北京化工二厂原址附近地区土壤微生物群落结构研究
程思齐1 宋傅天2
1北京市广渠门中学
2北京师范大学附属实验中学
指导教师：耿爽1 刚永运2薛慧君3闻红4
1北京大学微生物生态与生物技术实验室
2北京师范大学附属实验中学
3北京师范大学附属实验中学
4北京市广渠门中学
摘要：随着经济的快速增长，环境污染问题得到了越来越多的关注。在治理城市污染过程中，不少重污染的企业完成了搬迁工作。然而，企业原址仍然存在未妥善处理的污染源，为土壤修复带来了阻碍。土壤微生物是土壤生态系统的重要组份之一，对土壤微生物群落结构的研究将有利于了解土壤生态系统的功能及稳定性，对评价土壤健康具有重要指示作用。因此，本研究选择了北京化工二厂原址附近土壤9个采样点，27个样品进行分析，完成理化性质测定及微生物细菌群落末端限制性片段长度多态性分析。结果显示27个样品中微生物群落结构与含水量、pH相关性不强，但群落结构与采样点位置有较强相关性。距离污染水源较近及较远的采样点样品，其群落结构分别形成较为明显的聚类。该结果说明未妥善处理的污染水源对附近土壤微生物群落结构产生了影响，可能不利于该地区土壤的修复。
关键词：土壤微生物群落结构 T-RFLP
引言
北京化工二厂，曾于1980年锅炉发生设备事故，造成重油泄露，并引起大火；曾于2005年发生爆炸引起大火。两次重大事故的污染，对周边地区生活环境的影响很大；不仅如此其近五十年来生产过程中排放的污水，其中包括汞等重金属以及各种气体有机物对环境的危害不能小视。尽管北京化工二厂已经迁走，废水及废气的排放得到了有效遏制，但工厂附近的污染水源、进入土壤的废渣并
未完全清除，只能借助环境的自我净化功能。本课题主要研究的科学问题，是围绕着在北京化工二厂搬迁三年后，土壤的自我净化情况，以及残留的污染水源或废渣对土地自我修复的影响。
对于土壤来说，土壤微生物是土壤生态系统的重要组份之一，几乎所有的土壤过程都直接或间接地与土壤微生物有关，如分解土壤有机质和促进腐殖质形成，与植物共生促进植物生长，在有机物污染和重金属污染治理中起重要作用等[1]。土壤微生物是指示土壤生态系统稳定性及其功能的重要传感器，对土壤健康具有重要的指示作用。近年来将土壤微生物群落结构组成、土壤微生物生物量、土壤酶活性等作为土壤健康的生物指标来评价退化生态系统的恢复进程和指导生态系统管理等已逐渐成为研究热点[2]。因此，对土壤微生物群落结构多样性进行研究，将有助于我们全面、系统地综合评价土壤受污染的状况。
研究土壤微生物多样性的方法大致可分为两类：一类是基于培养和分离手段来揭示土壤微生物群落变化；另一类是基于生物指示分子（如DNA、RNA及磷脂脂肪酸）变异模式的土壤微生物多样性[2]。第一类方法属于传统方法，通过分离培养、测定生理生化、细胞化学成分分析来进行对微生物群体的多样性以及群落结构的研究[3]。用培养的方法虽然可以代表可培养部分微生物的多样性，但是很难分离到环境样品中所有的微生物，另一方面被分离培养的微生物通常并不是自然环境中的优势种群。显然，以传统方法得到的多样性结果无法反映系统中微生物群落的真实组成。相较之下，第二类方法表现出诸多优势。20世纪80年代中期，美国科学家Norman Pace首先绕开了对环境微生物的培养，直接利用环境样品的总DNA进行了16S rRNA基因的PCR扩增并进行鉴定。16s rRNA基因是原核核糖体30S小亚基的组成部分相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中，并对微生物种类的鉴定提供了重要依据。从这以后的20多年里，分子生物学技术的广泛应用克服了传统方法的限制，使得微生物学者可以从群体水平上直接分析群落组成，分析个体与群落的关系。分子生物学技术的应用极大推动了微生物生态学的发展，极大地丰富了微生物生态学研究的方法，从而导致了微生物分子生态学的产生。微生物分子生态学技术使我们可以不依赖于微生物的分离培养技术，而在基因组DNA水平上对复杂的微生物系统进行分析。借助分子标记、核酸指纹图谱等分子手段我们可以研究生物进化、遗传和物种多样性、生物对环境变
化的相应对策、转基因生物的环境释放等问题[4]。
末端限制性片段长度多态性技术[5]（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，简称T-RFLP）是一种新兴的研究微生物多态性的分子生物学方法，正受到研究人员的重视和青睐。该技术已经成功应用于各种微生物群落的分析比较、研究微生物群落多样性及结构特征等多方面。T-RFLP是建立在16S rRNA 基因分析基础上的技术。细菌的16S rRNA存在保守区和可变区，根据这些保守区可以设计出细菌的16S rRNA通用引物，用它们可以扩增出所有细菌的16S rRNA 片段，而16S rRNA可变区的差异则可以用来区分不同种的细菌。在设计保守区的引物时，其中一个引物的5’端用荧光物质标记，常用的荧光物质有HEX、TET、6-FAM等，然后提取待分析样品的总DNA，以它为模板进行PCR扩增，那么所得到的PCR产物一端就带有这种荧光标记。然后，将PCR产物用合适的限制性内切核酸酶消化, 一般选用酶切位点为4bp的限制性内切酶。由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点会存在差异，酶切后就产生了长度不同的限制性片段。然后酶切后的消化产物用自动测序仪（选用genescan功能）进行检测，只有末端标记的片段能被检测到，而其它没有荧光标记的片段检测不到。这些末端标记的片段反映微生物群落组成情况，对于从不同细菌扩增出来的片段，由于核苷酸序列不同，酶切位点就可能不同，这样就能得到不同长度的末端限制性片段。反过来，不同长度的末端限制性片段必然代表不同种的细菌，也就是说一种末端限制性片段至少代表着一种细菌。所以通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落组成情况。
这种方法还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上，每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面积越大。因此可以认为检测到的终端片段数目给出对群落中微生物种群数的最小估计值。而且该技术采用自动DNA测序仪对终端片段进行检测，并通过加入的DNA分子量标准参照物，自动DNA测序仪可以定量给出每个末端限制片度的碱基大小和相对荧光强度，从而可以定量地计算微生物群落的多样性并对不同环境样品的微生物群落进行定量化比较。
正文
1.实验设计及实验步骤
1.1．采样点的布置及取样
本研究采用蛇形布点取样。如图1所示，在原化工二厂外50米处选择9个采样点进行采用，覆盖面积约为50m×100m。在采样点的右侧有一条受工厂污染较为严重的河流，在本研究中可视为土壤的污染源。从采样点的布局可以看出，9号采样点距离污染水源最为接近，而1号采样点距离污染水源最远。采样时，每个采样点进行0-10 cm，10-20 cm，20-30 cm三个深度样品进行采集，因此一共有27个样品。样品编号及其对应的土样如表1所示。
图1：采样点布置示意图。
编号对应土样编号对应土样编号对应土样
1 1号采样点0-10cm 10 4号采样点0-10cm 19 7号采样点0-10cm
2 1号采样点10-20cm 11 4号采样点10-20cm 20 7号采样点10-20cm
3 1号采样点20-30cm 12 4号采样点20-30cm 21 7号采样点20-30cm
4 2号采样点0-10cm 13 5号采样点0-10cm 22 8号采样点0-10cm
5 2号采样点10-20cm 14 5号采样点10-20cm 23 8号采样点10-20cm
6 2号采样点20-30cm 15 5号采样点20-30cm 24 8号采样点20-30cm
7 3号采样点0-10cm 16 6号采样点0-10cm 25 9号采样点0-10cm
8 3号采样点10-20cm 17 6号采样点10-20cm 26 9号采样点10-20cm
9 3号采样点20-30cm 18 6号采样点20-30cm 27 9号采样点20-30cm
表1：样品编号及对应土样。
1.2.土壤样品理化性质检测
含水量测定：将一份土样混合均匀，称取1g，用铝箔纸包裹后测定质量，精确至0.01g。然后放置在105±2℃烘箱中烘烤24h后取出，立即称重，由此计算出各样品的含水率。
pH值检测：将土样称取4g，加入40 mL 无菌水混合，即土壤与水的比例（1:10）的条件下进行过夜浸提，10000 g离心3 min，采用pH计对浸提液进行pH值测定。
1.3. 利用T-RFLP进行群落结构检测
本研究对9个采样点中27个样品进行了末端限制性片段长度多态性分析，包括土壤样品DNA提取、16S rDNA的荧光PCR扩增、PCR产物纯化、PCR产物纯化后酶切反应、酶切产物脱盐、T-RFLP上样检测[5]。操作流程如图2所示。
图2：末端限制性片段长度多态性技术基本过程
（1）土壤样品DNA提取：参考相关文献[6]介绍的DNA 提取方法，根据FastDNA Spin Kit for soil试剂盒（MP Biomedicals; LLC）的相关说明作为本课题研究的DNA提取方法。步骤参见附录。
（2）16S rDNA的荧光PCR扩增：扩增体系和程序参考文献[7]，对菌落的16S rDNA 保守序列的扩增用细菌的通用引物对，其中正向引物为8F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，反向引物为1492R （5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）, 在引物8F的5’端标记荧光物质（8F-FAM），PCR扩增后将得到荧光标记的16S rDNA片段，用于菌落的T-RFLP分析。PCR 反应体系如表2所示。在PCR仪上进行扩增反应的程序为：95℃变性5min（1个循环）；94℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min 30s（23个循环）；最后72℃延伸10min。
组分（浓度）体积(μL)
10×Takara Taq Buffer w/MgCl
5
2
dNTP mix Takara (2.5mM) 4
正向引物(10 pmol/μL) 1
反向引物(10 pmol/μL) 1
Takara Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.3
H
O 37.7
2
DNA 模版（1ng/μL） 1
总体积50
表2：PCR 反应体系
（3）PCR产物纯化：采用离心柱型多功能DNA纯化试剂盒（北京百泰克生物公司），步骤参见附录。
（4）PCR产物纯化后酶切反应：采用4个碱基识别位点的限制性内切酶MspI 对细菌16SrRNA基因进行酶切，酶切位点如表3所示，酶切体系如表4所示。
内切酶MspI
酶切位点5' ... C^CGG ...
3'
3' ... GGC^C ...
5'
表3：限制性内切酶MspI酶切位点
组分Msp I酶切体系（μL）
纯化的PCR产物 3
Buffer tango 2
限制性内切酶（10U/μL） 1
H
2
O 14
总体积20
表4：限制性内切酶MspI酶切体系
（5）酶切产物脱盐：在酶切产物中加入2.5μL的3M NaAc(pH=5.2)，40μL 冰异丙醇，在离心管中混合均匀后，离心(16000 g，30 min)；小心吸取上清，并弃之；在离心管中加入100 μL在-20℃预冷的70%乙醇进行清洗,离心(16000 g，30min)后弃去上清；将离心管置于真空干燥仪中进行干燥约10-15min；加入15 μL甲酰胺(ABI)在4℃溶解沉淀半个小时或更长时间后，储存于-20℃，冷却3-5 min。
（6）T-RFLP分析：用移液枪将混有内标物Liz 500的脱盐酶切产物吸至96孔板中的相应孔内，注意加样时应避免在孔中存留气泡。然后将96孔板装在遗传分析仪样品板中，并设定样品序列和运行模式，为进样时间16s，进样电压1.2 kV，电泳电压1.5 kV，电泳时间1800 s，启动毛细管电泳运行程序对样品进行检测。
2. 实验结果及数据分析
2.1．理化性质结果
本研究检测了27个样品pH值及含水量，结果如图3、图4所示。从结果中我们可以看出样品pH值及含水量都与采样点具有较强相关性，即同一个采样点的上中下土层pH值及含水量较为统一。在同一个采样点中，含水量随土层深度有较大差异，表层土含水量普遍较低，深层土含水量普遍较高。该结果符合客观事实，因为表层土与空气紧密接触，蒸发最为严重，所以含水量普遍较低，而深层土与空气接触较少，保水性更强，因此含水量普遍较高。
图3:27个样品pH值结果
图4:27个样品含水率结果
2.2．群落结构结果
本研究利用T-RFLP技术检测了27个样品中土壤微生物群落结构。由于该实验流程较为复杂，我们获得了27个样品中24个样品的T-RFLP结果，详见附录图片。在T-RFLP图谱中，横坐标为带有荧光信号的碱基大小，纵坐标为该峰值
的响应值。每一个峰值代表了环境样品中的一种微生物，峰面积越大则说明群落中该类微生物含量越高。通过直观地比较24个T-RFLP图谱，我们发现不同样品所得到的图谱是不同的，这说明不同的样品具有不同的微生物群落结构。
2.3. 群落结构聚类分析
为进一步了解27个样品群落结构的相似及不同，本研究采用Spearman相关性矩阵对获得T-RFLP的24个样品进行聚类，结果如图6所示。在该图中，相似性越高分值越接近于1，区块颜色也越接近红色，相反，如果相似性越低分值越接近于0，区块颜色也越接近蓝色。图中对角线全部为红色，表示样品与自身进行比较，相似性达到最大值。而图中其它区块以蓝色及浅黄色为主，说明24个样品的微生物群落结构有较大差异。此外，本研究对24个样品进行Bray-Curtis 聚类。该聚类依据峰值的有无及峰面积大小进行计算，根据分值将群落结构接近的样品聚类在一起，结果如图7所示。在聚类结果中，我们可以将24个样品分为四个大支，聚类到同一个大支下的样品具有较为相似的群落结构。通过聚类结果可以看出，来源于采样点9的样品25，26，27同属于第二大支，而来源于采样点1的样品1，2，3同属于第四大支。这说明采样点1及采样点9的样品分别具有相似的群落结构。结合采样点布局，我们发现采样点9距离污染水源最为接近，而采样点1距离污染水源最为遥远。因此，采样点1及采样点9的样品分别聚类在一起说明污染水源可能对土壤产生了一定影响，从而影响了土壤微生物群落结构。
图5：对24个样品进行Spearman相关性矩阵分析
图6：对24个样品进行Bray-Curtis聚类
2.4 微生物群落结构与理化性质相关性分析
为进一步了解样品群落结构是否与土壤样品pH值及含水率存在相互关系，本研究利用典范对应分析（canonical correspondence analusis, CCA）对样品群落结构及pH值及含水率两个环境因子研究。结果如图8所示。图中黑色字体显示的是样品，红色字体显示的是T-RFLP出现的所有峰，蓝色字体显示的是环境因子pH值及含水率（WC）。如果样品点按照环境因子的方向进行排列，那么就说明样品群落结构与环境因子具有较强的相关性，如果样品未按照环境因子的方向排列，那么就说明样品群落结构与环境因子相关性不强。从图8中我们可以看出，24个样品未沿着环境因子的方向排列，说明在本研究中，土壤微生物群落结构与pH值及含水率相关性不强。
图7：24个样品群落结构与环境因子pH及含水量(WC)相关性分析
3.结论与展望
通过蛇形布点取样、样品理化性质分析、样品微生物群落结构T-RFLP分析、群落结构聚类以及群落结构与理化性质相关性分析，本研究对原化工二厂外不同采样点的土壤微生物群落结构有了较为全面的了解。距离污染水源较近及较远的样品能够分别形成聚类，说明距离污染水源较近及较远的土壤微生物分别具有相似的群落结构。这一特征与采样点的地理位置紧密相关，预示着工厂原址遗留下的污染水源对土壤生态存在一定的影响，遏制了土壤生态的正常修复。尽管北京化工二厂已经完成了搬迁工作，但未妥善处理的污染源仍然对环境产生着影响。因此，在进行环境修复过程中，相关单位需要对各个污染源进行充分、全面的处理，从而彻底地修复环境。
为了能够更进一步了解该地区的土壤微生物群落结构，下一步的工作重点可进行对群落中细菌的具体种类加以测定，结合原工厂所排放污水中的物质，探究污染源对土壤微生物产生影响的具体机制。还可以通过查阅文献，了解微生物消
化分解污染物质的知识，争取找到通过微生物技术修复化学污染的土地的方法。
参考文献
1.周丽霞，丁明懋：土壤微生物学特征对土壤健康的指示作用。生物多样性 2007.
15（2）：162-171.
2.腾应，骆永明，李振高：污染土壤的微生物多样性研究。土壤学报 2006. 43
（6）：1018-1026.
3.张素琴.微生物分子生态学[M].北京:科学出版社,2005.9:284-305.
4.池振明.现代微生物生态学[M].北京:科学出版社,2010:15-27.
5.宋福强. 微生物生态学[M]. 北京:化学工业出版社,2008.
6.Sambrook J, Russell D W. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed.
NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001: A8.9-A8.10.
7.Watanabe K, Kodama Y, Syutsubo K, et al. Molecular characterization
of bacterial populations inpetroleum-contaminated groundwater
discharged from underground crude oil storage cavities. Appl. Environ.
Microbiol., 2000, 66(11): 4803-4809.
致谢
首先，我要感谢“翱翔计划”可以给我们提供这次学习机会，让我们参与到重点实验室中去亲自做实验，亲身经历一个科研工作的过程。
感谢耿爽老师在百忙之中仍然对我们的耐心细心指导；感谢薛慧君老师在整个“翱翔计划”过程中对我们的关心和照顾；感谢学校老师对我们参与“翱翔计划”的理解和支持；感谢父母为我们参与“翱翔计划”的支持和付出；感谢参加活动的各位专家提供的宝贵意见。
感谢“翱翔计划”。
附录
1、DNA 提取步骤如下：
（1）往Lysing Matrix E tubea中加入978μL Sodium Phothate Buffer（磷酸盐）和122μL MT Buffer，振荡混匀；
（2）在细胞破碎仪上进行振荡破壁（2500rpm，30s），将振荡后的Lysing Matrix E tubea放于冰上冷却1min，共振荡2－3次；
（3）将Lysing Matrix E tubea放入离心机（14000rcf，10min）中离心；（4）将上清液转移到无菌的2mL离心管中，加入250μL PPS（Protein Peciptation Solution），用手上下振荡10次；
（5）将Lysing Matrix E tubea在离心机（14000rcf，5min）中离心，离心后将上清液转移至无菌的5mL的离心管中；
（6）混匀Binding Matrix悬浊液，将1mL悬浊液加入到5mL离心管中；（7）将离心管至于振荡器上振荡或者手摇颠倒混匀2min，让DNA充分绑定，然后室温静置3min让其沉淀；
（8）吸取约500μL上清液扬弃，混匀剩余的重悬液体，将其转移到SPIN TM Filter中，在离心机（14000rcf，1min）上离心，离心后清空下面的catch tube 的液体；
（9）往SPIN TM Filter的柱子内加入500μL SEWS-M洗涤液，用枪吹打使得液体和滤膜上的沉淀混匀；
（10）将SPIN TM Filter管子放于离心机（14000rcf，1min）离心，清空catch tube，继续在离心机（14000rcf，2min）上离心，甩干残余液体，丢弃catch tube，换上无菌的1.5mL离心管；
（11）将SPIN TM Filter开口置于通风橱中干燥5min；
（12）加入50-100μL DES重悬Binding Matrix，在气浴振荡器（55℃，5min）中振荡；
（13）将SPIN TM Filter在离心机（14000rcf，1min）上离心，在1.5mL离心管中收集到洗涤下来的DNA；
（14）采用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA（120V，25min），在溴化乙啶溶液中染色10-15min 后用UVP 成像系统检测条带。
2、PCR产物的纯化步骤如下：
（1）每100μLPCR产物加入500μL溶胶/结合液DB，充分混合；
（2）将所得的溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管内），室温放置1min，然后放入离心机（12000rpm，60s）中离心，倒掉收集管内的废液；
（3）加入700μL漂洗液WB，放入离心机（12000rpm，60s）中离心，弃掉废液；（4）加入500μL漂洗液WB，放入离心机（12000rpm，60s）中离心，弃掉废液；（5）将吸附柱AC放回空收集管中，放入离心机（12000rpm，2min）中离心，尽量出去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
（6）取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL 洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液实现放在65－70℃水浴中加热），室温放置2min，放入离心机（12000rpm，60s）中离心。如果需要较多量DNA，可将得到的溶液重新加入离心柱中，放入离心机（12000rpm，60s）中离心。
3、24个样品T-RFLP图谱：
班级 小组 姓名 评价等级 沅江三中四环八步教学模式 生物模块三导学案 第1页（共6页） 探究土壤微生物的分解作用(教师版) 【学习目标】 1.设计和进行对照实验，尝试探究土壤微生物的分解作用，进一步培养探究和创造能力。 2.分析土壤微生物分解淀粉的情况。 3.学会检测淀粉和还原糖的方法，并根据现象作出合理判断和解释。 案例1: 探究土壤微生物对落叶的作用 一、提出问题: 秋天，落叶纷飞。春天，绿草如茵。且不见落叶痕迹！落叶去哪里了？ 结合上面的实例，你能提出什么问题呢？请写下来。 落叶在土壤中能被分解掉,这究竟主要是土壤的物理化学因素的作用,还是土壤中微生物的作用呢 ？ 注意: （1）要选择有研究意义的问题作为课题来研究 （2）要选择我们能力范围之内的问题作为实验研究课题。 二、作出假设: 落叶是在土壤微生物的作用下腐烂的 提示:假设既可以是基于已有的知识或经验作出的解释,也可以是想像或猜测。 三、设计实验 1、设计方案 （1）实验原理: 微生物能分泌多种水解酶将大分子有机物分解成小分子有机物，如纤维素酶、淀粉酶可将纤维素、淀粉水解成葡萄糖。然后被分解者吸收到细胞中进行氧化分解，最终形成CO2、水和各种无机盐，同时释放能量。 （2）、实验材料: 土壤、落叶、 （3）、实验器具: 玻璃容器、标签、塑料d 袋、恒温箱、纱布。 （4）、实验设计步骤: ①取两个圆柱形的玻璃容器,一个贴上“甲组”标签,另一个贴上“乙组”标签。 ②将准备好的土壤分别放入两个玻璃容器中,将其中乙组放入恒温箱, 60℃灭菌1h 。 ③取 大小、形态相同的落叶12片,分成2份,分别用包好,埋入2个容器中,深度约5cm 。 ④将2 个容器放于实验室相同的环境中, 一段时间后,取纱布包。 ⑤观察比较对照组与实验组落叶的 腐烂程度。 提示: （1）要确定实验变量是什么 需要控制的变量有哪些如何控制这些变量 ； （2）要注意实验步骤的先后顺序。 （3）要注意写出具体的实验步骤以便指导实验的进行。
(5)高通量测序：环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究 热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面， 对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术 的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量 测序技术（尤其 是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵 敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我 们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重 要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通 过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以 对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微 生物群
落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传 染病病原微生物。研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四 类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学 方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分 子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包 括:DGGE/TGGE/TTGE 、 T-RFLP 、SSCP、FISH 、印记杂交、定量 PCR、基因芯片等。 DGGE 等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数 优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不只一种 16S rDNA 序列，因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息，还需 对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操 作相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做 到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微
《土壤里的微生物》教学设计（第1课时） “土壤里的微生物”是科版七年级下册第13章第2节的容。是上一节课容的基础上，让学生进一步认识到土壤里生物的多样性，以及它们对生物圈的平衡和稳定起着非常重要的作用，从而对本单元环境中生物的多样性具有全面的认识。同时为下一章引导学生对生物进行分类奠定基础。因此本节课的意义十分重要，是本章的重点和难点。 教材分析 课标对本节的要“描述细菌的主要特征以及与人类生活的关系”。本节从单细胞细菌到多细胞的真菌、从肉眼看不见的细菌到大型真菌，带领学生走进丰富多彩的微生物世界。土壤中的微生物，学生平时不易见到，细菌需要用高倍显微镜才能更好地观察到形态，细菌的结构更难观察，而初中又不要求使用高倍显微镜，教材呈现了细菌的形态结构图片，所以只能通过图片、视频引导学生观察、比较认识细菌的基本特征。 学情分析 七年级学生通过小学科学课和上一学期生物课的学习，对生物学科有了初步的了解，具有一定的生物基础知识和学习经验，能够通过观察图片、阅读材料、对比分析、合作讨论等方式获取有关信息。但在学习上仍以感性认识为主，好奇心强、注意力容易转移,但他们活泼好动，喜欢直观形象的事物，喜欢动手实践。 有关微生物的相关知识在上学期在生态系统的组成学习过程中及学生日常生活经验中对微生物的类型和作用从总体上有了一个初步的了解，特别是在生活过程中家长或者教师从卫生角度常常提到细菌这个概念，学生对这一概念还是比较熟悉，对细菌与人类的关系也有不同程度的了解。但在生活中微生物是肉眼看不见的生物，只有用高倍或电子显微镜才能观察到，与人类的关系和对生物圈的作用又是隐性和潜在的，很少有机会引起学生的关注，容易被学生忽视和轻视，学生缺乏相应的感性知识和学习兴趣。对土壤中的微生物的类型、形态特征，生殖、营养方式、分布以及与人类生活的关系，学生比较陌生，这些是课程标准的明确要求，也是学生学习的终极目标。教材中只用文字表述，学生不容易理解，在教学中一是通过组织学生阅读教材在自主学习中从理论上了解细菌、放线菌的有关知识。二是通过播放有关细菌、放线菌形态、结构等视频资料及图片引导学生观察分析细菌和放线菌的形态、结构。三是利用小组
土壤中重金属污染研究现状 【摘要】近几十年来,随着人类对自然资源的过度开发和利用，农用化学物质种类、数量逐年增加，工业、城市污染逐渐加剧，导致土壤重金属污染日益严重。通过翻阅一些资料和文献，深入了解了土壤重金属污染的现状。本文分析了土壤重金属污染的概念，土壤重金属污染的相关特点，并归纳了土壤重金属污染的治理方式[1]。 关键词：土壤污染；重金属；防治措施；治理措施 2008年以来，全国已发生百余起重大污染事故，包括砷、镉、铅等重金属污染事故达30多起。频繁爆发的污染事故损失惨重，不仅增加了环境保护治理成本，也使社会稳定成本大增，而土壤污染修复所需的费用更是天价。 污染的加剧导致土壤中的有益菌大量减少，土壤质量下降，自净能力减弱，影响农作物的产量与品质，危害人体健康，甚至出现环境报复风险。一是生态关系失衡，引起生态环境恶化[2]。 1 土壤重金属污染的概念 土壤重金属污染是指由于人类活动，土壤中的微量有害元素在土壤中的含量超过背景值，过量沉积而引起的含量过高，统称为土壤重金属污染[3]。污染土壤的重金属主要包括汞(Hg)、镉(Cd)、铅(Pb)、铬(Cr)和类金属砷(As)等生物毒性显著的元素，以及有一定毒性的锌(Zn)、铜(Cu)、镍(Ni)等元素。主要来自农药、废水、污泥和大气沉降等，如汞主要来自含汞废水，镉、铅污染主要来自冶炼排放和汽车废气沉降，砷则被大量用作杀虫剂、杀菌剂、杀鼠剂和除草剂。 2 土壤重金属污染的影响 2.1 重金属在土壤中的形态 土壤中重金属形态的划分有两层含义，其一是土壤中化合物或矿物的类型，其二是操作定义上的重金属形态。土壤中重金属存在的形态不同，其活性、生物毒性及迁移特征不同，其生态效应和植物效应也不同。重金属能在一定的幅度内
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算
土壤微生物量碳测定方法及应用 土壤微生物量碳（Soil microbial biomass）不仅对土壤有机质和养分的循环起着主要作用，同时是一个重要活性养分库，直接调控着土壤养分（如氮、磷和硫等）的保持和释放及其植物有效性。近40年来，土壤微生物生物量的研究已成为土壤学研究热点之一。由于土壤微生物的碳含量通常是恒定的，因此采用土壤微生物碳(Microbial biomass carbon, Bc)来表示土壤微生物生物量的大小。测定土壤微生物碳的主要方法为熏蒸培养法（Fumigation-incubation, FI）和熏蒸提取法（Fumigation-extraction, FE）。 熏蒸提取法（FE法） 由于熏蒸培养法测定土壤微生物量碳不仅需要较长的时间而且不适合于强酸性土壤、加 入新鲜有机底物的土壤以及水田土壤。Voroney (1983)发现熏蒸土壤用·L-1K 2SO 4 提取液提取 的碳量与生物微生物量有很好的相关性。Vance等(1987)建立了熏蒸提取法测定土壤微生物 碳的基本方法：该方法用·L-1K 2SO 4 提取剂（水土比1：4）直接提取熏蒸和不熏蒸土壤，提取 液中有机碳含量用重铬酸钾氧化法测定；以熏蒸与不熏蒸土壤提取的有机碳增加量除以转换 系数K EC (取值来计算土壤微生物碳。 Wu等（1990）通过采用熏蒸培养法和熏蒸提取法比较研究，建立了熏蒸提取——碳自动一起法测定土壤微生物碳。该方法大幅度提高提取液中有机碳的测定速度和测定结果的准确度。 林启美等（1999）对熏蒸提取-重铬酸钾氧化法中提取液的水土比以及氧化剂进行了改进，以提高该方法的测定结果的重复性和准确性。 对于熏蒸提取法测定土壤微生物生物碳的转换系数K EC 的取值，有很多研究进行了大量的 研究。测定K EC 值的实验方法有：直接法（加入培养微生物、用14C底物标记土壤微生物）和间接法（与熏蒸培养法、显微镜观测法、ATP法及底物诱导呼吸法比较）。提取液中有机碳的 测定方法不同（如氧化法和仪器法），那么转换系数K EC 取值也不同，如采用氧化法和一起法 K EC 值分别为（Vance等，1987）和（Wu等，1990）。不同类型土壤（表层）的K EC 值有较大不 同，其值变化为（Sparling等，1988，1990；Bremer等，1990）。Dictor等（1998）研究表 明同一土壤剖面中不同浓度土层土壤的转换系数K EC 有较大的差异，从表层0-20cm土壤的K EC 为，逐步降低到180-220cm土壤的K EC 为。 一、基本原理 熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破 坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4 溶液可提取 成分（Joergensen,1996）。采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数K EC 来估计土壤微生物碳。 二、试剂配制 （1）硫酸钾提取剂（·L-1）：取分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10L。由于硫酸钾较难溶解，配制时可用20L塑料桶密闭后置于苗床上（60-100rev·min-1）12小时即可完全溶解。 （2） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2 Cr 2 O 7 （分析纯）9.806g 于1L大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1L。K 2Cr 2 O 7 较难溶解，可加热加快其溶 解。 （3） mol·L-1（1/6K 2Cr 2 O 7 ）标准溶液：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g， 用蒸馏水溶解并定溶至1L。
初中生物新课程标准教材 生物教案( 2019 — 2020学年度第二学期 ) 学校： 年级： 任课教师： 生物教案 / 初中生物 / 七年级生物教案 编订：XX文讯教育机构
土壤里的微生物 教材简介:本教材主要用途为通过学习生物这门课程，可以让学生打开对世界的认识，提高自身的见识，本教学设计资料适用于初中七年级生物科目, 学习后学生能得到全面的发展和提高。本内容是按照教材的内容进行的编写，可以放心修改调整或直接进行教学使用。 一、教学目标 (一)认知目标 1．介绍细菌、放线菌和真菌的形态结构、营养方式和生殖方式。 2．介绍微生物在自然界里的作用 (二)技能目标 培养学生的观察能力、分析问题的能力 (三)情感目标 1．通过对微生物在生产生活中应用的学习，培养理论与实践相结合的习惯。 2．通过介绍我国人民利用微生物造福社会的事例，激发学生的民族自豪感。 二、教学重点与难点 1．教学重点：微生物的形态、结构、营养方式。 2．教学难点：微生物的营养方式和生殖。
四、教学过程 （一）导入 一、认识细菌： 引入新课，教师接着指出：细菌分布广泛，无论是空气、水、土壤还是每个人身上都有细菌生活。但它是单细胞生物，个体十分微小，所以我们用眼睛看不到，下面我们就要了解一下细菌的形态和结构特点。 细菌形态①用高倍显微镜演示细菌的三种形态；②可以用显微投影仪投影放大细菌的三种形态。③播放细菌显微结构和亚显微结构的录像片段。细菌三种形态的示意图。接着教师总结出细菌的形态：单细胞个体，从形态上分为：球菌、杆菌和螺旋菌三类。 （3）细菌的结构特点，让学生与前面所学过的植物细胞结构进行比较找出相同点和不同点。注意强调：细菌细胞没有成形的细胞核是细菌细胞与植物细胞在结构上的重要区别，所以细菌不属于植物范围。另外，有些细菌具有特殊结构如：①有的细菌具有鞭毛可在水中游动。②有的细菌在细胞壁外有荚膜、具有保护作用。 关于芽孢，教师应该指出：能否形成芽孢是细菌总的特征，不是所有细菌都能形成芽孢。芽孢是该菌种的休眠状态，称休眠体。注意说明芽孢的形成不是细菌的繁殖方式，一个细菌只能生成一个芽孢，在适宜条件下，一个芽孢萌发形成一个菌体。芽孢对恶劣环境有很强的
土壤微生物群落结构影响因素及研究方法的现状与展望 摘要: 土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分, 在土壤有机物质分解和养分释放、能量转移等中起着重要作用。随着人们对生物群落结构多样性重要性认识的不断深入及研究方法的不断改进, 土壤微生物群落结构多样性, 尤其是群落结构的研究工作逐渐受到生态学家的重视。本文从土壤微生物群落结构多样性的影响因素以及研究方法等方面阐述了目前国内外土壤微生物群落结构多样性的研究现状, 并对其未来研究方向进行了合理展望。 关键词:微生物,群落结构, 土壤微生物群落 Review and prospects on methodology and affecting factors of soil microbial community structure Abstract:Soil microorganisms are important components of soil ecosystem and play central roles in biogeochemicalcycling such as organic matter decomposition, mineral nutrient release, and energy transformation. Along with the intensive comprehension of the importance of microbial community structure diversity and the rapid development of methodology, more and more studies have focused on soil microbial community structure diversity. This review introduces the current development of methodology and affecting factors of soil microbial community structure diversity. We also discussed the directions of future research on soil microbial community structure diversity. Key words: biodiversity, community structure ; soil；microbial community 引言 土壤微生物主要指土壤中那些个体微小的生物体,主要包括细菌、放线菌、真菌,还有一些原生动物和藻类等。土壤微生物是影响土壤生态过程的一个重要因素, 土壤微生物在土壤形成、生态系统的生物地球化学循环、污染物质的降解和维持地下水质量等方面都具有重要作用。由于土壤中微生物个体微小, 数量多,土壤微生物分离和鉴定困难,土壤环境条件复杂等原因, 目前为止大约仅1～10%的土壤微生物被分离和鉴定,这些限制了对土壤微生物在陆地生态系统中重要作用的认识。虽然,对土壤微生物的认识有限,但这并没有影响它们在维护整个陆地生态系统稳定中的重要作用。近年来,随着研究的日益深入,对土壤微生物群
中国土壤分类研究综述 摘要：作者通过阅读有关研究“土壤分类”的文献资料，抽取其中适于“综述”的部分章节，整理形成这篇文章。本文整体上先介绍了国内外土壤分类的大致情况，又着重介绍了中国土壤分类的研究历史及土壤的具体类别。最后，又把我国土壤分类研究的主要成果----从定性到定量的飞跃----展示出来，说明我国科学家所研究的土壤分类水平已达到世界先进。关键字：土壤系统分类，分布特征，主要成果 1前言 土壤者，一切植物所资以生长之基础，而间接地与我人以营养之食物者也。苟大地之上，石质暴露，而无土壤，则地成不毛，生机灭绝，此世界将复不能存在矣[1]。 分类是致力于发现、表征、命名、归类对象，以便理解它的形成要素和它们之间相互关系。分类的目的是鉴别和认识，以及建立一个分类对象的有序体系。分类是所有科学的基本需要，并且必须随知识的增加周期性更新{11}。 土壤分类组织了关于土壤知识，提供科学家之间交流的语言，并为土壤使用者提供技术转移的工具。土壤分类的发展是伴随着土壤科学一起前进的，并在相当长的一段时间内引领土壤学的发展。19世纪至20世纪中叶植物和动物分类的成功促进了土壤分类的发展。但与植物和动物类相比，土壤分类面临更多的理论挑战和实践难题。因为土壤不像植物和动物个体那样易于区别，而是一个连续体，所以常会更多地依分类者观点去分割它[12]。 2土壤分类的历史与现状 2.1 世界土壤分类现状 美国诊断分类：（1951-1961-1975） 美国土壤系统分类是一个六级土壤分类系统，由上而下分为土纲、亚纲、大土类、亚类、土族和土系等六级。土系之下还可划分出土相。此分类法为45个国家直接采用，80多个国家作为第一或第二分类。此外还有联合国图例单元（FAO-1960-1980）、国际土壤分类参比基础（IRB-1980）、原苏联土壤发生分类[3]（1883）。 2.2中国土壤分类历史 2.2.1 古代土壤的分类 我国是世界上有文字记载土壤分类内容的最早国家。大禹治水，遍及全国后，对土壤进行了初步分类，在《禹贡》中，将全国土地划为九州：冀，青，兖，徐，扬，荆，豫，梁，雍。再根据土壤性质划为9种，并根据土壤肥力划为三等九级。 在《周礼》书中，传说由周公所作，在《禹贡》的基础上，把九州土壤按地形划为山林，川泽，丘陵等五大类，春秋时代管子著《地圆篇》中，考虑了土壤与植被的关系，区划出18个土类，每个土类分为5种，共90种。 古代土壤的划分有一定的科学性，是朴素的唯物主义世界观，但由于时代与社会制度的限制，未得到更大的发展。 2.2.2 解放前中国土壤分类 直到三十年代，我国才开始土壤调查和分类研究工作。主要受美国Marbut土壤分类影
土壤微生物研究规范——II. 土壤样品的运输和贮存 1. 土壤微生物样品的运输 土样从采集点到实验室往往需要经历一定时间的运输，土样运输过程中难免影响土壤的温度、水分、氧气等环境条件，所以要尽快置于黑暗、低温（4℃）的密闭环境，尽量维持土壤含水量稳定不变，黑暗环境是为了避免光照下藻类在土壤表明的生长，低温是为了减少细菌繁殖，维持微生物区系稳定。一般装于聚乙烯袋子，并松扎。另外，储存时尽可能避免物理压实，样品袋不要堆叠过多，以免破坏土壤原有的团粒结构，并导致底层样品处于厌氧环境。 微生物取样的土壤样品需要在0-4℃的条件下保存，所以土壤样品应及时保存在保温箱或冰箱中（设置0-4℃），并最好在一周内完成前期处理。 如果采集地有冰箱、熏蒸所需的真空干燥器和通风橱等设施，建议将微生物土壤样品熏蒸浸提后，以冷冻的浸提液保存在塑料小瓶中，以方便运送。 如果采集地没有通风橱等设施，建议将所取的土壤样品过筛后冷藏在保温箱中，以方便运送。具体的流程如下： （1）提前准备好保温箱及冷冻好的冰板。冰板需要提前1-2 d冷冻，可以再用自封袋装一定量水分放平冷冻为规则的冰块备用。 （2）按照微生物取样规范进行取样，及时过筛去除根系、土壤动物等杂质，放置在0-4℃保鲜冰箱中保存。用于DNA或RNA分析的土壤样品应用干冰速冻。用于RNA分析的土壤样品在运输过程中应用干冰保持低温。用于DNA分析的土壤样品应用冰盒运输，也可用干冰。 （3）运输当天将土壤样品密封好，放入保温箱中，保温箱底部、四周及顶部均放置冰板和用自封袋密封的冰块，保证样品四周均可接触冰板或冰块。注意保证土壤样品和冰块分别密封，以防路途中融化的水分进入土壤样品造成污染。 （4）到达目的地后，迅速将样品放入保鲜冰箱（0-4℃）保存待测。 如果采样地条件允许，可以根据规范上的实验方法，将样品熏蒸、浸提后保存在塑料小方瓶中，-20℃冷冻，然后再按照上述流程放置保温箱中运送到目的地，迅速放置在冷冻冰箱中（-20℃）保存待测。 如果购买不到保温箱，可以选用运输水果、蔬菜等的白色泡沫箱，密封严实后亦可。由于泡沫箱保温效果可能不及保温箱，路途较远时应多放置冰板及冰块，途中尽量不要打开，放入及取出都要及时，且需要提前确认样品采集地和目的地
第26卷第10期 2006年10月生 态 学 报ACT A EC O LOGIC A SI NIC A V ol.26,N o.10Oct.,2006 污染土壤微生物群落结构多样性及 功能多样性测定方法 陈承利,廖 敏3 ,曾路生 (污染环境修复与生态健康教育部重点实验室,浙江大学环境与资源学院,杭州 310029)基金项目:国家重点基础研究发展规划“973”资助项目(2002C B410804);国家自然科学基金资助项目(40201026) 收稿日期:2005206227;修订日期:2006205220 作者简介:陈承利(1982～),男,浙江平阳,硕士,主要从事土壤环境化学与环境生态毒理学研究.E 2mail :clchen1982@1631com 3通讯作者C orresponding author.E -mail :liaom in @https://www.doczj.com/doc/dd11256025.html, or liaom inzju1@1631com Found ation item :The project was supported by National K ey Basic Research Support F oundation of China (N o.2002C B410804)and National Natural Science F oundation of China (N o.40201026) R eceived d ate :2005206227;Accepted d ate :2006205220 Biography :CHE N Cheng 2Li ,M aster ,mainly engaged in s oil environmental chem istry and ecotoxicology.E 2mail :clchen1982@1631com 摘要:土壤微生物在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用,土壤微生物群落结构和组成的多样性及其变化在一定程度上反映了土壤质量。为了更好地了解土壤健康状况,非常有必要发展有效的方法来研究污染土壤微生物的多样性、分布以及行为等。回顾了近年来国内外污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的测定方法,包括生物化学技术和分子生物学技术,现将它们的原理、优缺点、实用性及其发展动态作一阐述,同时指出结合这两种技术可为微生物群落分析提供一个更全面的、精确的方法。 关键词:污染土壤;微生物多样性;分子生物学;BI O LOG;P LFA ;PCR ;DNA 文章编号:100020933(2006)1023404209 中图分类号:Q143,Q938,S154 文献标识码:A Methods to measure the microbial community structure and functional diversity in polluted soils CHE N Cheng 2Li ,LI AO Min 3,ZE NG Lu 2Sheng (MOE K ey Laboratory ,Environmental Remediation and Ecosystem H ealth ,College o f Environmental and Resources Sciences ,Zhejiang Univer sity ,Hangzhou ,310029,China ).Acta Ecologica Sinica ,2006,26(10):3404～3412. Abstract :S oil m icroorganisms ,such as bacteria and fungi ,play im portant roles in prom oting soil quality and im proving plant health and nutrition ,thus in fluencing terrestrial ecosystems.Increasing anthropogenic activities ,such as spraw ling urbanization ,agricultural development ,pesticides utilization ,and pollutions from all sources ,can potentially affect soil m icrobial community com position and diversity ,leading to deterioration of soil quality and fertility.H owever ,it is yet to be determ ined how these changes in m icrobial diversity can in fluence surface and ground ecosystems.T o that end ,there is an acute need for reliable and accurate methods to study the community structure and tax onomy of soil m icroorganisms.W ithout the development of effective methods for studying the m icrobial diversity ,distribution ,and behavior in polluted soil ,a thorough understanding of m icrobial diversity ,as well as its im pact on soil health ,cannot be achieved. The determ ination of species diversity depends on several factors including the intensity of each species ,the total number of species present ,species evenness ,and the spatial distribution of species.M ethods to measure m icrobial community structure and functional diversity in polluted soils can be classified into tw o groups ,i.e.,biochem ical 2based techniques and m olecular biological 2based techniques.T ypically ,diversity studies include the relative com parisons of communities across a gradient of stress and disturbance.W ith current techniques ,it is difficult to study true diversity due to lack of know ledge on com position and the techniques to determ ine the accuracy of the extraction or detection methods.T raditionally ,the analysis of soil m icrobial
《土壤里的微生物》教学设计（第1课时） 教材分析 “土壤里的微生物”是苏科版七年级下册第13章第2节的内容。是上一节课内容的基础上，让学生进一步认识到土壤里生物的多样性，以及它们对生物圈的平衡和稳定起着非常重要的作用，从而对本单元环境中生物的多样性具有全面的认识。同时为下一章引导学生对生物进行分类奠定基础。因此本节课的意义十分重要，是本章的重点和难点。 课标对本节的要求是“描述细菌的主要特征以及与人类生活的关系”。本节从单细胞细菌到多细胞的真菌、从肉眼看不见的细菌到大型真菌，带领学生走进丰富多彩的微生物世界。土壤中的微生物，学生平时不易见到，细菌需要用高倍显微镜才能更好地观察到形态，细菌的结构更难观察，而初中又不要求使用高倍显微镜，教材呈现了细菌的形态结构图片，所以只能通过图片、视频引导学生观察、比较认识细菌的基本特征。 学情分析 七年级学生通过小学科学课和上一学期生物课的学习，对生物学科有了初步的了解，具有一定的生物基础知识和学习经验，能够通过观察图片、阅读材料、对比分析、合作讨论等方式获取有关信息。但在学习上仍以感性认识为主，好奇心强、注意力容易转移,但他们活泼好动，喜欢直观形象的事物，喜欢动手实践。 有关微生物的相关知识在上学期在生态系统的组成学习过程中及学生日常生活经验中对微生物的类型和作用从总体上有了一个初步的了解，特别是在生活过程中家长或者教师从卫生角度常常提到细菌这个概念，学生对这一概念还是比较熟悉，对细菌与人类的关系也有不同程度的了解。但在生活中微生物是肉眼看不见的生物，只有用高倍或电子显微镜才能观察到，与人类的关系和对生物圈的作用又是隐性和潜在的，很少有机会引起学生的关注，容易被学生忽视和轻视，学生缺乏相应的感性知识和学习兴趣。对土壤中的微生物的类型、形态特征，生殖、营养方式、分布以及与人类生活的关系，学生比较陌生，这些是课程标准的明确要求，也是学生学习的终极目标。教材中只用文字表述，学生不容易理解，在教学中一是通过组织学生阅读教材在自主学习中从理论上了解细菌、放线菌的有关知识。二是通过播放有关细菌、放线菌形态、结构等视频资料及图片引导学生观察分析细菌和放线菌的形态、结构。三是利用小组合作学习并结合观察、对比的方法，引导学生主动获取知识。四是注重发掘生活资源，
第27卷增刊V ol 127,Sup 1广西农业生物科学Journal o f Guangx i A g ric 1and Biol 1Science 2008年6月June,2008 收稿日期:20080122。 基金项目:广西大学博士启动基金项目(X05119)。 作者简介:姚晓华(广西大学副教授,博士;E -mail:x hy ao@g xu 1edu 1cn 。文章编号:10083464(2008)增008405 土壤微生物群落多样性研究方法及进展 姚晓华 (广西大学农学院,广西南宁530005) 摘要:微生物多样性是指群落中的微生物种群类型和数量、种的丰度和均度以及种的分布情况。研究 土壤微生物群落多样性的方法包括传统的以生化技术为基础的方法(直接平板计数、单碳源利用模式等) 和以现代分子生物技术为基础的方法(从土壤中提取DN A ,进行G+C%含量的分析,或杂交分析,或进 行PCR,产物再进行D GGE/T GG E 等分析)。现代生物技术与传统微生物研究方法的结合使用,为更全面 地理解土壤微生物群落的多样性和生态功能提供了良好的前景。 关键词:微生物多样性;生化技术;分子生物学技术;DN A 中图分类号:.Q 938115 文献标识码:A Advancement of methods in studying soil microbial diversity YAO Xiao -hua (Co llege of Ag ricultur e,G uangx i U niv ersit y,N anning 530005,China) Abstract:Species div ersity consist o f species richness,the total number of species,species ev enness,and the distribution of species 1Methods to measure microbial diversity in so il can be categ orized into tw o g roups:biochemica-l based techniques and m olecular -based techniques 1The fo rmer techniques include plate counts,sole carbon so urce utilizatio n patterns,fatty acid methy l ester analysis,and et al 1The latter techniques include G +C%,DNA reassociation,DNA -DNA hy br idization,DGGE/TGGC,and et al 1Ov er all,the best w ay to study soil microbial diversity w o uld be to use a variety of tests w ith differ ent endpoints and degr ees o f r esolutio n to o btain the bro adest picture possible and the most inform ation r eg ar ding the microbial co mmunity 1 Key words:microbial diversity;biochem ica-l based techniques,mo lecular -based techniques,DNA 微生物多样性研究是微生物生态学最重要的研究内容之一。微生物在土壤中普遍存在,对环境条件的变化反应敏捷,它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[1] 。但土壤微生物的种类庞大,使得有关微生物区系的分析工作十分耗时费力。因此,微生物群落结构的研究主要通过微生物生态学的方法来完成,即通过描述微生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落产生的影响,揭示土壤质量与微生物数量和活性之间的关系。利用分子生物学技术和研究策略,揭示自然界各种环境中(尤其是极端环境)微生物多样性的真实水平及其物种组成,是微生物生态学各项研究的基础和核心,是重新认识复杂的微生物世界的开端。
第七章土壤微生物区系分析 (92) 第一节一般土壤微生物的分离与计数 (92) 一、稀释平板法 (92) 二、MPN稀释法 (94) 三、土粒法 (96) 第二节厌氧微生物的分离 (96) 一、充氮厌氧培养法 (96) 二、焦性没食子酸吸氧法 (97) 三、专性厌氧细菌的分离法 (98) 第三节土壤主要类群微生物的分离与计数 (99) 一、好氧细菌的分离与计数 (99) 二、丝状真菌的分离与计数 (100) 三、放线菌的分离与计数 (100) 第四节土壤中功能微生物的测定 (101) 一、氨化细菌的测定 (101) 二、硝化细菌的测定 (102) 三、反硝化细菌的测定 (104) 四、好氧性自生固氮细菌的测定 (105) 十一、纤维分解菌的测定 (106) 十二、光合细菌的测定 (108) 十三、甲烷产生菌的测定 (109) 十四、有机污染物降解菌的测定 (110) 十五、重金属抗性菌的测定 (111) 第八章根圈微生物分析 (111) 第一节根圈细菌的分析 (112) 一、根圈的分区 (112) 二、根圈细菌的分离 (112) 三、根圈优势菌株的分群 (114) 第二节植物组织内微生物的分离 (115) 一、植物材料的选择 (116) 二、组织表面消毒 (116) 三、分离方法 (117) 第十五章土壤微生物生物量的测定 (119) 第一节土壤样品采集与预处理 (119) 第二节土壤微生物生物量碳分析 (120) 一、熏蒸提取——容量分析法 (120) 第三节土壤微生物生物量氮分析 (124) 一、熏蒸提取——全氮测定法 (125) 二、熏蒸提取——茚三酮比色法 (127)
1．土壤是微生物生长和栖息的良好基地 土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地：其原因在于土壤舍有丰富的动植物和微生物残体，可供微生物作为碳源、氮源和能源。土壤台有大量而全面的矿质元素，供微生物生命活动所需。土壤中的水分都可满足微生物对水分的需求。不论通气条件如何，都可适宜某些微生物类群的生长。通气条件好可为好氧性微生物创造生活条件；通气条件差，处于厌氧状态时又成了厌氧性微生物发育的理想环境。土壤中的通气状况变化时，生活其问的微生物各类群之间的相对数量也起变化。土壤的pH值范围。3．5～10．0之间，多数在5.5～8．5之间，而大多数微生物的适宜生长pH也在这一范围。即使在较酸或较碱性的土壤中．也有较耐酸、喜酸或较耐碱、喜碱的微生物发育繁殖，各得其所地生活着。土壤温度变化幅度小而缓慢．夏季比空气温度低，而冬季又比空气温度高，这一特性极有利于微生物的生长。土壤的温度范围恰是中温性和低温性微生物生长的适宜范围。 因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。事实上，许多对人类有重大影响的微生物种大多是从土壤中分离获得的，如大多数产生抗生素的放线菌就是分离自土壤。 2．土壤中的微生物数量与分布 土壤中微生物的类群、数量与分布，由于土壤质地发育母质、发育历史、肥力、季节、作物种埴状况、土壤深度和层次等等不同而有很大差异。lg肥沃的菜园土中常可含有108个甚至更多的微生物，而在贫瘠土壤如生荒土中仅有103～107个微生物，甚至更低。土壤微生物中细菌最多，作用强度和影响最大，放线菌和真菌类次之，藻类和原生动物等数量较少，影响也小。 (1)细菌 土壤中细菌可占土壤微生物总量的70％～90％，其生物量可占土壤重量的 1/10000左右。但它们数量大，个体小，与土壤接触的表面积特别大，是土壤中最大的生命活动面，也是土壤中最活跃的生物因素．推动着土壤中的各种物质循环。细菌占土壤有机质的1％左右。土壤中的细菌大多为异养型细菌，少数为自养型细菌。土壤细菌有许多不同的生理类群，如固氮细菌、氨化细菌、纤维分解细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫酸盐还原细菌、产甲烷细菌等在土壤中都有存在。细茼在土壤中的分布方式一般是黏附于土壤团粒表面，形成菌落或菌团，也有一部分散布于土壤溶液中，且大多处于代谢活动活跃的营养体状态。但由于它们本身的特点和土壤状况不一样．其分布也很不一样。 细菌积极参与着有机物的分解、腐殖质的合成和各种矿质元素的转化； (2)放线菌 土壤中放线菌的数量仅次于细菌．它们以分枝丝状营养体缠绕于有机物或土粒表面，并伸是于土壤孔隙中。1g土壤中的放线菌孢子可达107～108个．占土壤微生物总数的5％～30%．在有机物含量丰富和偏碱性土壤中这个比例更高。