Giemsa染色20min。挑选形态清晰、分散度良好、收缩适中的染色体中期分裂相,在油镜下拍照,并统计染色体数目。利用PHOTOSHOP软件进行染色体剪贴,对同源染色体进行配对、测量、排队,并按Levan标准(1964)确定着丝粒类型[18-19,24]。

2.4同工酶分析在细胞培养操作过程中,很可能会发生种间交叉污染。乳酸脱氢酶(LDH)同工酶和苹果酸脱氢酶(MDH)谱系分析可得到清晰的特征谱系,从而检测细胞遗传性能是否稳定、未发生交叉污染[22,25]。LDH是一种参与糖代谢的重要的酶,催化乳酸氧化成丙酮酸,同时NAD+还原成NADH,或催化两者的逆向反应。LDH同工酶的生成受代谢物和遗传基因的双重控制,在组织分化过程中由于A、B基因调控和表达不同,因而LDH同工酶在电泳

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酶谱上,就会出现种属的特异性和组织器官的特异性。

细胞内的MDH同工酶一般分为线粒体型(m-MDH)和细胞质型(s-MDH)两种,前者分子量比后者大,而等电点比后者高,在电场作用下泳动速度比后者慢。

LDH同工酶和MDH是研究的最多的两种同工酶,常采用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳技术来获得酶谱。同工酶分析技术操作过程可参照关伟军等[22]、娜仁图娜拉[25]报道的操作方法。

2.5微生物检测

2.5.1细菌、真菌检测真菌污染易发现,大多呈白色或浅黄色小点漂浮于液面,在倒置相差显微镜下可辨别真菌种类。细菌污染初期,显微镜下不易观察、判断,可用无抗生素培养液培养,有大量细菌的液体,呈现浑浊、沉淀、变色或漂浮,并伴有气泡冒出。具体检测方法可参照陈亮等[16]、关伟军等[22]报道的方法。

2.5.2病毒检测检测方法主要有直接观察、动物接种检测、电子显微镜检查、免疫学及PCR法等。培养中,在相差显微镜下注意观察有无蚀斑、空斑等病毒损伤情况。对高代细胞或需培养细胞做红细胞吸附试验,以检测感染带有凝血素病毒。红细胞吸附试验方法参照O'Brien等[26]。

2.5.3支原体检测支原体检测方法主要有相差显微镜观察、低张处理地衣红染色观察、荧光染色、聚合酶链式反应(PCR)法等。相差油镜观察,可见支原体呈暗色微小颗粒,有类似布朗运动的表现,多位于细胞表面和细胞之间。应注意支原体与细胞破碎后形成的碎片和释放的细胞器如线粒体等相似,应细区别[23]。荧光染色检测利用荧光试剂Hoechst33258标记细胞和支原体DNA,观察支原体是否存在。美国典型培养物保藏中心(ATCC)使用DNA荧光染色法检测支原体,具体染色检测方法参照关伟军等[23]方法。

3羊成纤维细胞技术展望

目前,羊细胞培养保存技术已经成熟,成功保存了很多羊细胞[8,10-12,14-20,22,24-25]。从狭义上来讲,当所保存的物种个体数达到一定样本含量(一般为n≥30)时,便可称之为该物种的细胞库。ATCC是目前为止世界上规模最大的细胞库,也是最权威的细胞库。2001年以来,我国已经建立了64个重要、濒危畜禽品种成纤维细胞库和8个野生动物品种成纤维细胞库;建立了重要、濒危畜禽品种体细胞库构建和生物学特性研究的技术平台,实现濒危畜禽品种种质资源的长期保存[23]。体细胞技术涉及细胞生物学、动物细胞体外培养和检测技术,应用到畜牧业可促进畜禽生物保种(精子、卵母细胞、胚胎、体细胞)、育种(体细胞克隆、转基因)工作发展,对促进我国现代畜牧业进一步发展意义重大。

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(编辑:郭雪峰)

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细胞周期同步化1

细胞周期同步化 借助某种实验手段(自然地或经人为地),使细胞群体中处于细胞周期不同时相的细胞停留在同一时相的现象。 细胞周期同步化分:自然同步化和人工同步化。 自然同步化:是自然界存在的现象, 在动、植物细胞都有发现。它们不受人为条件的干扰, 因而有可能在接近自然的条件下进行观察, 但自然同步化的细胞群体受到诸多条件的限制, 对结果有很大的影响。 人工同步化:是利用细胞培养的方法, 用各种理化因素处理获得的同步化生长的细胞。常用的细胞人工同步化的方法分为选择同步化、诱导同步化或者两者的结合。 同步化分类及方法 (一)自然同步化 1.多核体 如粘菌只进行核分裂,而不发生胞质分裂,形成多核体。数量众多的核处于同一细胞质中,进行同步化分裂,使细胞核达108,体积达5~6cm。疟原虫也具有类似的情况。 2.某些水生动物的受精卵 如海胆卵可以同时授精,最初的3次细胞分裂是同步的,再如大量海参卵受精后,前9次细胞分裂都是同步化进行的。 3.增殖抑制解除后的同步分裂 如真菌的休眠孢子移入适宜环境后,它们一起发芽,同步分裂。 (二)人工同步化 1.选择同步化 1) 有丝分裂选择法:使单层培养的细胞处于对数增殖期,此时分裂活跃,分裂指数高,MI高。有丝分裂细胞变圆隆起,与培养皿的附着性低,此时轻轻振荡,M期细胞脱离器壁,悬浮于培养液中,收集培养液,再加入新鲜培养液,依法继续收集,这样每隔1h摇一次并收获一次,倾出培养液贮存于2~4℃冰箱中保存可连续收集24h,则可获得一定数量的中期细胞。其优点是,操作简单,同步化程度高,细胞不受药物伤害,缺点是获得的细胞数量较少。(分裂细胞约占1%~2%) 2)细胞沉降分离法:不同时期的细胞体积不同,而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比,因此可用离心的方法分离。其优点是可用于任何悬浮培养的细胞,缺点是同步化程度较低。 2.诱导同步化 1)DNA合成阴断法:选用DNA合成的抑制剂,可逆地抑制DNA合成,而不影响其他时期细胞的运转,最终可将细胞群阻断在S期或G/S交界处。5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度ADR、GDR和TDR,均可抑制DNA合成使细胞同步化。其中高浓度TDR 对S期细胞的毒性较小,因此常用TDR双阻断法诱导细胞同步化:

血管紧张素Ⅱ在心肌纤维化形成中的作用

中国微循环2004年2月第8卷第1期?5? 血管紧张素Ⅱ在心肌纤维化形成中的作用 赵凌杰,商玮,蔡辉 中图分类号:R542.2+3文献标识码:A 文章编号:1007-8568(2004)01-0005-03 心脏是由心肌细胞和几种非心肌细胞(成纤维细胞、平滑肌细胞和内皮细胞)构成的,非心肌细胞约占心脏细胞总数的三分之二,其中90%以上是成纤维细胞,它是合成和分泌细胞外基质的主要细胞。虽然婴儿出生后心肌细胞立即丧失增殖能力,但非心肌细胞仍然增殖,甚至在成人心脏也如此[1]。心肌纤维化有多种分型,大多根据有无心肌细胞坏死和瘢痕出现,而分为修复性心肌纤维化和反应性心肌纤维化。在心肌纤维化的发生发展过程中,血管紧张素Ⅱ(An gⅡ)的作用是非常重要的。 1血管紧张素Ⅱ的作用特点 An gⅡ生理功能的发挥主要是通过AT1受体和G蛋白构成的耦联型受体介导的,除了与传统上介导信号传递的G蛋白相耦联外,最近研究还显示, AT1可增加其细胞内底物的酪氨酸残基磷酸化,包括信号转导子与激活转录子(si g nal transducers and ac2 tiva-tors of transcri p tion,ST AT)家族。An gⅡ还可直接通过其AT1受体诱导ST AT复合体蛋白顺式诱导因子(sis-inducin g factor,S LF)的形成,S LF可与脱氧核糖核酸(DNA)序列综合,存在于许多基因的增强子中,这提示An gⅡ介导的炎症过程与器官重构是通过JAK-ST AT途径实现的,而该途径在调节基因转录,心血管细胞生长与发育以及炎症过程中具有重要作用[2]。S ano等[3]发现自发性高血压大鼠心肌成纤维细胞胶原合成量是正常W isttar-K y oto大鼠的1.6倍,给予An gⅡ刺激后胶原合成增加的反应也明显强于W isttar-K y oto大鼠,提示高血压大鼠心肌成纤维细胞对An gⅡ的反应性增强。对心室舒张功能不全的心脏病患者的室壁进行活组织检测表明,病变心脏的AT1受体表达增强,且与心肌肥厚的程度呈正相关。以上事实说明AT1受体在心肌成纤维细胞上的表达具有可被诱导性[4]。 2血管紧张素Ⅱ对心脏成纤维细胞增殖的作用 血管紧张素Ⅱ具有生长因子样作用,是刺激心肌肥大的重要体液因素之一,并可刺激心脏成纤维细胞增殖。许松等[5]通过对钙调神经磷酸酶在血管紧张素Ⅱ刺激的心脏成纤维细胞增殖中作用的研究发现,An gⅡ可使心脏成纤维细胞Ca2+浓度及CaN 活性明显增高,An gⅡ可显著刺激心脏成纤维细胞DNA合成速率增加。应用CaN抑制剂CsA(0.1~10μm ol/L),该浓度不引起细胞明显毒性作用(LDH释放和降解排斥染料数的变化均无统计学意义),CsA 以浓度依赖的方式抑制An gⅡ刺激的DNA合成速率增加,这些结果提示CaN可能参与An gⅡ刺激的心脏成纤维细胞增殖的信号传递。 方淑贤等[6]通过采用体外培养的心肌成纤维细胞的方法对芦沙坦对心脏成纤维细胞胶原Ⅰ、Ⅲ型mRNA表达水平的影响的研究发现,在生长因子An g Ⅱ的刺激下,C oⅠmRNART-PCR产物比对照组增加10倍,C oⅠⅢmRNART-PCR产物比对照组增加4倍,提示An gⅡ可直接调控胶原Ⅰ、Ⅲ型基因mR2 NA的表达水平,且对C oⅠmRNA表达调控作用强于对C oⅢmRNA表达调控作用。芦沙坦可直接抑制生长因子An gⅡ对C oⅠ和C oⅢmRNA表达调控作用,表明AT1受体激活对成纤维细胞胶原基因的转录水平有一定调控作用。提示芦沙坦不仅可通过抑制心肌细胞的肥大,也可通过调控成纤维细胞胶原基因的转录水平来达到逆转心肌纤维化的目的。 G rohe等[7]发现An gⅡ可以促进心肌间质成纤维细胞早期反应基因(如c-fos)的表达,加速其增殖,促进纤维化相关癌基因(c-fos,c-j un,E g r-1,纤维连接蛋白基因)表达,并参与细胞表型的调控,纤维化相关癌基因表达增强将导致心肌间质纤维化与心脏表型的“胎心化”。 体外研究也显示,机械牵张可以诱导心肌细胞储存的An gⅡ释放并导致心肌细胞的肥大,表明An gⅡ在压力依赖性心肌肥厚发病中发挥关键性作用。在An gⅡ转基因大鼠(心脏高表达An gⅡ)模型中显示,尽管An gⅡ转基因大鼠无高血压发生,但因An gⅡ表达增强而大鼠最终发展为心肌肥厚,提示 作者单位:210002江苏南京,南京军区南京总医院中医科 第一作者简介:赵凌杰(1966-),女,蒙古族,博士。从事中西医 结合基础研究。 ?心血管专辑?

成纤维细胞原代培养

利用组织块可以成功地培养得到原代培养的人皮肤真皮成纤维细胞。培养中应该注意以下事项: ①一般皮肤主要取白手术过程中切除的部分组织,方法似外科取断层皮片手术操作,但组织一般2—3cm 即可,注意取材时不要用碘酒消毒.此外,不要切取太厚,要尽量去除皮下组织,如果皮下脂肪太厚会影响组织块的贴壁,不易于日后细胞的游出. ②尽量去除表皮,如有表皮未被完全剔除,则可能造成表皮细胞竞争生长,最为常见的为角质形成细胞的污染,它可以和成纤维细胞共同生长.虽说在今后的传代培养时可通过细胞纯化方法适当去除,但这种混和生长状态会对后续实验产生影响.所以,一旦发现细胞污染,应立即停止实验,重新培养. ③在剪切组织块时要注意保持组织块湿润,可向其表面滴加几滴培养液,要始终保持其成湿润状态,这一点要特别注意而且十分重要.剪切时要掌握好时间,尽量在短时间内完成. ④组织块在最初贴壁时不是很牢固,所以开始加液不应太多,以刚刚浸没组织块为易,特别要注意,在最初几天时要减少移动培养瓶次数,避免过多晃动而造成组织块脱壁,最好在开始3 d内不换液.⑤文献报告成纤维细胞培养多在CO 培养箱内进行,培养箱内环境为CO 浓度50 ml/L,湿度95%,培养瓶为开放式.因其湿度,温度及氧气与人体内实际情况较为接近,所以适合成纤维细胞的成长.但开放式培养的同时也增加了细胞培养污染的机率,所以,可以根据

自己实验室的条件选用合适的培养方法,如半开放式和充气后密闭瓶口,其效果也十分理想.但同时要密切观察培养液的pH变化,以保持适宜的酸碱度. ⑥细胞培养失败的最常见原因是污染,其中以微生物污染最常见,污染一旦明确,多数将无法救治,应尽快弃之,以防止污染扩大,影响其他细胞.因此,应在各个阶段严格遵守无菌操作原则,把好每一关口,尽可能禁止其他污染的物品进入操作环节,以避免造成时间、人力、物力的浪费.

小鼠皮下脂肪细胞使用说明

小鼠皮下脂肪细胞 小鼠皮下脂肪细胞产品说明: 为使能尽快开展实验,派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期,且每次发货为汇合率达到70%的细胞,收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠皮下脂肪细胞取自新鲜的组织,按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠皮下脂肪细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件,降低杂细胞污染,保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时,派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程,所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测,保证细胞纯度在90%以上;同时也需经过微生物检测,保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠皮下脂肪细胞注意事项: 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好,培养液是否有漏液、浑浊等现象,若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书,了解细胞相关信息,如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用,细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合,使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片,记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研,不得用于临床应用。 小鼠皮下脂肪细胞产品简介: 1、产品名称:小鼠皮下脂肪细胞 2、组织来源:小鼠脂肪组织 3、产品规格:5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠皮下脂肪细胞简介: 小鼠皮下脂肪细胞来源于小鼠脂肪组织,皮下脂肪细胞主要功能: (1)脂肪细胞能储存能量并参与身体代谢。 (2)脂肪细胞分化是一个发展的过程,它对代谢稳态和营养信号很重要。(3)前脂肪细胞存在于小鼠脂肪组织中,能根据能量的平衡增殖和分化成熟的脂肪细胞。前体细胞的增殖和分化能够增加脂肪组织的体积。 (4)前脂肪细胞与脂肪分化以及许多生理病理过程密切相关,如脂肪代谢、能量平衡、肥胖、糖尿病、高血脂和乳癌,所以小鼠皮下脂肪细胞对这些疾病的研究提供素材。

小鼠成纤维细胞原代培养.docx

实验-小鼠成纤维细胞的原代培养 一.实验目的 1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。 2 ?熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。 3?了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。 二.实验原理 自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶,细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖,因此,细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分,而且已经成为生物化学、生物物 理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。 如今,细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。 细胞培养是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下,使其生存、生长、繁殖和传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。依据取材于动物组织或培养细胞,细胞培养分为原代培养和传 代培养。 1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养是建立细胞系的第一步,其最基本的方法有两种:组织块培养法和消化 培养法。 组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官,通过组织块直接长出单层细胞,该培养法是最常用的原代培养方法,其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶 中作为实验材料,一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。组织块培养法操作过程简 便、易行,培养的细胞较易存活,适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。 消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后,在不加任何粘附剂的情况下,直接移植在培养瓶壁上,加入培养基立即进行培养的方法。该方法主要使用生物化学手段将 较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化,使组织中结合紧密的细胞连接 松散、相互分离,细胞失去与间质的连接,活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液,分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动,在短时间内即可贴壁生长成片。胰蛋白酶

小鼠肾成纤维细胞使用说明

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鸡胚成纤维细胞的制作及培养

鸡胚成纤维细胞培养 1、准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、 75%酒精擦拭手至肘部。 2、布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3、选胚:取9-10日龄鸡胚,(注:鸡胚日龄越小,形成细胞活力越好,但产量较低)用新 洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。 4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼,放灭菌生理盐水中。 5、把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 6、剪切:用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块,以便于消化。 7、处理组织:将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中,其中加入0.25%的 胰酶,10个胚约7ml,或加组织消化液,一个胚1ml(组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导)结扎瓶口或塞以胶塞。 8、消化:将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴,消化中应不停摇动,如用电磁恒温搅拌器 消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10-15分钟。一般约12分钟。视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短。见组织松软即可。一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。 9、分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织 已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,加入0.5%的含5%犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank,s液少许。(制法见微生物试验实习指导),用力震摇,或用吸管吹打。 使细胞分散,脱落。然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清(可以不离心吸掉上清),加入适量含有血清的培养液。 10、计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培 养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。分装在细胞培养瓶中。视细胞多少而定加入培养基。 培养基为0.5%的含5%犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank,s液. 11、将其置入co2细胞培养箱中,37度。瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易 生霉菌,每次换液时需要换新塞。培养24小时进行观察。一般在24-48小时可形成单层细胞。 传代 1. 倾倒培养瓶内旧培养液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许,以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中2~5分钟,当发现细胞质回缩,细胞间隙增大后,立即终止消化。 4. 吸除消化液,向瓶内注入Hanks液数毫升,轻轻转动培养瓶,把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时,动作要轻,以免把已松动的细胞冲掉流失,如用胰蛋白酶液单独消化,吸除胰蛋白酶液后,可不用Hanks液冲洗,直接加入培养液。 5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞,使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后,把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中,置温箱中培养。

成纤维细胞生长因子及其与受体作用机制的研究进展

成纤维细胞生长因子及其与受体作用机制 的研究进展1 姜媛媛,任桂萍,王文飞,郝建权,李德山 东北农业大学生命科学学院生物制药教研室,哈尔滨(150030) E-mail:deshanli@https://www.doczj.com/doc/da14770804.html, 摘要:成纤维细胞生长因子(FGF)是一类多肽类物质,其中大多数成员可与肝素结合发挥作用。目前已知FGF至少包括23个因子,即FGF1~23。部分FGF家族成员N末端有大约3O个氨基酸残基组成的典型信号肽序列,可以分泌到细胞外。FGF家族成员是一类生理功能较广泛的生长因子,功能包括促进细胞有丝分裂、趋化与血管生成、促进中胚层和神经外胚层细胞的存活与生长等。本文根据最近的研究成果对 FGF因子及其受体研究进展做一综述,并主要对FGF因子特征及其研究趋势进行了探讨。 关键词:FGF,FGF受体,肝素 中图分类号:Q74 引言: 成纤维细胞生长因子最早是从脑和垂体的提取液中发现的,该物质是一种能促进成纤维细胞生长的多肽类活性物质,可以通过与细胞膜特异性受体结合对细胞生长进行调节。从70年代中期到目前已进行了大量广泛的研究,目前已知FGF至少包括23个因子,它们在一级氨基酸序列上有一定的同源性,并有类似的生物学功能,且广泛存在于体内多种组织中。FGF对中胚层和神经外胚层来源的细胞具有十分明显的促细胞分裂增殖作用,并且在机体内的胚胎发育、细胞生长分化、创伤组织愈合及肿瘤发生发展中起着十分重要的作用。 1. 成纤维细胞生长因子(FGF)家族 成纤维生长因子(Fibroblast growth factor, FGF)又被称为肝素亲和生长因子(Heparin binding growth factor, HBGF),是一类通过与细胞膜特异性受体结合发挥作用的多肽分子。现已知FGF家族至少包括23个成员,即FGF1~FGF23。FGF家族成员之间的氨基酸序列同源性约为25%~50%,其每个成员都有140个氨基酸的中轴,该中轴在不同的成员中有高度的同源性。结构分析表明,此中轴折叠成12条逆向平行的β链,它们又进一步形成圆柱状的结构。部分FGF家族成员N末端有大约3O个氨基酸残基组成的典型信号肽序列,使得它们可通过内质网一高尔基复合体的经典(即自分泌和旁分泌)途径被分泌到细胞外,但其中也有部分FGF则因本身缺乏信号肽结构,不能向外分泌,只能在细胞受损时释放[1]。多数FGF(如FGF3~8、10、15、17~19、21~23)的N末端具有典型的信号肽序列。而FGF16和FGF20虽然没有明确的信号肽序列却也能高效地分泌到细胞外[12]。FGF1 和FGF2也缺乏信号肽序列和正常的分泌途径,却也能出现在胞外基质,推测两者可能来自受伤的细胞,或者通过与内质网-高尔基体通路不同的细胞脱颗粒机制释放至胞外的。此外,FGF 11~14没有典型的信号肽序列,因此认为这些FGF是在胞内发挥作用[13]。由于FGF家族成员之间的氨基酸序列有25%~50%的同源性,分子结构有一定的共性,故FGF不同分子之间的生物学效应既有相似性,又有各自的特点[1-3]。 FGF1(aFGF)和FGF2(bFGF)是最先被发现,也是迄今为止研究最充分的两个成员,因其1本课题得到黑龙江省科技厅重点攻关项目(编号:2006G0461-00)的资助。

原代培养中成纤维细胞的抑制

成纤维型细胞:在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时,皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵园形核,胞质向外伸出2-3 厘米个 长短不同的突起,除真正的成纤维细胞外,凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。 培养细胞的纯化 【我是小米2】培养细胞的纯化: 1、自然纯化 即利用某一种类细胞的增殖优势,而排挤其他细胞生长,靠自然的增值潜力最后留下生长优势细胞,去除其他细胞。有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法,自然纯化建立细胞系。 2、人工纯化 (1)酶消化法 在消化培养细胞时,常是成纤维细胞先脱壁,而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁,特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显,因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。 (2)机械划除法 原代培养成功后,上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现,混杂生长。这种混杂生长常常分区成片,每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。 (3)反复贴壁法 成纤维细胞与上皮细胞相比,其贴壁过程快,大部分细胞常能在短时间内大约 10-30min完成附着过程,而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定,稍加振荡即浮起,这样可以利用此差别来纯化细胞。 (4)克隆法 采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞,使之分别生长成克隆,选择出所需要的克隆。 (5)培养及限定方法 某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质,否则无法生长,可以利用这种技术来纯化细胞。

(6)流式分选 brdu 【sxtyzyq2】除了Brdu能用于抑制成纤维细胞的生长,便宜易买到的 【snany】阿糖孢苷效果不是特别理想 【cl1202】我在SD大鼠胃粘膜壁细胞原代培养的文献中看到的:成纤维细胞大量生长是壁细胞分离培养失败的常见原因。培养基中加入血清会刺激成纤维细胞而抑制壁细胞生长,对壁细胞可能还有一定的毒性作用。为了减少成纤维细胞的生长,先加入含有胎牛血清(100ml/L)的培养液,时差贴壁30-45分钟,除去成纤维细胞,然后再换用无血清的培养液进行培养。不知道你有没有用?试试吧。 【sxtyzyq2】买sigma公司的brdu然后把它配成终浓度为1 mmol/l然后1ml 培养液中加入5微升就可抑制成纤维细胞 【gfeng8078】我是养心肌原代,也需要抑制成纤维细胞,请问各位大侠,5-brdu 用多大的浓度? 【cheerfulness】养心肌原代最初24h培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的brdu 【gfeng8078】你是怎么样达到0.1mmol/L的浓度呀,由于有培养液的存在,加了Brdu进去,自然就稀释了?我想把Brdu溶解于DMEM中然后一起抽滤,可是有报道说这对Brdu的药效有影响 【jiangbin1230】请问用组织块贴壁法能培养出肠的成纤维细胞吗?我试过很多次了,一个皿就只有零散的一二十个成纤维细胞,都是柱状上皮细胞,是否由于正常组织太少不能培养出啊?能帮帮忙吗? 【sdf771214】请问成纤维细胞的帖壁时间一般是多少?我养的是内皮细胞,如何时差帖壁啊? 【victoh】不同来源的成纤维细胞在不同培养支撑介质上的贴壁时间应该是不一样的,此外也还受到其他一些因素的影响,至于上皮细胞,其本身种类就更加复杂了 上皮细胞 【warmbull】我现在正在做的培养,但发现有几瓶细胞可能是被成纤维细胞(长梭形、透明细胞)污染了,后来成纤维细胞抑制了色素上皮细胞的生长。现在又出现了这种情况,请问各位大侠,有什么办法可以除去杂细胞?还有,我养的色素上皮细胞生长增殖很缓慢,有的甚至慢慢萎缩,会是什么原因呢?

原代小鼠心肌成纤维细胞提取

原代小鼠心肌成纤维细胞提取方法 1.提前配置0.8%胰酶 3mL、0.1%胶原酶II 10mL(均用DMEM配置),放入37℃水浴锅中预热15min;准备1个50mL的离心管,提前加入10mL含10%FBS的完全培养基,冰浴备用; 2.取5-10只7天出生内的C57乳鼠,用灭菌或消毒的组织剪剪开胸腔,迅速取出心脏,置于含2%双抗的预冷的DMEM培养基中; 3.将心脏组织转移至超净台,用DMEM反复清洗,取出血液、大血管组织,将组织放入1个1.5mL的EP管中,充分剪碎(小于1mm3); 4.用巴氏管向组织块中加入1mL预热的胰酶,反复吹打、吸入至含胰酶的离心管中,37℃水浴加热 3min,适当振荡;[循环1] 5.吸取上清液丢弃,余下的组织块中加入2mL胶原酶,37℃水浴加热5min,期间每分钟振荡1次,吸取上层液体至冰浴的完全培养基中;[循环2] 6.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后(约20次)后水浴消化4min,随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中;[循环3] 7.向组织块中再次加入2mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀2min后(约30次),此时肉眼可见组织块逐渐变小,呈透明粘液状,随后再次水浴消化4min,随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中;[循环4、5] 8.向组织块中再次加入1mL新鲜、预热的胶原酶,用巴氏管或移液枪吹打混匀1min后(约20次),此时肉眼可见组织块逐渐消失,消化液变得浑浊,再次水浴消化3min,随后吸取上层液体至冰浴的完全培养基中;[循环6、7]; 9.将50mL离心管中的液体分装入2个15mL离心管中,1000rpm离心6min,小心吸去上清液,组织/细胞沉淀加入1mL完全培养基吹打混匀后转移至50mL的培养瓶中,加3mL完全培养基(含4%双抗),2h后可见细胞贴壁,12h内换液;2-3d后常规传代(1:2),P1-2用于实验。

细胞原代培养细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名: 学号: 班级: 专业: 同组成员: 一、实验原理

细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一,可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来,故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法: 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎,每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次,自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20-30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液,离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清,加入带有双抗的培养基,放入培养瓶培养。 取材注意事项: 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时,要用锋利的器械,如手术刀或剃须刀片切碎组织,尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织,切碎组织时应避免组织干燥,可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等,一般来讲,胚胎组织较成熟个体组织容易培养,分化低的较分化高的组织容易生长,肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物:9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤

成纤维细胞同步化研究

不同浓度秋水仙素和nocodazole对绒山羊成纤维细胞周期同步化的影响 杨惠茹,肖红梅,蔡婷,俎红丽,于新蕾,刘志红,李金泉,王志新 (内蒙古农业大学动物科学学院动物遗传育种与繁殖重点实验室,呼和浩特 010018 ) 摘要:本文旨在探索更加优化的条件,使绒山羊成纤维细胞经处理后更多的处于有丝分裂G2/M 期。本研究分别采用秋水仙素和nocodazole (诺考达唑)试剂对绒山羊成纤维细胞进行周期同步化处理,用流式细胞仪检测G2/M 期的细胞数量进行比对,观测最佳作用浓度。结果表明,秋水仙素的使用浓度不宜过大;其次,添加秋水仙素时间的不同也会对试验结果产生明显的影响。另外在相同条件下,经nocodazole处理的绒山羊成纤维细胞周期同步化效果比秋水仙素好,最优的处理条件是300 ng/mL nocodazole处理成纤维细胞24 h,所得G2/M期的细胞所占比例为15.10%。结果提示对于绒山羊的成纤维细胞来说,细胞周期同步化处理时,选择nocodazole更好一些。 关键词:绒山羊;成纤维细胞;秋水仙素;nocodazole(诺考达唑);细胞周期同步化;流式细胞仪 Dolezel等(2011) 报道随着测序技术的发展,使用流式细胞仪分离单条染色体,将拓展测序技术应用的领域,对于山羊这种大基因组动物更有广泛的应用价值。流式细胞术可以分选出指定的染色体,能快速精确地检测染色体数目和结构的畸变,以及非整倍体和染色体缺失。目前已在l7个植物物种中利用流式细胞术对染色体进行分析与分选。Macas等(1993)利用FCM对碗豆的流式核型进行分拣,结合PCR技术对其DNA进行物理定位,成功实现了USP基因、碗豆球蛋白基因和假基因在相应染色体区域上的定位。施家琦等 (1998) 在人类的染色体分选研究中,通过采用流式细胞技术分离染色体实现对人二倍体成纤维细胞的单分散染色体核型的分析及分选。最近的研究中,Yang等(2011) 通过流式技术分离出单个染色体已经完成了基因组的测序工作。翟中和等(1992) 采用流式分离单条染色体工作的核心在于富集足量同步化的中期染色体的细胞核型,因此细胞同期化的处理是研究中最基础最为重要的一步。细胞周期时间长短的主要差别在G1期,而S期、G2期和M 期的总时长相对恒定,尤其是M期持续的时间更为恒定,常常仅持续半小时左右。通过添加有丝分裂抑制剂,来阻滞细胞的有丝分裂使其停滞在G2/M 期,人工调控增加G2/M期的细胞数量,为单条染色体分选做前期准备。目前,秋水仙素是一种最为常用的有丝分裂抑制剂,起作用机理在于抑制中期纺锤体的形成。nocodazole是一种类似于秋水仙素的细胞微管抑制剂,也可阻止微管蛋白聚合和纺锤体形成,使细胞同步于M期,从而使大部分细胞的发育停滞在G2/M期和M期,与秋水仙素试剂相比毒性较低。Tanaka等(1995)研究表明采用nocodazole处理法对大鼠进行同期化处理后,M 期细胞的数量显著增加。因此,本研究将采用这两种试剂对成纤维细胞同期化的最优化条件做探索。 1 材料和方法 1.1材料 1.1.1 试剂耗材和动物 秋水仙素、nocodazole、胎牛血清(Hyclone)、,0.25%胰酶(Gibco)、DMEM/F12培养基(Hyclone)、无水乙醇(国产)、DPBS(Hyclone)、青链霉素(Gibco)、PI(碘化丙啶)、15 mL离心管(corning)、50 mL离心管(corning)、细胞培养瓶(corning)25 cm2、塑料吸管。 本研究选用绒山羊公羊耳源组织,来自于内蒙古鄂尔多斯农场。 1.1.2 主要仪器设备 流式细胞仪( Beeton Diekinson FACSCalibur )、CO2恒温培养箱 ( Galaxy A,RXBiotech) 、

成纤维细胞

成纤维细胞 科技名词定义 中文名称:成纤维细胞 英文名称:fibroblast 定义: 普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。分泌前胶原、纤连蛋白和胶 原酶等细胞外基质成分,伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。 所属学科:细胞生物学(一级学科);总论(二级学科) 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 疏松结缔组织中的成纤维细胞 成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织的主要细胞成分,由胚胎时期的 间充质细胞(mesenchymalcell) 分化而来。成纤维细胞较大,轮廓清楚, 多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构,其细胞核呈规则的卵圆形,核仁

大而明显。根据不同功能活动状态,可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞,成纤维细胞功能活动旺盛,细胞质弱嗜碱性,具明显的蛋白质合成 和分泌活动,在一定条件下,它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维 细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分 重要的作用。 目录 细胞的功能活动状态划分 来源 特征 创伤修复 分离培养 原代培养 展望 展开 编辑本段 细胞的功能活动状态划分

根据不同的功能活动状态,将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型:成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞,细胞和细胞核较大,轮廓清楚,核仁大而明显,细胞质弱嗜碱性,具明显的蛋白质合成和分泌 活动;纤维细胞(fibrocyte)功能活动不活跃,细胞轮廓不明显,核 小着色深,核仁不明显,细胞质少。此二型细胞可互相转化。[1] 编辑本段 来源 成纤维细胞:数目最多,胞体大,为多突的纺锤形或星形的扁平 细胞,细胞核呈规则的卵圆形,细胞轮廓不清。 成纤维细胞摄取所需的氨基酸,如脯氨酸和赖氨酸等,在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链(proalphapolypeptidechain ),多肽链输送到高尔基复合体后,组成前胶原分子(procollagen )。前 胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面,然后通过胞吐作用释放到细胞 外。在前胶原肽酶催化下,将每一前α多肽链的尾段除去,成为原胶 原分子(tropocollagen )。许多原胶原分子成行平行排列,结合成具 有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结合形成胶原纤维。 编辑本段 特征 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞,由胚胎时期的间充质细 胞(mesenchymalcell)分化而来。在结缔组织中,成纤维细胞还以其成熟状态—纤维 细胞(fibrocyte)的

鸡胚成纤维细胞培养doc

一、鸡胚成纤维细胞的体外培养 鸡胚成纤维细胞在病毒学研究中十分常用。孵化8-12d的鸡胚可用作培养的材料来源。 (一)实验材料 1. 鸡胚:孵化10d的受精蛋数个。孵化方法是将受精蛋放到38.5℃孵卵箱或恒温箱中,静置。每日翻动1—2次,以防止鸡胚粘连到蛋壳上影响发育。箱内湿度(40~70%)可通过在箱底放一盛水盘来维持。鸡胚的孵化期为2ld。孵化前,如遇蛋壳表面污物较多,可用刀片等器具刮除,不要用湿布擦拭,更不能用酒精棉球消毒或者用水洗蛋。孵育前可将受精蛋保存在10℃左右,保存期一般不超过10d。也有人将受精蛋保存在4℃冰箱中。 2. 消化液:含0.25%胰蛋白酶、青霉素100 1U/ml、链霉素100 μg/ml混合消化液。用Hanks 液或HEPES液配制。 3. 培养液:DMEM培养液,添加10%-20%的胎牛血清(FCS)、青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/mL。 4. 其它培养用品:手术器械、平皿、三角瓶或15ml血清瓶、离心管、100目不锈钢筛网、培养瓶或培养板、振荡水浴箱、离心机等。 (二)操作步骤 1)取孵化10d的鸡胚,分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒,晾干。用一已消毒金属器具将受 精蛋大头端击破,用镊子小心夹去破碎蛋壳,然后撕去气室外面的膜,暴露出尿囊绒膜及附着的血管。开口大小以受精蛋内容物不溢出为宜,但不宜太小。用镊子轻轻夹住鸡胚的颈部,小心取出鸡胚,放于无菌培养皿中,除去头部、四肢、内脏和皮肤。 2)胚体用Hanks液或生理盐水清洗3次,切成1-2 mm3的小块,然后转移到容积适中的 三角瓶或15ml血清瓶内。 3)加入适量消化液,一般每10个鸡胚加20 m1消化液,用胶塞密封瓶口。 4)在振荡水浴箱上37℃慢速搅拌5-10 min。加入少量血清钝化胰蛋白酶。然后通过100 目不锈钢筛网,制备细胞悬液,将细胞悬液转移到离心管中。 5)离心(800 rpm,10 min),弃上清液,将细胞沉淀用培养液洗2次。 6)加入培养液,用吸管吹打制成细胞悬液。用血球计数板计数细胞。 7)以0.2~1X06个细胞/ml的密度接种细胞。于37℃、5%CO2培养箱中培养。每2-3d换 液1次。待细胞汇合成片后,可行传代培养。 (三)结果 在倒置显微镜下观察,用8~12d龄鸡胚培养的细胞主要为具有长突起的梭形、星形或三角形的成纤维细胞。用I型和Ⅲ型胶原的抗体作免疫细胞化学分析,培养物以呈阳性反应的成纤维细胞为主。 (四)讨论 鸡胚成纤维细胞在普通培养液中具有生长优势,一般不需特殊处理,经几次传代后就可逐渐排除其它细胞,得到较纯的成纤维细胞。体外培养的胚胎细胞的形态与所取鸡胚的胚龄有关。若用体节前期的胚胎,培养的细胞不是典型的长的或星形的成纤维细胞,而为宽扁的细胞,这可能与胚胎细胞的分化状态有关。

乳腺癌相关成纤维细胞的研究进展

四综述四乳腺癌相关成纤维细胞的研究进展 陈珊珊 姚和瑞 DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0807.2012.03.013 基金项目:国家自然科学基金资助项目(30973505,30945201);广东省科技计划资助项目(2009B030801005);广州市科技计划资助项目(2009Y?C011?1) 作者单位:510120广州,中山大学孙逸仙纪念医院肿瘤科 通信作者:姚和瑞,E?mail:yaoherui@https://www.doczj.com/doc/da14770804.html, 恶性肿瘤严重威胁着全人类的健康与生命三近年来,肿瘤基础研究领域的一个重要进展是发现肿瘤微环境对肿瘤生物学行为的调控,即不再认为肿瘤的发生二发展仅与肿瘤细胞有关,而是肿瘤细胞与间质成分构成的肿瘤微环境相互作用的结果三肿瘤相关成纤维细胞(tumor?associated fibroblasts,TAFs)是肿瘤间质的主要成分,参与肿瘤的结构支持并可分泌多种细胞因子三越来越多的研究者认为TAFs 不仅仅是肿瘤结构的机械性支持,而且通过多种信号途径直接参与肿瘤的发生及发展三笔者就TAFs 的来源二功能及其在乳腺癌中的作用进行综述三 1 TAFs 的来源及特征1.1 TAFs 的来源(1)20世纪90年代的研究已证实,间质内的成纤维细胞在难以修复的组织损伤或慢性炎症等因素刺激下可活化为TAFs;血管平滑肌细胞和周细胞亦可转化为TAFs [1]三(2)近几年研究发现,发生上皮?间质转化(epithelial?mesenchyonal transition,EMT)的肿瘤细胞[2]以及内皮细胞也可能转化成为TAFs [3]三肿瘤细胞发生EMT,并通过转化生长因子?β(transforming growth factor?β,TGF?β)下调上皮钙黏着蛋白(E?cadherin)的表达,促使上皮细胞向间质细胞转化三(3)来源于骨髓的CD34+干细胞也可转化成为TAFs三Quante 等[4]的最新研究证实至少有20%的TAFs 来源于骨髓及间充质干细胞三1.2 TAFs 的特征 形态及标志:TAFs 的形态与正常成纤维细胞相似,呈长梭形,核不规则,细胞质中含有多种收缩纤维蛋白二丰富的粗面内质网二细胞间连接和纤维连接蛋白(fibronectin,FN)三TAFs 可合成分泌蛋白质二胶原纤维二弹性纤维二网状纤维及有机基质等,除表达间质细胞的标志物波形蛋白(vimentin)外,还表达其特征性标志物平滑肌肌动蛋白α(α?smooth muscle actin,α?SMA)三这是其

心脏成纤维细胞原代细胞培养

乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养 一、实验动物 1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。 二、试剂及配制 高糖DMEM(gibco)、Ⅰ型胶原酶(MP)、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清(gibco 160000-044)、青霉素-链霉素混合液(solarbo)。 培养液:DMEM培养基:FBS:双抗100:10:1(45ml:5ml:0.5ml) 酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH7.2 ~7.4)稀释,配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ 型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH7.2~7.4) 中,配成0.1%的胶原酶消化液。0.1%胰蛋白酶及 01%Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。 三、实验仪器 超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机?? 四、组织消化和分离细胞 1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5s, 转移至超净台。 用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。 2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。用眼科虹膜剪在剑 突处正中线 稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部 , 取 出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。 3、将鼠心脏全部取出后 , 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷PBS液清 洗3次, 去除血污。 4、将心脏剪成约1mm×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪 刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。 5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍,37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器 ,60r/min 搅拌 10min, 吸管轻轻吹打组织块 1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。 6、再次加入消化酶液8~15ml消化8min。 五、培养细胞 1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后,1200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。

小鼠真皮成纤维细胞使用说明

小鼠真皮成纤维细胞 小鼠真皮成纤维细胞产品说明: 为使能尽快开展实验,派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期,且每次发货为汇合率达到70%的细胞,收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠真皮成纤维细胞取自新鲜的组织,按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠真皮成纤维细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件,降低杂细胞污染,保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时,派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程,所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测,保证细胞纯度在90%以上;同时也需经过微生物检测,保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 注意事项: 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好,培养液是否有漏液、浑浊等现象,若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书,了解细胞相关信息,如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用,细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合,使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片,记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研,不得用于临床应用。 小鼠真皮成纤维细胞产品简介: 1、产品名称:小鼠真皮成纤维细胞(Mouse dermal fibroblast cells) 2、组织来源:小鼠乳鼠背部皮肤组织 3、产品规格:5×105cells / 25cm2培养瓶 小鼠真皮成纤维细胞简介: 真皮成纤维样细胞是真皮组织的源细胞,是创面愈合的主要修复细胞。该细胞的体外分离、培养、诱导、分化,是创面修复的相关研究的关键之处。 本公司生产的小鼠真皮成纤维样细胞采用混合酶消化制备而来,细胞总量约为5×105cells/瓶,细胞纯度可达85%以上,且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。 小鼠真皮成纤维细胞培养基信息: 1)培养基类型:成纤维样细胞专用培养基

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