第Z5卷第4期江西农业大学学报Vol.Z5No.4 Z003年8月A ct a A g ri cult urae Uni versit ati s Ji an g Xi ensi s Au g.Z003
文章编号!1000-Z Z86Z00304-0635-04
安福火腿发酵微生物分离与
发酵工艺研究
黄占旺!徐明生!汤凯洁!蒋艳!吴少福
江西农业大学食品科学系江西南昌330045
摘要!安福火腿表层的微生物主要是霉菌和酵母菌内层的微生物主要是酵母菌和球菌不含霉菌酵母菌
霉菌和球菌是火腿发酵过程中的优势菌群从安福火腿中分离得到了Z株发酵微生物木糖葡萄球菌
S l a P hlococc us J$los us和季也蒙假丝酵母Candi da g uillier m ondii并研究了火腿发酵工艺
关键词!火腿微生物分离发酵
中图分类号!TS Z05.Z文献标识码!A
S e p arati on of Fer m ent ati on M icroor g anis m i n Auf u H a m
and its Fer m ent ati on Technol o gy
~UANG Zhan-Wan g XU M i n g-shen g
TANG Kai-i e JI ANG Yan WU Shao-f u
D e p t.of Food S ci ence J AU Nanchan g330045Chi na
Abstract The m i cr oor g ani s m s on t he surf ace of Anf u ha m are m ai nl y mol ds and y easts and t he m i cr oor g ani s m s i nsi de t he ha m are m ai nl y y easts and cocci i ncl udi n g no mol ds and ot her col oni es. The f er m ent ati on m i cr oor g ani s m s of Anf u ha m are m ai nl y y easts mol ds and cocci.The f er m ent ati on m i cr oor g ani s m s S l a P hl ococc us J$l os us and Candi da g uillier m ondii Were se p arat ed f r o m Anf u ha m and its f er m ent ati on t echnol o gy Was st udi ed.
Ke y Words ha m m i cr oor g ani s m se p arati on f er m ent ati on
安福火腿是我国传统的特产品其风味独特香气浓郁深受人们喜爱江西省每年产量100万只该产品几百年一直采用传统的生产方式即在自然条件下经过腌制洗晒发酵等主要阶段加工而成火腿在天然发酵微生物的作用下经过4～6个月发酵成熟生产周期长达9个月传统工艺生产的火腿中含有多种微生物Z0世纪90年代以来江东福马萍等1Z1990研究了宣威火腿中的微生物菌群结果表明其主要发酵微生物为酵母菌它在火腿的前期发酵和后期成熟中对风味的形成起了重要作用霉菌与火腿的质量色香味没有直接的关系火腿表面生长的霉菌对引起腐败变质的细菌有抑制作用这种抑菌作用以及霉菌在火腿表面形成的抗氧化保护层使火腿在漫长的发酵阶段不会变质江东福张玲琪19943报道了火腿发酵微生物两个汉逊酵母新种为了探索火腿工业化生产我们对安福火腿中的发酵微生物进行分离得到了Z个菌株木糖葡萄球菌S l a P hl ococc us J$l os us和季也蒙
收稿日期!Z003-04-Z8
作者简介!黄占旺!1964-"#男#副教授#主要从事食品工艺科学研究$
江西农业大学学报
第Z 5卷
表l 菌落类群分布情况
霉菌酵母菌球菌杆菌火腿表层菌落数49Z 31415火腿内层菌落数
46
31
18
假丝酵母(Candi da g uillier m ondii )
9人工接种于腌制的腿肉内9控制发酵工艺条件9达到缩短发酵时间9
提高产品质量9对火腿生产具有重要的经济和社会效益o l 材料与方法
l .l 材料l .l .l 样品安福火腿9购于江西安福火腿公司9水分50.8%9盐分11%9p ~6.0o
l .l .2培养基马铃薯培养基9麦芽汁培养基9MRS 培养基9
番茄汁培养基9营养琼脂培养基o l .l .3菌种鉴定试剂盒酵母菌鉴定APIZ 0CAUX 试剂条9细菌鉴定API STAP ~Z 0500试剂条9法国
梅里埃生物公司o l .2方法
l .2.l 微生物分离筛选样品处理(
取火腿不同部位表层\内层肉块在无菌条件下研碎9加生理盐水振荡打散)一稀释至10-3
一平板培养一纯化一火腿发酵筛选一鉴定o l .2.2菌种鉴定依据API 法鉴定o l .2.3检测方法游离氨基酸9高效液相法;水分9直接干燥法GB5008.3-85;蛋白质9凯氏定氮法GB5008.5-85;
脂肪9索氏提取法GB5008.6-85;食盐9硝酸银容量法GB9695.8-88o 2结果与分析
2.l 火腿中主要微生物类群
按无菌操作要求9取火腿不同部位表层\内层肉块研碎9然后稀释至10-39Z 8C 下平板培养9
每个类型的菌落挑取5～10个观察9大致确定微生物类群9结果见表1o
从表1可见9安福火腿表层的微生物主要是霉菌和酵母菌9
火腿内层的微生物主要为酵母菌和球菌9不含霉菌9这说明酵母菌\霉菌和球菌是火腿发酵过程中的优势菌群o
2.2发酵微生物分离!筛选
按无菌操作要求9
取火腿不同部位表层\内层肉块研碎后分别加入到含10%的氯化钠麦芽汁培养基和含10%的氯化钠番茄汁培养基9置于Z 8C 培养3d o 按上述方法转接3次9将培养后的菌液稀释至10
-3
\10-4\10-59
用相同培养基进行平板分离9从平板上选取典型的9个菌落进行纯化9得9个菌株9经显微镜检查其中5株为酵母菌9Z 株为球菌9Z 株为杆菌o 然后进行发酵试验9
选购大小\重量接近的猪腿9加6%食盐腌制9分别接种分离纯化后的菌株制作火腿9每株菌作3只重复9对不同处理的火腿作感官鉴评9筛选风味优良的菌株9结果如表Z o
表2火腿接种发酵情况
菌号试验腿数清香针数总数平均数/只异味针数
总数平均数/只描述
评审人数每只火腿打针数名次S 138Z .7371Z .3有类似豆腐乳的气味;颜色较淡
5
38S 631Z 43311一签香9二签有异味36S 834414.610.3三签腊香味较浓;颜色正常
531S 1133010155二签香9一签有异味534S 3Z 34113.641.3三签腊香9但香味较淡533C 1393361Z 一签香9二签有异味537C 534Z 1431三签腊香味较浓;颜色正常
53Z B Z 33010155二签香9一签有异味535B 6
3
8
Z .7
37
1Z .3
有轻微酸味;颜色较淡
5
3
9
636
第4期
黄占旺等:安福火腿发酵微生物分离与发酵工艺研究
表5API LAB PI US 软件分析结果
菌号菌名
C 5木糖葡萄球菌(S l a P hlococc us J $los us >S 8季也蒙假丝酵母(Candi da g uillier m ondii >S 3Z
季也蒙假丝酵母(Candi da g uillier m ondii >
图1温度对菌株生长的影响
由表4可见
菌株S 8~S 3Z ~C 5能单独发酵制成的火腿 45针中清香签数分别为44针~4Z 针和41针 且无异味签 色泽均比较正常 初步说明此三株菌适宜于加工火腿 而其他菌株出现了较多的异味签 不能用于火腿制作的发酵微生物 给予淘汰 对酵母菌S 8~S 3Z 和球菌C 5进行鉴定 2.3菌种鉴定
经上述火腿发酵试验 选取3株产香较好的菌株S 8~S 3Z ~C 5进行菌种鉴定 API 试剂条检测结果如表3~表4 表3葡萄球菌C 5鉴定结果!API STAP ~20500"
菌号0GLU FRU MNE MAL LAC TRE MAN XLT MEL N I T PAL VP RAF XYL SAC MDG NAG AD~URE 结果
-+
+
+
-+
----+
+
--+
+
---+
表4酵母菌S 8#S 32鉴定结果!API 20CAUX "
菌号0GLU GLY Z KG ARA XYL ADO XLT GAL I NO SOR MDG NAG CEL LAC MAL SAC TRE MLZ RAF S 8-++++++++-++++-++-+-S 3Z
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-+
+
+
+
-+
+
-+
-
2.4发酵工艺研究
2.4.l 发酵温度的确定将S 8~S 3~C Z 以1%的接种量分别接种到p ~7.0的麦芽汁培养基中
分别在Z 0C ~Z 5C ~Z 8C ~30C 下培养3d 进行菌落计数 结果如图1所示 由图1可知 Z 株季也蒙假丝酵母菌生长的适宜温度为Z 5～Z 8C
木糖葡萄球菌生长的适宜温度为Z 8～30C 因此 在火腿发酵工艺中 选择Z 5～30C 较为合适
2.4.2发酵工艺的确定将分离的季也蒙酵母
和木糖葡萄球菌制成液体发酵剂 按如下工艺进行分别人工接种 接种量1% 人工条件发酵温度
Z 5～30C
制成后的火腿进行感官评定及理化检测 选择适宜的发酵工艺 试验结果见表6
表7 工艺I :鲜腿用6%的食盐腌制+接种一洗腿~晒腿一发酵(自然条件>一成熟
工艺H :鲜腿用6%的食盐腌制+接种一洗腿~晒腿一发酵(人工条件>一成熟
工艺皿:鲜腿用6%的食盐腌制一洗腿~晒腿一接种一发酵(自然条件>一成熟
工艺w :鲜腿用6%的食盐腌制一洗腿~晒腿一接种一发酵(人工条件>一成熟 工艺V :鲜腿用6%的食盐腌制一洗腿~晒腿一发酵(自然条件>一成熟
从表6可知 在发酵50d 的情况下 除第V 组(对照组>外 接种工艺发酵制作的火腿感观质量均符合火腿的感官要求 对照组在自然条件下不接种发酵50d 难于达到火腿感官要求 在接种发酵的四种工艺中 腌制时接种发酵剂的工艺优于盐腌后接种发酵剂的 这可能是因为腌制后接种液体发酵剂增加了火腿的水分含量 不利于火腿中后期发酵3在人工条件下发酵的好于自然条件发酵的 这是由于发酵微生物处在人工控制的最适宜生长环境下生长较好 另外 火腿处在Z 5～30C 的较高温度下 各种酶
类的活性较强 火腿的失水相对较快 肌肉组织结实
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江西农业大学学报第Z 5卷
表6各组火腿的感官评定
组别试验腿数发酵时间/d 描述
色\香\味评分总计评审人数名次I 350香味较浓;肌肉松软\肉色淡红;脂肪洁白\有光泽46753H 350香味较浓;肌肉结实\肉色鲜红;脂肪洁白\有光泽49051皿350香味较浓;肌肉松软\肉色淡红;脂肪洁白\有光泽45054w 350香味较浓;肌肉结实9肉色鲜红;脂肪洁白\有光泽4875Z V
3
50
香味较淡;肌肉松软\肉色淡红;脂肪洁白\有光泽
353
5
5
表7各组火腿的理化检测
组别蛋白质/%脂肪/%食盐/%水分/%游离氨基酸每百克计/m g
I 31.5618.38.844.6410.87H 30.3819.09.14Z .4433.58皿30.0Z 15.38.546.0384.65w Z 6.4616.59.04Z .7406.0Z V
30.54
15.1
8.3
54.6
378.4Z
由表7可知9在人工条件下制成的火腿水分含量较低9经微生物接种发酵制成的火腿其游离氨基酸含量明显高于对照组9对形成火腿的风味有积极的作用9这与感官评定的结果是一致的 根据火腿发酵试验结果可知9工艺H 是人工接种发酵微生物制作火腿的最佳工艺
3小结
<1>安福火腿表层的微生物主要是霉菌和酵母菌;内层的微生物主要为酵母菌和球菌9不含霉菌 酵母菌\霉菌和球菌是火腿发酵过程中的优势菌群
和季也蒙假丝酵母
<3>按工艺H <鲜腿用6%的食盐腌制+接种一洗腿\晒腿一发酵<人工条件>一成熟>生产加工火腿9发酵时间缩短至Z ～3个月9火腿质量符合标准 参考文献!
[1]马萍9江东福.宣威火腿及其微生物作用菌群研究I [J ].云南大学学报<自然科学版>9199091Z <1>=64～70.[Z ]江东福9段若玲.宣威火腿及其微生物作用菌群研究H [J ].云南大学学报<自然科学版>9199091Z <1>=71～75.[3]江东福9张玲琪.汉逊酵母的两个新种[J ].微生物学报91994934<3>=197～183.
[4]朱俊晨.中式发酵香肠用发酵剂混合菌种的研究[J ].食品与发酵工业9Z 0019Z 7<5>=17～Z 0.
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第六章微生物发酵制药工艺 6.1 微生物发酵与制药 6.2 微生物生长与生产的关系 6.3 微生物生产菌种建立6.4 发酵培养基制备 6.4 发酵培养基制备 ? 概念（medium）供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要 的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。 ? 培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。 6.4.1 培养基的成分 碳源 氮源无机盐水生长因子 前体与促进剂 消泡剂 1、碳源(carbon sources) 概念： 构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。作用：为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物质和代谢产物的合成提供碳骨架。 碳源种类 糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜 脂肪：豆油、棉籽油和猪油醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白类：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖类、有机酸 迟效碳源：酪蛋白水解产生的脂肪酸 2、氮源（nitrogen sources） 概念：构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。 作用：为生长和代谢主要提供氮素来源。种类：无机氮源、有机氮源 有机氮源 几乎所有微生物都能利用有机氮源 黄豆饼粉、花生饼粉 棉籽饼粉、玉米浆、蛋白\胨、酵母粉、尿素 无机氮源 氨水、铵盐和硝酸盐等。氨盐比硝酸盐更快被利用。 工业应用：主要氮源或辅助氮源；调节pH值生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质。（NH4）2SO4利用后，产生硫酸 生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。硝酸钠利用后，产生氢氧化钠。 3、无机盐和微量元素 ? 概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质 ? 作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。? 种类：盐离子 磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加 铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加。 4、水 菌体细胞的主要成分。 营养传递的介质。良好导体，调节细胞生长环境温度。培养基的主要成分之一。 5、生长因子（growth factor）
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
实验六微生物的接种、分离和培养 一、目的要求 1．理解和掌握微生物接种、分离基本技术的原理及操作要领。 2．熟悉微生物接种、分离的无菌操作过程。 3．了解微生物需氧培养的方法。 4．学会观察和描述微生物的各种培养性状。 二、实验原理 1. 微生物接种 指将微生物纯种或含菌材料转移到另一营养基质上的过程。根据不同的目的可采用的不同的接种方法，如平板划线法、斜面划线法、浸洗法、涂布法、倾注法、穿刺法、点植法和影印法。 2. 微生物分离 指依据微生物的特征，采用各种方法从含菌样品中获得由单一个体（如单一菌体或孢子）或一段菌丝生长繁殖形成的微生物群体的过程。常用的分离方法有：平板划线法、稀释涂布平板分离法、稀释倾注平板分离法和单细胞分离法。 平板分离法的基本原理包括两个方面： （1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入 某 种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 （2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。 因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。 值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。 3. 微生物培养 指微生物被接种到营养基质后，在一定条件下生长繁殖的过程，分需氧培养法和厌氧培养法。本实验所做的需氧培养法，是采用生化培养箱和恒温摇床进行的。 4. 微生物的培养形状 培养性状是微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。平板菌落特征、斜面和液体培养特征、半固体穿刺培养特征等培养性状，是鉴定微生物的重要形态学依据。 菌落是由单个或少数细胞在固体培养基表面或里面生长繁殖所形成的眼可见的子细胞群体。菌落形态会因菌种不同或菌种相同但所用培养基、培养温度和时间等条件不同而存在
微生物发酵类技术 一、那他霉素 菌种，纳他链霉菌（ Streptomyces natalensis）发酵周期， 96 —120h 发酵单位， 8g/L（最高 10g/L ） 提取收率， 60% 二、DHA 菌种：裂殖壶菌（ SS 菌） 1、国内最先进的工业化技术：周期，60 小时发酵单位，7-8 g/L 葡萄糖单耗， 20Kg 葡萄糖产 1 公斤 DHA 毛油（粗油）含 DHA45% 以上发酵液到毛油收率 95% 毛油到精油收率 80-85% 2、国内一般技术：周期， 120 小时发酵单位， 15-20 g/L 葡萄糖单耗， 40Kg 葡萄糖产 1 公斤 DHA 毛油（粗油）含 DHA25-35% 发酵液到毛油收率 95% 毛油到精油收率 80-85% 新技术优点：周期短，减少染菌率；葡萄糖单耗低，成本也低； 毛油 DHA 含量 45% 以上，不担心含量低于 28%，无法提纯；干法提取，可以和 ARA 共线生产。 三、ARA 周期， 12 天 生物量， 30 g/L 油含量 35-40% 油中 ARA 含量 40-45% 收率，粗油 95%，精油 85% 四、辅酶 Q10 三级发酵，主发酵罐体积 110 立方，34℃培养，通气量 2000-2500m3/h ， 0.03Mpa ，pH6.50 ，残糖 5-10g/L ，磷 0.05-0.15g/L ，80-90 小时，放罐效价：2500-3000mg/L 。期间三次代放，代放总产量 47kg，放罐产量 225kg，单罐（ 110 立方）总产量 272kg 。 单罐体积 110 立方，发酵时间 88 小时，三次代放， 56 小时第一次代放收获15.85kg ； 68 小时第二次代放收获 18.9kg； 80 小时第三次代放收获 12.66kg；最后放罐收获227.13kg。 110 立方发酵罐单罐总产量 274.54kg 。 五、氨基葡萄糖 以葡萄糖为底物 ,经 60 小时发酵 ,可产 N-乙酰氨基葡萄糖 80g/L 。葡萄糖质 量转化率 40%，收率 70%，纯度 99%， N-乙酰氨基葡萄糖可通过酸解，得到氨基葡 萄糖。 六、卷曲霉素 发酵周期 158 小时，平均发酵单位 8.0g/L ，收率 70-75% ，成本 1500-2000 元/ kg，售价 5000-5500 元/ kg ，主要出口，国外年需求量 10 吨以上。 七、4-雄甾二烯二酮（ADD） 底物植物甾醇加入量大于 25g/l，发酵周期约 4 天，发酵单位达到 9g/L 以上；底物植物甾醇加入量大于 50g/l，发酵周期约 7天，发酵单位达到 18g/L 以上 八、9a-羟基 -AD （9 α-OH-AD） 植物甾醇为原料直接发酵，无油工艺，植物甾醇投料量≥ 100g/L ，产物 9α -OH-AD 40g/L （ HPLC ），发酵时间 120-130 小时 九、雄烯二酮（国外无油工艺 4AD ）雄烯二酮是生产激素类原料药的重要中间体，可以说几乎所有甾体激素药物都可以以雄烯二酮为起始原料进行生产，如用于
实验三微生物分离纯化技术 一、目的要求 掌握浇注平板法、平板涂抹法和平板划线法分离微生物的基本原理和具体操作 二、实验材料 1、菌种 2、培养基：牛肉膏蛋白胨培养基 3、试剂和仪器：无菌水、无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、水浴锅 2人一组，每人分别用三种方法操作三个培养皿 三、实验原理 平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 浇注平板法和涂布平板法是两种最常用的菌种分离纯化方法，它们不仅可用于分离纯化，还可用于计数等。浇注平板法是将待分离的试样用生理盐水等稀释液作梯度系列稀释后，取其中一合适稀释度的少量菌悬液加至无菌培养皿中，立即倒入融化的固体培养基，经充分混匀后，置室温下培养。最后可从其表面和内层出现的许多单菌落中选取典型代表，将其转移至斜面培养后保存，此即为初步分离的纯种。 涂布平板法是指取少量梯度稀释菌悬液，置于已凝固的无菌平板培养基表面，然后用无菌的涂布棒把菌液均匀地徒步在装个平板表面，经培养后，在平板培养基表面会形成多个独立分布的单菌落，然后挑取典型的代表移接至斜面，经培养后保存。 四、实验过程 （1）稀释平板法 A 每组取培养皿2只，即每个同学做1只。先在无菌培养皿底部贴上标签，注明分离菌名、稀释度、组别、班级。 B 另取一吸管，以无菌操作法吸取10-3或10-4稀释液0.2mL，加在无菌培养皿的一边； C 取已熔化的在水浴锅中保温45－50 ℃左右的培养基，分别倒入上述培养皿中（见图－2），轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于37 ℃恒温培养。 （2）平板涂抹法 A 每组取无菌培养皿2只（每个同学做1只）。在皿底贴上标签，注明分离菌名、稀释
病原物的分离与培养 病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤: 1.有关器皿的灭菌和消毒； 2.制作培养基； 3.病原菌的分离 4.病原菌的培养。 －、灭菌与消毒 灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。 (一) 热力灭菌 热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。 1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。 干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。 进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；
《微生物发酵及其应用》课外相关知识收集： （一）味精生产的第一步是选育出能产生谷氨酸的细菌菌种，如谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌等。这些细菌先是从自然界中分离出来的，再用诱变、基因工程等现代生物技术处理，便可得到高产的菌种。 由于谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌是细菌，其同化作用类型是异养型的，所以要大量培养这些细菌，就需根据细菌的代谢特点配制相应的培养基。培养基如何配制可参看教科书中关于配制培养基的解释。 由于生产中要采用单一菌种发酵，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以生产味精的培养基和发酵设备必须经过严格的灭菌，并进行无菌操作。 在味精生产过程中，由于发酵罐的体积很大，需要的菌种（种子）量就多。为提高发酵罐中的发酵效率，缩短生产时间，要把谷氨酸棒状杆菌或黄色短杆菌的菌种，经过培养，达到一定数量后，才能接入到发酵罐中，即要先经过扩大培养后再接种。 当谷氨酸棒状杆菌或黄色短杆菌的菌种接入发酵罐后，这些细菌就会利用罐内培养基中的营养物质大量繁殖，同时产生大量的谷氨酸。为使发酵过程处于最佳状态，现代化的味精生产企业，其发酵罐均有计算机控制系统，能对发酵过程中的各种条件严格控制，以大幅度地提高生产率。需要说明的是，谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌均是好氧菌，因此，发酵过程中要不断地通入无菌空气，以满足它们生长繁殖的需要。 在温度为30～37℃、pH为7～8的条件下，经28～32h，发酵罐内的培养液中就会生成大量的谷氨酸，随后，将谷氨酸从培养液中分离出来，用适量的Na2CO3溶液中和（形成谷氨酸钠结晶）后，再经过过滤、浓缩、离心分离等步骤，便成了味精。这便是味精生产的最后一步，即分离、提纯产物，获得产品。 （二）微生物发酵应用 1.食品业： 糖果、饼干、果冻等添加了红曲色素，以调节色泽； 果汁、饼干、面包、点心、方便面等添加了黄原胶，起悬浮、稳定、增稠、改善口感、防止粘牙、延长储存期等作用； 各类罐头，包括蔬菜、水果、蘑菇、鱼类、肉类、蛋类罐头，香肠，包装奶等添加了乳链杆菌肽，以保鲜、防腐，保存营养和改善口感等； 各种果汁、啤酒和饮料中均需使用柠檬酸或乳酸作为酸味剂调节口味、口感； 饭店、食堂和家庭制作的菜肴中常加味精或肌苷，以增加鲜味。 可以说市场上出售的各类食品均加有各种食品添加剂，其中约70%～80%的食品添加剂是用发酵法，或发酵产生的酶，加工生产的。 （三）发酵工业大致经历的时期 (1)原始发展时期 人类有意无意地利用微生物已经有几千年的历史，在长期的生产实践中，积累了丰富经验。最初可能是人类发现储存水果会自然发酵变酒，而逐渐形成酿酒技术。相传，在埃及和中亚我国利用
第一章概述 1、微生物制药是利用微生物技术，通过高度工程化的综合性技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。 传统微生物药物: 主要指微生物合成的抗生素。 现代微生物药物: 指由微生物在其生命活动过程中产生的、具有生理活性（抗微生物感染、抗肿瘤、特异性酶抑制剂、免疫调节等作用）的次级代谢产物及其衍生物。 2、微生物药品种类：包括抗生素、维生素、氨基酸、核酸、酶及酶抑制剂、免疫抑制剂、生物制品、甾体激素等药物。 3、掌握微生物制药的一般生产过程。 答：微生物制药工艺过程一般包括菌体生产及代谢产物或转化产物的发酵生产。 其主要内容包括生产菌种的选育培养及扩大，培养基的制备，设备与培养基的灭菌，无菌空气的制备，发酵工艺控制，产物的分离、提取与精制，成品的检验与包装等。 4、微生物制药的工业发酵类型：微生物菌体发酵；微生物酶发酵；微生物代谢产物发酵；微生物转化发酵。 5、了解微生物制药的特点。 答：以活的生命体(微生物)作为目标反应的实现者，反应过程中既涉及特异的化学反应的实现又涉及生命个体的生长发育及代谢，生物反应机理非常复杂，较难控制，反应液中杂质也多，不容易提取、分离； 反应通常在常温常压下进行，条件温和，能耗小，设备较简单；微生物发酵过程是微生物菌体非正常的、不经济代谢过程，生产过程中应为其代谢活动提供良好的环境。因此，需防止杂菌污染，要进行严格冲洗、灭菌，空气需要过滤等；微生物药物生产周期长，生产稳定性差，技术复杂，不确定因素多，废物排放及治理要求高，难度大；现代微生物制药的最大特点是高技术含量、智力密集、全封闭自动化、全过程质量控制、大规模反应器生产和新型分离技术综合利用等。 第二章抗生素概论 1、半合成抗生素：将天然代谢产物再用化学、生物或生化方法进行分子结构改造，制成的各种衍生物。氨苄西林 2、次级代谢：微生物在一定的生长时期(一般是稳定生长期），以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动没有明确功能的物质的过程 次级代谢产物:微生物在细胞分化过程中产生的，往往不是细胞生长所必需的代谢产物，对细胞生长并不具有明显的作用，而且通常由一簇结构相似的化合物组成。 3、抗生素的主要产生菌是：产抗生素的微生物中，以放线菌为最多，其次是真菌和细菌。除微生物外，还有来源于植物、动物和海洋微生物的抗生素。 4、医疗用抗生素应具备的条件：难使病源菌产生耐药性；较大的差异毒力；最小抑菌浓度要低；抗菌谱要广。 5、抗生素剂量的表示法 答：合理使用抗生素的剂量十分重要。 抗生素在应用时剂量很小，因此除质量外，更常用特定的效价单位（简称单位）表示。单位是衡量抗生素有效成分的一种尺度。 目前国际上抗生素活性单位表示方法主要有两种：一是指定单位(unit)；二是活性质量（μg)。 6、管碟法测定抗生素效价的原理：在培养过程中，小管中的抗生素向培养基中呈球面扩散，与此同时试验菌也开始生长。抗生素浓度高于最小抑菌浓度之处，试验菌不能生长，出现抑菌圈，其圈之边缘处就是最低抑菌浓度。 7、抗生素生产工艺过程：菌种→孢子制备→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取精制→产品检
微生物菌种的分离和纯 化方法 https://www.doczj.com/doc/d69252409.html,work Information Technology Company.2020YEAR
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。 1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法
发酵技术指标 沃蒙特发酵技术服务平台 NO 项目英文技术名称名称指标 1他克莫司Tacrolimus 发酵单位：大于 1.0g/L, 发酵周期： 240 小时 , 提取收 率： 60-70% 2西罗莫司Sirolimus\Rapamyci 发酵单位： 1000±200 mg/L，发酵周期： 192hrs ，收率：35- 40% n产品含量：≥ 98% 3乳酸链球菌素Nisin 发酵水平 : 12-15g /L ，发酵时间：16-20小时，收率 :65% 以上。 4霉酚酸mycophenolate 发酵单位： 12g/L 以上，发酵时 间：160 小时，提取得率：mofetil, MMF 75% 5去甲金霉素DMCT,Demethylchlor 发酵单位： 10± 2g/L ，发酵时间： 200 小时，产品收率： 75％ tetracycline 6雄烯二酮Androstenedione 发酵时间 96 ± 24 hrs ，每 3- 3.3 公斤植物甾醇可获 得 1 公斤雄烯二酮。 7利福霉素Rifamycin 发酵周期 220 小时，发酵单位大于 20g/L ，收率 65% 86- 羟基烟酸6-Hydroxynicotinic 纯度：≥ 98%，用途说明：用于合成维 生素 A Acid 9L- 缬氨酸Valine 发酵产酸： 60±5 克 /L ，发酵周 期： 60 ± 5 小时，提取 收 率： 65%（医药级） 10 L- 异亮氨酸Isoleucine 发酵产酸： 25-30 克 / 升，发酵周期 : 60-72 小时， 提取收 率： 80% 发酵单位 :35 ± 3g/L ，发酵时间 :33-35 小时，产品 得率 : 饲 11 L- 色氨酸Tryptophan 料级≥ 85%，药品级 ≥ 70%，产品质量 :>98.0%( 纯度 ) ， 糖转化率： 18% 12 糖化酶Glucoamylase 发酵周期： 6～7 天，酶 活： 8 万- 10 万 U 13 耐高温淀粉酶Amylase 发酵周期： 140h，酶活： 17 万单位 14 纤维素酶Cellulase 发酵周期： 6～7 天，酶活： 80-100IU 15 超级泰乐菌素Super tylosin 发酵单位： 14000- 16000U/ml 发酵时间： 130-150 小时提 取 收率： 70-75%
微生物制药的一般工艺流程 微生物制药技术 工业微生物技术是可持续发展的一个重要支撑，是解决资源危机、生态环境危机和改造传统产业的根本技术依托。工业微生物的发展使现代生物技术渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域，并扮演着重要角色。欧美日等国已不同程度地制定了今后几十年内用生物过程取代化学过程的战略计划，可以看出工业微生物技术在未来社会发展过程中重要地位。 微生物制药技术是工业微生物技术的最主要组成部分。微生物药物的利用是从人们熟知的抗生素开始的，抗生素一般定义为：是一种在低浓度下有选择地抑制或影响其他生物机能的微生物产物及其衍生物。(有人曾建议将动植物来源的具有同样生理活性的这类物质如鱼素、蒜素、黄连素等也归于抗生素的范畴，但多数学者认为传统概念的抗生素仍应只限于微生物的次级代谢产物。)近年来，由于基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，报道的微生物产生的除了抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质日益增多，如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活动的范围。但这些物质均为微生物次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序及生产工艺等方面和抗生素都有共同的特
点，但把它们通称为抗生素显然是不恰当的，于是不少学者就把微生物产生的这些具有生理活性（或称药理活性）的次级代谢产物统称为微生物药物。微生物药物的生产技术就是微生物制药技术。可以认为包括五个方面的内容： 第一方面菌种的获得 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 分离思路新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。具体分离操作从以下几个方面展开。 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。
微生物的分离与培养知识小结与专题训练 一、微生物的培养和分离技术 1.微生物生长需要的营养物质一般都含有水、碳源、氮源、无机盐 牛肉膏又称牛肉浸膏，是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。 蛋白胨，是有机化合物。蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。在胃内蛋白质的初步消化产物之一就是蛋白胨。蛋白胨富含有机氮化合物，也含有一些维生素和糖类。能为微生物提供C源、N源、生长因子等营养物质。 对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机化合物既是碳源，又是氮源、能源。 2.培养基的制作合格与否通过未接种的培养基表面是否有菌落生长来验证 3.常用的无菌技术有 ⑴对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 ⑵将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。 ⑶为避免周围环境中的微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 ⑷实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 考点细化： ①灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。消毒是指用较为温和的理化方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物，不包括芽孢、孢子。 ②灭菌的方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌，灼烧灭菌用于接种用的金属工具；干热灭菌用于能耐高温的，需要保持干燥的玻璃器皿等；高压蒸汽灭菌用于培养基等 ③消毒的方法有煮沸消毒法，用于液体消毒；巴氏消毒法，用于不耐高温的液体；化学药剂（如用体积分数70%-75%的酒精）或紫外线消毒，用于物体表面的消毒。 4.微生物的纯培养指的是防止外来杂菌入侵。 5.配制固体培养基的步骤：计算、称量、溶化、（调节pH、分装、包扎）灭菌、倒平板 6.微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。 平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是纯化的菌落。 ★平板划线法中的注意事项 ①操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：
微生物发酵中药的相关调查 中药发酵制药技术是在继承中药炮制学发酵法的基础上,吸取了微生态学研究成果,结合现代生物工程的发酵技术而形成的高科技中药制药新技术,是从中药(天然 药物) 制药方面寻找药物的新疗效。传统的中药发酵多是在天然的条件下进行的, 而现在的中药发酵制药技术是在充分吸收了近代微生态学、生物工程学的研究成果 而逐渐形成的。其先进发酵工艺特点是:以优选的有益菌群中的一种或几种、一株 或几株益生菌作为菌种,加入中药提取液中,再按照现代发酵工艺制成产品,它是一 种含有中药活性成分、菌体及其代谢产物的全组分发酵液的新型中药发酵加工制剂。 一、微生物发酵中药的应用历史 早在千余年前,我国已开始用发酵方法制药,直到现在临床仍在应用的发酵(制品) 中药有六神曲、半夏曲、淡豆豉、豆黄等,其工艺均为固体发酵。 1、微生物发酵中药中所应用到的很多微生物是药用真菌或者含有真菌的混合菌群，其中药用真菌很多本身作为中药来应用。因此一定意义上讲，中药与微生物，特别 是与一些药用真菌具有密切的联系。 早在东汉年间《神龙本草经》中，就有灵芝、茯苓、猪苓、雷丸等药用真菌分 别列项论述，这些药物至今沿用不衰。 2、微生物发酵中药应用历史悠久，也是传统中药加工炮制的重要方法之一，一般 主要是起到中药复合炮制的作用。而且很多发酵之后的药物在临床应用上取得了较 好效果。 微生物发酵中药在中医药应用中得到了很大的体现。如片仔癀的主要成分是三 七的微生物发酵物；神曲由面粉、赤小豆、苦杏仁、鲜青蒿、鲜苍耳、鲜辣蓼按一 定比例混匀后经发酵而成的曲剂。 3、某些传统的微生物制剂一直使用至今，其中以不同中药作为辅料，采用微生物 处理后自身成为发酵物组成的一部分，如半夏炮制，神曲制备等。同时随着历史的 发展，微生物发酵中药的应用也在不断变化。 半夏在整个炮制过程中使用到了一些中药，最终形成具有一定功效的以半夏为 主要组成部分的中药炮制品。半夏至汉代始用汤洗去毒，即为炮制品。南北朝时增 加生姜制、热汤洗、白芥子末制、头醋制等炮制品。唐代增加姜汁制，宋代增加麸炒、热洒炒、酸浆浸、米醋炒浸、生姜甘草桑白皮制、猪苓制、白矾制、萝卜制、 姜矾牙皂制和半夏曲。金之时期，增加米泔浸、香油炒、菜油拌炒。明代增加盐水洗、面炒醋制、杏仁炒。清代增加巴豆制、活生姜制、猪胆汁炒、皂荚白矾姜汁竹 沥制，有仙半夏和法半夏。由此可见，半夏的炮制方法繁多，而且种类各异，如仙 半夏、半夏曲等，已经成为含半夏的一个复方 二、微生物发酵中药的研究现状 中药发酵研究开始于80 年代,但仅是对真菌类自身发酵的研究,如灵芝菌丝体、冬虫夏草菌丝体、槐耳发酵等,大都是单一发酵。虽有报道加入中药,但也仅是将中 药当做菌丝体发酵的菌质,同时研究发现,含有中药的菌质对原发酵物的功效有影响,只是未见深入研究。目前,已有学者呼吁中药发酵制药可按新药审批办法规定开发新药。同时也开展了另一项研究,即生物转化,我们认为它与中药发酵是密不可分的 1、利用中药为培养基的组成部分，构建药性菌质，比较发酵前后中药相关成分的
微生物培养与分离方法 大多数细菌均可以通过人工方法培养，而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡胚、特殊细胞株及动物接种。只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用。 一、接种与分离方法 根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。 1．平板划线分离培养法 对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。临床送检的标本如痰、咽试子、泌尿生殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需要借助琼脂平板划线分离目的菌。平板划线分离法通常有两种方法： （1）分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便或混合细菌的分离。先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的1/4）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。 （2）连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。 琼脂斜面接种法 主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。 3．穿刺接种法 此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。 4．液体培养基接种法 用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。 5．倾注平板法 本法主要用于饮水、饮料、牛乳和尿液等标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标本1ml至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45~50℃左右的琼脂培养基15~20ml倾注入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37℃培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升标本中所含菌数。先数6个方格（每格为1cm2）中菌落数，求出每格的平均菌落数，并算出平皿直径，然后按下列公式计数，求出每毫升标本中的细菌数。 全平板菌落数=每方格的平均菌落数×лr2 每ml标本中的细菌数=全平板菌落数×稀释倍数 6．涂布接种法 本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表面，
一、实验目的：掌握无菌技术的操作，尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤 （1）制备培养基（马铃薯琼脂培养基）：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（已完成） （
三.巩固检测 1．获得纯净培养物的关键是( ) A．在无菌环境中培养B．接种纯种细菌 C．接种环灼烧灭菌D．防止外来杂菌的污染 2．巴氏消毒法常用于酒、奶等食品的消毒，该消毒法就是加热到70～75 ℃、保持30 min，或加热到80 ℃、保持15 min，能杀死一般杂菌和病原菌。这与灭菌的要求相比，巴氏消毒法( ) A．不能杀灭芽孢和孢子B．只能杀灭芽孢等休眠状态的细菌 C．能杀灭各种细菌，包括芽孢D．能杀灭各种真菌，包括孢子 3．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部分的微生物（） A．接种环、手、培养基 B. 高压锅、手、接种针 C. 培养基、手、接种环 D. 接种环、手、高压锅 4.下列操作与消毒或灭菌无关的是（） A. 接种前用酒精灯火焰灼烧接种环 B. 接种前用酒精擦试双手 C. 接种在酒精灯水焰旁完成 D. 培养基在冷却到50℃ 时倒平板 5．制备固体培养基的步骤是( ) A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌 B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌 C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板 D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板 6.平板冷却凝固后要将平板倒置，其意义是（） A. 防止菌种死亡B．利于培养基的冷却 C．利于大肠杆菌的接种D．防止皿盖上的冷却水倒流入培养基 7．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入恒温箱培养的目的是（）A．为了检测温度是否最适宜B．检查培养基是否灭菌彻底 C．为了下次接种时再使用D．没必要放入未接种的培养基 8. 下列关于平板划线操作的叙述正确的是（） A．使用已灭菌的接种针、培养皿，在操作过程中不再灭菌 B．打开含菌种的试管，需通过火焰灭菌，取出菌种后，需马上塞上棉塞10. 稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是（） A．操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释 B．需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面 C．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落 D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理 11. 下列关于平板划线法和稀释涂布平板法纯化大肠杆菌的叙述，正确的是（） ①可以获得单个的菌落②都需要使用接种环进行接种 ③都需要在火焰旁进行接种④都可以用来计数活菌． A．①② B. ③④ C.①③ D. ②④ 12. 下列有关实验室中微生物培养和分离的叙述，错误的是（） A. 获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵 B. 高温灭菌的目的是杀死所有微生物 C. 划线分离可在培养基上获得均匀分布的单菌落 D. 稀释涂布平板法可用于计数活菌数目 13. 平板划线法：通过在琼脂固体培养基表面的操作，将聚集的菌种逐步 到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是。 14. 稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的，然后将不同稀释度的菌液分别 在琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成。 15．大肠杆菌是生存在人体肠道中的正常菌群，每克粪便中含有109 个，且能够与致病菌混杂生长。如果食品和饮用水中出现大肠杆菌，就意味着食物可能被粪便污染而带上致病菌，因而常将大肠杆菌的数量作为食品卫生的检测指标之一。请据此回答下列问题： （1）测定街边出售的奶茶中大肠杆菌的数目，常用稀释涂布平板法进行测定。 该方法首先配置LB 培养基，进行高压蒸汽灭菌后冷却至60℃，在 旁倒在培养皿中形成平板；对奶茶样品进行一定倍数的稀释，取0.1mL 奶茶稀释液，加在培养皿的固体培养基上，用涂布在培养基平面上，然后进行培养；观察统计培养皿中的数目；该数据比实际数值要(高、低)，原因是 C．将培养皿盖全部打开后，用沾有菌液的接种环进行划线接种 D. 接种时，接种环在培养基上迅速划线后盖上皿盖 9. 在农业生产研究上，常需要进行微生物的培养和计数，下图是利用平板划线法进行微生物接种过程中的部分操作，有关叙述不正确的是（） A．每次划线前都需要灼烧接种环 B．接种环冷却后从上一区划线的末端开始划线 C．最后一区和第一区要保证不重叠 D．只有在图中的5 区域才可以得到所需菌落 。实验完成后需要对培养基进行处理，然后才能倒掉。（2）若要对上述培养基中的菌种进行扩大培养，则需配置LB 培养基，灭菌后，将在酒精灯火焰上烧红后冷却，然后蘸取单菌落中的菌体接种到新的培养基中，在适宜环境中培养。
微生物发酵蛋白饲料 项目概述 （一）微生物发酵蛋白产品： 发酵蛋白饲料是以微生物、复合酶为生物饲料发酵剂菌种，将饲料原料转化为微生物菌体蛋白、生物活性小肽类氨基酸、微生物活性益生菌和复合酶制剂为一体的生物发酵蛋白饲料。 （二）微生物发酵蛋白产品生产背景： 生物技术特别是微生物发酵技术来开发新型蛋白饲料资源，具有广泛的应用前景。利用微生物生产的饲料蛋白、酶制剂、氨基酸、维生素、抗生素和益生菌等相关产品，可以弥补常规饲料中容易缺乏的氨基酸等物质，而且能使其他粗饲料原料营养成分迅速转化，达到增强消化吸收利用效果。 饲料和粮食生产一直是我国国民经济的薄弱环节。由于受人口增长、耕地减少和肉食品消费增加的影响，我国粮食供需平衡十分脆弱。我国人均占有粮食一直在400k以下其中粮食总产量的40%左右用于饲料生产。在耕地和水资源长期紧缺的情况下，我国粮食产量已很难提高。饲料资源短缺的问题长期制约着我国农牧业的发展，尤其是蛋白质饲料的严重不足已经成为全球性问题。发展高效饲料工业，提高粮食向畜牧产品的转化效率和饲料利用率、开发新型蛋白饲料是满足人民对肉、禽、鱼、蛋越来越大的需求量的最佳途径。 （三）微生物发酵的分类： 微生物发酵根据获得产品的不同可分为微生物酶发酵、微生物菌体发酵、微生物代谢产物发酵、微生物的转化发酵、生物工程细胞的发酵。根据微生物
的种类不同可分为厌氧发酵和好氧发酵，厌氧发酵在发酵时不需要供给空气，如利用乳酸杆菌进行的丙酮、丁醇发酵等；好氧发酵需要在发酵过程中不断的通入一定量的空气，如利用黑曲霉进的柠檬酸发酵，利用棒状杆菌进行的谷氨酸发酵利用黄单胞菌进行的多糖发酵等。根据培养基的同可分为固体发酵和液体发酵，根据设备不同可分为敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵和深层发酵。 （四）微生物发酵的优越性 4.1发酵脱毒 多数情况下微生物的代谢产物可以降低饲料毒素含量，甘露聚糖可以有效地降解黄曲霉B 1 等。有研究表明，曲霉属，串珠霉属等 5个菌株能效的降低发酵棉籽粕中游离棉酚的含量。 4.2改变蛋白质的品质 微生物可以分解品质较差的植物性或动物性蛋白质，合成品质较好的微生物蛋白质，例如活性肽、寡肽等。微生物能把15%以上的糖、半纤维粗纤维3%及以上的粗脂肪转化为30%以上的粗蛋白、赖氨酸和蛋氨酸，有利于畜禽的消化吸收。 4.3 产生促生长因子 不同的菌种发酵饲料后所产生的促生长因子量不同，这些促生长因子主要有有机酸族维B素和未知生长因子等。 4.4降低粗纤维 一般发酵水平可使发酵基料的粗纤维含量降低12%～16%，增加适口性和消化率等研究。Carlson报道，发酵后饲料中的植酸磷或无机磷酸盐被降解或析出，变成了易被动物吸收的游离磷。
微生物的接种、分离纯化与培养方法 一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３） 图３－３接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。 ７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。 ８）活体接种活体接种是专门用于培养病毒或其它病原微生物的一种方法，因为病毒必须接种于活的生物体内才能生长繁殖。所用的活体可以是整个动物；也可以是某个离体活组织，例如猴肾等；也可以是发育的鸡胚。接种的方式是注射，也可以是拌料喂养。 ２、无菌操作 培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具（如接种针和吸管等）在无菌条件下接种含菌材料