河北农业科学,2009,13(5):34-36,85
J ou rnal ofH eb eiAgri cu lt u ral Sciences
编辑 白瑞霞
水稻成熟胚不同接种方式对愈伤组织诱导的影响
吕孟雨,王海波*
,高义平
(河北省农林科学院遗传生理研究所,河北省植物转基因中心,河北石家庄 050051)
摘要:采用4种不同的接种方式,对3个水稻品种的成熟胚进行了愈伤组织诱导试验。结果表明:在胚上纵切1刀,将种子接种在培养基上的接种方式,愈伤组织诱导率最高、出芽率最低,且愈伤组织质量最好,可以在短时间内获得大量胚性愈伤组织,建立悬浮系,其愈伤组织在较短的时间即可分化出再生植株,是1种简单、方便、效果好的诱导水稻愈伤组织的理想方法。关键词:水稻;成熟胚;接种方式;组织培养
中图分类号:S511 文献标识码:A 文章编号:1008 1631(2009)05 0034 03E ffects of Inocu l ation M et hods of R ice M ature E m bryo on Callus Induction LV M eng yu ,WANG H a i bo *
,GAO Y i pi ng
(Institute of G enetic and Physiology of H ebei A cade m y of A gri cult ure and Forestry Sci ences ,H ebe i Center of P lant G e net i c T ransfor mation ,Shijiazhuang 050051,China)
Abstract :T he m ature e mbr yos of three rice variet i es were i noc ulated by four m ethods for callus induct i on The results sho w ed that the i noculat i on m et hod of cutt i ng the e mbr yo and inoculati ng the seed on the m ediu m was a ideal m ethod for i nducing rice callus easil y ,conveniently and effect i vely w ith the highest callus i nduction r ate ,the lo west shooti ng rate
and the best callus A lar ge number of e mbryogenic calli could be obtained and t he plants could be regener ated i n a short
t m i e usi ng th i s m ethod
K ey words :R ice ;M ature e mbryo ;
I noculat i on m ethod ;T i ssue c ulture
收稿日期:
2009 04 15
作者简介:吕孟雨(1963-),男,河北晋州人,研究员,硕士,主要从事生物技术研究。
通讯作者:王海波研究员,博士。
关于水稻组织培养,前人有过许多研究,已有用根尖、节、盾片、叶鞘、胚芽鞘、花药、胚囊、幼胚、叶片和幼穗等[1]组织成功进行离体再生培养的报道,但上述取材多受季节和环境限制,难以满足常年试验的要求。越来越多的研究者开始以水稻成熟种子作为受体材料,期待从成熟种胚中诱导出高质量的愈伤组织[2]
。郑
文静等
[3]
以成熟胚、幼胚、幼穗及花药为外植体,进行
水稻组织培养,考察同种培养条件下4种外植体的愈伤组织诱导率和诱苗率,并调查各种方法所获后代的有利变异率,结果显示,以成熟胚为外植体时,愈伤组织诱导率最高。以有生活力的成熟种子进行培养,由于在选择培养时间上具有较大的灵活性,在操作上也具有简便性,因而应用得较多
[1]
。水稻遗传转化主要以具有强增
殖能力和高分化能力的愈伤组织为受体转移外源有利基因,因此,建立高效、稳定的组织培养转化体系是遗传转化的首要环节和重要基础[1,4~6]。一般随继代培养时间的延长,植物愈伤组织再生植株变得困难且变异比例提高。建立快速、高效的愈伤组织诱导方法,可以随时提供大量优质的试验材料,以便进行植物转基因、原生质体培养和诱变等试验。
毛建军等
[7]
研究比较了N 6、M S 和NB 培养基在日
本晴成熟胚组织培养中的效果,结果表明,3种培养基中,NB 培养基对愈伤组织的诱导效果最好,转化效率最高,获得了转基因水稻植株。针对以往利用水稻成熟胚为外植体诱导愈伤组织时,均采用直接接种消毒的种子或接种剥离的完整胚,诱导愈伤组织
[1~3,5,7~16]
,本研
究增设2个切胚处理的接种方式,对3个水稻基因型进行愈伤组织诱导和植株再生试验,通过分析比较不同成熟胚接种方式的愈伤组织诱导率和愈伤组织质量,旨为了解水稻成熟胚离体培养的表现特点与规律,以寻找高效诱导胚性愈伤组织的方法,为方便、快捷、大量建立水稻体细胞无性系奠定基础。
1 材料与方法
1 1 试验材料
供试材料为中花11号、中花15号和日本晴3个水稻品种的成熟种子。1 2 试验方法
1 2 1 外植体消毒 选择成熟、饱满、无病斑的水稻种子,剥去颖壳。在超净工作台上用0 1%的H g C l 2溶液表面消毒15m i n ,无菌水漂洗5次。用镊子和解剖刀取出种子或成熟胚,将其接种于诱导培养基上,每个三角瓶接种10粒种子或成熟胚,重复3次。1 2 2 接种方式 采用4种接种方式:
(1)用解剖刀
在胚上纵切1刀,将种子接种在培养基上(处理 );(2)用解剖刀将成熟胚从种子上剥离,再用解剖刀切
第5期吕孟雨等:水稻成熟胚不同接种方式对愈伤组织诱导的影响
1刀,接种在培养基上(处理);(3)用解剖刀将成
熟胚从种子上剥离后,直接接种在培养基上(处理
!);(4)将种子直接接种在培养基上(处理?)。各
接种方式在继代前均不进行去芽等处理。
1 2 3 培养方法 在24~26#下暗培养。诱导培养
7d后,统计愈伤组织和出芽情况,计算愈伤组织诱导
率和出芽率。培养14d后,观察愈伤组织和出芽情况及
愈伤组织质量。培养25d后,将大部分愈伤组织(不
进行选择)接种于分化培养基上,在24~26#、光照
培养条件(12h光/12h暗,1500~2000l x)下诱导苗
的分化。选择少量生长旺盛、分散、质地紧密、呈淡黄
色颗粒状的愈伤组织进行继代培养。
培养基成分分别为:
诱导愈伤培养基:NB+24 D2m g/L+蔗糖30g/L
+植物凝胶2 5g/L(p H值5 8)。
愈伤组织继代培养基:N
6
+24 D2mg/L+蔗糖
30g/L+植物凝胶2 5g/L(pH值5 8)。
植株分化培养基:M S+6 BA2m g/L+KT0 5mg/L
+蔗糖30g/L+植物凝胶2 5g/L(p H值5 8)。
出芽率、愈伤组织诱导率和分化率的计算公式分别为:
出芽率=产生芽数/接种的种子或胚数?100%
愈伤组织诱导率=产生愈伤组织的胚数/接种的种
子或胚数?100%
分化率=分化出苗的愈伤组织块数/分化的愈伤组
织块数?100%
2 结果与分析
2 1 成熟胚不同接种方式的愈伤组织诱导率
诱导培养7d后,同一水稻品种不同接种方式的成
熟胚愈伤组织诱导率存在差异(表1)。除处理!外,
其他3种接种方式的愈伤组织诱导率和出芽率在不同品
种间的表现趋势基本一致,处理 的愈伤组织诱导率最
高,出芽率最低;处理?的愈伤组织诱导率最低(均为
0%),出芽率最高(%95%),说明处理 是利用水稻
表1 诱导培养7d后不同接种方式的愈伤组织诱导效果
Table1 The call u s w ith four inocu l at i on
me thod s i nd i cated for7days (%)
品种处理愈伤组织诱导率出芽率
中花11号 65 030 0
35 040 0 !5 095 0?0 0100 0
中花15号 70 025 0
35 065 0 !50 030 0?0 095 0
日本晴 75 025 0
40 060 0
!20 070 0
?0 0100 0
成熟胚诱导愈伤组织较好的接种方式。处理!各品种间
的愈伤组织诱导率和出芽率差异明显,且愈伤组织诱导
率高的品种,其出芽率低;愈伤组织诱导率低的品种,
其出芽率高的规律,这可能与品种自身的特性有关。
培养14d时,3个品种的愈伤组织诱导结果显示,
日本晴最容易诱导出愈伤组织,中花11号次之,中花
15号最难;愈伤组织质量也是日本晴最好,中花11号
次之,中花15号最差,表明不同水稻基因型的愈伤组
织诱导难易和质量存在着差异。3个品种处理 的愈伤
组织诱导率差别进一步缩小,说明处理 是1种对多种
水稻基因型通用的、适宜诱导愈伤组织的接种方式。培
养20d时,3个品种处理 的愈伤组织诱导率均达到
100%。
2 2 成熟胚不同接种方式的愈伤组织状态
诱导7d的愈伤组织鲜嫩,白色,水分含量高(图
1);诱导14d,后出芽的基部也开始出现愈伤组织;随
时间的延长,不同处理的愈伤组织诱导率均达到
100%,表现出较高的愈伤组织诱导率,愈伤组织颜色
由白色逐渐变为淡黄色,但形态上有所差异。处理 、
处理和处理!的愈伤形态基本一致,呈颗粒状,浅黄
色,结构致密;处理?的愈伤组织呈黄色,块大,干
硬,大部分有根毛分化(图2)。从出芽基部产生的愈
伤组织白色,干硬,结构较致密,颗粒较大,这类愈伤
组织容易分化生根,不利于植株再生,因此以调查诱导
7d时的愈伤组织诱导情况,来判断各处理间的差异更
为客观、有效。
图1 接种7d后的愈伤组织诱导和出芽情况
Fig 1 The ca llus i nduction and budd i ng indicated for7
days
图2 接种25d后的愈伤组织诱导和出芽情况
Fig 2 The call u s i nduction and budd i ng ind icated for25days
2 3 不同诱导方式对植株再生的影响
2 3 1 不同诱导方式分化再生植株的速度 从分化再
生植株的速度看,处理 和处理?分化出苗较快,中花
&
35
&
河北农业科学2009年
15号最早分化出植株,其处理 从诱导愈伤到分化出植株仅34d,从接种于分化培养基上到出苗仅8d,进一步表明处理 是1种较好的水稻愈伤组织诱导方式。处理和处理!分化出苗较慢,可能是由于离开种子的胚不再接受种子提供的营养和活性物质,不利于植株再生。中花11号和日本晴较晚分化出植株,这与完整胚前期(7d)的愈伤组织诱导率有一定的相关性,表现为前期愈伤组织诱导率高的品种再生植株较快,愈伤组织诱导率低的品种再生植株较慢。
2 3 2 不同诱导方式的再生植株情况 不同诱导方式的再生植株分化率存在差异,其中,处理 的再生植株分化率最高,处理?次之(表2)。处理 不仅有利于形成状态良好的胚性愈伤组织,而且有利于愈伤组织再生植株。再次表明,处理 是1种利用水稻成熟胚诱导愈伤组织的较好方式。
表2 不同诱导方式的再生植株分化率
Tab le2 The p l an ts regenerati on rate w ith
fou r inocu l ation m ethods (%)处理日本晴中花15平均值
36 1032 1034 10
12 508 7010 60
!6 1025 9016 00
?20 9021 4021 50
3 结论与讨论
本研究结果表明,水稻成熟胚离体培养时,不同接种方式的愈伤组织诱导效果不同。其中,处理 的前期愈伤组织诱导率显著高于其他3种处理方式,并且发芽率最低,说明处理 有利于进行脱分化培养。尽管在诱导愈伤组织初期,发芽的材料随时间的延长也可以诱导出愈伤组织(一些是由芽基部分化出的愈伤组织),但其诱导的愈伤组织数量少、质量差,还形成许多根毛,不利于获得胚性愈伤组织。诱导时间较长时,虽然各处理间愈伤组织诱导率的差异变小,但愈伤组织质量存在差异。最先诱导的愈伤组织一般都可以发育成为胚性愈伤组织,因此统计诱导7d时的愈伤组织诱导率能够较好地反映不同接种处理的愈伤组织诱导的差异。不同水稻品种的发芽率、愈伤组织诱导率、愈伤组织质地结构及植株再生率存在差异,不同水稻品种各处理平均愈伤组织诱导率的顺序为中花15号>日本晴>中花11号,而不同水稻品种处理 的愈伤组织诱导率顺序为日本晴>中花15号>中花11号,不同水稻品种处理!的愈伤组织诱导率顺序为中花15号>日本晴>中花11号,可以看出,不同品种间处理!的愈伤组织诱导率与各处理平均愈伤组织诱导率是一致的,基本反映了不同水稻基因型间的差别。处理 可以缩小这种差别,但不能完全改变水稻基因型间的差别。
3个水稻品种的愈伤组织以浅黄色、小颗粒状、结构致密的干燥型愈伤组织居多,这类愈伤组织有可能发育成为胚性愈伤组织,是有利于幼苗分化的、质地较好的愈伤组织。3个品种成熟胚离体培养不同处理间表现的趋势一致,说明不同接种方式对水稻愈伤组织诱导具有较为普遍的适用性,采用较好的接种方法,可以较快地获得愈伤组织,同时愈伤组织的质量也好,并且不需要去芽处理,可以方便、快捷地诱导大量愈伤组织供试验利用。试验发现,水稻愈伤组织在最初诱导后,其最初继代时间掌握在25d以内较好,而不是通常采用的30d,因为诱导20d以后许多愈伤组织开始变硬、变大,不利于形成松散颗粒状的胚性愈伤组织。从诱导愈伤组织到分化出再生植株最快仅需34d,这为开展其他试验提供大量高质量的试验材料奠定了基础。
前期愈伤组织诱导率高的品种再生植株较快,愈伤组织诱导率低的品种再生植株较慢,由于该结果是在本试验控制条件下得出的,因此,如果提前或推迟进行植株分化,是否还会出现这种结果,有待进一步研究。在不同的培养基上是否出现类似结果,也有待进一步研究,但是也表明不同水稻品种间确实存在差异,为根据不同品种选用不同的培养基提供了间接依据。不同诱导方式的再生植株分化率存在差异,处理 的再生植株分化率最高,不仅有利于形成状态良好的胚性愈伤组织,而且有利于愈伤组织再生植株,表明在利用水稻成熟胚诱导愈伤组织时,胚乳的存在与否,不仅对愈伤组织的质量高低有影响,而且对再生植株的难易也有明显的作用。
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-806
(下转第85页)
& 36 &
第5期龙永彬:5种外来入侵植物在广东省的分布
表1 广东省5种外来入侵植物的样地分布数量
Tab le1 The d istribution of f i ve spec i es of alien i n vasive
p lan ts in G uangdon g P rovi n ce (个)市(县)薇甘菊飞机草凤眼莲金钟藤五瓜金龙小计白云区001001
宝安区100001
龙岗区600006
斗门区002002
翁源县001001
新丰江010001
紫金县001001
惠城区100001
惠阳区101002
博罗县120003
海丰县001001
东莞市300003
南海区202004
三水区010001
江城区000011
阳西县010001
阳春市000202
廉江市030003
茂南区030003
高州市050005
信宜市020002
电白县01300013
化州市030003
合计 153492161
表2 广东省5种外来入侵植物的地类分布数量Tab le2 The l and sort of f i ve spec i e s of alien i n vasi ve
p lan ts in G uangdon g P rovi n ce (个)地类薇甘菊飞机草凤眼莲金钟藤五瓜金龙小计乔木林11100012疏林地000101国家灌木林地91200122其他灌木林地000101未成林造林地110002耕地171009水域2080010工矿用地010001居民用地010001交通用地100001其他用地010001合计1534921613 2 建立外来植物生态安全评估体系
在生物引种前,就应进行充分、科学地评估和预测。不仅要考虑引进生物的生物学和生态学等习性,而且应评估和预测外来植物对本地生态系统及物种多样性的影响。外来植物引入后,应加强科学观测和调研,发现问题应及时采取有效措施,避免造成大面积为害。
3 3 提高公众参与和防止植物入侵的意识
防止生物入侵,需要全社会的共同努力。应充分调动公众的积极性,提高全社会的防范意识,使全社会参与到防止生物入侵的行动中,形成全社会共同防止生物入侵的氛围。
3 4 用生物方法结合物理和化学方法进行防治
生物与生物之间相互制约、相互协调,将各自的种群限制在一定的栖境和数量内,就可形成稳定的生态平衡系统。入侵植物在新的环境下没有天敌的制约,从而大肆扩散、蔓延,破坏了生态平衡,造成了生物灾害。当前,对于入侵植物,各地大多是采取物理(人工清除)和化学方法(药物防治)进行治理,效果不甚理想。如薇甘菊的入侵可由风力传播种子,形成扩散,一般的物理和化学方法难以根治。根据外来入侵物种形成灾害的原因,应从根本抓起,引进外来入侵物种的天敌,抑制外来入侵物种的扩散,但同时也要注意防止引进新的入侵物种。
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&
85
&
粉蕉愈伤组织的诱导1 朱军，黄惠琴，方哲，鲍时翔 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口 (571101) E-mail：bsxhhq@https://www.doczj.com/doc/d211092202.html, 摘要：香蕉是一种重要的热带水果。本文就影响粉蕉愈伤组织诱导的因素（外植体来源、生长调节剂种类、浓度等）进行了研究。其诱导的最佳条件是：以未成熟雄花花序或球茎为外植体，MS＋2,4-D 4 mg/L＋IAA 1 mg/L＋NAA 1 mg/L，28℃下暗培养。以球茎所诱导的愈伤组织诱导率可达89.1%。 关键词：香蕉，愈伤组织，诱导 中图分类号：S668 1. 引言 近年来，利用植物生产人类疫苗和其他药用蛋白越来越受到人们的重视。作为世界上重要的热带水果和粮食作物的香蕉（Musa spp.），因其果实营养丰富、生产周期短、可鲜食等特点而成为理想的植物生物反应器，因此香蕉转基因技术研究尤其显得重要。由于利用愈伤组织作为转化受体并诱导胚状体而再生的转基因香蕉可降低嵌合体发生[1]，且胚性愈伤组织可大量增殖、保存时间长，因此愈伤组织作为香蕉转基因受体受到越来越多研究者的重视。但香蕉是一种愈伤诱导率极低的作物，且品种间差异极大[1～5]。这极大的限制了香蕉转基因技术的研究。本文就粉蕉愈伤组织诱导进行了探讨，希望为我国香蕉转基因技术的研究提供参考。 2. 材料与方法 2.1 材料 选取香蕉品种粉蕉(Musa spp., ABB)为试验材料。 2.2 方法 2.2.1 外植体表面消毒 剥去未成熟雄花花序的苞叶，直至4 cm左右；在70%(体积分数)的酒精中浸泡1 min；再用1 g/L升汞(HgCl)浸泡10 min；取出，用无菌水彻底冲洗汞。假茎、球茎、幼叶取自试管苗，故无须消毒。 2.2.2 不同外植体的处理 选取粉蕉未成熟雄花花序、假茎、球茎、幼叶为外植体。分别将香蕉未成熟雄花花序剥去苞叶直至1.5 cm左右，沿轴线纵切成4块，再横切成厚约1 mm的薄片；假茎切成厚约1 mm左右的薄片；球茎切成小块；幼叶切成10 mm×10 mm方块接入愈伤组织诱导培养基中培养。 1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(No.20050565004) 的资助。
实验二愈伤组织诱导及观察 一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照
水稻愈伤组织转化 一、实验目的 1.掌握植物组织培养的基本原理； 2.学习水稻愈伤组织的诱导方法； 3.学习农杆菌转化法的原理，掌握农杆菌转化水稻愈伤组织的方法； 4.学习转基因植株的各种鉴定方法（包括PCR检测、GUS染色、Southern-blot、Western-blot、FISH 等），同时能够操作PCR与GUS染色鉴定的方法。 二、实验原理 1.植物组织培养 植物组织培养（plant tissue culture）是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体和花药等，在人工控制的培养基上培养，使其生长、分化以及形成完整植株的技 术。自1902年Haberlandt 首先用紫鸭跖草( Tradescantia )的叶片栅栏组织进行培养来，植物组织培养已有100余年历史。用于离体培养的各种植物材料称为外植体（explant）。根据外植体的类 型，又可将组织培养分为：器官培养、组织培养、胚胎培养、细胞培养以及原生质体培养等。（从这个角度讲，本学期的实验属于胚胎培养。）植物组织培养的理论基础是植物细胞全能性。 2.基因工程 基因工程技术是在离体条件下对不同生物的遗传物质(DNA)进行人为“加工”，并按照人们的意愿重新组合，以改变生物的性状和功能，然后再通过适当的载体将重组DNA转入生物体或细胞 内，并使其在生物体内或细胞中表达，从而获得新的生物机能。这种利用基因工程技术获得的植 物一般称为“基因工程植物”。自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术发展十分迅速， 成功进行转基因的植物已达60多种，在世界上批准进入田间试验的转基因植物已超过500例，有些转基因产品已进入市场。通过基因工程改良作物品种在未来的农业生产中日益显示出巨大潜力。 3.农杆菌转化法 转基因的方法有很多，对于植物而言，最常用的是农杆菌转化法和基因枪法。农杆菌转化法使用的是根癌农杆菌，其内含Ti质粒：
小麦愈伤组织诱导与其再生培养体系的建立 前言：小麦属于禾本科植物，麦粒在植物学上称为颖果，在种子学上则称为种子，通常称为小麦。麦粒皮色有红白之分，红皮的叫红麦，白皮的叫白麦。由于品种和受环境影响不同，红皮小麦又有深红色和红褐色；白皮小麦又有白色、乳白色或黄白色之分。 一：目的及意义 我国小麦目前的状况有以下几点：1 我国是农业大国，小麦面积4亿亩、产量9000万吨左右，分别占世界总量的 12%和18%，均居世界第一位。2 我国春小麦主要分布在东北、西北及华北北部。据中国粮油信息中心的数据显示，预计中国 03/04市场年度（7月至次年6月）春小麦播种面积仅为190万公顷，较上年度减少5％，这是多年来中国春小麦种植面积首次低于200万公顷；预计03/04年度春小麦产量为580万吨，较02/03年度下降7.48%。我国的小麦种植面积不断的减小，总产量也在不断减少。由于我国目前存在的状况，农业大国，主产小麦，但小麦的产量的质量都不是很好，种植面积又在减少，本研究主要是提高小麦的产量和质量。 二：综述国内外对小麦的研究状况 2.1 小麦愈伤组织诱导及原生质体的分离与纯化张小红，闵东红，邵景侠（西北农林科技大学，陕西杨凌712100） 试验方法：以普通小麦的幼穗和幼胚为外植体进行了愈伤组织诱导，及由幼胚愈伤组织进行了原生质体分离和纯化试验，研究了幼穗和幼胚外植体及低温预处理等因素对愈伤组织诱导的影响，在原生质体分离中研究了酶浓度和配比、酶解时间及蔗糖浓度等因素对幼胚愈伤组织原生质体游离和纯化的影响。结果表明：小麦幼穗离体培养时，以1.0~1.5 cm长度的幼穗有利于愈伤组织的诱导；小麦幼穗和幼胚外植体采后低温储藏时不易超过3 天，时间太长会影响愈伤组织诱导；2.0%纤维素酶＋0.5%果胶酶+0.6 M甘露醇分离原生质体较好，最佳酶解时间为 4~6 h，原生质体产量和活力较高。 2.2 小麦愈伤组织诱导及其植株再生研究进展王廷璞，陈荃，崔爱明，刘瑞媛，马伟超 （天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001） 试验方法：小麦组织培养体系的建立与完善是应用植物基因工程改良小麦品质的重要基础和保证，综述了近年来小麦愈伤组织诱导及植株再生的研究情况。研究资料表明：小麦组织培养中，不同来源和不同生理状态的小麦外植体（幼胚、幼穗、花药、成熟胚、叶、根等），在愈伤组织诱导和获得再生植株的能力方面均显示了优点和不足。不足之处是在生产过程中，不断受到生物、非生物等因素的胁迫，严重影响其产量及品质。 2.3小麦愈伤组织诱导及其再生能力影响因素的研究贾海燕, 王洪刚 ( 山东 农业大学农学院, 山东泰安 271018) 试验方法：以农艺性状较好的24 份小麦品种( 系) 为材料, 筛选出了愈伤组织诱导率高且植株再生能力强的基因型材料山农995604 和F281- 10, 在此基础上对影响愈伤组织的分化能力以及较长时间保持分化能力的因素进行了研究。结果表明, 在愈伤组织的继代过程中, 保持较高浓度的2, 4- D, 或对愈伤组织进行交替继代培养有利于较长时间保持其再生能力。最佳取材时间在开花后15d 左右,
水稻愈伤组织的诱导 李希 北京科技大学化学与生物工程学院生物科学与技术系，北京，100083 摘要：以水稻种子为外植体，研究了外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过 程。结果表明水稻种子接种在诱导培养基上两天已产生愈伤组织发芽2mm，四天愈伤组织呈现浅黄色发芽5-10mm，6天愈伤组织颜色加深发芽1-2cm，8天愈伤组织为橙黄色发芽2-3cm，无杂菌污染。 关键词：水稻种子外植体诱导愈伤组织 引言 自Niizeki和Oono1968年首次获得水稻花粉植株以来，水稻组织培养取得了很大的进展，如各种水稻品种愈伤组织的诱导、继代、植株再生培养基的筛选，遗传特性，基因工程转化体系的建立等等。水稻种子愈伤组织的诱导是这些研究的基础，因此掌握外植体的消毒方法和接种技术，了解了水稻愈伤组织诱导的过程至关重要。以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用。本次试验使用的诱导剂为2,4-D，诱导率为100%。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1实验材料 水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 1.1.2仪器设备及用具 超净工作台培养室、培养皿：￠9cm×2 枪形镊量筒：100mL×2 三角瓶：50mL×2(无菌)；废液缸；保鲜膜；标签纸 1.1.3试剂及培养基 试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL) 培养基：诱导培养基：MS+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8） 1.2 实验方法 1.2.1 MS固体培养基配制： 由于实验室中的MS培养基已含有蔗糖和琼脂，所以直接按照41.5g/L的浓度配置。实验中配置50ml培养基，需依次加入2.075gMS，0.1mg2,4-D； 用NaOH或HCl调节PH=5.8； 高压蒸汽锅121℃灭菌20min。 1.2.2接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 1.2.3种子去壳 选取饱满、无霉变成熟水稻种子，用手工脱去谷壳（注意保持胚完整），准备20粒去壳种子，
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223 愈伤组织的诱导和培养 一、实验目的及意义 植物愈伤组织的诱导和培养在植物科学的基础研究和应用研究中都有重要的意义。通过本次实验，可以初步掌握植物外植体材料消毒、接种的无菌操作技术，愈伤组织的诱导方法和愈伤组织继代培养的方法。 二、实验原理 植物组织与细胞培养是应用无菌操作的方法培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择适当的消毒剂对植物外植体进行表面消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得植物组织培养，成功的基本前提和重要保证。由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织（callus）。植物生长调节剂如2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）等是诱导外植体形成遇上组织的重要因素。 三、实验仪器与药品 超净工作台，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，75%乙醇，酒精消毒棉 材料：烟草无菌苗，甘薯无菌苗 四、实验步骤 1.按下表分别配制培养基
将配置的四种培养基分别分装入20个培养瓶，高温灭菌后水平放置凝固 2.接种前，将实验所需器具放入超净工作台，打开紫外灯灭菌20~30min，关闭紫外灯，开启通风开关。洗手后用酒精喷洒消毒手、手臂、实验材料及培养基外部等进入超净工作台的部分。进入超净工作台，用酒精棉擦拭台面（手勿伸出工作台），台面完全风干后点燃酒精灯。 3.接种开始时，将镊子及手术刀在酒精中浸泡，并在酒精灯外焰上烧炽片刻，充分冷却。取幼嫩的烟草（甘薯）叶片，用手术刀切割成小片，再用镊子将其接种至相应的培养基上，每瓶接种3~5片，封口后取出超净工作台，标注姓名、日期、培养基和接种材料。 4.将上述培养材料常温暗培养，每隔7天观察一次，并记录培养情况 五、实验结果
水稻愈伤组织的诱导 一、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)； 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（pH5.8）； 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤 1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒
在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL 无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO ，不时摇动搅拌，共处理30分钟→弃NaCLO →用无菌水洗3次，每次停留1分钟→倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无菌滤纸的无菌培养皿中吸干。 6、接种与观察 将吸干的消毒种子用无菌的镊子接入培养基并均匀放置，每皿接10粒，每人共接种2皿。接种完成后，将培养皿盖上并用保鲜膜封口，然后将接种有材料的培养皿移出超净台，贴上标签写明日期、接种人，按照班级统一放入一篮子，再将篮子放入培养室进行25℃暗培养。注意每隔2-3天前来观察一次实验现象，1周后调查计算污染率，14天后调查计算愈伤组织诱导率。 五、实验结果 本次实验我组未出现被污染的种子，污染率均为0 。说明实验过程中，我组成员操作规范，保证所接种的种子均不受到污染。 最后，我组的2个培养皿分别可以诱导出7和8株水稻苗，诱导率分别为70% ×100% 形成愈伤组织的种子数 污染率(%)= ×100% 污染的种子数 接种的总种子数 诱导率 (%)= 接种的总种子数
水稻愈伤组织的诱导 、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酉精，2% NaCLO无菌水（每组1瓶400mL）; 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+ 琼脂8g/L （pH5.8）; 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（C 9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL 2 个、三角瓶（50mL无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照 射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30 分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备 30 粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒 在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶一加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）一弃水，倒入75%酉精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）一弃酒精f加适量无菌水洗一次f弃水f倒入适量2% NaCL O不时摇动搅拌，共处理30分钟一弃NaCL f用无菌水洗3次，每次停留1分钟f倒去无菌水，将种子从三角瓶转到带无 菌滤纸的无菌培养皿中吸干。 6、接种与观察
水稻愈伤组织的诱导实验 报告 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
水稻愈伤组织的诱导 一、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)； 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（）； 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒 在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO，不时摇动搅拌，共处理30分
实验二 愈伤组织的诱导与再分化 一、目的 掌握外植体的消毒方法和接种技术；了解愈伤组织诱导的过程及再分化。 二、原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养都能形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体如果是带菌的，在接种前都必须消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料 水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 四、仪器设备及用具 （一） 仪器设备 超净工作台 培养室 （二） 用具（每组5人用量） 量筒：100ml ×2 培养皿：￠9cm ×1 三角瓶：50ml ×2(无菌)，1000ml ×1 枪形镊：×4 无菌滤纸：（10cm ×10cm ）×5 五、试剂及培养基 （一） 试剂 75%酒精，2% NaCLO ，无菌水(每组1瓶400ml) (二) 培养基 1、诱导培养基：N 6+2,4-D2mg/1+蔗糖30g/l+琼脂8g/l 2、分化培养基：N 6+ CuSO 4·5H 2O 1.25mg/l+BA 2mg/l+NAA 1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂8g/l 六、实验步骤 1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、消毒剂的配制 （1）、75%酒精：每组配95ml 。量取95%酒精75ml ，加蒸馏水至95ml 即可. （2）、2%NaCLO ：每组配100ml. x ：应吸取的NaCLO 原液的毫升数； y ：NaCLO 原液的有效氯浓度。 3、种子去壳 用自制的脱壳砂纸脱去谷壳，注意保持胚完整。每人准备30粒去壳种子。 4、外植体消毒（以下工作在超净工作台内进行） 将米粒放入50ml 无菌三角瓶→无菌水洗一次→弃水，倒入75%酒精，搅拌，30秒→弃酒精，倒入2% NaCLO ，不时搅拌，30分钟→弃NaCLO ，用无菌水洗3次，每次停留10.5%×100 y X= (ml)
中 国 海 洋 大 学 实 验 报 告 姓名： 马宁 专业年级： 生命基地班2009级 学号： 040212009020 课程： 植物生理学实验 题目： 植物愈伤组织诱导培养基的配制 一 .实验目的 1、掌握植物组织培养基母液配制的原则。 2、掌握植物MS 培养基的配制方法。 3、学会使用高压灭菌锅。学会植物组织含水量、自由水和束缚水含量的测定 二 .实验原理 概念： 1.植物组织培养： 将植物的器官组织以至单个细胞，应用无菌操作方法，使其在人工条件下，能够分裂、增殖、分化发育成一完整植株的过程。 2.愈伤组织及脱分化、再分化： 植物的组织在人工培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，可以重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织，这一过程称为“脱分化作用”。而已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称为“再分化作用”。植物激素在“再分化”过程中起着重要作用，生长素和细胞分裂素的比例，决定了根和芽的分化。 培养基配置见下表 化合物 含量 mg/L 母 液 吸取母 液量 ml/L 编号 浓度 mg/ml 称量 mg 配制量 ml NH 4NO 3 1650 1 33 16500 500 25 KNO 3 1900 38 19000 KH 2PO 4 170 3.4 1700 MgSO 4.7H 2O 370 7.4 3700 CaCl 2.2H 2O 440 2 8.8 4400 500 25
三 .主要仪器试剂 三蒸水、蔗糖、琼脂、用分析纯试剂：NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4?7H2O 、CaCl2?2H2O 、 ZnSO4?7H2O 、MnSO4?4H2O 、H3BO3预先配制好的不同组分的培养基母液、2-4D 溶液、烧杯、移液管、铁缸子、玻璃棒、手套、加热器等。 四.实验操作步骤 1、母液的配制（教师配好） 1）配制母液的好处和原则 （1）好处 a.可减少每次配制称量药品的麻烦. b.减少极微量药品在每次称量时造成的误差。 母液配成10~100倍，2－4℃冰箱中保存，用时按比例稀释。 （2）原则：按照药品的种类和性质（相似）分别配制，避免形成沉淀。 2）实验中用到的各母液 ZnSO 4.7H 2O 8.6 3 0.86 430 500 5 MnSO 4.4H 2O 22.3 2.23 1115 H 3BO 3 6.2 0.62 310 NaMoO 4.2H 2O 0.25 4 0.25 125 500 0.5 CuSO 4.5H 2O 0.025 0.025 12.5 CoCl 2.6H 2O 0.025 0.025 12.5 KI 0.83 5 0.083 41.5 500 5 Na-EDTA 37.3 6 7.46 3730 500 2.5 FeSO 4.7H 2O 27.8 5.56 2780 盐酸硫胺素 0.1 7 1 25 25 0.05 盐酸吡多醇 0.5 8 1 25 25 0.25 肌醇 100 9 20 1000 50 2.5 甘氨酸 2 10 1 50 50 1 烟酸 0.5 11 1 25 25 0.25
水稻愈伤组织的诱导实 验报告 标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
水稻愈伤组织的诱导 一、实验目的 1、掌握外植体的消毒方法和接种技术； 2、了解愈伤组织诱导的过程。 二、实验原理 以植物器官、组织、细胞等作外植体进行离体培养时，在一定的诱导培养条件下都能诱导形成愈伤组织。愈伤再经分化培养，通过器官发生途径或体细胞胚胎发生途径可再生成植株。 外植体源自自然环境均为带菌状态，在接种前都必须进行消毒。对于难消毒的材料，有时要几种消毒剂配合使用；对于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展着剂（吐温20）以增强消毒效果。 三、实验材料与用具 1、材料：水稻成熟种子（用于诱导愈伤组织）； 2、试剂：75%酒精，2% NaCLO，无菌水(每组1瓶400mL)； 3、培养基：诱导培养基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L（）； 4、仪器设备：培养室、超净工作台、培养皿（￠9cm）2个、枪形镊、量筒（100mL）2个、三角瓶（50mL、无菌）2个、废液缸、保鲜膜、标签纸。 四、实验步骤
1、接种室、培养基及用具表面消毒 用75%酒精棉球试擦超净工作台、镊子，将培养基及用具放工作台，打开紫外灯，照射20分钟以表面消毒。之后关紫外灯，打开工作台风机，通风30分钟后可进行无菌操作。 2、种子去壳 选取饱满、无霉变、成熟的水稻种子，手工脱去谷壳（注意保持胚完整），每人准备30粒去壳种子，并按照分组放到三角瓶中。 3、操作者双手的清洗与消毒 在进入无菌室之前，各操作者先用自来水清洗干净双手并晾干，然后进入无菌室，坐在超净台前位子上后，用含75%酒精的酒精喷壶喷洒双手对双手进行消毒，在超净台风口待双手酒精风干后进入超净工作台。（注意：酒精喷壶喷洒双手时切记不要把酒精喷到超净台的有机玻璃板上！） 4、超净台面的表面消毒（以下工作在超净工作台内进行） 用枪形镊子从含75%酒精棉球的容器中取一团棉球，仔细把整个超净台面擦试一遍，尽量降低超净台面的带菌量，并将废棉球丢到废液缸中，然后点亮超净台里面放置的酒精灯。 5、外植体消毒（分组操作，每组由一位代表操作完成外植体的消毒工作） 将脱谷壳米粒转到一50mL无菌三角瓶→加适量无菌水洗一次（以没过种子为准，下同）→弃水，倒入75%酒精适量，摇动搅拌，放置30秒（过程中适当轻摇动混匀）→弃酒精→加适量无菌水洗一次→弃水→倒入适量2% NaCLO，不时摇动搅拌，共处理30分
第五章 愈伤组织的诱导、形成及分化 第一节愈伤组织的诱导、形成及特点 、愈伤组织的诱导和形成 愈伤组织是在离体培养条件下，经植物细胞脱分化和不断增殖所形成的无特定结构的组 织。经一段时间的生长和增殖以后，在其内部出现一定程度的分化，产生出一些具有分生组 织结构的细胞团、色素细胞或管状分子。 植物外植体在培养基和外界环境的作用下，经过一个复杂的过程形成愈伤组织，即：外植体+培养基+环境愈伤组织 愈伤组织的形成一般可分为三个时期：诱导期、细胞分裂期和细胞分化期（见图 4.1 ）。 改变原来的分化方向和代谢方式, 合成代谢加强，合成大量蛋白质和 核酸物质，为细胞的分裂和增殖奠定基础外植体外层细胞开始分 裂，细胞脱分化，愈伤组织结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透 明愈伤组织表层细胞分裂逐渐停止，转向内部的局部地区，并改变 分裂面的方向，出现瘤状结构外表，愈伤组织中可以发现维管组 织，但不形成维管系统 图4.1 愈伤组织的形成特点 1. 诱导期 愈伤组织诱导期又称启动期，是指外植 体组织受外界条件刺激后，开始改变原来的分裂 方向和代谢方式，合成代谢活动加强，大量合成蛋白质和核酸物质，为细胞分裂做准备。 诱导期的长短因植物种类、外植体的生理状态和外部因素而异，即使是同一种物种不同 基因型同一外植体的愈伤组织，其诱导期也不同。有的植物愈伤组织诱导期只有1天（菊芋），而有的植物诱导期需要数天（胡萝卜）。刚收获的菊芋块茎的诱导期仅22 h，但经贮藏5个 月后，诱导期延长为2天。 2. 分裂期 外植体在培养基上经过离体诱导后，外层细胞开始发生分裂，细胞脱分化。愈伤组织的 细胞分裂快，结构疏松，缺少组织结构，颜色浅而透明（见图 4.2）。分裂期的细胞分裂局限在愈伤组织的外缘，主要是垂周分裂。 图4.2 小麦幼胚愈伤组织诱导分裂期与分化期 （东北农业大学小麦研究室，李文雄，曾寒冰，胡尚连等，1994）愈伤组织进入分裂期时，外植体的脱分化因植物种类、基因型、外植体种类和生理状况 分化期分化期
实验1 愈伤组织的诱导 1、实验目的 （1）学习植物材料表面灭菌的常规方法； （2）了解接种的无菌操作技术； （3）学习诱导植物器官形成愈伤组织的方法。 2、实验原理 植物组织培养是应用无菌操作的方法，培养离体的植物器官、组织或细胞的过程。如果组织培养使用的植物材料是带菌的，在接种前就必须选择合适的消毒剂对植物外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。 由于植物细胞具有全能性，外植体在合适的培养基上，可以通过脱分化，形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团——愈伤组织。 3、实验仪器和试剂 仪器：超净工作台、光照培养箱、酒精灯、打火机、记号笔、脱脂棉、75%酒精及棉球。 无菌器材：无菌吸水纸（定性滤纸）、灭菌培养皿、无菌水、镊子、解剖刀。 植物材料：直根胡萝卜、烟草叶片。 试剂：95%乙醇、0.1%氯化汞。 培养基：MS+1mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+10g/L琼脂,pH5.8 4、实验步骤 （1）接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种间紫外灯，照射约30 min，然后关闭紫外灯，通风20 min后，打开日光灯即可进行无菌操作。 （2）外植体预处理：将胡萝卜根用流动的自来水冲洗干净，用小刀削去其表皮1-2mm，切成大约15-20mm厚的块段。 （3）以75%乙醇棉将手擦试一遍。以下操作全部在无菌条件下进行。
（4）外植体消毒：用0.1%的升汞消毒1min-3min（烟草叶片消毒10秒钟左右）,然后用无菌水中漂洗3次，每次2分钟。 （5）将胡萝卜片放入垫有无菌滤纸的培养皿中，一手用消毒好的镊子固定胡萝卜，一手用灭菌后的解剖刀切除胡萝卜块段截面的表面部分，余下部分切成包含形成层的长、宽约5mm，厚约5mm的小块。在完成切割后，将解剖刀和镊子放入95%乙醇中浸蘸一下，在酒精灯焰上灼烧灭菌之后，放回原处，待冷却后即可使用。注意：在每一次使用镊子、解剖刀后，都要对其消毒一次。 （6）接种：在酒精灯焰附近处，用无菌镊子夹取胡萝卜薄片并迅速半插入琼脂培养基上，每皿放4-5片，注意将近根尖的一面接触培养基。将培养皿口在酒精灯焰上小心地轻转灼燎数秒，立即用封口膜封好瓶口。 （7）培养：将接种后的三角瓶放到光照培养箱中，在25℃下的黑暗中培养3-4周。 5、结果记录与分析 （1）接种1周-10天后，调查、计算污染率： 污染率(%)=污染的材料数/接种材料数×100% （2）每周观察并记录胡萝卜外植体产生愈伤组织的情况，包括出现愈伤组织前培养物的形态，愈伤组织出现的时间以及愈伤组织的形态特征（愈伤组织的颜色、质地等），4周后调查、计算愈伤组织诱导率： 诱导率（%）=形成愈伤组织的材料数/接种材料数×100% 6、思考题 （1）分析影响愈伤组织诱导的主要因素。 （2）以胡萝卜为材料为什么要强调要切取含有形成层部分，胡萝卜其它部分（如茎、叶、花）能否诱导出愈伤组织？ 实验二真菌菌丝DNA提取 1实验目的 学习利用CTAB法少量提取真菌菌丝体DNA，同时掌握在DNA提取中各
108 林业科技开发2013年第27卷第1期 doi ：10．3969/j．issn．1000－8101．2013．01．030 龙凤竹愈伤组织诱导及再分化的试验 袁云香 （渭南师范学院化学与生命科学学院，陕西渭南714000） 摘 要：以龙凤竹茎段为外植体，采用不同培养基进行愈伤组织诱导试验。将获得的龙凤竹愈伤组织转入再分化 培养基中，采用正交设计实验，添加不同浓度6－BA 、NAA 和蔗糖，组成9种不同的再生植株分化培养基，对龙凤竹愈伤组织进行再分化培养。结果表明:NMB 为最适的基本培养基;诱导培养基中添加6－BA 1mg /L +NAA 0．1mg /L 时，有利于龙凤竹愈伤组织形成，诱导率达86．67%;再分化率最高的培养基配方为NMB +6－BA 2．0mg /L +NAA 0．2mg /L +5%蔗糖。关键词：龙凤竹;组织培养;愈伤组织;再分化 Experiment on callus induction and redifferentiation of Pedilanthus tithymaloides var．nanus ∥YUAN Yun-xiang Abstract ：The stems of Pedilanthus tithymaloides var．nanus were taken as explant and induced callus formation．The dif-ferent culture media ，the proportion of different plant hormone were investigated．To add different concentration 6－BA and NAA to the medium composed of 9different plant regeneration medium by orthogonal design L 9（34）were investigated．The results showed that the suitable media NMB was in favor of the induction ，the induction medium added 1mg /L 6－BA and 0．1mg /L NAA was beneficial to the callus induction．The suitable regeneration medium was NMB containing 2．0mg /L 6－BA ，0．2mg /L NAA and 5%sucrose ，it could improve obviously the frequency of regenerated shoots．Key words ：Pedilanthus tithymaloides var．nanus ；tissue culture ；callus ；redifferentiation Author ’s address ：College of Chemistry and Life Science ，Weinan Teachers University ，Weinan 714000，Shaanxi ，China 收稿日期：2012－08－28修回日期：2012－10－29 基金项目：陕西省教育厅项目（编号：12JK0832）；陕西省教育厅项目（编号：09JK434）；国家自然科学基金项目（编号：31000410）。作者简介：袁云香（1980－），女，讲师，主要从事植物分子遗传学研究 工作。E- mail ：yuanyunxiang2006@126．com 龙凤竹（Pedilanthus tithymaloides var．nanus ）为 大戟科红雀珊瑚属红雀珊瑚的变种之一，植株小巧玲珑、通体绿色、茎肉质、叶排成两列、株型极为美观，其栽培育种技术已受到人们的高度重视。目前，关于其他变种的多肉多浆花卉的引种栽培研究已有报道，例如红雀珊瑚、玉麒麟、非洲霸王树等品种的栽培技术较为成功。由于龙凤竹种苗资源有限，常规的繁殖方 法耗时长、难以满足市场需求［1］ 。因此，组织培养技术已成为龙凤竹快速繁殖的重要途径。 在组织培养过程中，不同培养基、不同植物生长调节剂种类以及同一种植物生长调节剂的不同浓度都会影响龙凤竹愈伤组织植株的再生。因此，开展不同植物生长调节剂对龙凤竹愈伤组织植株再生的影响研究，有利于筛选出一种高效快速的龙凤竹愈伤组织植株再生方法，为龙凤竹的规模化生产研究奠定良好基础。 1材料与方法1．1 试验材料 以渭南市花鸟市场购买的龙凤竹当年生枝条的 嫩茎为试验材料。1．2试验方法 1．2．1 龙凤竹愈伤组织的诱导 剪取龙凤竹当年生枝条的新嫩枝，放入烧杯中，加入适量洗衣粉，在自来水下冲洗约2h 后，再用蒸馏水冲洗5min ，于超净工作台内，先用75%酒精处理15s ，再用0．1%升汞处理8min ，然后用无菌水冲洗5 6次，切成约0．5 1．0cm 的茎段作外植体，接种于诱导培养基上进行培养。诱导培养基基本成分为N 6、 MS 、NMB 、NB 。其中：（1）NMB 为N 6大量元素+MS 微量元素+B5有机元素；（2）NB 为N 6大量元素+B5微量元素及有机元素。4种基本培养基均添加脯氨酸500mg /L +水解酪蛋白300mg /L +6－BA 1．0mg /L +NAA 0．1mg /L +蔗糖3%+0．7%琼脂，pH 5．8（单位下同）。培养条件为24 26?光照培养，光照强度为1500 2000lx 、每天光照时间12h 。21d 后统计诱导率，并观察愈伤组织诱导及生长状 技术开发欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗欗
毕业论文开题报告 生物工程 水稻愈伤组织的诱导 1 选题的背景和意义 水稻是人们重要的粮食作物之一，也是经典的模式植物．生长和分裂旺盛的胚性愈伤组织细胞培养是获得转基因植物的最好来源。近年来，研究者先后从水稻各部位诱导出愈伤组织和再生植株。虽然，幼穗、幼胚、花粉粒、花药愈伤组织诱导率高，愈伤组织质量好而受到青睐，但上述材料多受季节限制，取材不便，阻碍了水稻组织培养的进一步发展．本实验选用本省粳稻种子为材料，对其在不同培养基条件下的出愈率及愈伤组织状态进行研究，以期获得状态较好的愈伤组织，为进一步利用其进行悬浮细胞培养及转基因研究提供理论及实验依据。 2 相关研究的最新成果及动态 自1965年我国开展水稻细胞培养研究后，研究者以水稻幼穗、幼胚、花粉粒和花药为材料进行组织培养研究，取得了较大的进展，尤其是建立起来的水稻胚性悬浮细胞系可作为基闪枪的理想受体，在水稻的遗传转化，品种培育巾具有重要作用。 再如细胞次生代谢物的生产，即通过细胞培养可得到大量合成的植物次生化合物，如生物碱、抗菌剂、利血平、橡胶、类同醇、糖类衍生物、天然色素等很多物质。远源杂种植物的产生，是指由受精后障碍导致远缘杂交的植物不孕，使得植物的种间和远缘杂交常难以成功。采用胚的早期离体培养可以使杂种胚正常发育，产生远缘杂交后代，从而育成新物种。植物的快速繁殖，是指利用植物组织培养技术对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法。植物快速繁殖是植物组织培养技术在农业生产中应用最广泛，产生经济效益最大的研究领域，涉及的植物种类繁多，技术日益成熟并程序化，繁殖速度突破了植物自然繁殖的界限，成就了工厂育苗的梦想。 植物种质资源的离体保存，即从20世纪60年代开始，人们利用细胞和组织培养再生植株的技术，进行了离体保存种质的研究。种质资源离体保存是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长的处理使之保存，在需要时可
一.实验目的 通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。 二.实验内容 （一）、实验原理 植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。 愈伤组织的形成 从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。 起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出