第九章内皮祖细胞 内皮祖细胞（EPC）是一类能循环、增值并分化为血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞。广义上认为EPC包括从血液血管干细胞分化为成熟内皮细胞的过程中所有一系列细胞。 第一节内皮祖细胞的分类与来源 一分类 从外周血中分离单细胞进行体外培养，3--5天后出现纺锤体形细胞，在2---3周生长达到高峰，在第4周死亡，称为早期EPC； 另一种细胞在第2---4周出现，成鹅卵石形，在4---8周呈指数生长，可存活12周，称为晚期EPC。 早期EPC主要存在于骨髓中，主要表面标记是CD133（AC133）、CD34、VEGFR-2 晚期EPC强表达所有内皮系标记VE-cadherin、FL T-1内皮一氧化氮合酶、CD31等。 二来源 EPC的来源主要有一下几种 1.血液血管干细胞 根据 （1）
造血干细胞（HSC）血细胞成分 血岛（卵黄囊的腹侧） 血管内皮前体细胞血管内皮细胞（原始毛细血管网） (2)原始的HSC和EPC享有共同的细胞表面标志CD34、AC133、血管内皮细胞生长因子受体-2（VEGFR-2） (3)HSC存在的部位如骨髓、外周血、新生儿脐带血、胎儿肝、胎儿脾均已证实含有EPC。 2.髓系祖细胞 髓系祖细胞是单核细胞和巨噬细胞定向分化的前体细胞。然而，许多实验表明，在血管生成的培养条件下，髓系CD34-/CD14+单核细胞能够表达许多内皮细胞的特异标志，并可在体外形成网状结构。 成熟的CD34-/CD14+外周血单核细胞在VEGF诱导下也能分化为内皮细胞样细胞，这些细胞同时表达内皮细胞标记。把这些细胞和CD34+细胞一起注入体内时，发现他们能够结合到新生血管的管壁中去。这一实验表明不仅CD34+细胞能分化成内皮细胞，CD34-/CD14+单核细胞能够分化为有生理功能的血管内皮细胞，并可作为EPC的来源。 3.多潜能成体祖细胞 许多成体组织存在少许MAPC。在细胞因子的诱导下，MAPC可在体外分化为内、中、外各胚层，在特定组织中定向分化为相应的干细胞。目前，成体造血组织骨髓中已被证实存在MAPC，体内外研究证实MAPC细胞可以分化为心肌细胞和血管内皮细胞。心脏组织残留的MAPC也成功分离，研究显示
2．1小胶质细胞的原代细胞培养 2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。 第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定 2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。分离后的底层混
合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。 2．1．3免疫荧光鉴定步骤 1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。 2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟 3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右 4)PBS洗3次，每次5分钟 5) 5％BSA室温封闭30分钟 6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜 7)PBS洗3次，每次5分钟 8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时 9)PBS洗3次，每次5分钟 10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟 11)1xPBS洗3次，每次5分钟 12)95％甘油封片
血管内皮细胞体外培养 1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养中的EC形态呈"鹅卵石样"镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。 2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。 2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。 2.2 介绍几种主要EC的分离 2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离 2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管） a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。 b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。 c．注入0.1%胶原酶（1型）溶液，待血管内残留的D-Hanks液流尽后，用注射器封注另一端针头，继续注入胶原酶溶液，致血管充盈，放入37℃无菌的D-Hanks液中，消化15min 后取出。 d．收集血管内酶溶液，并且注入含20%小牛血清的M199培养液（pH 7.2）冲洗血管收集合并于同一容器内，以1000r/min离心7～10min。 e．去上清液，加入20%小牛血清的M199培养液重新悬浮细胞备用。 f．其它大血管如牛主动脉，猪主动脉等，可在无菌下分离，然后用线结扎血管各分支，再依上述步骤分离EC。 2.2.2 酶消化法小血管内皮细胞的分离 2.2.2.1 兔主动脉，大鼠主动脉因血管较小，分支极细，不能采用上述方法消化。 a．将动物主动脉取出后放D-Hanks中，将血管外的脂肪细组织分离干净，用丝线结扎血管一端，然后用探针顶住该端，将整条血管翻转，使内膜翻在外面。将另一端折入腔内0.5cm，并用丝线结扎紧，以防外膜外露及避免酶液进入外膜腔内。 b．用D-Hanks液清洗干净外翻的内膜面，然后血管浸泡在含0.1%胶原酶溶液的小瓶内，盖上瓶盖在37℃水浴中轻轻摇荡消化，使EC离散下来，消化15～20min后，见酶液稍有混
血管内皮细胞（endothelial cell, EC）体外培养 1．概述血管内皮细胞（endothelial cell, EC）是衬于心，血管和淋巴管腔内表面的一种单层扁平上皮细胞。EC极薄，厚度约为0.1～1μm，长约25～50μm，宽约10～15μm，在体内呈梭形，相邻细胞之间借少量粘合质彼此嵌合，细胞长轴与血流方向平行。其超微结构特点是在胞质中含有的特殊颗粒，称Weibel-palade小体（内含有与凝血有关的第Ⅷ因子相关抗原）；细胞间有紧密连接的缝隙相连。EC除了能保持血管壁内表面的光滑和通透性外，还有多种生物学功能：维持正常的血液流动性，分泌多种生物活性物质，在调节细胞生长，改变脂质代谢，维持血管壁的完整性，调节血管张力和选择性通透性以及免疫调节方面起到重要作用。EC功能的异常，与血栓形成、动脉粥样硬化、高血压等心血管疾病及肿瘤扩散，免疫疾病都有密切关系。体外培养中的EC形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。 2．培养方法EC生长在血管内表面，由于其所处的独特位置不利于观察和研究，所以体外培养EC显得特别重要，目前已有多种种属（人、牛、猪、兔、大鼠等），多种组织（脐带动脉、静脉、肺动脉、主动脉、脑毛细血管、心脏毛细血管等）的EC能在体外培养成功。人们将培养器皿预先用明胶或纤连蛋白或胶原等粘附蛋白包被后，形成人工的EC下基质层，可促进EC的粘附与生长。 2.1 方法原理用酶消化法，酶消化＋机械刮脱法或单纯刮脱法将EC分离下来，在适宜的条件下可贴壁并长成致密单层。 2.2 介绍几种主要EC的分离 2.2.1 酶消化法大血管内皮细胞的分离 2.2.1.1 人脐带动、静脉（或其它大血管） a．在37℃水浴中，预热培养用的所有无菌溶液，备用。 b．在无菌条件下，取健康产妇分娩后新鲜的婴儿脐带（25cm左右，不超过6h），选择无夹痕、无扭曲、无凝血阻塞的部分，放入含有100 U/ml的青霉素和100 μg/ml链霉素的D-Hanks液中，在脐静脉或脐动脉的两端插入磨平的注射器针头用丝线扎紧，用注射器从一端注入D-Hanks液冲洗血管，直到流出的液体无血迹。
树突状细胞的培养与鉴定 【摘要】目的研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子gm-csf和il-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, dcs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的dcs的培养方法。方法通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。在细胞因子gm-csf和il-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。结果在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。流式分析发现细胞高表达dc表面特异性抗原 cd80，cd86，hla-dr，并且不再表达单核细胞表面抗原cd14，细胞纯度约为93.12%。淋巴细胞增殖实验显示dcs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。结论通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用 gm-csf和il-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。【关键词】树突状细胞；磁珠；流式 molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes. 【abstract】 objectives：to develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (dcs) from highly purified cd14 + monocytes from human peripheral blood. methods：monocytes were purified by negatively sorting
匡堂绽述；Ｑ堕生！旦筮！！鲞箜！！翅丛型垫尘曼塑塑ｉ坐丛！：墅Ｐ！Ｑ塑：！生：！！：盟！：！！ ［１１］［１２］［１３］［１４］［１５］ＶａｎＩｔａｌｉｉｅＣＭ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＪＭ．Ｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｇｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎｐｏｒｅｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ），２００４，１９（６）：３３１－３３８． ＡｎｇｅｌｏｗＳ，ＡｈｌｓｔｒｏｍＲ，ＹｕＡＳ．ＢｉｏｌｏｇｙｏｆｅｌａｕｄｉｎｓＪＩ．ＡｍＪ ＰｈｙｓｉｏｌＲｅｎａｌＰｈｙｓｉｏｌ，２００８，２９５（４）：８６７－８７６． ＡｒｒｉｅｔａＭＣ．ＢｉｓｔｒｉｔｚＬ．ＭｅｄｄｉｎｇｓＪＢ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｉｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｏｒ－ ｍｅａｂｉｌｉｔｙｌＪ１．Ｇｕｔ，２００６，５５（１０）：１５１２．１５２０． ＶａｌｌＩｔａｌｌｉｅＣＭ．ＡｎｄｅｒｓｏｎＪＭ．Ｃｌａｕｄｉｎｓａｎｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｐａｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｉｌｓ．Ⅳ，ｒｔｌＪＩ．ＡｎｎｕＲｅｖＰｈｙｓｉｏｌ，２００６，６８（３）：４０３－４２９． ＢａｌｋｏｖｅｔｚＤＦ．Ｔｉｇｈｔｉｕｎｃｔｉｏｎｃｌａｕｄｉｎｓａｎｄｔｈｅｋｉｄｎｅｙｉｎｓｉｅｋｎｅｓ６ ａｎｄｉｎｈｅａｌｔｈ【Ｊ】．ＢｉⅢ?ｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ，２００８．７（４）：１０１６． ＷｉｌｌＣ。Ｆｎｍ，ｌｍＭ，Ｍｔｉｌｌｅｌ＂Ｄ．Ｃｌａｎｄｉｎｔｉｇｈｔｉｕ／Ｒｍｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｎｏｖｅｌａ８． ｐｅａｓ ｉｎｐａｒａｅｅｌｈｌａｒｔｒａｎｓｐｏｒｔ［Ｊ］．ＰｅｔｉｔＤｉａｌＩｎｌ，２００８，２８（６）：５７７－５８４． ＮｉｔｔａＴ。ＨａｔｓＭ，ＧｏｔｏｈＳ。ｅｔａ１．Ｓｉｚｅ．ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｌｏｏｓｅｎｉｎｇｏｆｔｈｅ ｂｋｘＭ—ｂｒａｉｎｂａｒｒｉｅｒｉｎｃｌａｕｄｉｎ－５．ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅＪｆ．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ， ２００３．１６ｌ（３）：６５３－６６０． ＨｏｕＪ，ＧｏｍｅｓＡＳ，ＰａｕｌＤＬ。ｅｔａ／．Ｓｔｕｄｙｏｆｃｌａｎｄｉｎｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ眦～ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ｛Ｊ１．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ，２００６，２８ｌ（４７）：３６１１７．３６１２３． ＶａｎＩｔａｌｌｉｅＣＭ，ＨｏｌｍｅｓＪ，ＢｒｉｄｇｅｓＡ．ｅｔ ａ１．ＴｈｅｄｅｎｓｉｔｙｏｆｓｎｌｕＵ ｔｉｇｈｔｉｕｎｃｔｉｏｎｐｏｒｅｓｖａｒｉｅｓａｍｏｎｇｃｅｌｌｔｙｐｅｓａｎｄｉｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙｅｘ． ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｌａｕｄｉｎ－２［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＳｃｉ，２００８。１２１（Ｐｔ３）：２９８－３０５． ＳｉｍｏｎＤＢ，ＬｕＹ，ＣｈｏａｔｅＫＡ，ｅｔａ１．Ｐａｒａｃｅｌｌｉｎ—１．ａｒｅｎａｌｔｉｇｈｔｉｕｎｅ． ｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｐａｒａｅｅｌｌｕｌａｒＭ９２＋ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９９。２８５（５４“）：１０３一１０６． ＳｏｎＳ，ＫｏｊｉｍａＴ，ＤｅｃａｅｎｓＣ，ｅｔａ１．Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆｔｉｓｈｔｉｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｌａｕｄｉｎ－２ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｂｉｌｅｃａｎａｌｉｃｕｌａｒｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎＷＩＦ—Ｂ９ ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＨｉｓｔｅｃｈｅｍＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００９，１３ｌ（３）：４１１４２４． ＤｅｃａｅｎｓＣ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚＰ，Ｂｏ血ｈａｕｄＣ．ｅｔａ１．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｈｅ． ｐａｔｉｏｃｅｌｌｐｏｌａｒｉｔｙｉｎｔｈｅｒａｔｈｅｐａｔｏｎｍ—ｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｈｙｂｒｉｄ ＷＩＦ—Ｂ９．Ａｂｉｐｈａｓｉｃｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ ｇｏｉｎｇ ｆｒｏｍａ ｓｉｍｐｌｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｐｏ． １ａｒｉｚｅｄｐｈｅｎｏｔｙｐｅｔｏａｎｈｅｐａｔｉｃｐｏｌａｒｉｚｅｄｏｎｅ［Ｊ］．ＪＣｅｌｌＳＣｉ，１９９６， ［１６］ ［１７］ ［１８］ ［１９］ ［２０］ ［２１］ ［２２］ ［２３］ ［２４］ ［２５］ ?２７５３? １０９（Ｐｔ６）：１６２３－１６３５． ＤｅｃａｅｎｓＣ。ＤｕｒａｎｄＭ。Ｇｌ＇ＯＳｓｅＢ，ｅｔ ａ／．骶ｉｃｈｉｌｔｉｖｉｔｒｏｍｏｄｅＩｓｃｏｕｌｄ ｂｅｂｅｓｔｕｓｅｄｔｏｓｔｕｄｙｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｐｏｌａｒｉｔｙ？［Ｊ］．ＢｉｏｌＣｅｌｌ，２００８， １００（７）：３８７－３９８． Ｈａｄｊ．ＲａｂｉａＳ，ＢａｈｉａＬ，Ｖａｂ№Ｐ，ｅｆａ／．Ｃｌａｕｄｉｎ．Ｉｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎｎｅｏｎａｔａｌｓｃｌｅｍｓｉｎｇｅｈｏｌａｎｇｉｔｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｉｃｈｔｈｙｏｓｉｓ：ａｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎｄｉｓｅａｓｅ【Ｊ］．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ。２００４，１２７（５）；１３８６一１３９０． ＴａｍｏｒａＡ。ＫｉｔａｎｏＹ．ＨａｔａＭ．ｅｔ ａ１．Ｍｅｇａｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｉｎｃｌａｕｄｉａ—１５一 ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２００８，１３４（２）：５２３－５３４． ＺｈａｏＪ，ｄｅＶｅｒａＪ。ＮａｒａｓｈｉｍａＳ，ｅｔａ１．Ｒ—ｓｐｏｎｄｉｎｌ．ａｎｏｖｅｌｉｎｔｅｓｔ／． ｎｏｔｒｏｐｈｉｅｍｉｔｏｇｅｎ，ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｉｔｉｓｉｎｍｉｃｅ［Ｊ］． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ。２００７，１３２（４）：１３３１．１３４３． ＪｏＶＯＶＢ，ＶａｎＩｔｌｌｉｅＣＭ，ＳｈａｈｅｅｎＮＪ，一ａ１．Ｃｌａｎｄｉｎ—ｌ８：ａｄｏｍｉｎａｎｔ ｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎＢａｒｒｅｔｔ’ｓｅｓｏｐｈａｇｕｓａｎｄｌｉｋｅｌｙｃｏｎｔｒｉｂｕｔｏｒ ｔｏｉｔｓａｃｉｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．ＡｍＪＰｈ【ｙｓｉｏｌＧａｓｔｍｉｎｔｅｓｔＬｉｖｅｒＰｈｓｉｏｌ。 ２００７．２９３（６）：１１０６．１１１３． ＦａｓａｎｏＡ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆｚｏｎｕｌｉｎ—ｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｂａｒｒｉｅｒｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ：ｌｉｖｉｎｇｌｉｆｅｏｎｔｈｅ ｅｄｇｅｏｆｔｈｅｗａｌｌ［Ｊ］．ＡｍＪＰａｔｈｏｌ。２００８。１７３（５）：１２４３?１２５２． ＶａｌｌＩｔａｌｌｉｅＣＭ．ＢｔｔｓＬ．ＳｍｅｄｌｅｙＪＧ．村ａ１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｔｈｅｃｌａｕｄｉｎ． ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｆｆｒｉｎｇｅｎｓｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ［Ｊ］．ＪＢｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００８，２８３（１）：２６８－２７４． ＴｓｕｋｉｔａＳ．ＦｕｒｕｓｅＭ．Ｃｌａｕｄｉｎ．ｂａｓｅｄｂａｒｒｉｅｒｉｎｓｉｍｐｌｅａｎｄｓｔｒａ！ｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒｓｈｅｅｔｓ【Ｊ］．ＣｕｒｒＯｐｉｎＣｅｌｌＢｉ０１．２００２．１４（５）：５３ｌ－５３６． Ｆｕ兀ｌｓｅＭ，ＨａｔａＭ，ＦｕｍｓｅＫ，ｅｔａ／．Ｃｌａｎｄｉｎ—ｈａｓｅｄｔｉｇｈｔｊｔｉｌｌ（－ｔｉｏｎｓ瓣 ｃｒｏｃｉａｌｆｏｒｔｈｅｍａｍｍａｌｉａｎｅｐｉｄｅｒｍａｌｔｍｒｔｉｅｒ：ａＩｅｔＫｓｏｎｆｒｍｎｃｌａｕｄｉｎ．１．ｄｅ－ ｆｉｃｉｅｎｔｎｆｉｃｅＩＪ】．ＪＣｅｌｌＢｉｏｌ，２０１１２，１５６（６）：１０９９一１１１１． ＮｌｅｓｓｅｎＣＭ．Ｔｉｇｈｔｊｕｎｃｔｉｏｎｓ／ａ，ｔｈｅｒｅｎｓｉｕｎｃｔｉｏｎｓ：ｂａｓｉｃｓｌｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄｆｕｎｏｔｉｏｎ【ＪＩ．ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ，２００７．１２７（１１）：２５２５．２５３２． 收稿Ｕ期：２００９旬３－２３修同日期：２００９－０７－０２血管内皮祖细胞治疗缺血性心脏病的研究进展 陈闽荔’，张金莲△（综述），吕建国（审校） （天津市胸科医院心内科，天津３０００５１） 中圈分类号：Ｒ５４１文献标识码：Ａ文章编号：１００６－２０８４（２００９）１８－２７５３－０４ 摘要：内皮祖细胞是内皮细胞的前体细胞，是一类能够迁移、增殖，并分化为成熟血管内皮细胞 的前体细胞，属于干细胞群体，参与人胚胎血管生成及出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程，还可在一定条件下分化为心肌细胞。近年来的研究表明其与冠心病发生、发展及治疗的关系密切，为冠心病治疗提供了新思路。本文就内皮祖细胞的生物学特性及其在缺血性心脏病中的临床研究现状予以综述。 关键词：内皮祖细胞；缺血性心脏病；治疗；细胞移植 Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｂｏｕｔＥｎｄｏｔｈｅｌｌａｌＰｒｏｇｅｎｉｔｏｒＣｅｌｉｓｉｎＴｒｅａｔｉｎｇｌｓｃｈｅｍｉｃＨｅａｒｔＤｉｓｅａｓｅＣＨＥＮＭｉｎ．１ｉ．ＺＨＡＮＧＪｉｎ?ｌｉａｎ，ＬＶＪｉａｎ－ｇｕＤ．（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ＣｈｅｓｔＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴ／ａ彬ｎ，‰ｎｊｉｎ３０００５１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｉｓｔｈｅｐｍｃｅｌｌｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．ｗｈｉｃｈＣａｌｌｍｉｇｒａｔｅ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ ａｎｄｄｉｆｉｅｒｅｎｔｉａｔｅｔｈｅｐｒｏｃｅｌｌｏｆｍａｔｕｒｅｔＩｒｅｓｓｅｌｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｅｅｌＩｓ．Ｔｈｅｙｂｅｌｏｎｇｔｏｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ｗｈｉｃｈｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅｎｏｔｏｎｌｙｔｈｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｖａｓｅｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ。ｂｕｔａｌｓｏｔｈｅｖａｓｃｕｌａｒｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓａｆｔｅｒｂｅｍａｎｄｒｅｐａｉｒｐｒｏｃｅｓｓａｆｔｅｒｅｎｄｏ．ｔｈｅｌｉａｌｉｎｊｕｒｙ．Ｔｈｅｒｅｃｅｎｔｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓｓｈｏｕｌ‘ＪｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏＣｏｍｎａｒｙ ｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅｃｌｏｓｅｌｙａｂｏｕｔｉｔｓｇｅｎｅｓｉｓ．ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｔｈｅｒａｐｙ．ＥＰＣｐｒｅｏｖｉｄｅｓ ａ ｎｅｗｉｄｅａｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃｏｒｏｎａｒｙｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｓｔｕｄｉｅｓｏｆｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓｉｎｉｓｃｈｅｍｉｃｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ；Ｉｓｅｈｅｍｉｅｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ；Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ 缺血性心脏病（ｉｓｅｈｅｍｉｃｈｅａｒｔｄｉｓｅａｓｅ，ＩＨＤ）是由 于冠状动脉循环改变引起冠状动脉血流和心肌需求 之间不平衡而导致的心肌损害，在急性缺血时，心肌 细胞在短时间内大量凝固性坏死；慢性长期血供不 足使心肌组织发生营养障碍和萎缩，残余的心肌细 胞无法莺建坏死的组织，心脏功能随着时间进行性 恶化，其中最常见的原因是冠心病，约占９０％。ＩＨＤ 是严重危害居民健康的多发病和常见病，是慢性心 力衰竭的主要原因，传统的治疗手段主要是重建血供，而不能修复损伤和坏死心肌。近几年兴起的干细胞移植治疗ＩＨＤ不仅可以再生血管，而且可以再生心肌，使人们看到了新的希望。血管内皮前体细胞或血管内皮祖细胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉ－ｔｏｒｃｅｌｌ。ＥＰＣ）是成熟血管内皮细胞的前体细胞，能够特异性归巢于血管新生组织并分化为血管内皮细胞，属于干细胞群体，既可自我更新 又能定向分化为成熟的血管内皮细胞，参与血管再 生和损伤血管的再内皮化，还可在一定条件下分化 为心肌细胞，具有重要的生理和病理意义，也为缺血 性心脏疾病的治疗提供了新策略…。 １ＥＰＣ概述 １．１ＥＰＣ的来源胚胎期第１３～１５天，胚外造血 启动，卵黄囊的胚外中胚层的一些间充质细胞逐渐 聚集成条索或团块状，形成血岛。这些细胞团结构 进一步出现腔隙化改变，聚集在细胞群中央的细胞…㈨㈨………州 万方数据
血管内皮祖细胞与血管新生的研究进展(一) 【关键词】血管内皮祖细胞；血管新生 血管内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)是一类能分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞，不仅参与人胚胎血管生成，同时也参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程。大量的研究显示，动员和移植的EPCs可提高缺血组织的血管新生能力，促进损伤血管的修复和再内皮化，这为治疗以坏死性血管炎为主要病理改变的一类疾病带来了新的希望。因此EPCs已成为目前的研究热点之一，本文就血管内皮祖细胞与血管新生的关系及其在治疗性血管新生中应用的研究进展作一综述。 1内皮祖细胞的来源 内皮祖细胞（EPCs）是近年来研究较多的一类细胞。1997年Asahara等〔1〕首次从成人外周血单个核细胞中分离得至CD34+细胞，因其在体外可向内皮表型细胞分化，表达内皮细胞标志物并且参与血管形成，故将此命名为EPCs。EPCs也叫成血管细胞，是一种多能干细胞，能循环、增殖并分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞，缺乏成熟内皮细胞的特征性表型，不能形成管腔样结构。EPCs起源于胚外中胚层卵黄囊血岛，由位于血岛外层的造血/成血管细胞（又称原血干细胞，是造血干细胞和内皮祖细胞的共同起源）分化发育而来。目前，许多研究证明，EPCs在成人外周血，人脐带静脉血和骨髓中均有分布，且人外周血、脐带血的EPCs均来自于骨髓。EPCS的来源还有多潜能成体祖细胞(multipotentadultprogenitorcells，MAPCs)、骨骼肌〔2〕。Lin等〔3〕发现骨髓来源的EPCs增殖能力明显高于成熟循环内皮细胞，两者体外扩增能力之比为50:1。在骨髓内EPCs与造血干细胞和骨髓基质细胞之间存在着密切联系，造血干细胞和骨髓基质细胞可影响EPCs的发育、增殖、动员和迁移。Murahara 等〔4〕用免疫磁珠分离法从脐血中成功地分离出EPCs，这些细胞经培养可以摄取as-LDL，释放NO，表达VE-cadherin、CD31和vWF。在体外扩增后回输到裸鼠肢体缺血模型，发现EPCs参与了缺血局部新生毛细血管的形成，因此脐血可成为EPCs研究的细胞来源。Gehling 等〔5〕从G-CSF动员的外周血中分离到CDl33+细胞，在VEGF和干细胞生长因子的诱导下形成了内皮细胞。 Zengin等〔6〕研究发现在成人几乎各个脏器的大中血管的平滑肌和外膜之间存在一个“血管发生区域”，该区域中也存在着CD34+、VEGFR-2+的EPC，并且有少部分细胞为CD45+。该区域可能是出生后血管发生的源泉，且与肿瘤的血管生成有关。 2EPCs的表面标记 由于EPCs与造血细胞(hematopoieticstemcells，HSCs)有着共同的起源，所以它们具有许多共同的表面标记，如CD34、CD133、VEGFR-2、Eph等；EPCs进一步分化为成熟内皮细胞，两者都表达内皮细胞特异性的表面标志，包括VEGFR-2、Tie-1、Tie-2和VE-cadherin〔7〕。这些相同的表面标记使EPCs的分选变得非常困难，其中有3个最重要的表面标志：CD34、CD133、VEGFR-2。一般将CD34+／CD133+／KDR(VEGFR-2+或Flk-l+)的细胞定义为EPCs。有研究表明，同时表达CD133、VEGFR-2和CD34的细胞具有迁移并分化为成熟内皮细胞的能力，能够促进出生后的血管形成。 CD34是一种白细胞分化抗原，它选择性地表达在造血前体细胞、血管内皮细胞、间质前体细胞和各种问质肿瘤细胞中，是骨髓、外周血和脐血中HSCs的主要标志，可同时识别出包括HSCs、EPCs和成熟内皮细胞的混合细胞群。从外周血中分离出的CD34细胞在体外能够向内皮细胞分化，在体内能够促进新生血管形成，因此，这些细胞可能大多数为EPCs。但是，近来研究发现，CD34-细胞群体中也含有EPCs〔8〕，这使得用CD34来富集EPCs的方法受到挑战。 CD133(又称AC133)是存在于人细胞表面的糖蛋白，相对分子质量为120000的糖基化多肽，含有5个跨膜结构域，包括膜外的N端及胞浆内C残端，选择性地在人类胎肝、骨髓和血
毛细血管（二） 毛细血管（capillary）是管径最细，分布最广的血管。它们分支并互相吻合成网（图8－8）。各器官和组织内毛细血管网的疏密程度差别很大，代谢旺盛的组织和器官如骨骼肌、心肌、肺、肾和许多腺体，毛细血管网很密；代高血压较低的组织如骨、肌腱和韧带等，毛细血管网则较稀疏。 图8-8 人胃粘膜血管铸型扫描电镜像示毛细血管网 （一）毛细血管的结构 毛细血管管径一般为6～8μm，血窦较大，直径右达40μm。毛细血管管壁主要由一层内皮细胞和基膜组成。细的毛细血管横切面由一个内皮细胞围成，较粗的毛细血管由2～3个内皮细胞围成。内皮细胞基膜外有少许结缔组织。在内皮细胞与基膜之间散在有一种扁而有突起的细胞，细胞突起紧贴在内皮细胞基底面，称为周细胞（pericyte）（图8－9，8－10）。周细胞的功能尚不清楚，有人认为它们主要起机械性支持作用；也有人认为它们是未分化的细胞，在血管生长或再生时可分化为平滑肌纤维和成纤维细胞。 图8-9 毛细血管扫描电镜像示周细胞 P 周细胞胞体 1、2周细胞突起
图8-10 毛细血管电镜像 左图连续毛细血管，中图有孔毛细血管，右图毛细血管扫描电镜像示内皮孔 E 内皮细胞，P周细胞，↑内皮细胞孔 (二)毛细血管的分类 光镜下观察，各种组织和器官中的毛细血管结构相似，但在电镜下，根据内皮细胞等的结构特点，可以将毛细血管分为三型。 1．连续毛细血管连续毛细血管（continuous capillary）的特点为内皮细胞相互连续，细胞间有紧密连接等连接结构，基膜完整，细胞质中有许多吞饮小泡。连续毛细血管分布于结缔组织、肌组织、肺和中枢神经系统等处。肺和中枢神经系统内的毛细血管内皮细胞甚薄，含吞饮小泡较少（图8－10）。 2．有孔毛细血管有孔毛细血管（fenestrated capillary）的特点是，内皮细胞不含核的部分很薄，有许多贯穿细胞的孔，孔的直径一般为60～80nm（图8－10）。许多器官的毛细血管的孔有隔膜封闭，隔膜厚4～6nm，较一般的细胞膜薄。内皮细胞基底面有连续的基板。此型血管主要存在于胃肠粘膜、某些内分泌腺和肾血管球等处。肾血管球的内皮细胞的孔没有隔膜。 3．血窦血窦（sinusoid）或称窦状毛细血管（sinusoid capillary），管腔较大，形状不规则，主要分布于肝、脾、骨髓和一些内分泌腺中。血窦内皮细胞之间常有较大的间隙，故又称不连续毛细血管（discontinuous capillary）。不同器官内的血窦结构常有较大差别，某些内分泌腺的血窦，内皮细胞有孔，有连续的基板；有些器官如肝的血窦，内皮细胞有孔，细胞间隙较宽，基板不连续或不存在。脾血窦又不同于一般血窦，其内皮细胞呈杆状，细胞间的间隙也较大。 （三）毛细血管与物质交换 毛细管是血液与周围组织进行物质交换的主要部位。人体毛细血管的总面积很大，体重60kg的人，毛细血管的总面积可达6000m2。毛细血管管壁很薄，并与周围的细胞相距很近，这些特点是进行物质交换的有利条件。 物质透过毛细血管壁的能力称毛细血管通透性（capillary permeability）。毛细血管结构与通透性关系的研究表明，内皮细胞的孔能透过液体和大分子物质，吞饮小泡能输送液体，细胞间隙则因间隙宽度和细胞连接紧密程度的差别，其通透性有所不同。基板能透过较小的分子，但能阻挡一些大分子物质。另外一些物质，如O2、CO2和脂溶性物质等，可直接透过内皮细胞的胞膜和胞质。
?１１４? ?综述? ！随废匡堂！Ｑ塑生！！旦箜垫鲞笙１２期￡！型型丛型丝些：旦竺：２Ｑ塑：！！！：垫：盥垒！兰血管内皮祖细胞与冠心病的研究进展 严卓综述李结华审校 （安徽医科大学第一附属医院干部心内科，合肥２３００２２） 冠心病（ＣＨＤ）是现代社会严莺威胁人类健康的主要疾病之一，其病死率极高。内皮细胞的损伤与ＣＨＤ的发生发展关系密切。血管内皮祖细胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ，ＥＰＣｓ）作为内皮细胞的前体细胞，在组织缺血及血管损伤时动员入血，参与微血管的生成及血管内皮的修复，在冠心病发生及发展过程中起着非常莺要的作用。现就｜ＩＩＬ管内皮祖细胞的生物学特性、与冠心病相互关系的研究进展及目前存在的问题综述如下。 ｌＥＰＣｓ的定义及其生物学特性 １．１ＥＰＣｓ的起源与分化：血管祖细胞是指能产生成熟的、有功能的血管壁细胞和前体细胞群，主要包括内皮祖细胞（ＥＰＣｓ）、平滑肌祖细胞（ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｃｅｌｌｓ，ＳＭＰＣ）、造血干细胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＨＳＣ）、间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣ）和其他来源的前体细胞‘“。ＥＰＣｓ是一群在胚胎发育过程中，发源于中胚层、发源部位邻近并具有发育和分化为外周血细胞和血管壁细胞功能的细胞群‘“。１９９７年，Ａｓａｈａｒａ等报道ｆ自成人体内分离纯化的ＣＤ３４＋的造血祖细胞可在体外培养分化成内皮细胞表型．表达内皮细胞标记并整合进缺血部位的新生皿管中，这些细胞即为ＥＰＣｓ。在体外，ＥＰＣｓ能吸收乙酰化低密度脂蛋白，结合荆豆凝集素（ｕｌｅｘｅｕｒｏｐｅａｓｌｅｃｔｉｎ）形成毛细血管管腔样结构；在体内，ＥＰＣｓ能募集、归巢到血管损伤区，分化为内皮细胞，促进血管再生。 １．２ＥＰＣｓ的分离、表面标记和体外诱导分化：ＥＰＣｓ主要集中在骨髓，同时在外周血及胎肝、脐带血中亦有存在。日前，用于ＥＰＣｓ的体外分离纯化的方法有两种。包括密度梯度离心法和免疫磁珠分选法。对于ＥＰＣｓ的表型特征尚存在诸多争议：最初内皮祖细胞被定义为既有造血细胞的标记如ＣＤ３４，又有内皮细胞的标记如血管内皮生长因子受体一２（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ一２，ＶＥＧＦＲ一２）的一群幼稚细胞，随着细胞的分化，幼稚细胞的特征（ＣＤ３４）会逐渐消失。取而代之的是内皮细胞的表型特征。骨髓中的ＥＰＣｓ进入外周血后会逐渐丧失ＣＤｌ３３抗原而ＣＤ３４和ＶＥＧＦＲ一２表犁仍可呈阳性，而且还表现出血管内皮细胞钙粘素、ＣＤ３１、血管性血友病因子（ｖＷＦ）、内皮一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）及Ｅ选择素以及结合乙酰化低密度脂蛋白胆固醇的阳性特征。随后进一步的研究发现，ＣＤｌ３３在成熟内皮细胞以及单核细胞不表达，由此可见，ＣＤｌ３３＋／ＶＥＧＦＲ＋的细胞町能更能反映内皮祖细胞，但至今的研究尚未发现ＥＰＣｓ失去ＣＤｌ３３标志的准确时间和机制。，同时有研究证明．造血千细胞以外的其他细胞群也有分化为内皮细胞，并形成内皮样结构的能力，如脂肪组织来源的于细胞，以及神经干细胞在特定环境下能分化为内皮细胞，并拥有促进血管新，圭的潜能…。所以，目前尚难定义一种“真正”的内皮祖细胞。 有研究发现｜４１，ＥＰＣｓ有迟发性高增殖能力，体外培养时ＥＰＣｓ的扩增能力是１０００倍，而成熟的内皮细胞仅为２０倍。成熟微血管内皮细胞在体外能很快进入增殖期。但４～６周后增殖活力即逐渐下降。与此相反，外周血、胎肝、骨髓来源的ＥＰＣｓ细胞在１５—２０ｄ后形成迅速生长的鹅卵石样内皮细胞层，并能稳定传代３０次以上，其增殖潜能是脐静脉内皮细胞的ｌｏ倍。ＥＰＣｓ在ＶＥＧＦ、粒细胞集落刺激因子（Ｇ—ＣＳＦ）等趋化因子的作用下能归巢到缺血组织参与新生血管形成。ＥＰＣｓ作为血管内皮的前体细胞。也具有与成熟血管内皮细胞相似的特性，如能表达内皮系特异性抗原，能摄入乙酰化低密度脂蛋白并能与荆豆凝集素反应，在体外培养７～１０ｄ的内皮祖细胞成纺锤形内皮细胞样并町成典型的铺路石样形态特征，能分泌维持正常血管功能的活性物质，作为组织工程再生内皮化的种子细胞具有良好的血液相容性．能分泌抗血栓形成的生物活性物质。 １．３ＥＰＣｓ的动员、迁移、归巢：ＥＰＣｓ在骨髓分化完成后，经过动员经血液循环到达损伤部位并分化为成熟的内皮细胞，参与损伤部位内皮的修复和新生血管的生成，这一过程被称为ＥＰＣｓ的动员，确切机制尚不清楚。研究表明，如ＶＥＧＦ、Ｇ—ＣＳＦ、粒一巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ—ＣＳＦ）、干细胞因子（ＳＣＦ）和基质细胞衍牛因子一ｌ（ＳＤＦ一１）等细胞因子在ＥＰＣｓ的动员、归巢和分化中发挥重要的作用Ｈ１。ＥＰＣｓ的分化与粘附分子、粘附后细胞间的相互作用及微环境有密切关系。有研究指出，Ｃ一反庇蛋白可抑制ＥＰＣｓ的分化。用Ｃ一反应蛋白处理ＥＰＣｓ，可通过抑制ｅＮＯＳｍＲＮＡ的表达，显著抑制ＥＰＣｓ的分化，并加速其凋亡冲Ｊ。基质细胞衍生因子ＳＤＦ—ＩＯａ与ＥＰＣＳ表面的趋化子受体ＣＸＣＲ一４结合，在ＥＰＣｓ的归巢中也发挥重要作用“。血管紧张素Ⅱ受体阻断剂能增加２型糖尿病患者循环中再生ＥＰＣｓ数目，可能有助于保护心血管系统。“，另外，体内缺血、血管损伤可动员骨髓中的ＥＰＣｓ，使其向外周循环迁移，并分化为成熟内皮细胞，促进形成新牛血管，缓解组织缺血和修复血管损伤。Ｓｈｉｎｔａｎｉ等的研究也支持这个结论。 １．４ＥＰＣｓ的功能和病理生理意义：胚胎血管有丽个过程发育，即血管发生和血管生成。血管发生是指中胚层衍生的血管母细胞在发育胚胎中形成原始血管网，血管生成是指从已存在的血管中生长出新的毛细血管。最初的学者认为成人血管仅由血管新生来维持和修复，但ＥＰＣｓ的发现提示在成人也存在血管发生。有研究证实，在新生血管中有约２５％的内皮细胞有ＥＰＣｓ增殖分化而来一ｊ。同时有研究指出，ＥＰＣｓ不仅参与生理性血管形成，而且在多种病理状态下也能被动员入外周循环，增强代偿性血管重建并参与肿瘤血管的生成，如在非小细胞肺癌中发现（＇Ｄ１３３（＋）ＥＰＣｓ参与其血管生成，促进肿瘤生长。 ２ＥＰｃｓ与冠心病 ２．１冠心病患者内皮细胞的变化：研究证实¨…，冠心病发生 万方数据
血管内皮细胞功能与心血管疾病关系的研究进展 摘要：血管内皮细胞（VEC）功能与心血管疾病的发生和发展密切相关, 本文综述了血管内皮细胞合成与释放的一氧化氮、内皮素、血管紧张素Ⅱ等多种生物活性物质及VEC功能紊乱与心血管疾病的关系，研究VEC功能与心血管疾病形成之间的相互关系将为心血管疾病的治疗提供新思路、新策略。 关键词：血管内皮细胞；一氧化氮；内皮素；血管紧张素Ⅱ；心血管疾病 现已证明VEC除了完成血液和组织液的代谢交换以外，还是机体最大的内分泌腺【1】，可以产生和分泌十余种生物活性物质，具有维持正常的血管张力、血液的正常状态和动态平衡等作用，并通过其屏障和分泌功能，影响着炎症反应的发生、发展，参与调节机体的免疫应答。VEC功能紊乱在高血压、心力衰竭、动脉粥样硬化（AS）等心血管疾病的发病过程中具有重要意义。 1血管内皮细胞功能【2】 VEC的功能极其重要和复杂。1维持血管内膜的光滑，防止血小板及白细胞粘附，防止有害物质侵入血管壁。2具有半透膜的作用，维持血液、组织液中物质的交换。3合成并释放多种生物活性物质，如一氧化氮（NO），PGI2,，内皮素（ET）等，调节血管张力，维持正常血压。4合成致栓及抗栓物质，维持其动态平衡，如肝素，组织型纤溶酶原激活物（t-PA）及血管性假血友病因子（vWF）等。5 合成胶
原基底膜及血管平滑肌保护层。6合成血管生长因子及血管紧张素转化酶（AEC）。7影响血管壁对脂蛋白等物质的代谢。 2血管内皮细胞功能的标志物质【3~5】 2.1 一氧化氮(NO)。NO由血管EC释放，EC以L一精氨酸和分子氧作为底物，在NO合酶作用下生成NO 继之进入邻近的平滑肌细胞，激活鸟苷酸环化酶分解GTP使c—GMP增加，导致血管平滑肌舒张。NO还有抑制血管平滑肌增殖、抗血小板聚集和抗血栓形成作用【 3.5】。基础状态下，EC作为血藏感受器，转化血液切变力的机械信号为化学剌激，促使NO释放，维持血管张力和血流量相对恒定。乙酰胆碱、5_羟色胺、P物质，缓激肽、凝血酶、腺苷、TXA2、组胺{细胞因子如白介素-1、肿瘤坏死因子以及内毒素，都能促使NO释放。 2．2 PGI2。EC通过环氧化酶及前列环素合成酶途径代谢花生四烯酸产生PGI2，再通过第二信使cAMP发挥生物学效应。凝血酶、缓激肽、组胺，腺苷、高密度脂蛋白、TXA2、白三烯、血小板生长因子、组织缺氧和血流动力学应激等，促使EC释放PGI2。PGI2和NO 协同扩张血管，防止血小板聚集和抗血栓形成【5】。 2．3ET1988年Yanagisawa【6】从猪主动脉EC中分离提纯出21 个氨基酸组成的多肽,称内皮素。ET 受体中B型主要分布在EC,激活后可使EC释放NO、PGI2,但其舒血管效应常被A型受体兴奋所致平滑肌细胞强烈而持久的收缩所掩盖。有实验表明,给大鼠持续滴注ET1 后血液浓缩,微动脉和微静脉收缩,微循环血流量减少,血栓形成;
姓名程开源系年级2010级临床医学八年制组别同组者孙琳 科目分子细胞生物学目细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号201000232012 【实验目的】 1.学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2.了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。 3.熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。 4.学习细胞生死状态鉴别的方法。 5.了解细胞生死状态鉴别的原理。 6.熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 7.掌握细胞技术方法，计算细胞存货率。 【实验原理】 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。 【实验材料】 1.超净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样器、吸管、酒精灯；小鼠、培养基 2.血球计数板、盖玻片、滴管、显微镜；培养的小鼠脾脏细胞、台盼蓝、伊红 【实验步骤】