前沿报道?RNA干涉宫颈癌细胞抑制HPV16E6基因表达
对FHIT基因表达的影响
范余娟, 彭芝兰, 牛晓宇, 王和, 陈悦悦, 李文
四川大学华西第二医院妇科,四川成都610041
E ffect of inhibited HPV16E6expre ssion by RNA interference on FHIT gene expre ssion
in cervical cancer cells
FA N Yu2j uan,P EN G Zhi2lan,N IU X iao2y u,W A N G He,C H EN Yue2y ue,L I Wen
Department of Gy necology,West China S econd Hos pital,S ichuan Universit y,Cheng du610041,P.R.China
【摘要】 目的:研究HPV16E6基因被RNA干涉抑制后F HIT基因表达的变化,探讨两者在宫颈癌组织中的相关性。方法:合成针对HPV16E6基因的特异性siRNA,脂质体介导转染宫颈癌CaSki细胞, R T2PCR测定转染前后HPV16E6、F HIT 基因mRNA表达;Western blot和流式细胞仪检测转染前后HPV16E6、F HIT蛋白表达情况。结果:将HPV16E6siRNA转染CaSki细胞后48h,HPV16E6mRNA表达水平较转染前降低了8013%,P<0101;
F HIT mRNA的表达水平较转染前升高了4117%,P<0101。转染前后HPV16E6蛋白表达水平分别为2617±313和812±111, t=141224,P=01005;F HIT蛋白表达水平分别为7315±516和10919±511,t= 221018,P=01002。结论:抑制HPV16E6基因的表达可使宫颈癌组织中F HIT基因的表达增加。
中华肿瘤防治杂志,2007,14(21):1605-1608[ABSTRACT] OB JECTIVE:To detect the changes of F HIT gene expression after the HPV16E6gene expression was inhibited by RNA interference,and explore the relationship between HPV16 E6and F HIT gene in cervical neoplasms.METH ODS:The specific small interfering RNA(siRNA)of HPV16E6gene was synthe2 sized and transfected into cervical cancer cell line CaSki.The mR2 NA levels of HPV16E6and F HIT before and after transfection were measured by R T2PCR,and the protein levels of HPV16E6 and F HIT were measured by Western blot and flow cytometry. RESU LTS:The mRNA level of HPV16E6reduced by8013%at 48hours after transfection(P<0101),but the mRNA level of F HIT was4117%higher than before at48hours after transfection (P<0101).The protein levels of HPV16E6before and after transfection were(2617±313)and(812±111),respectively,t= 141224,P=01005;The protein levels of F HIT before and after transfection were(7315±516)and(10919±511),respectively,t= 221018,P=01002.CONC L USION:F HIT gene expression can be up regulated by inhibition of the expression of HPV16E6gene in cervical neoplasms.
Chin J Cancer Prev T reat,2007,14(21):1605-1608
【关键词】 宫颈肿瘤/病理学;RNA干扰;基因表达;乳头状瘤病毒,人;流式细胞术
[KE YWOR DS] cervix neoplasms/pathology;RNA interference;gene expression;papillomavirus,human;flow cytometry
【中图分类号】 R73-3 【文献标识码】 A 【文章编号】 1673-5269(2007)21-1605-04
【基金项目】 国家自然科学基金(30371483)
【第一作者简介】 范余娟,女,四川乐山人,博士,副教授,主要从事妇科肿瘤的临床诊治及基础研究工作(现在广西医科大学第一附属医院工作)。
E2mail:yjfan530@https://www.doczj.com/doc/d410990388.html,
【通讯作者简介】 彭芝兰,女,四川成都人,教授,博士生导师,主要从事妇科肿瘤的临床及基础研究工作。
Tel:86-28-85532494 86-28-85423065
E2mail:pengzled@https://www.doczj.com/doc/d410990388.html,
16型人乳头瘤病毒(human papilloma virus type 16,HPV16)是引起宫颈癌最常见的高危型H PV病毒,H PV16E6、E7早期基因产物可分别与p53和p Rb基因的产物结合并使其降解失活,从而影响细胞周期调控,抑制细胞凋亡,致细胞癌变[1,2]。三联脆组(f ragile histidine triad,F HIT)基因跨越人类染色体脆性部位FRA3B,由其cDNA推算出来的蛋白质与具有三价组氨酸结构域的三联组氨酸(histidine t riad, H IT)蛋白质高度同源,故命名为F HIT基因。F HIT 基因在肺癌、头颈部肿瘤、消化道肿瘤、宫颈癌、白血病及膀胱癌等肿瘤中存在广泛异常,尤其是在和环境致癌因素关系密切的恶性肿瘤中异常率较高[3-6]。
H PV16DNA可频繁地整合到FRA3B部位,与F H IT/FRA3B区域的杂合性缺失(loss of heterozy2 go sity,LO H)有关[7],前期研究发现,宫颈癌组织中H PV16E6蛋白阳性表达率与F H IT蛋白的阳性表达率呈负相关;用H PV16E6小片断干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染宫颈癌CaSki细胞,可使CaSki细胞内E6基因表达在24h内明显下降,并持续>9d[8]。本研究用脂质体介导siRNA转染技术特异性抑制CaSki细胞的HPV16E6基因表达,观察F H IT基因表达的变化,以探讨HPV16E6基因与F H IT基因在宫颈癌发生发展中的相关性。
1 材料与方法
1.1 材料
宫颈癌细胞株CaSki购自武汉大学典型物培养保藏中心。羊抗H PV16E6单克隆抗体、ECL显影试剂盒购自美国Santa Cruz公司,兔抗F HIT多克隆抗体、FITC标记的羊抗兔Ig G以及FITC标记的兔抗羊Ig G购自美国Zymed公司,HPV16E6双链RNA2si2 RNA使用德国Proligo公司产品,H PV16E6siRNA 基因转染试剂盒购自德国Q IA GEN公司,RNA抽提试剂盒使用美国Invit rogin公司产品。PCR引物由北京赛百盛公司合成(表1)。
表1 实验中使用的基因引物序列
基因名称引物序列产物长度
(bp)
F HIT
5u25′2A TCCT GGAA GCT T T GAA GCTCA23′
3d25′2TCACT GGT T GAA GAA TACA GG23′
5u15′2TCCGTA GT GCTA TCTACA T23′
3d15′2CA T GCT GA T TCA GT TCCTCT T GG23′
707
β2actin
Fp5′2CCAA GGCCAACCGCGA GA G23′
Rp5′2A GGGTACA T GGT GGT GCCGC23′
589 HPV16E6
Fp5′2A T GCACCAAAA GA GAACT GCA23′ Rp5′2GTA TCTCCA T GCA T GA T TACA23′493
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 购买的CaSki细胞复苏、传代,于
含10%小牛血清的RPM I1640培养基中,37℃、5%
CO2条件下培养。
1.2.2 H PV16E6siRNA转染及其基因表达检测
基本按文献[7]的操作程序合成H PV16E6siRNA并
转染CaSki细胞,于转染后48h收集细胞,提取细胞
总RNA,检测转染前后CaSki细胞内E6及F HIT
mRNA的变化。行H PV16E6、F HIT外套PCR
(5u2、3d2)反应。反应条件为F HIT:94℃2min;
94℃45s,62℃30s,72℃1min,31个循环;72℃
7min。HPV16E6:94℃2min;94℃45s,58℃
30s,72℃1min,35个循环;72℃7min。再行
F H IT巢式PCR(nested PCR):取F HIT第一轮PCR
产物作模板,再用F HIT基因引物(5u1、3d1)作巢式
PCR。循环参数同上,共36个循环。扩增产物用琼脂
糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。
1.2.3 流式细胞技术检测转染前后CaSki细胞
H PV16E6及F HIT蛋白表达 收集未转染和转染后
48h的CaSki细胞,固定后顺序加入第一抗体(抗
F H IT和H PV16E6抗体)和FITC标记的第二抗体,
作用后用流式细胞仪测定细胞内FITC的荧光强度
值,实验重复3次,数据用Bios Consort30软件处理。
HPV16E6蛋白抑制率(%)=(1-
转染后样品蛋白荧光强度-阴性对照
未转染样品蛋白荧光强度-阴性对照
)×100%
1.2.4 Western blot检测转染前后CaSki细胞
H PV16E6及F H IT蛋白表达 提取细胞总蛋白,定
量后取等量蛋白经过12%聚丙稀酰胺凝胶电泳,转移
至硝酸纤维素滤膜上,顺序加入一抗(抗H PV16和
F H IT抗体)和二抗后用ECL显色,X线下摄片。
1.3 统计学方法
所有数据用SPSS1110统计软件包进行分析,采用t检验,差异有统计学意义,P≤0105。
2 结果
2.1 HPV16E6siRNA转染前后Ca Ski细胞内HPV16
E6及FHIT mRNA的表达变化
HPV16E6siRNA转染后2d,CaSki细胞内
H PV16E6mRNA表达水平减少了8013%,而细胞内
F H IT mRNA表达水平则增加了4117%(图1)。
2.2 HPV16E6siRNA转染前后Ca Ski细胞HPV16
E6及FHIT蛋白表达水平的变化
流式细胞仪检测结果显示,HPV16E6siRNA转染前后,CaSki细胞内HPV16E6蛋白表达水平分别为
2617±313和812±111,t=141224,P=01005,HPV16
E6蛋白抑制率为8011%,P =01000;转染前后FHIT 蛋白的表达水平分别为7315±516和10919±511,t =221018,P =01002,转染后FHIT 蛋白抑制率为-5317%,P =01001(图2)。同样,Western blot 检测结果亦显示,HPV16E6siRNA 转染后CaSki 细胞内HPV16E6蛋白表达较转染前减少,P <0105;FHIT 蛋白表达较转染前升高,P <0105(图3)
。
图1 siRNA 转染CaSki 细胞前后HPV16E6和
FHIT 的电泳结果
1:Marker ;2和3:转染前后β2actin ;4和5:转染前后HPV16E6;6和7:
转染前后F HIT
产物
图2 流式细胞仪检测转染siR NA 后CaSki 细胞
HPV16E6(A )和FHIT (B )蛋白的表达
G 和D :阴性对照;H 和E :转染前;C 和F :转染后
3 讨论
3.1 RNAi 对宫颈癌Ca SK i 细胞中HPV16E6基因的
特异性沉寂
有研究者用E6/E7反义寡核苷酸和核酶抑制
E6/E7癌基因,但没有明显的蛋白抑制效果[9,10],郑燕
芳等[11]用病毒质粒将H PV16E6核酶转染CaSki 细胞,其对H PV16E6mRNA 的抑制率仅为50%。牛晓宇等[8]用HPV16E6siRNA 转染CaSki 细胞,使细胞内E6基因表达在24h 内明显下降,转染后48h 对H PV16E6蛋白表达的抑制率>80%,至转染后9d
对蛋白抑制率仍然>50%。本研究用牛晓宇法于CaSki 细胞内转染E6siRNA ,转染后48h 对E6蛋白
表达的抑制率>80%,证明了该法沉寂H PV16E6基因的高效性和可重复性,为研究宫颈癌组织H PV16E6基因与其他癌相关基因的关系提供了较好的选择。
图3 We stern blot 检测siR NA 转染前后CaSki 细胞
FHIT 和HPV16E6蛋白的表达
1为转染前;2为转染后
3.2 抑制HPV16E6基因表达对FHIT 基因表达的影响
HPV16E6与F H IT 基因均与宫颈癌的发生发展
有关,而两者之间的关系尚不十分清楚。H PV16致癌的关键在于可以整个DNA 或E6、E7片断整合到细胞DNA 中,整合的位点多在染色体脆性部位,细胞通过
病毒启动子表达E6、E7基因,靠近整合位点的细胞癌基因表达也可发生改变。E6、E7基因的表达产物可分别与p53和p Rb 基因产物结合,使其降解;而另一些基因如Notch 21、F HIT 、Myc 和J un 2B 等,在H PV16整合后断裂或丢失,这些癌相关基因的异常是
不可逆的,可能导致细胞的恶性表型[12,13]。
F HIT 基因位于3p1412区,易受外界致癌因素的
影响而失活,其可能的失活机制为:1)致癌因子直接作
用于FRA3B 引起F HIT 基因外显子或内含子的缺失;2)位于5′端启动子区的Cp G 岛发生甲基化引起转录失活[14,15]。本研究结果显示,含60～600个拷贝H PV16DNA 的CaSki 细胞内F H IT 蛋白的表达水平
是正常的,提示CaSki 细胞内F HIT 基因并没受H PV16整合的影响。当将HPV16E6siRNA 转染CaSki 细胞后48h ,CaSki 细胞内H PV16E6mRNA
表达明显减少,蛋白表达量下降,F HIT mRNA 表达增多,蛋白表达量升高。提示siRNA 使HPV16E6基
因表达受抑制的同时造成了F HIT基因的转录和蛋白表达增多。
siRNA是一种小干涉性RNA始动的序列特异性基因沉默机制,可引起特异基因的降解,是一种转录后基因沉默现象,对细胞DNA无影响[16]。本研究结果也证明了这一点,然而,HPV16E6又是通过什么途径调控F HIT基因表达,尚需进一步研究。
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收稿日期:2006-10-10 修回日期:2007-02-08
(编辑:王光英)
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是1998年由Fire等在线虫中发现的一种转录后的基因沉默(Posttranscriptional gene silencing，PTGS)机制。双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)能特异地抑制或沉默目的基因表达，产生如同目的基因突变的缺陷表型，这种由dsRNA介导的基因阻抑作用被称为RNAi。1990年，美国和荷兰的两个转基因植物实验组，在矮牵牛中发现的一种转基因能同时抑制相应的内源基因以及自身表达的基因沉默现象，当时将这种现象称为共抑制。到1994 年，由Cogni等在真菌中发现转录后的基因沉默现象，在野生型粗糙链胞霉中转入胡萝卜素基因albino 1或albino 3时，发现在部分实验中，内源性al 1或al 3基因的表达水平反而减弱，称此现象为基因压制(quelling)。1998年，Fire等在线虫中发现了RNAi现象，并揭示了SuGuo发现正义RNA对基因表达也有抑制作用的原因，认为SuGuo发现的这种现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量的双链RNA，而且dsRNA 能比反义RNA或正义RNA更有效地抑制基因的表达，把由RNA引起的基因表达的抑制称为RNA干涉。 最初普遍认为共抑制、基因压制以及RNAi是机制完全不同的基因抑制现象。但经过科研人员的不断研究，发现在共抑制、真菌中的基因压制以及RNAi现象之间存在着密切的联系。都是由RNA引起的转录后的基因沉默，可能有共同的生物学意义和相似的作用机制。但是共抑制与RNAi并不是完全相同，在植物的共抑制中，dsRNA不仅能引起转录后的基因沉默，而且还能引起转录水平的沉默，其可能机制是dsRNA能引起染色质的重组或甲基化而改变其内源基因的序列。因此，在植物共抑制中还存在RNAi以外的由RNA指导的DNA 甲基化，而引起转录水平抑制的机制。dsRNA能特异地抑制目的基因的表达，其广泛存在各种有机体中，包括线虫、果蝇、涡虫、水螅、锥虫、真菌、植物以及哺乳动物。 1 RNAi的特征 RNAi是发生在转录后水平的基因沉默。 dsRNA具有很高的特异性，能特异地将与其同源的mRNA降解。Andrew在植物中用3种转基因诱导的转录后的基因沉默(PTGS)都检测到有约25 nt(nucleotide)长的siRNA(short interference RNA)。Shi Chenyang等从已转染dsRNA的未分化的胚胎干细胞、卵母细胞以及老鼠胚胎细胞的细胞质提取物中都发现有21～23 nt长的siRNA。这些siRNA可能具有指导核酸酶特异地识别靶mRNA 而将其降解的功能，21～23 nt以下的片段还没有发现，由于这些片段不稳定，易被胞内其他核酸酶降解。 极低浓度的dsRNA就能完全抑制基因的表达。这可能由于RNA存在复制或由于dsRNA 具有很强的催化功能。 dsRNA抑制效应具有传递性。Timmons等用含目的基因表达dsRNA载体大肠杆菌喂养线虫，RNA从肠中吸收，但在体细胞及生殖细胞中都有分布表达。此外，RNAi不仅发生在亲代动物本身，其子代伴随基因表达过程也产生了强烈而特异的抑制效应。细胞的这种抑制能力还能在细胞与细胞之间通过胞间连丝传递，甚至可以通过植物的维管组织在整个植物体中传递。Jorgenese等将有共抑制现象的植物作为砧木，没有抑制现象的植物作为接穗，一段时间以后在接穗中产生了共抑制现象。说明有某种信号分子通过植物的维管系统进行传递，由于这种系统获得的沉默具有序列特异性的特点，这种信号分子可能是一种RNA与蛋白质的复合体。
RNA干扰作用原理及其应用 【摘要】 RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。 【关键词】 RNA干扰 siRNA dsRNA RNA诱导的沉默复合体 Argonaute RNA聚合酶III 启动子 【Abstract】 RNA interference(RNAi) in diverse organisms reveals the same highly conserved mechanism with an ancient is the mode of sequence-specific post-transcriptional gene silencing in animals and plants initiated by homologous double-stranded
RNA(dsRNA).The discovery of RNAi and the molecular mechanism will help us apply it to study the gene function and exploit the gene drug. 【Key words】 RNA interference(RNAi) small interfering RNA(siRNA) double-stranded RNA(dsRNA) RNA-induced silencing complex(RISC) Argonaute pol III 1 背景 20 多年前，在对矮牵牛进行的研究中有个发现：Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制，Jorgensen将这种现象命名为协同抑制。在真菌中也有类似的现象，1996年就在脉孢菌属(Neurospora)发现这
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。它是指小分子双链RNA可以特异性地降解或抑制同源mRNA表达,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。显然，在理论上，通过siRNA几乎可以治疗所有的疾病，包括肿瘤、传染病、遗传性疾病等等，因而RNAi受到学术界普遍的关注，是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。除此之外，RNAi技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。可见，RNAi的应用非常广泛，具有巨大的市场发展空间。但是，由于RNAi现象刚被发现不久，仅仅才14年的时间，无论国外还是国内，目前都缺乏有效的siRNA载体，这大大制约了RNAi的应用，包括实验研究和药物开发。目前市场上主流的siRNA转染试剂是脂质体类的转染试剂，它能将siRNA转染入多种体外培养的细胞株，但原代细胞、悬浮细胞的转染效果不是很好。由于它是脂质体类的转染试剂，因而对培养细胞有一定毒性。而英格恩生物独辟蹊径，转染载体的材料不是用传统的脂质体，而是纳米聚合物材料。这种材料对细胞几乎没有毒性，转染效率在多数细胞株都可达到90%以上，在很多原代细胞中，转染效果也比较好。更为难得的是，该公司的体内RNA转染试剂Entranster-in vivo，和核酸混合后，便可注射进动物体内，完成动物体内RNA干扰实验，十分便捷，是动物体内RNA干扰实验的新创举。
RNA干扰（RNAi）实验原理与方法 近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RN A(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为R NA干扰（RNAi）。一、RNAi的分子机制 通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。证据表明；一个称为Dicer的酶，是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP 依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因，病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。 在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一个A TP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer 的RNA酶。 另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt 长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默. 二、如何进行RNAi试验 (一)siRNA的设计 1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选： https://www.doczj.com/doc/d410990388.html,/business/products/order2.htm https://www.doczj.com/doc/d410990388.html,/techlib/misc/siRNA_finder.html https://www.doczj.com/doc/d410990388.html,/Stu/shilin/rnai.html https://www.doczj.com/doc/d410990388.html,/rnadesign/default.aspx?SID=45358710 2.RNAi目标序列的选取原则： (1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3
什么是siRNA和RNAi 双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA,这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因静默机制，它通过生物体内siRNA介导识别，特定RNA水解酶参与，并靶向切割同源性靶mRNA。实现RNA干扰现象是真核生物中普遍存在的抵抗病毒等外来入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前RNA干扰技术已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，大量的论文被发表，成百上千的专利被授权或递交申请，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具以及新药开发的诱人前景，RNAi也越来越为人们所重视。 RNAi技术发展历程 1998：植物基因中基因沉默现象的发现 2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现 2001：被《科学》评为当年十大科技突破之一 2003：动物体内观察到RNA干扰作用 2004：在恒河猴上的SARS病毒研究取得进展 2004：Acuity Pharmaceutical 第一个RNA干扰药物申请IND 2004：siRNA Therapeutics 第一个RNA干扰药物申请IND 2005：第一个RNA干扰药物进入一期临床，取得良好的效果 2005：化学修饰的siRNA oligo 体内系统给药取得突破 2006：诺贝尔医学奖授予两美国RNAi技术专家 2007：美国卫生研究院（NIH）组建首个RNAi委员会，旨在为NIH 的科学主管给出有关如何尽可能改善他们对RNAi 技术的评估 截止2008年：已有七项核酸干扰药物项目在美国进入临床试验，其中，有一项药物已经推入到第III期临床试验 RNAi 2006诺贝尔医学奖述评 ——年轻的获奖者—— 2006年10月2日，现年47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在RNAi(RNA interference，RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者，且获奖日期距其研究发表仅8年时间，获奖速度之快亦令人叹为观止。颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的基本机制，解释了困惑这一研究者们许久的难题。”“像在清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了”。 —— RNAi的殊荣—— 2001年，随着人类基因组测序的完成，针对其它多种生物的基因组测序计划也相继开展起来。在未来的一段时间内，科学界将不会出现比人类基因组测序更瞩目的技术。有人将人类基因组测序称为“21世纪科学发展史上的里程碑”、“生物学领域最重要的成就之一”。然而时隔不久，同一年在哺乳动物中发现的RNAI掀起了一场风暴，而且愈演愈烈。《Science》杂志将RNAi称为“2002年的重大突破”(Couzin，2002)。然而，更加令人吃惊和兴奋的是，4年以后的今天，Andrew Fire和Craig Mello就因此获得2006年诺贝尔医学奖。一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的青睐和肯定，此前是绝无仅有的，这也足见RNAi在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。 —— RNAi的机制——
?综述?RNA干涉(RNAi)及其应用 蔡佩玲,牟林春,李新枝 (成都医学院基础医学院人体解剖学与组织胚胎学教研室 四川成都 610083) 【中图分类号】 Q752 【文献标识码】 A 基因沉默(gene silencing)是指生物体内的特定基因由于种种原因不表达的遗传现象,它有两方面的功能:一方面,它是生物遗传操作创造新的遗传修饰生物(genetically modified organisms)的障碍;另一方面,它是植物抵御外来核酸入侵(如病毒)的一种反应,为植物抗病毒的遗传育种提供了具有实用价值的策略[1]。近年来,不同的研究领域和生物中发现了许多新的使基因关闭或者沉默的类型,并赋予其不同的名称:植物中称为RNA共抑制(co2supp ression)[2],真菌中叫RNA压制(RNA quelling)[3],动物中则为RNA干涉(RNA interference,RNAi)[4]。 RNAi现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(double2 st rand RNA,dsRNA)导入细胞后,能特异性地降解该mRNA,使相应基因沉默,从而产生相应的功能表型缺失[5]。RNAi现象广泛存在于生物界,从低等原核生物到植物、真菌、锥虫、涡虫、囊虫、水螅、果蝇、线虫、斑马鱼和老鼠早期胚胎等不同种属的生物体中都发现了此现象[6],只是机制也更为复杂,下面就RNAi的发现、作用原理及其应用等进行综述。 1 RNAi现象的发现及其生物学意义 111 RNAi现象的发现 20世纪20年代,人们发现植物在受到野生型病毒感染以后,能产生对另一种亲缘关系相近的病毒的抵抗力[7]。十多年前,科学家在努力进行生物遗传改良时,发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。早期由美国Jorgensen和荷兰Mol带领的两个研究团体试图通过增加色素合成基因的拷贝数来创造一种紫色更深的矮牵牛,但结果出人意料,一些转基因植株部分或完全开出白花,这表明色素合成途径被关闭而不是被加强。事实上,不仅仅该转入的基因不表达,而且植株中所有的色素合成基因都失活。他们将这一现象称之为共抑制[8]。 几年后,英国植物研究人员Ruiz等在进行抗病毒的植物遗传工程研究时也发现了类似现象。他们将X病毒繁殖所必需的编码复制酶的基因转入到西红柿中,结果发现一些植株表现为抗病毒,另一些则表现为不抗病毒。进一步研究表明,抗病毒的植株产生非常少的复制酶,而染病的植株则大量表达X病毒复制酶,抗病植株不仅能使转入的基因沉默而且还能使X病毒的复制酶基因沉默。意大利的Cogoni 将类胡萝卜素合成所需的基因转入到粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中,结果30%的转化细胞自身基因失活。他们称这种现象为压制[1]。 Guo等[9]在研究建立线虫胚胎极性的par I基因作用时,将par I基因的正义和反义RNA链分别注射到野生型线虫卵巢中,均发现50%子代胚胎致死。一般认为反义RNA可与体内自身的mRNA结合,抑制基因的表达,为什么正义RNA也会产生与反义RNA类似的遗传效应呢?1998年,Fire等[4]将unc22、fem1、hlh1、myo3、gfp等基因的正义RNA、反义RNA、dsRNA分别注射到线虫中。他们惊奇地发现:dsRNA所引起的基因沉默效应要比单个正义RNA或者反义RNA都要强的多。且注射入到线虫的性腺以后,在其第一子代中也诱导出同样基因的抑制现象,说明RNAi在原核生物中具有可遗传性[4,5]。他们将这种基因沉默现象称为RNA干涉。 Kennredell等进一步研究发现,用dsRNA注射果蝇胚胎是一种抑制特定基因表达的有效方式[1]。为了解RNAi的特异性,Timmons等[10]将与unc22无关的dsRNA和unc22ssRNA一起注射到线虫体内,但并未发现非同源的dsRNA能够增强ssRNA 对unc22的干涉效应。同时他们还发现:与不同的内含子和启动子序列相对应的dsRNA片段并不产生明显的干涉效应;大多数基因的dsRNA注入可以明显减少或消除内源的mRNA转录本;dsRNA介导的干涉表现为惊人的细胞穿透力,可以传递给其他组织及后代。Tabara等[11]也发现基因沉默不仅仅局限在开始的细胞,还在动物体的各个部分激发RNAi,同时可传递给后代[1,6]。 过去认为哺乳动物细胞中不存在RNAi现象,因为较长的dsRNA在哺乳动物细胞中能诱导干扰素(IFN)生成,并激活STA T途径参与的P KR(dsRNA 依赖性激酶)的转录,同时dsRNA本身与P KR结合
简单的说是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细 胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致 基因表达沉默。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi具有 传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi) RNAi与转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgene silencing)在分子层次上被证实是同一种现象。 RNA干扰是基因转录后沉默的一种方式，是生物界古老而且进化的高度保守的现象之一。RNAi是通过siRNA介导的特异性高效抑制基因表达途径，由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA。RNAi具有生物催化反应特征，反应中需要多种蛋白因子以及ATP参与。RNAi在基因功能研究和基因药物应用具有广泛的前景。 机理 siRNA RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补 与mRNA结合，从而导致mRNA降解。对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的 小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称之为小干 扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。 在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与 双链RNA结合，并将其剪切成21～23nt及3'端突出的小分子RNA片断，即siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复 合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引 导（guide strand），序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA， 引发靶mRNA的特异性分解。 迄今为止已鉴定出包括Dicer在内的若干个与RNAi有关的蛋白因子。在果蝇（Drosophila melanogaster）RISC中，已知存在着称为Argonaute2(AGO2)的因子，AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必须因子。研究表明Argonaute家族蛋白具 有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi机制正是由Argonaute家族 蛋白的RNA切割酶活性主导。另外，几个RNA解旋酶(RNA helicase)也被鉴 定为参与RNAi机制的因子。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的RNAi中必须 的因子有EGO1。这是一种RdRP(RNA-dependent RNA Polymerase)，植物中也 存在该蛋白同系物。RNAi中RdRP是将标靶mRNA作为模板，以导入的dsRNA(或siRNA)作为引物合成RNA，在细胞内针对于标靶mRNA合成新siRNA的酶。这 一反应在一些生物的RNAi中为必须，但RdRP活性在人和果蝇的RNAi中是非 必须的，这说明在不同物种之间RNAi机制的基本框架虽然相同，但存在着微妙差异。 microRNA 在真核生物当中，还存在另外一种小分子RNA（microRNA）也能引 起RNA干扰现象。microRNA大多20-22nt长，前体具有类似发夹性的茎环结
RNAi研究及其进展 公光业M110107259 前言 RNAi是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA 启动的序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。1998年，Andrew Fire等首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中。由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力。RNAi被《Science》杂志评为2010年十大科学成就之一，2002年又名列《Science》杂志十大科学成就之首，成为分子生物学研究的热点。本文综述了该研究的最新进展。正文 RNAi的发现： 上世纪90年代，科学家们在进行生物遗传改良的研究中，发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。最早报道的是在1990年美国科学家Jorgensen等,他们在增强矮牵牛花紫色的转基因研究中，得到的结果是转基因植株部分或完全开白花，表明色素合成途径被关闭而不是被加强。他们将这一现象称为共抑制(cosuppresion)，后来的研究者称之为转录后基因沉默。此后不久，科学家们开展了真菌中的RNAi 的研究。1994年，意大利的Cogoni在野生型粗糙链抱霉(Neurospora crassa)的转基因研究中，把抑自身和相应内源基因表达的基因沉默现
象称为消除作用(quelling或基因压制)。 1995年，Guo等利用反义RNA技术阻断线虫的par-1基因表达，发现无论是给线虫注射正义RN A还是反义RN A，都可以抑制特异基因（par-1）的表达，结果与反义RNA技术的传统机制正好相反。这种出乎意料的发现引起了各国科学家的注意，从此展开了RNAi在动物体内的研究。1998年，Frei在研究秀丽隐杆线虫基因沉默时，首次揭开了Guo遇到的悬疑：Guo遇到的正义RNA抑制基因表达现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的，并且还发现双链RNA能够比反义RN A或正义RNA更有效地关闭基因的表达，抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级，他们称这种现象为RNAi。从此，一个新的基因功能研究领域诞生了，人们已在不同种属的生物中进行了广泛而深人的研究，结果不仅证实R- NAi现象存在于秀丽小杆线虫、植物、真菌、果蝇、锥虫、涡虫、水媳、斑马鱼、小鼠乃至人类等多种生物中，而且对RNAi的分子机制逐渐有了比较清晰的认识，植物中的“共抑制”和真菌中的“压制”，与动物中双链RNA诱导的RNAi具有高度保守的相似机制。 RNAi作用机制: 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA （大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作