[文章编号] 100723949(2002)21020320253204
?方法学研究?
同时检测多种心血管疾病相关基因多态性的方法
夏永静,满 永,国汉邦,李红霞,杨振华
1
(卫生部北京医院老年医学研究所;1.卫生部临床检验中心,北京市100730)
[主题词] 心血管疾病; 基因; 多态性; 多位点基因型分析方法[摘 要] 应用R oche 分子系统提供的试剂、材料和实验操作步骤,介绍其建立的一种同时检测多种心血管疾病相关基因的多个位点基因型分析方法,并且比较所检测的不同中国地区(北京和香港)的中国人群之间和中国人与法国人群之间的各等位基因频率的差异。结果发现,北京人群和香港人群在所有检测的等位基因频率方面没有显著差别,但是中国人和法国人在一些等位基因频率分布方面存在显著差异。总之,R oche 分子系统建立的是一种快速而有效的分析多基因多位点基因型的方法,有益于大规模的人群调查心血管疾病的遗传危险因素。[中图分类号] R446.1[文献标识码] A
A Multilocus G enotyping Assay for C andidate G enotypes of C ardiovascular Disease
XI A Y ong 2Jing ,M AN Y ong ,G UO Han 2Bang ,LI H ong 2X ia ,and Y ANG Zhen 2Hua
①
(Beijing Hospital and Beijing Institute o f G eriatrics ;①Center o f National Clinical Chemistry ,Ministry o f H ealth ,Beijing 100730,China )
[MeSH ] Cardiovascular Disease ; G enes ; P olym orphism ; Multilocus G enotyping Assay [ABSTRACT ] Aim T o introduce a multilocus genotyping assay for candidate genotypes of cardiovascular disease (C VD )established by R oche M olecular Systems (RMS ). Methods By applying the regents ,materials and the protocol provided by RMS ,genotyping was done for the Chinese from different regions (Beijing and H ong K ong )and a French population. R esults By com paring the allelic frequencies between the Chinese from different regions and between the Chinese and the French popula 2tions ,no significant difference was found for each allelic frequency between the tw o Chinese groups ,but s ome allelic frequencies significantly differed between the Chinese and the French populations. Conclusions This multilocus genotyping assay estab 2lished by RMS is a rapid ,convenient and efficient method in determining the genotypes possibly related to the development of C VD in a large 2scale population study for the genetic risk of C VD.
[收稿日期] 2001212203 [修回日期] 2002204222
[作者简介] 夏永静,女,1967年出生,辽宁沈阳人,博士,副研究
员,主要从事专业基因多态性与血管性疾病发生关系的研究。
Ο编者注:作者对RMS 方法检测的目的基因及其表达产物的功能列表作了详细介绍,因版面有限出版时已删去,若有需要者,可直接与第一作者联系。
心血管疾病(cardiovascular disease ,C VD )是发达国家疾病患者死亡的主要原因,是多基因相关的疾病,因此有必要建立一种快速、方便、有效的同时检测多个C VD 候选基因多位点基因型的分析方法,以便简化大规模人群C VD 遗传危险因素的调查。美国R oche 分子系统(roche m olecular systems ,RMS )研究组在建立这样一种方法的探索中取得了一些成绩[1,2],建立了一种同时检测15种可能的C VD 相关基因29个位点的基因型检测方法,并且向许多国家的大规模人群C VD 危险因素调查项目提供了该方
法所需要的试剂、材料和检测操作步骤。Cheng 等[2]
对这些候选基因及其所检测的基因型的已知生理作
用做了概括Ο
。这些目的基因是按其生物功能进行的分类,野生型或频率高的等位基因被列在突变核苷酸或编码子数字位置的左侧,这样变异体就在右
侧。值得一提的是,国际间的合作使我们有幸利用
这种方法检测和比较来自不同地区的中国人群(北京和香港)和法国南锡地区的法国人群在这些候选基因多位点等位基因的频率分布和差异。
1 材料与方法
1.1 研究对象
研究对象DNA 有3个来源:北京医院老年医学研究所生物化学室收集的健康体检人群DNA 标本;香港中文大学附属医院提供的健康人DNA 标本;法国南锡Stanislas 研究计划收集的健康人DNA 标本。这些研究对象均为65岁以上的健康老人。1.2 RMS 建立的同时检测多个心血管疾病候选基因多位点基因型方法1.2.1 原理 应用PCR 首先扩增每个DNA 样本多种目的基因含有要研究的突变位点的基因序列。PCR 所用引物事先用生物素标记。PCR 后每个样本的PCR 产物被变性,再通过一个检测反应实验,与包被在硝酸纤维素膜上的多种特异性目的基因的寡核苷酸探针杂交。通过观察和识别杂交带来确定该
样本在各个特定位点上的基因型。
1.2.2 生物素标记目的基因的引物合成 此PCR体系按应用不同的引物混合物被分为2组。一组引物包括那些检测PCR产物时能与A条(strip A)上固定的寡核苷酸探针杂交的目的基因引物,共14对。另一组引物包括那些检测PCR产物时能与B 条(strip B)上固定的寡核苷酸探针杂交的目的基因引物,共13对。
1.2.3 Strip A和Strip B上的寡核苷酸探针合成及固定 在硝酸纤维素膜上固定对应各PCR产物的各个目的基因的寡核苷酸探针。Strip A包括在PCR A反应中可以扩增出的以下基因的寡核苷酸探针。它们是一些与脂代谢有关的蛋白质基因:载脂蛋白E、B和CⅢ、对氧邻酶(paraox onase,PON)、胆固醇酯转移蛋白(cholesteryl ester trans fer protein,CETP)和脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LP L)。这些寡核苷酸探针用于杂交以下多态性或点突变位点:载脂蛋白E(ε2,ε3,ε4)、载脂蛋白B(Thr71Ile和Arg3500G ln)、载脂蛋白CⅢ(T2625del、C2482T、T2 455C、C1100T、C3175G和T3206G)、CETP(Ile405Val 和Asp442G ly)、LP L(T293G、T239C、Asp9Asn、Asn291Ser和Ser447T erm)和PON(G ln192Arg)。
Strip B包括在PCR B反应中可以扩增出的以下特异目的基因的寡核苷酸探针,它们是:①肾素血管紧张素系统的重要组分基因:血管紧张素转换酶基因(angiotensin converting enzyme,ACE)的插入Π缺失(InsertionΠDeletion,IΠD)多态性,血管紧张素Ⅱ受体基因(angiotensinⅡreceptor,ATⅡR)A1166C突变,血管紧张素(angiotensin,AG T)基因Met235Thr 突变;②与同型半胱氨酸代谢(hom ocysteine me2 tabolism)有关的酶基因:胱硫醚2β2合成酶(cystathi2 onineβsynthase,C BS)Ile278Thr和G ly307Ser与甲烯四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)C677T突变;③与血栓形成相关的基因突变:血栓形成因子V(Factor V)Arg506G ln突变、纤维蛋白原β链(fibrinogenβ)G2455A突变、糖蛋白Ⅲa (G PⅢa)Leu33Pro突变和白细胞内皮粘附因子(en2 dothelial leukocyte adhesion m olecule212E LAM)G98T、Ser128Arg和Leu554Phe突变。
1.2.4 目的基因的PCR扩增 每个DNA样本根据所用的A或B引物组分别进行2个体系的PCR 扩增,反应条件相同。PCR扩增条件为:94℃预变性12.5min,之后以96℃15s、60℃1min、72℃1.25min进行33次循环。最后以68℃5min结束扩增。1.2.5 基因型检测反应 ①预处理PCR产物和检测用条(Strip A,Strip B):以RMS提供的母液(SSPE和S DS)配制洗液和杂交液,以洗液在52℃条件下洗Strip A和Strip B10min,分别取15～20μL PCR产物,用NaOH变性液进行变性处理。②杂交:在盛有Strip A或Strip B的槽中分别加入杂交液和被变性的PCR产物。在52℃的条件下杂交20min。用洗液室温下洗条,在新的杂交液中加入12μL辣根过氧化物酶,使之与杂交条上的携带生物素标记的PCR片段偶合。用洗液于室温下洗条后,严格控制温度和时间(52℃12min)再次洗条后,室温下以50mm olΠL的枸橼酸钠处理条5min。③显色反应:以4∶1的体积比配制过氧化氢和四甲基联苯胺的混合液,使之与杂交条进行颜色反应(developing col2 or)。④识别基因型:以RMS提供的等位基因标准为参照,确定每个样本在各个目的基因多态性或突变位点的基因型。拍照或压膜保存Strips。
1.3 统计学方法
以基因计数(gene counting)法计算各种基因的各等位基因频率。卡方检验比较中国人之间和中国人与法国人在等位基因频率分布方面的差别。
2 结果
由于RMS方法固定在Strip条上的探针位置是已知的,所以,在确定基因型时,RMS提供了两张分别显示Strip A和Strip B各个基因型位置的透明塑料膜,以便我们能够将各个样本的Strip A条和Strip B条分别放在对应的透明塑料膜上进行拍照。图1 (Figure1)是RMS提供的检测参考结果确定图,图2 (Figure2)是我们的实验结果图。如果在某个对应的等位基因位置上,样本出现一条蓝色的条带,那么,这个样本就携带这个等位基因。对于野生型纯合子的记录为10,对于杂合子的记录为11,对于突变纯合子的记录为01,这样便于统计分析。
2.1 北京、香港和法国人的Strip A条所含等位基因频率的比较
在Strip A条上,共检测了6种与脂代谢相关基因14个位点的等位基因。这些基因包括载脂蛋白E、载脂蛋白B、载脂蛋白CⅢ、LP L和PON,被检测的位点是:载脂蛋白E(ε2,ε3)、载脂蛋白B(Thr71Ile, Arg3500G ln)、载脂蛋白CⅢ(T2625del、C2482T、T2 455C、C1100T、C3175G和T3206G)、CETP(Ile40 5Val,Asp442G ly)、LP L(T293G、T239C、Asp9Asn、Asn291Ser和Ser447T erm)和PON(G ln192Arg)。在这
图1. RMS检测多种候选基因多态性的图谱结果.
Figure1. RMS genotyping result p atterns of the PCR prod2 ucts.
2组中国人群中,我们没有发现2个LP L的突变位点,即LP L293TΠG和Asp9Asn,不同于法国人群。中国人之间在这些等位基因频率分布方面没有显著差异,而在载脂蛋白B Thr71Ile、载脂蛋白CⅢ(-482CΠT、1100CΠT、3175CΠG和3206TΠG)、CETP (405IleΠVal)、LP L(-93TΠG和Asp9Asn)和PON
(G ln192Arg)位点的等位基因频率有显著差异。
2.2 北京、香港和法国人的Strip B条所含等位基因频率的比较
Strip B条所检测的基因是与血压形成、同型半胱氨酸代谢和血栓形成有关的基因及其常见多态性图2. RMS方法检测中国人样本候选基因型的结果. Figure2.R esults of the R MS genotyping in the Chinese popula2 tion.
位点。它们分别是ACE(IΠD)、ATIIR(A1166C)、AG T (Met235Thr)、C BS(Ile278Thr和G ly307Ser)、MTHFR (C677T)、Factor V(Arg506G ln)、Fibrinogenβ(G2 455A)、G PIIIa(Leu33Pro)和E LAM(G98T、Ser128Arg 和Leu554Phe)。在中国人群中,没有发现以下基因的突变等位基因:G PⅢ(Leu33Pro)、Factor V (Arg506G ln)和E LAM(G98T和Ser128Arg),显著不同于法国人群;也没有发现其它位点的等位基因频率显著不同。但是除Factor V(Arg506G ln)和E LAM (Leu554Phe)外,中国人和法国人在其它等位频率上都存在显著差异(表1,T able1)。
表1. 中国人和法国人等位基因频率比较.
T able1. Comp arison of the allelic frequencies betw een Chi2 nese and French subjects.
Allele
Beijing
(n=208)
H ong K ong
(n=206)
French
(n=200)
P
apoEε20.090.1020.096
ε30.870.8060.803
ε40.040.0920.1010.94 apoB(71)Thr0.870.840.68
Ile0.130.160.32<0.001 apoCⅢ(-625)T0.630.5630.65
Del0.360.4370.350.07 apoCⅢ(-482)C0.630.6120.765
T0.370.3880.235<0.001 apoCⅢ(-455)T0.640.6020.67
C0.360.3980.330.15 apoCⅢ(1100)C0.400.4220.765
T0.600.5780.235<0.001 apoCⅢ(3175)C0.690.7180.915
G0.310.2820.085<0.001 apoCⅢ(3206)T0.330.2330.685
G0.670.7670.315<0.001 CETP(405)Ile0.510.5290.73
Val0.490.4710.27<0.001 CETP(442)Asp0.990.985 1.00
G ly0.010.01500.09 LP L(-93)T 1.000 1.000.97
G000.030.01 LP L(9)Asp 1.000 1.000.975
Asn000.0250.02 LP L(447)Ser0.860.8930.91
T er0.140.1070.090.57 PON1(192)G ln0.350.3590.68
Arg0.650.6410.32<0.001 ACE I0.570.6360.465
D0.430.3640.5350.001 ATIIR(1166)A0.970.9420.755
C0.030.0580.245<0.001 AG T(235)M et0.240.150.585
Thr0.760.850.415<0.001 C BS(278)Ile0.99 1.000.925
Thr0.0100.075<0.001 MTHFR(677)C0.630.7770.65
T0.370.2230.350.005 G PIII(33)Leu 1.000 1.000.84
Pro000.16<0.001 Fibrinogen(-455)G0.840.7210.80
A0.160.2790.200.70 Factor V(506)Arg 1.000 1.000.964
G ln000.0360.007 E LAM(98)G 1.000 1.000.90
T000.10<0.001 E LAM(128)Ser 1.000 1.000.905
Arg000.095<0.001 E LAM(554)Leu0.940.9510.95
Phe0.060.0490.050.953 讨论
基因多态性在个体对疾病易感性、疾病的临床表现、治疗效果的反应性和预后效果方面有重要意义,因此基因多态性检测方法的建立十分重要。RMS研究组从C VD候选相关基因入手,建立多基因多位点基因型分析方法,为大规模人群研究C VD遗传危险因素建立了基础,Cheng等[2]首先试验了这些欧美科学家最为关注的C VD候选基因。
RMS基因型分析方法的最大优点是:仅仅用限制性片段长度多态性方法分析一个基因多态性样本所需要的DNA量,分析该样本多个基因的多个位点的基因型,不仅节约了模板DNA的用量,而且可以获得许多遗传信息,该方法智力和技术成分含量都很高,比如引物设计、引物的生物素标记、寡核苷酸在硝酸纤维素膜上的固定等。
在RMS分析方法中,必须注意引物的分类加入,避免由于引物和DNA的错加影响分析结果。操作中水浴温度和时间需严格遵守,否则容易产生非特异性条带,影响确定基因型的工作。此方法的局限性在于对实验操作者的工作能力要求较高,检测仪器也不是实验室常用仪器,成本较高,比如水浴摇床、盛Strip条所用的槽和照相系统。
众所周知,生物芯片时代的到来对Strip分析方法是一个挑战,但是RMS分析方法比生物芯片分析更容易被临床化学实验室接受和掌握,其结果的直接性也有利于这种方法的推广和应用。该方法有利于有针对性、有目的地研究我们所关注的已知基因多态性与疾病发生的关系,以便在低成本和有效的时间内了解研究对象的目的基因的遗传信息,适用于临床实验室和大规模流行病调查研究。虽然我们的样本量不是很大,但是应用此方法研究不同地区中国人样本和法国人样本的结果也基本显示了中国人的遗传相似性和法国人与中国人的遗传性差异。由于这些候选基因是通过对高加索人群C VD发病相关遗传因素确定的,所以中国人可能在某些位点无突变等位基因,有必要发现中国人特有的与C VD 发生相关的基因多态性。
[参考文献]
[1] Cheng S,Pallaud C,G row M A,et al. A multilocus gen oty ping assay for cardio2
vascular disease. Clin Chem Lab Med,1998,36:5612566
[2] Cheng S,G row M A,Pallaud C,et al. A multilocus gen oty ping assay for candi2
date markers of cardiovascular disease risk. G enome Res,1999,9:9362949 (此文编辑 朱雯霞)
. 人基因多态性分析 一、实验目的 1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。 2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。 二、实验原理 基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 三、器材与试剂 1. 器材 ⑴离心机。 ⑵DNA扩增仪。 ⑶电泳仪。 ⑷水平电泳槽。 ⑸紫外检测仪。 ⑹移液器。 2. 试剂 . . ⑴口腔拭子DNA抽提试剂盒。 ⑵琼脂糖。 ⑶1×TAE电泳缓冲液：980ml蒸馏水中加入50×TAE母液20ml。 ⑷50×TAE母液：Tris 121g，0.5M EDTA（pH8.0）50ml，冰醋酸28.55ml，定容至500ml。
ALDH2基因多态性检测 项目简介：ALDH ( aldehyde dehydrogenase gene ) 人类乙醛脱氢酶，是一种四 联体蛋白，催化乙醛和其他脂肪族醛氧化。目前已发现ALDH 有19 种同工酶，主要有ALDH1～4 四种，其中ALDH2最为重要。在肝和胃中具有很高的表达量，是乙醇代谢途径中最重要的酶之一。ALDH2基因位于人类第12号染色体，由于ALDH2 基因存在G1510A 多态性，导致氨基酸序列第487位上的谷氨酸被赖氨酸所替换( Glu487 Lys)，其中具有催化活性的野生型称为G等位基因(ALDH2*1)，催化能力失活的变异型称为 A 等位基因(ALDH2*2)。在亚洲的黄种人群中， ALDH2*2是频率最高且最重要的突变型。 临床用药医生应考虑的因素： ALDH2基因突变致乙醛脱氢酶活性下降引起的临床表现： 1、ALDH2与硝酸甘油治疗：硝酸甘油是治疗心绞痛的经典药物，研究发现硝酸甘油的舒血管作用是通过释放一氧化氮（NO）所介导。但临床上部分病人舌下含服硝酸甘油不能迅速有效地缓解心绞痛，使心肌严重缺血加重。近来发现， ALDH2与硝酸甘油转化为NO密
切相关。有研究表明，ALDH2*1基因型的患者硝酸甘油治疗心绞痛的疗效明显优于ALDH2*2患者，且前者迅速起效率也明显高于后者。 2、ALDH2与酒精性疾病：乙醛脱氢酶( aldehyde dehydrogenase, ALDH)和乙醇脱氢酶( alcohol dehydrogenase, ADH) 在人体内共同组成了人乙醇脱氢酶系, 负责催化人体的乙醇分解代谢。ALDH2在肝和胃中具有很高的表达量，是乙醇代谢途径中最重要的酶之一。研究发现，突变型基因ALDH2*2的存在能导致ALDH2活力的严重缺失，并与过度饮酒导致的酒精依赖、酒精性中毒、酒精性肝病、消化道癌症等疾病之间存在深刻的联系。过度的饮酒行为，不仅使ALDH2*2 携带者对酒精产生依赖，还可能引起肝癌等的酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)。ALD是长期、大量饮酒所引起的肝脏病变，已成为现代社会的主要健康隐忧之一。研究显示，携带ALDH2 变异基因型者大量饮酒将显著增加患肝癌的危险性。虽然摄入人体的乙醇有90 %以上是在肝脏内完成代谢过程的，但其在摄入过程中与消化道上皮细胞的直接接触也不容忽视。在饮酒人群中，尤其是重度饮酒者，由于其上消化道长期地与大量酒精直接接触，该区域出现癌变(食道癌、口咽癌等)的几率较高。研究发现，ALDH2*2突变与饮酒人群患消化道癌的风险之间具有明显的联系。此外，ALDH2*2显性突变与胃癌的易感性也存在一定的联系。由此可见，ALDH2*2突变是增加区域性癌化几率的重要因素之一。 ALDH2基因多态性检测标本采集及出报告时间：病人抽静脉血2ml（用 EDTA-K2抗凝）送检验科分子生物诊断室，4个工作日出报告。 电话：8801063 手机：余宗涛65327 高波 64444 ALDH2基因多态性检测临床意义： 1、指导临床硝酸甘油的个体化差异用药剂量：虽然硝酸甘油是心绞痛急性发作的常规首选药物，但该药的临床疗效常因人而异。中国汉族人群中，硝酸甘油含服无效的比例高达25%以上。复旦大学、瑞金医院、华山医院等的一项研究显示：部分国人服用硝酸甘油治疗心绞痛无效的原因为线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因发生突变。ALDH2*2携带者服用硝酸甘油无效风险大幅增加；ALDH2*2携带者在中国约占30-50%，比重大；建议患者在使用硝酸甘油前进行ALDH2基因检测，ALDH2*2携带者建议慎用或不用硝酸甘油，改用其它药物。 2、ALDH2与酒精代谢：①ALDH2异常的饮酒者与正常人群相比，其发生肝癌的风险是正常人的3倍以上；②乙肝病毒携带者，如果又正好是ALDH2异常，其饮酒发生肝癌的危险性将升高52.17倍；③持续的过量饮酒导致肾的代谢压力过大，残留的酒精附着在肾细胞上，致使大量肾细胞处于休眠状态，会导致肾功能下降。 3、ALDH2与消化系统疾病：ALDH2异常的饮酒者与正常人群相比，其发生食道癌的风险是正常人的12.95倍，出现口腔癌的风险则为11.72倍。 4、ALDH2与心血管系统疾病：ALDH2异常的冠心病患者，发生心肌梗死的相对风险也为ALDH2正常的3.42倍。 5、ALDH2与内分泌系统疾病：ALDH2异常的人发生II型糖尿病的风险是正常人的6.08倍。
如何用PCR法检测基因的多态性 多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA 位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longth polymorphism)。 基因多态性的主要检测方法简述如下： 1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变， 用限制酶切割基因组时， 钠 问 亢兔扛銎 蔚某ざ染筒煌 此 降南拗菩云 纬ざ榷嗵 裕 贾孪拗破 纬ざ确⑸ 谋涞拿盖形坏悖 殖莆 嗵 晕坏恪W钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。 2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。 3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。 4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素
基因多态性的检测方法 多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性(longth polymorphism)。 基因多态性的主要检测方法简述如下： 1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所产生的片段数目和每个片段的长度就不同，即所谓的限制性片段长度多态性，导致限制片段长度发生改变的酶切位点，又称为多态性位点。最早是用Southern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。 2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。 3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。 4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行
人基因多态性分析 一、实验目的 1. 了解基因多态性在阐明人体对疾病、毒物的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性以及对药物治疗的反应性中的重要作用。 2. 了解分析基因多态性的基本原理和研究方法。 二、实验原理 基因多态性（gene polymorphism）是指在一个生物群体中，同时存在两种及以上的变异型或基因型或等位基因，也称为遗传多态性（genetic polymorphism）。人类基因多态性对于阐明人体对疾病的易感性、毒物的耐受性、药物代谢差异及遗传性疾病的分子机制有重大意义；与致病基因连锁的多态性位点可作为遗传病的诊断标记，并为分离克隆致病基因提供依据；病因未知的疾病与候选基因多态性的相关性分析，可用于辅助筛选致病易感基因。 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction—Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一种常用的DNA分子标记。原理是通过PCR扩增获得目的基因。若目的基因存在等位变异（多态性），且变异正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，则酶切结果就会产生大小不同的片段，即片段长度多态性，再利用琼脂糖凝胶电泳分离，可呈现出多态性电泳图谱。若将患者与正常的多态性图谱比较，可确定是否变异。应用PCR-RFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。 三、器材与试剂 1. 器材 ⑴离心机。 ⑵DNA扩增仪。 ⑶电泳仪。 ⑷水平电泳槽。 ⑸紫外检测仪。 ⑹移液器。 2. 试剂
1定义： 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。理论
应用TaqMan探针技术检测MTHFR基因的C677T和A1298C多态 性 目的探讨一种快速、准确运用于临床检测MTHFR基因多态性的方法。方法提取43例胃癌患者的外周血基因组DNA，用TaqMan探针技术对MTHFR 基因的C677T和A1298C两个多态性位点进行分型，并采用直接测序法对TaqMan探针分型结果进行验证。结果43例样本的MTHFR C677T基因型分别为14例CC、23例CT和6例TT；A1298C基因型为24例AA、18例AC、1例CC，两种分型方法结果一致。结论本研究选用的TaqMan探针分型方法结果准确可靠，能够用于MTHFR的C677T和A1298C两个多态性位点分析。 标签：TaqMan探针；MTHFR；多态性；DNA测序；胃癌 胃癌（Gastric cancer）是世界范围内的高发肿瘤之一[1]。近年研究表明，低叶酸水平可增加包括胃癌在内的许多肿瘤发生的危险性[2]。亚甲基四氢叶酸还原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）是叶酸代谢途径中的一关键酶，MTHFR参与的体内同型半胱氨酸（Hcy）和甲硫氨酸之间的循环反应，反应中生成的S腺苷甲硫氨酸（SAM）是体内代谢唯一的甲基供体，涉及DNA 的修复与合成，影响DNA代谢，与许多肿瘤化疗药物的疗效相关。 MTHFR的活性很大程度上可能受基因多态性的影响，从而影响疾病的发生和药物的疗效。MTHFR基因C677T和A1298C为两个常见的多态性位点，有研究表明该位点的基因多态性会导致MTHFR酶活性的改变[3]，可能导致患者之间出现较大的个体差异。因此，测定MTHFR的基因型对疾病的预防和合理用药有重要的意义。现已有的MTHFR基因多态性的研究，大多数采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术，该技术不仅费时，且易污染造成假阳性。不适宜用于临床检测。本研究旨在探讨一种可用于临床快速准确检测MTHFR基因型的方法，故选用TaqMan探针技术对MTHFR的C677T和A1298C 两个多态性位点进行分型。 1资料与方法 1.1一般资料经CT、MRI或病理组织学活检确诊的胃癌患者43例，来源于昆明医科大学第一附属医院，收集样本人群的外周静脉血2 mL。采用Genomic DNA Purification Kit（PROMEGA公司）对基因组DNA进行提取，使用Nanodrop 2000测定DNA的浓度和纯度。 1.2 TaqMan探针技术检测MTHFR基因C677T和A1298C位点的多态性TaqMan探针试剂由ABI公司为MTHFR基因C677T（SNP ID：rs1801133），A1298C（SNP ID：rs1801131）多态性设计的TaqMan SNP分析试剂，每个位点的TaqMan SNP基因分型试剂中，含有两条MGB探针。MTHFR C677T一条以VIC荧光标记碱基G，对应样本基因突变位点C；一条以FAM荧光标记碱基A，
CYP2C19基因多态性检测 项目简介：CYP2C19是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，是人体重要的药物代谢 酶，在肝脏中有很多表达。CYP2C19基因座位于染色体区10q24.2上，由9个外显子构成。CYP2C19具有很多SNP位点，最常见的是CYP2C19*2和CYP2C19*3。CYP2C19*2会导致转录蛋白的剪切突变失活，而CYP2C19*3能构成一个终止子，破坏转录蛋白的活性。据统计，CYP2C19*2和CYP2C19*3两个突变位点能解释几乎100%的东亚人和85%的高加索人种的相关弱代谢遗传缺陷，而其他两种等位基因CYP2C19*4和CYP2C19*5主要在高加索人种中分布。大量证据证实，不同人种在CYP2C19的底物的代谢能力有很大差异；2–5%高加索人是弱代谢者，而13–23%的亚洲人是弱代谢者。这是由于在亚洲人口中CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因的高频率造成的。通过CYP2C19基因检测，判断患者对相关药物的代谢能力，可以指导临床用方案的制定，实现个体化用药治疗。 临床上常用的经由CYP2C19酶代谢的药物： 1、治疗胃酸相关性疾病：如质子泵抑制剂：奥美拉唑（omeprazole）、兰索拉唑（lansoprazole）、泮托拉唑（pantoprazole）、 雷贝拉唑（rabeprazole）、埃索美拉唑 （Esomeprazole）。 2、治疗心血管疾病：Clopidogrel、氯吡格雷、抗凝血药物。 3、抗真菌药物：Voriconazole、伏立康唑、广谱抗真菌药物。 4、神经类药物：①S-美芬妥英mephenytoin为乙内酰脲类抗癫痫药，在体内的羟化代谢主要由单基因CYP2C19编码表达的CYP2C19酶蛋白介导，由羟化酶CYP2C19氧化生成4’-羟基美芬妥英；②地西泮diazepam，一种长效的镇静、安眠药；③丙米嗪imipramine ，抗抑郁药，N-去甲基化和2-羟化；④苯巴比妥phenobarbital，传统的抗癫痫药；⑤抗心律失常药,抗抑郁药,抗精神病药，β受体阻断剂,抗高血压药和止痛剂。 5、抗肿瘤药：环磷酰胺。 6、抗结核药：利福平。 7、孕激素：黄体酮。 8、抗疟疾药：氯胍。 9、HIV蛋白酶抑制剂。 10、抗移植排斥药物：他克莫司、兰索拉唑。 CYP2C19基因多态性检测标本采集及出报告时间：病人抽静脉血2ml（用 EDTA-K2抗凝）送检验科分子生物诊断室，4个工作日出报告。 电话：8801063 手机：余宗涛65327 高波 64444 CYP2C19基因多态性检测临床意义： 1、基因剂量效应。 2、CYP2C19基因多态性，导致了个体间酶活性的多样性。等位基因的突变使酶活性降低，对药物代谢的能力随着等位基因的不同组合而呈现出一定的规律性，表现出正常基因纯合子>正常基因与突变基因杂合子> 突变基因纯合子或杂合子的变化趋势。 3、对于不同代谢能力的个体，运用不同的药物剂量等策略是非常必要的，可达到更好的治疗效果。 4、根据CYP2C19基因型给予个性化的药物和剂量可以降低副作用发生率-安全性；提高治
检测基因多态性的方法 一种用于快速检测基因多态性的方法，具有如下特征：(a)根据所测样本靶序列设计两对引物，其中一对为锚定引物；(b)将上述两对引物及一个与锚定引物的锚定部分序列相同的引物加入到含有底物及其它PCR扩增反应试剂的溶液中，进行PCR扩增反应；(c)以适当的方法检测扩增产物中链长不同的DNA片断；(d)根据反应产物中DNA片断的多少及其长短判断基因多态性的类型。本发明涉及一种基因多态性检测方法，可用于单碱基多态性、基因突变、单碱基插入或缺失、微卫星分析等。本方法是首先设计两对引物，其中一对为通常PCR引物，用于扩增含有基因多态性位点的DNA片段；另一对为锚定引物，用于判断基因多态性的类型。再将上述两对引物及一个与锚定引物的锚定部分序列相同的引物加入到含有底物及其它PCR扩增反应试剂的溶液中，在单管中进行PCR扩增反应，并使扩增反应产生与基因多态性相对应的DNA扩增产物，然后以凝胶电泳法、或毛细管电泳法、或微流控芯片法，或高效液相色谱法等分离技术检测，根据扩增产物中DNA片段的多少及链长判断基因多态性的类型。为提高延伸反应的特异性，在锚定引物的3’端区域人为地引入一个与模板不互补的碱基。 用于检测遗传多态性的方法，包括：生成寡核苷酸探针和／或寡核苷酸引物，使得该寡核苷酸探针和／或引物包含在编码受体的基因或与其互补的序列中存在的多态位点，或者，当编码受体的所述基因和与其互补的所述序列至少其中之一得到扩增时，使得多态位点包含在扩增片段中；并使用由此生成的寡核苷酸探针和／或寡核苷酸引物检测编码靶受体的基因中的至少一种遗传多态性。 多态性是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因的多态性。这种多态性可以分为两类，即DNA 位点多态性和长度多态性。 基因多态性的主要检测方法： 1，限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism）:由DNA的多态性，致使DNA分子的限制酶切位点及数目发生改变，现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。 2，单链构象多态性：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。 3，PCR-ASO探针法：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。 4，PCR-SSO法：原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。 5，PCR-SSP法：SSP（序列特异性引物）只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的。 6，PCR-荧光法： 7，PCR-DNA测序：是诊断未知突变基因最直接的方法。 8，PCR指纹图法：实用于快速的同种异性DR/DW配型。 9，基因芯片法：又称为DNA微探针阵列。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针，通过与被标记的若干靶核苷酸序列互不匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图像，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图像，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹