（实验题目）
开题报告
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导师姓名：
开题时间：
论文
题目中文垂吊矮牵牛再生体系的建立
英文The establishment of petunia's regeneration system
论文工作计划简述（开题报告内容）
1、本论文课题国内外概况和文献综述：
矮牵牛, 又名碧冬茄、灵芝牡丹, 属茄科矮牵牛属的多年生草本植物. 矮牵牛花大而色彩丰富, 是装饰花坛、街道的理想花卉, 广泛地应用于城市及园林绿化, 是世界上最普及,销售量最大的花卉之一[1 ] .
近年来矮牵牛在组织培养方面的研究发展很快,现将国内外研究概况分述如下。
1.外植体的选择
根据植物细胞全能性，理论上任何活组织在适宜的条件下都能发育成完整的植株。但是，在不同生长状况下、发育阶段、生长环境和不同部位的外植体存在一定的生理生化差异，因此选择不同的外植体课影响组织培养的形态发生。
分别以叶片、茎尖、茎段、种子、花蕾、花药等作外植体获得再生植株[3-8 ] , 但从分化结果来看, 茎尖作外植体最好, 幼芽分化所需时间短，分化出来的幼芽健壮；其次为茎段，叶片不但产生愈伤组织少，而且产生幼苗所需时间长。在茎尖和茎段试验中，前者无论在生长势或分化率方面都优于后者.由于茎尖数量有限，而叶片培养时间长，因此以茎段（包括茎尖）作为外植体是矮牵牛组培的最佳选择。
2.培养基和培养条件的选择
在基本培养基的选择上，主要用MS和1/ 2MS , 其中MS 主要用来培养愈伤组织及继代增殖, 1/ 2MS 主要用于生根培养.也有用N H 培养基[ 6 ] 和1/ 4MS 培养基[ 9 ] 对矮牵牛进行组培的. 针对不同的要求，可以改变基本培养基中的营养成分及其含量。
目前为止, 大部分组织培养研究者都用6-BA 作为主要激素[4 ,6 ,10-11 ] , 至于使用量, 不同的品种、不同的材料和不同的研究者得到了不同的结论.大部分研究者用BA或6-BA或NAA 组合来诱导愈伤组织的产生，而且取得了良好的效果。一般BA在1.0-3.2mg/L之间，NAA 在0.1-0.2mg/L之间都能获得大量的愈伤组织，最常用的是BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。也有用6-BA与IBA组合取得较好效果的。
培养条件的选择上，目前普遍使用的条件为：PH值5.8，光照10-12h，温度20-28度，光照强度1000-2000lx。
3.组培苗移栽技术
组培苗移栽一般经过三个步骤：首先，当根长至1cm以上，苗高约4-5cm时在自然条件下打开瓶口开始炼苗，炼苗时间约2-3d或7-8d，然后把苗取出，用温水洗干净根部粘附的培养基，移栽至消过毒的无水基质中，适当遮阴并控制环境温度：10-20d后即可移栽大田或上盆。
虽然矮牵牛组织培养已经初步建立了快繁体系, 为市场幼苗的需求做出了一定贡献, 尚有许
多问题值得继续研究. 如取材污染率高, 组织培养适应期长, 工厂化
生产成本高等问题制约了矮牵牛组培苗工业化生产。
2、本论文课题的理论和实际应用意义：
基础理论：1）植物细胞全能性
2）细胞分化、脱分化与再分化
3）器官发生和胚状体发生
实际意义：垂吊矮牵牛大面积栽培具有地被效果，景观瑰丽、悦目，具有很好的市场价值。植物组织培养以其繁殖系数大、繁殖周期短、有利保持亲本性状、成本较低、可周年进行生产等优点, 为在较短时间内大量生产花卉植物, 满足市场需求提供了可能. 应用组织培养技术对矮牵牛进行快速无性繁殖, 不仅可以保持其优良性状, 使花色纯化, 在短期内生产出大量整齐、均匀的健壮种苗, 还可以进行周年生产, 满足市场需求.
3、论文的基本内容、结构框架以及要突破的难点：
一、仪器及用品：试剂瓶、电子天平、烧杯、量筒、移液管、玻璃棒、容量瓶、培养皿、PH 计、记号笔、高压灭菌锅、超净台
二、配置培养基
（1）MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L
（2）MS+6-BA1mg/L+NAA0.1mg/L
（3）MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L
（4）壮苗培养基：MS
（5）生根培养基：MS+IBA0.5mg/L
上述培养基均为100ML固体培养基，2.5%蔗糖，0.85%琼脂，PH5.8
三、材料与方法
1.取材、消毒与接种
取垂吊矮牵牛的幼嫩叶片及带顶芽的茎段，用自来水冲洗干净，再用无菌水冲洗
2-3遍，在超净工作台上用75%酒精浸泡30S，再用10%次氯酸钠溶液浸泡9min，
用无菌水冲洗3次，用消毒滤纸吸干表面水分，将幼嫩叶片切成0.5*0.5左右大小，
与带顶芽的茎段一起分别接种于（1）-（3）号培养基中培养，光照10-12h，温度20-28度，光照强度1400-1600lx
2.快速繁殖
将已分化出芽的愈伤组织分割切小，转接入（1）号培养基中，可以获得大量的丛
生芽。
3.生根与移栽
将带有大量丛生芽的愈伤组织转入不含激素的MS培养基中，丛生芽不再增
殖，而是起到壮苗的作用，以利生根。当试管苗长到2cm左右时，切下转入生根
培养基中。将生根的苗打开封口膜在室内炼苗1-2天，小心取出苗，转泥炭土栽培。
注意事项及难点：1）灭菌条件的度量,矮牵牛包被短毛，灭菌困难，易污染。
2）培养条件的控制。
3）干扰因素的排除。
4、论文计划及进度：
实验第一周，配置愈伤组织诱导所需的（1）-（3）三个梯度培养基。
实验第二周，进行接种。
实验第三周，将愈伤组织转接（1）号培养基，获取丛生芽。并配置4号MS培养基。
实验第四周，将带有大量丛生芽的愈伤组织转接入4号培养基，进行壮苗培养。
实验第五周，将试管苗转入生根培养基，进行生根培养。
实验第六周，进行炼苗以及移栽。
实验期间定期观察培养基凝固情况、是否长菌、愈伤组织生长情况，及时处理褐化、玻璃化等外植体。并做好观察记录，需记录的信息如下表
日期培养箱条件观察结果处理事项备注
5、主要参考文献：
[ 1 ] 瞿素萍. 矮牵牛的组织培养研究. 西南农业大学学报, 2001 , 23 (05) : 4472448
[ 3 ] 王贤荣. 早樱种系的分类及其观赏价值.南京林业大学学报: 自然科学版, 2000 , 24 (06) : 44246
[ 4 ] 谢利锁. 野生早樱嫩枝扦插繁殖技术研究. 林业科技开发, 2002 , 16 (02) : 20222
[ 5 ] 李继华. 扦插的原理和应用. 上海: 上海科学技术出版社, 1987 : 31233
[ 6 ] 王振师, 周丽华, 曾雷. 绯寒樱的扦插繁殖. 中南林学院学, 2005 , 25 (03) : 82284
[ 7 ] 孟新法, 周维燕. 吲哚丁酸酸对苹果矮化砧离体快繁生根的影响. 北京农业大学学报, 1982 , (02) : 25227
[ 8 ] Dumano GH , Aygun AA , Gunes NT , et al. Effect of timing , IBA and Put rescine on rooting and shooting in Pyrus
elaeagri folia pall sof twood cuttings . Hort Sic , 1999 , 69 (11) : 1237
[ 9 ] 林伯年, 内昭作(日) , 沈德绪. 园艺植物繁育学[M] . 上海: 上海科学技术出版社, 1994 : 177
[10 ] Sagee O. Involvement of rooting factors and f ree IAA in the root ability of cit rus species
stem cuttings . Hort Sci ,
1992 , 51 (34) : 1872195
[11 ] 高新一, 王玉英. 植物无性繁殖实用技术. 北京: 金盾出版社, 2003 : 74286
开题报告概况（包括单位、地点、出席人数及对论文工作计划提出的意见和建议）：指导教师意见：
签名：年月日
指导组召集人意见：
签名：年月日
植物组织培养实验报告
一实验目的
让植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。
二实验原理
植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸（IAA ）和6 –苄基氨基腺嘌呤（6 –BA ）的比例，决定了根和芽的分化。
三实验器材
（一）试剂
乙醇、IAA 或2 ， 4 –D 、HgCl 2 （或次氯酸钠）、6- 苄基氨基腺嘌呤（6-BA ）
MS 培养基
（二）仪器设备
培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（100mL ），烧杯，量筒，培养皿，超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，橡皮筋等
三实验步骤
1. 配制培养基
（1 ）愈伤组织诱导培养基：MS 培养基（蔗糖含量为10 g/L ，2,4 –D 含量为2 mg/L ，琼脂10 g/L ）。
（2 ）试验培养基：在MS 培养基中按表33 –1 加入IAA 和6–BA 。
吲哚乙酸先用少量0.1 mol/L NaOH 溶解，6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量0.1 mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。
2. 培养基灭菌
将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至pH 5.8 ，趁热分装于100 mL 三角烧瓶中，每瓶约20 mL 。待培养基冷却凝固后，用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121 ℃（1 kg/cm 2 ）下灭菌20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。
3. 诱导产生愈伤组织
（1 ）取健壮的玫瑰、菊花茎数段，每段约5 cm 长，于烧杯中用0.1% 氯化汞（升汞）浸泡20 min ，取出用无菌水洗3 ～4 次，置于无菌培养皿中，在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌30 min ），用解剖刀切成5 mm 厚的圆片（弃去开始一片和最后一片），用长镊子将它接种在诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶接种4 片，接种后扎好瓶口。
（2 ）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在25 ℃温室中，每星期检查l ～
2 次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶，
3 ～
4 周后产生愈伤组织。
（3 ）选取愈伤组织生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移），每瓶放1 ～2 块，仍培养在25 ℃温室中，每周1 ～2 次观察不同处理的三角烧瓶中，愈伤组织分化情况，直至长出根和芽。长成的幼小植株即为“试管苗”，可移栽于花盆中。
四实验结果
因为时间有限及实验严密性等问题，大部分都失败了，但是仍然有小部分分化发育了出来。已经证明了植物组织能够经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。
植物组织培养实验报告
一实验目的
让植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。
二实验原理
植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸（IAA ）和6 –苄基氨基腺嘌呤（6 –BA ）的比例，决定了根和芽的分化。
三实验器材
（一）试剂
乙醇、IAA 或2 ， 4 –D 、HgCl 2 （或次氯酸钠）、6- 苄基氨基腺嘌呤（6-BA ）
MS 培养基
（二）仪器设备
培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（100mL ），烧杯，量筒，培养皿，超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，橡皮筋等
三实验步骤
1. 配制培养基
（1 ）愈伤组织诱导培养基：MS 培养基（蔗糖含量为10 g/L ，2,4 –D 含量为2 mg/L ，琼脂10 g/L ）。
（2 ）试验培养基：在MS 培养基中按表33 –1 加入IAA 和6–BA 。
吲哚乙酸先用少量0.1 mol/L NaOH 溶解，6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量0.1 mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。
2. 培养基灭菌
将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至pH 5.8 ，趁热分装于100 mL 三角烧瓶中，每瓶约20 mL 。待培养基冷却凝固后，用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121 ℃（1 kg/cm 2 ）下灭菌20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（如长镊子、解剖刀、剪刀等）及灭菌水，需同时灭菌。
3. 诱导产生愈伤组织
（1 ）取健壮的玫瑰、菊花茎数段，每段约5 cm 长，于烧杯中用0.1% 氯化汞（升汞）浸泡20 min ，取出用无菌水洗3 ～4 次，置于无菌培养皿中，在接种箱中按无菌操作要求剥去外皮（接种箱事先用紫外灯灭菌30 min ），用解剖刀切成5 mm 厚的圆片（弃去开始一片和最后一片），用长镊子将它接种在诱导培养基上，注意圆片的切口朝向培养基，每瓶接种4 片，接种后扎好瓶口。
（2 ）将已接入植物组织（外植体）的三角烧瓶，培养在25 ℃温室中，每星期检查l ～
2 次，剔除材料已被杂菌污染的三角烧瓶，
3 ～
4 周后产生愈伤组织。
（3 ）选取愈伤组织生长良好的三角烧瓶，用解剖刀将愈伤组织切下，转移到含有不同激素的试验培养基中（也可以连同原来的外植体一起转移），每瓶放1 ～2 块，仍培养在25 ℃温室中，每周1 ～2 次观察不同处理的三角烧瓶中，愈伤组织分化情况，直至长出根和芽。长成的幼小植株即为“试管苗”，可移栽于花盆中。
四实验结果
因为时间有限及实验严密性等问题，大部分都失败了，但是仍然有小部分分化发育了出来。已经证明了植物组织能够经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。
植物组织培养实验及实习指导
杨玲编
西南林学院生物技术教研室
目录
实验一、母液的配制和保存 (2)
实验二、培养基的配制与灭菌 (5)
实验三、外植体消毒与初代培养的建立 (7)
实验四、继代与增殖培养 (9)
实验五、生根培养 (11)
实验六、植物茎尖脱毒培养 (13)
实习试管苗的炼苗与移栽 (15)
实验一、母液的配制和保存
一、实验目的
通过配制MS培养基母液，掌握贮备液的配制和保存方法。
二、原理
配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存。使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。
以MS培养基为例，所需配制的母液为：大量元素母液（母液Ⅰ，浓缩20倍）、微量元素母液（母液Ⅱ，浓缩200倍）、铁盐母液（母液Ⅲ，浓缩200倍）和有机化合物母液（母液Ⅳ，浓缩200倍）等。
三、实验材料、试剂和仪器设备
1．试剂
NH4NO3, KNO3, CaCl2?2H2O, MgSO4?7H2O, KH2PO4, KI, H2BO3，MnSO4?4H2O, ZnSO4?7H2O, Na2?MoO4?2H2O, CuSO4?5H2O, CoCl2?6H2O, Na2?EDTA?2H2O，FeSO4?7H2O，烟酸，甘氨酸, 盐酸硫胺素, 肌醇, 盐酸吡哆醇, 蒸馏水
2．仪器设备
冰箱，天平，酸度计或pH试纸，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，容量瓶(1000ml，500ml，100ml)，磨口试剂瓶(500ml，1000ml)，药勺、称量纸、酸度计或pH试纸，滴管、玻璃棒，电炉，微波炉
四、实验方法
1.大量元素母液的配制
配制时先用量筒量取蒸馏水大约800ml，放入1000ml的烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,MgSO4.7H2O ,CaCl2.2H2O，待第一种化合物溶解后再加入第二种化合物，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液倒入1000ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至1000ml，然后，倒入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
2.微量元素母液的配制
按照配方表中用量用电子天平分别依次称取MnSO4 ?4H2O，ZnSO4?7H2O ，H2BO3 ，KI ，NaMoO4?2H2O，CuSO4?5H2O，CoCl2?6H2O，按制备母液Ⅰ的方法逐个溶解。（钼酸钠难溶解，可在室温下用蒸馏水溶解后再加入到微量元素母液中。）定容至1000ml，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
3.铁盐母液配制
把FeSO4?7H2O和Na2?EDTA?2H2O分别置于450ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解。保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2?EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后把pH值调到5.5，加蒸馏水到最终容积1000ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4℃冰箱中保存备用。
4.有机化合物母液的配制
按配方表中用量依次称取：维生素B1，烟酸，甘氨酸，维生素B6，用蒸馏水依次溶解并定容后，装入1000ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
5.植物生长物质母液的配制
NAA母液：准确称量10mg，先用少量1mol/LNaOH溶液完全溶解后，加蒸馏水定容至100ml，即配制成浓度为0.1mg/ml的NAA母液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、浓度、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。
6-BA母液的配制方法相似，母液浓度为2mg/ml。请注意细胞分裂素的溶解方法。
五、实验报告
按照实验报告格式要求及各组在实验中的配制溶液情况，完成报告撰写。
附：MS培养基母液配方
成分数量(mg/L) 成分数量(mg/L)
母液Ⅰ母液Ⅱ
NH4NO3 33000 MnSO4 ?4H2O4460
KNO3 38000 ZnSO4?7H2O1720
KH2PO4 3400 H2BO3 1240
MgSO4?7H2O 7400 KI 166
CaCL2 ? 2H2O 8800 Na?MoO4?2H2O50
母液ⅣCuSO4?5H2O 5
肌醇20000 CoCl2?6H2O 5
烟酸100
维生素B1 100 母液Ⅲ
甘氨酸400 FeSO4?7H2O 5560
维生素B6 100 Na2?EDTA?2H2O 7460
实验二、培养基的配制与灭菌
一、实验目的
学习用母液法配制培养基以及掌握培养基灭菌的方法。
二、原理
组织培养所用的培养基含有植物细胞生长所必需的各类营养物质，同时也是微生物繁殖的极好场所，因此必需对培养基进行灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。
三、实验材料、试剂和仪器设备
1．试剂
琼脂，蔗糖，蒸馏水，NAA，6-BA，1mol/LHCl，1mol/LNaOH
2．仪器设备
天平，烧杯（50ml，100ml，500ml，1000ml），量筒(1000ml，100ml，25ml)，移液管（10ml，5ml，2ml，1ml，0.5ml），药勺，称量纸，玻璃棒，吸耳球，滴瓶，酸度计或pH试纸，培养瓶，封口膜，耐热橡皮筋，线绳，高压灭菌锅，微波炉，电炉，标签纸，记号笔
四、实验步骤
1.培养基的配制
培养基组成：MS+6-BA2mg/L+NAA0.1mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂(pH5.8)
①将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。
本实验需配制的培养基所需吸取的各种母液的用量如表1所示：
母液名称母液浓度扩大倍数500ml培养基吸取量
大量元素20
微量元素200
有机成分200
铁盐200
NAA 0.1mg/ml
6-BA 2mg/ml
②取50ml烧杯一个，用量筒量取大量元素母液，然后用各母液专用移液管分别吸取微量元素母液，有机母液、铁盐母液和生长物质母液，置于烧杯中备用。
③取500ml烧杯一个，加入300ml蒸馏水，称量琼脂4g倒入烧杯中，将烧杯置于电炉上或微波炉内加热，待琼脂完全溶化后，加入15g蔗糖，充分溶解后，将准备好的大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素母液混合液倒入烧杯中，用蒸馏水将装过母液混合液的烧杯洗三遍，一并倒入500ml烧杯中，并加蒸馏水定容。
④充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为5.8。
⑤把培养基分装到广口瓶中，每瓶约50ml。用封口膜封好瓶口。贴上标签，注明培养基名称，配制者姓名和配制日期，待灭菌。
2.培养基灭菌（灭菌条件：121℃，15分钟）
①检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。
②盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。
③灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。
④刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷却。在室温下放置1-2天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。
要求：每人准备培养基2瓶。
提前准备实验三所需的无菌材料。
五、实验报告
附：稀酸和稀碱的配制方法
1mol/LHCl
取浓盐酸8.25ml，加蒸馏水至100ml，即为1mol/LHCl。
1mol/LNaOH
称取氢氧化钠4g，加入蒸馏水100ml，即为1mol/LNaOH。
实验三、外植体的消毒与初代培养的建立
一、实验目的
通过实验，初步掌握外植体材料消毒、接种的无菌操作技术以及外植体初代培养的方法。二、原理
植物组织培养是在无菌条件下对离体的植物器官或组织的培养。而植株各部分的表面携带着各种不同的微生物，所以在接种前就必须选择合适的消毒剂对外植体进行消毒，获得无菌材料进行组织培养，这是取得组织培养成功的前提和重要保证。离体器官或组织受到适当刺激，便可进行器官分化，从而实现细胞的全能性。
三、实验材料、试剂和仪器设备
1．实验材料：月季当年生枝条
2．试剂：升汞，吐温-80
3.仪器设备（以各组所需为例）
无菌器材：
4个不锈钢托碟+吸水纸
1升无菌水
大号、中号镊子各2把
2把解剖刀、1把剪刀
2个500ml烧杯
非无菌材料：
0.1%升汞消毒液200ml
1个250ml消毒缸
2盏酒精灯及火机1个
1000ml搪瓷缸(装废液用)
1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml
1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球
1把大号镊子、1把枝剪、1把解剖刀、1把旧牙刷
橡皮筋若干、标签纸、记号笔、洗衣粉、毛巾、洗衣粉、喷雾器、鞋套、肥皂
四、实验步骤
1．实验二制备的培养基即是本实验所用培养基。
2．接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台。房间用酒精喷雾降尘后打开超净工作台紫外灯及房间的紫外灯，照射约30mins；然后关闭紫外灯，打开房间换气扇以及超净工作台的风机，并微启超净工作台的玻璃挡板，通风20min 后，即可进行无菌操作。
3．选取生长健壮的枝条，用饱满又未萌发的侧芽作为外植体（取中部的芽较好）。将外植体用手术刀切去叶片，并剥去附在茎上的叶柄及皮刺，用毛刷沾洗衣粉刷洗并在自来水下冲洗干净。吸干水份后切成约2-3cm的茎段，每段至少有1个侧芽。将处理好的外植体转入洁净的消毒缸中，用加了数滴吐温-80的0.1%的升汞溶液浸泡10min。在表面灭菌过程，应不停摇动消毒缸使消毒液与外植体充分接触。
3．准备进入接种间，用肥皂水清洗双手至手肘部位并在自来水下冲洗干净，进入缓冲室后套上鞋套。
4．把浸泡在消毒液中的外植体转移到超净工作台中。消毒时间结束后在酒精灯火焰旁用无菌镊子将已完成表面灭菌的外植体转移到烧杯中，用无菌水清洗5次，每次不少于1分钟，洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒剂。最后一次清洗后将外植体转移到无菌托碟上，吸干水分备用。
5．将消毒后的外植体按极性方向接种到培养基上，每瓶可接入3～4段月季茎段。将培养瓶放置在21±2℃，光强800～1200lx，光周期为12h的环境下培养。约30天长成具5～8片叶的无根试管苗。
6．各组的每位同学操作完后将镊子等器械浸入75%酒精中，由下一位同学在使用前灭菌。方法是将浸于酒精中的器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。
五、实验报告
1.接种2天后观察污染情况，计算污染率。
污染率=污染的材料数/总接种材料数×100%
2.每周观察并记录外植体萌动的情况，包括外植体基部是否有愈伤组织出现及其出现时间，侧芽萌发时间及芽的生长状况（萌芽数及芽平均长度）等，并计算萌发率。并注意观察是否有芽玻璃化等异常情况出现。
萌发率=侧芽萌发的茎段数/总接种材料数×100%
为什么常在消毒液中加入1～2滴表面活性剂如吐温-80？
实验四、继代与增殖培养
一、实验目的
通过实验，掌握运用植物生长调节物质调控植物器官分化的方法。
二、原理
以植物的茎、叶等作为外植体进行离体培养，可以直接诱导器官分化，产生芽、根，形成新的植物体；也可以诱导其改变原来的分化状态脱分化形成愈伤组织。这种愈伤组织在一定条件下，又能“再分化”出根和芽等器官。在该过程中，植物生长调节物质起着决定作用，调控着培养细胞再生完整植株的不同方式。
三、实验材料、试剂和仪器设备
1．实验材料，实验三获得的月季无菌枝条
2．试剂
MS母液，各种植物生长物质
3．仪器设备
无菌器材：
8瓶培养基
3～4瓶4－6周龄月季无菌枝条
4个不锈钢托碟+吸水纸
大号、中号镊子各2把
2把解剖刀
非无菌材料：
1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球
1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml
2盏酒精灯及火机1个
橡皮筋若干、标签纸、记号笔、喷雾器、鞋套、肥皂
1把大号镊子
四、实验步骤
1.培养基准备。增殖培养基，①MS+6-BA0.5mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.05mg/L；②MS+6-BA1.0mg/L+KT0.2mg/L+NAA0.05mg/L。
2.接种室的灭菌见实验三。
3.继代，将实验三的培养瓶转移到接种室，在将瓶放入超净工作台前用75%的酒精棉球擦拭瓶外表面，减少附在瓶外壁上的灰尘与微生物。然后在酒精灯火焰旁进行无菌操作，将无菌芽从原茎段上切下，切成1～2cm的带腋芽茎段转接到继代增殖培养基上，促使嫩茎长出更多的侧芽。
4.培养，培养温度同于初代培养，将光强增至2000lx，光周期延长为16h/天，以免试管苗生长细弱。
五、实验报告
1.观察并记录月季茎段在增殖培养基上的生长和增殖情况，并计算增殖率（继代接种时的茎段数目与继代培养后所产生的茎芽数之比）。
2.根据在两种培养基上的生长情况，确定最适增殖培养基。
实验五、生根培养
同实验四。
二、原理
同实验四。
三、实验材料、试剂与仪器设备
1．实验材料，实验四获得的月季试管苗
2．试剂
MS母液，各种植物生长物质
3．仪器设备
无菌器材：
8瓶生根培养基
3～4瓶8～10周龄月季试管苗
4个不锈钢托碟+吸水纸
大号、中号镊子各2把
2把解剖刀
非无菌材料：
1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球
1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml
2盏酒精灯及火机1个
橡皮筋若干、标签纸、记号笔、喷雾器、鞋套
1把大号镊子
四、实验步骤
1.培养基准备。生根培养基，①1/2MS+IBA0.5mg/L；②1/2MS+NAA0.5mg/L；③1/2MS+IBA0.5mg/L+NAA0.2mg/L。
2.接种室灭菌。
3.接种培养，在超净工作台上进行无菌操作。选取生长粗壮的无根苗，切成2～3cm的茎段，分别转入①②③三种生根培养基中，于温度23±2℃，光强2000lx，光周期为12h的环境下培养。当幼苗基部伤口愈合，并出现白色根尖突出物时即可进炼苗和移栽管理。
五、实验报告
1.观察并记录月季无根苗在生根培养基上培养3～4周后的不定根发生情况，并计算生根率。生根率（%）=生根无根苗数/接种无根苗总苗数×100%
2.比较3种生根培养基的诱导效果。
六、思考题
植物芽和根的分化与植物生长调节物质有何关系？
实验六、植物茎尖脱毒培养
一、实验目的
熟练掌握外植体表面消毒技术及茎尖剥离和培养的基本方法。
二、原理
病毒在植物体内的分布是不均匀的。在受侵染的植株中，成熟的组织和器官病毒含量较高，而幼嫩的和未成熟的组织和器官病毒含量较低，生长点则几乎不含或含量很少。
三、实验材料、试剂与仪器设备
1.实验材料,盆栽菊花,万寿菊或矮牵牛种子
2．试剂
MS母液，各种植物生长物质
诱导培养基：MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L+3%糖+0.7%琼脂，pH5.8
增殖培养基：MS+6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+3%糖+0.7%琼脂，pH5.8
生根培养基：1/2MS+NAA0.1mg/L+珍珠岩
3．仪器设备
无菌器材：
4瓶诱导培养基
4个培养皿+吸水纸
中号、小号镊子各2把
2把解剖刀、2把解剖针
非无菌材料：
1个广口瓶(500ml)，内装75%酒精及棉球
1个锥形瓶（250ml），内装75%酒精150ml
2盏酒精灯及火机1个
橡皮筋若干、标签纸、记号笔、喷雾器、鞋套
旧牙刷、金刚砂、珍珠岩、小花盆（10cm）
研钵1个、镊子2把、解剖刀1把、解剖镜1台
四、实验步骤
1.母株病毒的鉴定（汁液感染法），取母株叶片放于等体积（W/V）的缓冲液（0.1mol/L磷酸钠）中，研磨成汁液，接种于万寿菊/矮牵牛鉴别寄主上。接种后，放置在18～25℃的防虫室中观察1个月，记载症状反应。
2.取带顶芽茎段，长约3～5cm，除去叶，保留护芽的叶柄，用洗涤液充分清洗尤其是叶柄处，用软毛刷充分涮洗并在自来水下反复冲洗干净后，先用70%酒精处理30s，再用0.1%升汞消毒6分钟，并不时轻轻搅动。灭菌结束后用无菌水清洗5～6次，吸干水份，转入无菌三角瓶中备用。
3.将已灭过菌的材料放入无菌培养皿中，在解剖镜下用解剖针剥去顶芽外面的幼叶，直至看到表面光滑呈圆锥形的生长点，只剩下1～2个叶原基，切取约0.3mm和0.5mm两个不同长度的茎尖，接种到培养基中培养。最好是放在培养基凝固时产生的冷凝水表面上，防止茎尖脱水，且正放。温度23±2℃，光强1000～3000lx，光周期12～16h培养。
4.约3天后茎尖开始萌动，颜色逐渐变绿，基部逐渐膨大，4～6周后形成丛芽。将诱导出的芽切下，转接到增殖培养基或生根培养基上进行培养。该步可根据具体条件进行。
5.等组培苗长至2.5～3.5cm高时，具2～3片叶时，可从瓶中取出苗，用自来水冲洗干净基部附着的培养基后，整株放在研钵中磨成汁液。按1所述方法接种鉴别寄主和培养，观察组培苗是否脱去相应病毒。
五、实验报告
1.观察并记录茎尖在培养基上的生长情况，是否出现愈伤组织，芽的分化数及形态，生长长度，并统计茎尖的繁殖系数。
2.比较两种不同接种长度的茎尖接种成功率。
3.统计脱毒率。比较两种长度的脱毒效果。
实习试管苗的炼苗与移栽
一、实验目的
通过月季试管苗的炼苗与移栽管理，掌握组培苗炼苗与移栽的基本方法与过程。
二、原理
试管苗生长在恒温、高湿、弱光、无菌和有完全营养供应的特殊条件下，这样的试管苗若未经充分锻炼，一旦被移出培养瓶后难以适应自然环境的变化，则很快失水萎蔫至死亡。通过炼苗，逐步改变试管苗的生长环境，促使气孔逐渐建立开闭机制，促使叶片逐渐启动光合功能等，提高试管苗的适应能力，为移苗成功打下基础。
三、实验材料、试剂和仪器设备
1.实验材料，实验五所获得的月季生根苗
2.试剂及仪器设备
MS培养液，蛭石，河沙，园土，泥炭土，甲醛，高锰酸钾，多菌灵，育苗盘，喷雾器，塑料薄膜，温室
四、实验步骤
1.炼苗，将培养瓶放在温室自然光照下培养，同时昼夜有明显温差，5～7天后再打开封口膜使瓶中空气湿度降低，通气加强，2～3天后可移苗。
2.移栽基质的准备，①蛭石；②河沙：园土：泥炭土（1：1：2），拌和均匀。用甲醛和高锰酸钾进行熏蒸消毒。移栽基质要用能密封的器具盛装，然后在土中间放一小烧杯，将称量好的高锰酸钾倒入烧杯中，再把已量取的甲醛溶液慢慢倒入烧杯中，完毕，密封好器具。3天后打开器具取出基质在阳光下曝晒再装入育苗盘中。
3.幼苗出瓶后，先洗去沾附的培养基，用0.1%多菌灵溶液浸泡后移栽于基质中，种植密度为2～3cm×4～6cm/株。移栽完后，一次性浇透水，并用0.1%多菌灵喷雾。当叶表面水珠消失后盖好保湿薄膜，保持温度15～25℃，湿度在85%以上，同时注意通风，控制光照在50%左右。每7～10天喷一次杀菌剂，待小苗成活并开始长新梢后可施稀薄的MS培养液作追肥。逐渐增强通风直至约2周后打开保湿薄膜。当叶片呈现深绿色、生长健壮，根长至，约50天后即可盆栽管理。
五、实习报告
详细记录试管苗的炼苗及移栽管理过程，报告生长现象及移栽成活率。
植物组织培养报告内部编号：（YUUT-TBBY-MMUT-URRUY-UOOY-DBUYI-0128）
大蒜茎尖的组织培养 谢婷婷江宋青万嫣文吕凌宇一、实验目的 掌握植物组织培养的相关理论知识及操作方法； 通过自行设计并完成实验，提高动手能力和思维能力； 利用植物细胞的全能性，使大蒜茎尖经过脱分化作用形成愈伤组织，再分化为有结构的组织和器官，最终增殖培育出大量品质优良的大蒜试管苗。二、实验原理 植物组织培养是利用植物细胞的全能性原理。植物组织培养是在无菌环境下，将离体的植物器官、组织以至单个细胞，在人工配置的培养基上培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化”。已经脱分化的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化”。 三、实验材料、试剂和器材 1 供试材料 以购于府前菜场的大蒜为实验材料，实验在丽水学院生态学院组培实验室进行。 2 仪器与设备 超净工作台、培养事、电子天平、烧杯、容量瓶、玻璃棒、量筒、移液
管。 3 试剂 70%酒精、95%酒精、0.1%升汞、蔗糖、琼脂条、6-BA（1.5 mg/L；2.0 mg/L）、2,4-D（2.0 mg/L）、NAA（1.0 mg/L；）、IBA（2.0 mg/L）、10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的铁盐、100倍的有机物。 四、实验步骤 1.培养基的配制及灭菌 诱导培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+2,4-D 2.0 mg/L 出芽培养基：MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L 生根培养基：MS+IBA 2.0 mg/L （1）将MS母液（10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的铁盐、100倍的有机物）按顺序排列、检查是否失效。 （2）在装有3/4蒸馏水的容器中加入0.7%琼脂和3%蔗糖，加热溶化。（3）依次吸取适量各种母液移到容器中。 （4）用蒸馏水定容到相应体积。 （5）调节pH值(用0.1M的NaOH或HCl调节)至5.8-6.0。 （6）向培养基中加入适量激素。 （7）将配制好的培养基进行分装（20-30ml/瓶）。 （8）用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121 ℃下灭菌 20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，冷却后备用。接种操作所需的一切用具（烧杯、培养皿、灭菌水等），需同时灭菌。 （9）将灭菌后的培养基于常温下放置一星期，观察有无污染。
植物的组织培养技术 【学习目标】 1、指导植物组织培养技术的基本原理和基本技术。 2、掌握植物培养过程中使用的无菌技术（重点）。 3、掌握植物知识培养的基本过程及操作。 4、说出被子植物花粉发育的过程及花药例题培养产生花粉植株的两种途径。 5、说出花药离体培养的因素，学习话要例题培养的基本技术。 【要点梳理】 要点一、植物组织培养的基础知识【高清课堂：植物的组织培养技术 高清未发布 课题1：基础知识】 1、植物组织培养的基本过程： 离体的植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化（去分化）。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫再分化。再分化形成的试管苗移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物组织培养的过程可以简要归纳为： 离体的植物器官、组织或细胞（外植体）???→脱分化愈伤组织???→再分化根、芽—→植物体。 2、植物组织培养的理论基础：细胞的全能性 要点诠释： 细胞的全能性与植物组织培养间的关系 ①细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。 植物组织培养的理论基础是细胞的全能性。植物细胞只有脱离了植物体，在一定的外部因素作用下，经过细胞分裂形成愈伤组织，才能表现出全能性，由愈伤组织发育、分化出新的植物体。 ②高度分化的植物细胞仍具有全能性的原因是所有体细胞均来自受精卵的有丝分裂，均有和受精卵相同的一整套遗传信息。 ③植物体的组织、器官的形成，是基因选择性表达的结果，其细胞的全能性受到限制，在离体状态下，其全能性才容易得以表达，表达的过程须经过脱分化和再分化。 ④容易进行营养繁殖的植物细胞，其全能性容易表达，易进行植物组织培养。 要点二、影响植物组织培养的因素 1、无机营养 （1）大量元素：除碳（C ）、氢（H ）、氧（O ）外，还有氮（N ）、磷（P ）、钾（K ）、钙（Ca ）、镁（Mg ）、硫（S ）等元素。 （2）微量元素：包括铁（Fe ）、铜（Cu ）、钼（Mo ）、锌（Zn ）、锰（Mn ）、钴（Co ）、硼（B ）和碘（I ）等。 2、有机营养 （1）维生素类：植物组织培养中经常使用维生素C 、维生素B 1（盐酸硫胺素）、维生素B 6（盐酸吡哆醇）、维生素H （生物素）、叶酸和烟酸等，一般使用浓度为0.1～10 mol ／L 。 （2）氨基酸：有甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白（CH ）和水解乳蛋白（LH ）等，是重要的有机氮源。 （3）有机添加物：是一些成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等的复杂化合物，它们对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。 3、植物生长调节物质 植物生长调节物质是培养基中的关键物质，对植物组织培养起着重要、明显的调节作用。植物生长调节物质包括生长素、细胞分裂素及赤霉素等。
植物组织培养实验室组培室规划设计 一、实验室要求理想的组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染 源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。规模化生产的组织 培养实验室最好建在交通方便的地方，便于培养产品的运送。实验室的建设均 需考虑两个方面的问题：一是所从事的实验的性质，即是生产性的还是研究性的，是基本层次的还是较高层次的；二是实验室的规模，规模主要取决于经费 和实验性质。无论实验室的性质和规模如何，实验室设置的基本原则是：科学、高效、经济和实用。一个组织培养实验室必须满足3个基本的需要：实验准备(培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌)、无菌操作和控制培养。此外，还可根据从事的实验要求来考虑辅助实验室及其各种附加设施，使实验室 更加完善。在进行植物组织培养工作之前，首先应对工作中需要哪些最基本的 设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规 模太小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养 程序来没计，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培养是在严格 无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同 时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。二、实验室组成(一)基本实 验室基本实验室包括准备室、洗涤灭菌室、无菌操作室、培养室、缓冲间，是 组织培养实验所必须具备的基本条件。如进行工厂化生产，年产4万-20万， 需3-4间实验用房，总面积60平方米。1、准备室(化学实验室)功能：又叫化 学实验室，进行一切与实验有关的准备工作：完成所使用的各种药品的贮备、 称量、溶解、器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养 材料的预处理等。要求：最好有20平方米左右。要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。分类：分体式-研究性质实验室，分开的若干房间将准备室分解为药品贮藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌 室等，功能明确，便于管理，但不适于大规模生产。通间式-规模化实验室，准备室一般设计成大的通间，使试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。 准备试验的过程在同一空间进行，便于程序化操作与管理，试验中减少各环节 间的衔接时间，从而提高工作效率。此外还便于培养基配制、分装和灭菌的自
植物组织培养实验 李永吉 12101705 12青年农场主班 第一部分：培养基母液的配制 通过配制母液过程了解植物外植体立体培养所需各种营养成分及激素种类，掌握培养基母液配制的方法。之所以要配制培养基母液，是因为考虑到在配制培养基时使用更方便、操作更简化、用量更准确，减少每次配药称量各种化学成分所花费的时间和误差，所以我们在配制培养基之前将配制培养基所需无机大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素成分分别配制成比需要量大若干倍的浓缩母液，置于冰箱保存。当配制培养基时，按预先计算好的量分别量取各种母液即可。 实验所需用具器材有：电子天平（检测灵敏度0.0001g ）、pH 计、托盘电子秤（检测灵敏度0.01g ）、冰箱、烧杯（1000mL 、500mL 、250mL 、50mL ）、量筒（2000mL 、1000mL 、100mL 、50mL ）、试剂瓶（1000mL 、250mL 、150mL ）、药匙、玻璃棒 实验所需药品试剂有：蒸馏水、1N HCl 、1N NaOH 、95%酒精、各种所需化学药品（分析纯） 实验内容： 1、无机大量元素母液的配制（20倍） 按培养基配方所需量，将各种化合物称量扩大20倍，用托盘电子秤称取，并用200mL 蒸馏水溶解于250mL 烧杯中，如溶解缓慢，可稍加热。CaCl2单独用100mL 纯水溶解。溶解后将以上溶液倒入容量瓶中定容至1000mL 。倒入试剂瓶中并贴好标签，保存于冰箱冷藏。 MS 无机大量元素母液配制 2、无机微量元素母液配制 按培养基配方所需量，将各种化合物称量扩大200倍，用托盘电子秤称取，并用200mL 蒸馏水溶解于250mL 烧杯中，。溶解后将以上溶液倒入容量瓶中定容至500mL 。倒入试剂瓶贴好标签，保存于冰箱。 母液 名称 化合物名称 配方规定量（g/L ） 贮备液的倍数 配制母液称取量/g 母液体积/mL 配一升培养基时取母液量/mL 大 量 元 素 NH 4NO 3 1.65 20 33 1000 50 KNO 3 1.9 38 CaCl 2 0.332 6.64 MgSO 4.7H 2O 0.37 7.4 KH 2PO 4 0.17 3.4
植物组织培养实验报告 摘要：以大豆子叶为外植体，在MS培养基上附加不同浓度、不同种类的植物激素，以研究不同激素组合和不同浓度对大豆子叶愈伤诱导率的影响，并练习无菌操作。实验结果显示第2组即MS+6-BA（2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L)和第 3 组即MS+KT（0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 培养基中愈伤组织诱导率较高，为较佳的愈伤组织诱导组合。 关键词：大豆；植物组织培养；无菌操作；愈伤组织 1.材料与方法 1.1实验材料：大豆子叶 1.2实验试剂与仪器 （1）试剂：75%酒精、MS干粉、蔗糖、琼脂、植物生长调节剂（NAA、2，4-D、KT、6-BA）、无菌水、升汞、NaOH溶液 （2）仪器：超菌净工作台、圆纸片、培养皿、封口膜、称量纸、千分之一天平、不锈钢杯子、移液枪、试管、高压灭菌锅、注射器、酒精灯、镊子、手术刀、搁置架、烧杯、电炉。 1.3实验方法 1.3.1培养基的配制与灭菌 1.3.1.1 配制培养基的准备阶段 （1）准备80个培养试管及封口膜，2个小培养皿、1个大培养皿，用洗衣粉、自来水洗净，再用蒸馏水把每个培养试管、润洗一下。带晾干后将试管编号1-80；（2）在称量纸上用百分之一天平分别称取1.5g 琼脂4份，7.5g 蔗糖4份，在烧杯里用千分之一天平上称取1.185g MS干粉4份（烧杯不要清洗）；
（3）剪小圆纸片40，均分在两个小培养皿小能从中自由取出为宜；剪大圆纸片10，均分在两个大培养皿中。然后分别用报纸包好。 （4）把接种工具手术刀、镊子、剪刀等用报纸包好。 1.3.1.2 配制培养基 （1）在装有MS干粉的烧杯中按下表加入植物生长调节剂 实验所用的所有激素浓度均为0.5mg/mL 激素的加样量(ml) 编号培养基配置 6-BA NAA KT 2,4-D 1 MS+6-BA（1.0mg/L)+NAA(0.5mg/L) 0.5 0.25 2 MS+6-BA（2.0mg/L)+NAA(1.0mg/L) 1.0 0.5 3 MS+KT（0.5mg/L)+2,4-D(1.0mg/L) 0.25 0.5 4 MS+KT（1.0mg/L)+2,4-D(2.0mg/L) 0. 5 1.0 （2）用量筒量取250ml（稍多）蒸馏水，取一个不锈钢杯子加入150ml蒸馏水和称量好的琼脂，在电炉子加热沸腾2min，再加入混合好的MS培养基1号和蔗糖，混合沸腾2min，用剩余的蒸馏水定容至250ml； （3）当温度降到60℃左右时，将溶液pH 调至5.8，一般加4滴NaOH溶液即可；（4）取编号1-20的培养试管，用大量注射器以每瓶12.5ml 左右培养基分装在培养试管中，用封口膜封口，4支一捆捆扎好。 （5）用相同的方法配置2-4号培养基，并分装、捆扎。 1.3.1.3高压湿热灭菌 （1）将包好的接种工具，包好的培养皿，以及分装好的试管一起放到高温灭菌
1.（2014广东卷）（16分）铁皮石斛是我国名贵中药，生物碱是其有效成分之一，应用组织培养技术培养铁皮石斛拟原球茎（简称PLBs，类似愈伤组织）生产生物碱的实验流程如下： 在固体培养基上，PLBs的重量、生物碱含量随增殖培养时间的变化如图17所示，请回答下列问题： ⑴选用新生营养芽为外植体的原因是，诱导外植体形成PLBs的过程称。 ⑵与黑暗条件下相比，PLBs在光照条件下生长的优势体现在，，。 ⑶脱落酸（ABA）能提高生物碱含量，但会抑制PLBs的生长。若采用液体培养，推测添加适量的ABA可提高生物碱产量。同学们拟开展探究实验验证该推测，在设计实验方案是探讨了以下问题： ①ABA的浓度梯度设置和添加方式：设4个ABA处理组，1个空白对照组，3次重复。因ABA受热易分解，故一定浓度的无菌ABA母液应在各组液体培养基后按比例加入。②实验进程和取样：实验50天完成，每10天取样，将样品（PLBs）称重（g/瓶）后再测定生物碱含量。如初始（第0天）数据已知，实验过程中还需测定的样品数为。 ③依所测定数据确定适宜的ABA浓度和培养时间：当某3个样品（重复样）的时，其对应的ABA浓度为适宜浓度，对应的培养时间是适宜培养时间。
【答案】（1）细胞分化程度低，容易诱导形成PLBs（2分）；细胞的脱分化（2分）（2）生长起始快（2分），快速生长时间较长（2分）；PLBs产量较高（2分）；（3）①灭菌、冷却（2分）；②75（2分）；③PLBs重量和生物碱含量乘积的平均值最大（3分） 【解析】（1）新生营养芽分裂能力强，全能性容易表达；根据题干可知，PLBs类似愈伤组织，外植体形成愈伤组织的过程是脱分化。（2）据图分析，光照下PLBs的重量高于黑暗条件下，原因可能是光照有利于细胞增殖、叶绿体的形成和进行光合作用制造有机物。（3）①由于ABA受热易分解，所以各种液体培养基灭菌后，冷却，再加入不同浓度的ABA ②根据题干可知，实验50天完成，每10天取样，需要取样5次，4个ABA处理组，1个空白对照组，3次重复，因此每次取样需要记录15个样品中的数据，共需要测定样品数75 ③适量的ABA可提高生物碱产量，当样品的平均值最大时，所对应的ABA浓度和时间为最适。 2.（2014江苏卷）（9分）为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。请回答下列问题： （1）外植体经诱导后形成愈伤组织的过程称为。 （2）在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如右图所示。细胞干重在12d后下降的原因有；培养液中蔗糖的作用是、。 （3）多倍体愈伤组织细胞产生的次生代谢产物量常高于二倍体。二倍体愈伤组织细胞经处理，会产生染色体加倍的细胞。为检测愈伤组织细胞染色体数目，压片前常采用纤维素酶和酶解离愈伤组织。若愈伤组织细胞（2n）经诱导处理后，观察到染色体数为8n的细胞，合理的解释是、。 （4）为了更好地获得次生代谢产物，生产中采用植物细胞的固定化技术，其原理与酵母细胞固定化类似。下列说法正确的有（填序号）。 ①选取旺盛生长的愈伤组织细胞包埋②必须在光照条件下培养
植物组织培养实验设计及 常用设备的使用与维护 一．实验目的 1.熟悉植物组织培养实验室的组成及设备 2.掌握植物组织培养实验室的设计要求 3.熟悉植物组织培养所需的仪器设备 二．实验原理 植物组织培养是通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。要达到无菌操作和无菌培养，就需要人为创造无菌的环境，使用无菌的器皿及器械，同时还需要人工控制的温度,光照，湿度等培养条件。无菌环境和培养条件的创造需要一定的设施及设备。 三．实验步骤 1.实验室的设计要求 功能齐全、布局合理、环境清洁、易于灭菌 2.实验室的组成及功能 实验室的组成： 洗涤室、药品室、称量室、培养基配制室、灭菌室、接种室、培养室、观察记录室、储藏室、移苗室 实验室的功能： 洗涤室用于玻璃器皿、实验用具的清洗、干燥、培养材料清洗、预处理也可在本室完成。室内应建造大型水槽和一个或几个浸泡
池，水槽最好上一内衬白瓷片的水泥槽，为防止碰坏玻璃器皿，下面可铺一活动的橡胶板。备有晾瓶架，用于放置刷净的培养器皿，配备有一定数量的周转盘或小推车，用于运输培养器皿。地面要注意防滑，排水通畅，墙壁要有耐湿、防潮功能。 药品室用于存放各种药品试剂。室内要求干燥、通风，避免光照，配有药品柜、冰箱等设备。化学试剂物品分类存放于柜中，有毒物质如升汞需要专人密封保存。原药可室温下存放，配好的母液，宜置于4℃冰箱中保存。药品室紧邻称量室较好，便于工作。 称量室进行化学药品的称量。要求干燥、密闭，无直射光照，避免腐蚀性药品和水气直接接触。有固定的水磨石平台，安放普通天平、精密天平和分析天平，要有电源插座，最好设计在阴面的房间，这样对怕光药品的保存和称量有利，称量室紧邻培养基配制室较好，以方便配制母液和培养基。房间较少时，可以与药品室合二为一。 培养基配制室主要进行母液的配制，培养基的配制、分装、包扎和灭菌前的暂时存放。在条件允许下，面积宜大不宜小，室内应有大型实验台。配有电炉、锅子、量具、培养基分装器具、吸管、培养容器、水浴锅和酸度计等。如规模较小，可与洗涤室、灭菌室合并在一起。
植物组织培养实验报告 一实验目的 让植物组织经过脱分化作用，形成愈伤组织，经过再分化作用，愈伤组织又能重新分化为有结构的组织和器官，最终形成完整的植株。 二实验原理 植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。植物激素在此过程中起着重要的作用，吲哚乙酸（IAA ）和 6 –苄基氨基腺嘌呤（6 – BA ）的比例，决定了根和芽的分化。 三实验器材 （一）试剂 乙醇、IAA 或 2 ，4 – D 、HgCl 2 （或次氯酸钠）、6- 苄基氨基腺嘌呤（6-BA ） MS 培养基 （二）仪器设备 培养室，高压灭菌锅，水浴锅，解剖刀，三角烧瓶（100mL ），烧杯，量筒，培养皿，超净工作台，分析天平，长镊子，剪刀，橡皮筋等 三实验步骤 1. 配制培养基 （1 ）愈伤组织诱导培养基：MS 培养基（蔗糖含量为10 g/L ，2,4 – D 含量为 2 mg/L ，琼脂10 g/L ）。 （2 ）试验培养基：在MS 培养基中按表33 – 1 加入IAA 和6–BA 。 吲哚乙酸先用少量0.1 mol/L NaOH 溶解，6- 苄基氨基腺嘌呤先用少量0.1 mol/L HCl 溶解，然后用蒸馏水稀释，再加入培养基中。 2. 培养基灭菌 将配好的培养基加入琼脂加热溶解，调至pH 5.8 ，趁热分装于100 mL 三角烧瓶中，每瓶约20 mL 。待培养基冷却凝固后，用两层称量纸包扎瓶口，并用橡皮筋扎牢，然后在高压灭菌锅中121 ℃（ 1 kg/cm 2 ）下灭菌20 min 。取出三角烧瓶放在台子上，
多肉植物是指植物营养器官的某一部分，具有发达的薄壁组织用以贮藏水分，在外形上显得肥厚多汁的一类植物。常见的有仙人掌科的仙人掌、仙人球、昙花、蟹爪兰、金琥；番杏科的生石花、肉锥花；百合科的康平寿、玉露、卧牛；大戟科的虎刺梅、彩春锋；景天科的石莲花、长寿花、虹之玉；龙舌兰科的金边龙舌兰、虎尾兰；菊科的翡翠珠等。 肉植物耐干旱，净化空气，具有外观小巧玲珑，植株肥厚多汁，造型特异等特点，是近年来逐渐流行的一类观赏植物。组织培养技术，对保存多肉植物优良的种质资源、繁殖名优珍稀品种、快速繁殖出口需要和园林绿化需要的优良品种。 传统多肉植物可依靠分株、扦插繁殖，分株繁殖如芦荟、仙人球、虎尾兰；扦插繁殖如蟹爪兰、长寿花、落地生根，仙人掌则是分株和扦插繁殖都可以。值得一提的事，生石花在生长中有一个脱皮、分裂的过程。通常在冬末春初，植株中缝逐渐开裂，在开裂处有一个或两三个新的植株逐渐长大，而原有的植株逐渐枯萎，为新株所取代。这个由新植株替代老植株的过程，就是脱皮生长和分裂繁殖过程。 外植体的选择 取优良母株新萌发的幼嫩侧芽、幼嫩枝条；一些没有侧芽的珍稀名贵品种的母株则可等待植株开花期间取其较充实的花梗作为外植体。夏季休眠期，多肉植物外植体在培养基中对激素常反应迟钝，生长静止，不易培养成功。 1.????????? 消毒灭菌 2.1选择合适的培养基的，配置好、调节适当的激素浓度。 2.2制作好的培养基须立即放入高压灭菌锅灭菌，备用。， 2.3外植体材料的消毒：切取多肉植物幼嫩的侧芽或花梗→肥皂水或洗洁精洗涤→在自来水下冲洗→超净工作台中用 75%酒精浸泡数秒→ 0.1%升汞处理 10～30min，→无菌水冲洗 6 遍，→消毒滤纸吸干水分 3.接种 无菌条件下操作→手术刀切取所需的培养材料→无菌操作植入初代诱导培养基中培养。 3.培养
植物组织培养的应用及 发展前景 集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]
植物组织培养技术应用及进展 摘要：本文综述了植物组织培养理论的发展，重点论述其再脱毒、快繁、育种与有机化合物工业生产以及种质资源的保存等方面的应用，并对应用的前景作简单的展望。 关键词:植物组织培养；应用；进展 中图分类号： 1.理论起源 19世纪30年代，德国家施莱登和德国动物学家创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特在的理论是植物组织培养的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从传向世界各地，美国植物学家斯等人，用韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。 植物组织培养的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。 植物组织培养的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工上进行培养，这些器官或组织就会进行，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。 植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科 2.植物组织培养发展简史 植物组织培养是20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。它是在人工配制的培养基上，于无菌状态下培养植物器官、组织、细胞、原生质体等材料的方法。 植物细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。20世纪初，曾有人提出能否将植物的薄壁细胞培养成完整植株研究者从胡萝卜根的韧皮部取下一块组织，并在液体培养基中培养，使其分化出了愈伤组织，从愈伤组织又得到胚状体，胚状体转移到固体培养基上继续培养后，获得了完整的胡萝卜试管植株。经过栽培，此植株能够正常生长并开花结果，其种子繁衍出来的后代与正常植株的种子所繁衍出的后代别无二致。根据此实验可以得出以下结论：即不经过有性生殖过程也能将植物的薄壁细胞培养出与母体一样的完整植株。由于植物的每个有核细胞都携带着母体的全部基因，故在一定条件下，它们均能发育成完整植株，这就是所谓的植物细胞全能性。
植物组织培养 1.简述植物组织培养的基本技术。（10分） 答：植物的组织培养）技术是指利用细胞全能性和植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具有关键性作用，分离一个或数个体细胞或植物体的一部分在无菌条件下培养的技术。通常我们所说的广义的组织培养，是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。 2.简述植物组织培养的主要障碍、发生原因及防治措施。（10分） 植物组织培养的主 要障碍 发生的原因防治措施 褐变1)材料的基因型差异 2)材料的生理状态 3)培养基成分 4)其他因子的影响（培养时间 的长短等）1.选择适当的外植体 和培养条件 2.抗氧化剂和抑制剂 的作用 3.其他防止褐变的措 施（连续转移或预 处理等） 玻璃化 1.玻璃化苗的形态学，解剖学 特征1.选择适当的外植体 2.改善培养基组成
2.玻璃花苗的生理生化特点 3.外植体 4.培养环境条件 5.培养成分 3.改善培养条件 遗传的稳定性自身的遗传特性选择合适的外植体 控制好培养条件 污染污染的来源（材料的本身，由 外界环境侵入）1)供体材料的选择 （选择健康，无病 毒的植株） 2)培养物的检验 3)合理的扩繁程序 4)严格的无菌操作 规程 3.组培苗生长环境有何特点？如何提高其移栽成活率？（10分） 组培苗生长环境特点:组培苗水分散失较快，易于萎蔫。吸水能力较弱。所以导致环境有了极大的改变：湿度降低、光照增强、温度升高、温差变大。具以上特点的组培苗，在此环境下，叶片失水较严重，根系吸水能力不足，即吸水量小于蒸腾水量，从而造成植物萎蔫，炼苗失败。另一种情况是，空气温度上升要比基质温度上升快，而根系的吸水能力在一定范围内与温度是成正比的，当气温升高时，加之湿
蝴蝶兰植物组织培养全过程 一实验目的： 1 掌握植物细胞组织培养的原理和方法； 2了解植物组织培养的方法； 3 学习植物组织培养的原理； 4 了解不同浓度BA对蝴蝶兰生根的影响； 5了解炼苗的作用； 6掌握训化的方法步骤； 7观察蝴蝶兰组织培养到种植的全过程，并注意其中出现的问题。 二实验原理： 蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属植物,因花型奇特、色彩艳丽、花期长久而享有“洋兰皇后”的美誉。蝴蝶兰原产于缅甸、菲律宾、台湾、马来西亚、印度尼西亚等热带亚洲地区,具有极高的观赏和经济价值,是国际上最具商业价值的四大观赏热带兰之一。蝴蝶兰属单茎性气生兰,再生能力弱,很难进行分株繁殖,且种子无胚乳,自然条件下难以萌发,增殖系数低,难以满足日益增长的市场需求。应用植物组织培养技术进行蝴蝶兰快速繁殖可以缩短繁育周期,获得大量成株,并可以保持优良性状,维护种质资源,是蝴蝶兰快速繁殖的有效途径。在以蝴蝶兰根尖、茎尖、叶片和花梗芽为外植体诱导原球茎时,由于根尖的诱导率低,摘取茎尖会损失母株等原因,因此在蝴蝶兰组织培养中根和茎都不是诱导原球茎的理想材料。而蝴蝶兰叶片和花梗芽作为外植体诱导圆球茎时,其诱导率较高、对母株伤害不大,是较为理想的外植体材料。 三材料与用具： 蝴蝶兰的茎尖、1/ 2MS +BA2. 5 mg/L + NAA0. 2 mg/L花梗腋芽诱导培养基、1/ 2 MS + BA3. 5 mg/L + KT1. 0 mg/L + NAA0. 5 mg/L + 椰乳10 %增殖培养基、母液、量筒、烧杯、玻璃棒、移液管、无菌水、高压灭菌器、容量瓶、pH试纸、75%酒精、2%次氯酸钠、镊子、解剖刀、超净工作台、95%酒精、穴盘等。 四方法与步骤 （1）母液的配制 根据需要的母液量配制母液，配好后要贴好标签，以防弄错。标签上要注明是什么母液和母液的稀释倍数。将配好的母液进行储藏，要用的时候可以方便使用。 配制培养液时应注意：
偶尔就能听到关于多肉植物组培的各种传言，组培苗是什么一回事？组培苗到底好不好？为什么有那么多组培苗?如何鉴别组培苗？等等关于多肉植物组培苗的那点事，你都可以在面这篇文章里看到（文字较多，耐心观看），lansemeiyan 什么是组培苗？ 组织培养技术，指代的是利用植物体的某个部分，通过无性营养繁殖来获得新苗（克隆苗）的过程，又叫植物克隆。从广义上来说，利用多肉植物的侧芽、叶插、根插、砍头进行繁殖，都属于组织培养范畴。组培这个概念，很多人一开始可能都误解了。 那么导致市场动荡的“组织培养”到底是指代什么呢？确切的说应该是“离体快速繁殖”，即组织培养技术的一个分支——离体快速繁殖，简称“快繁”。这门技术是从叶插、根插技术演变来的，我们用土壤做叶插和根插，“快繁”则是用人工合成的基质来做，这种人工基质看上去很像果冻，而容器也由花盆变更为玻璃瓶。这就是后来大家在电视上看到的植物组织培养工厂。 为什么在玻璃瓶里的培养基可以实现快速繁殖呢？原因在于优越的外环境和植物激素的作用。快繁实验室的温度、光照和湿度都是恒定的，“培养基”里含有足够的营养和强大的植物激素。这些激素可以按照人为意愿调整植物的生长状态，让它出根还是让它出芽（但这也取决与操作者的学术水平和经验，能够从容操作激素的人在国内是有限的）。 我们平时做叶插和砍头的时候，也会取巧的使用一些激素，其实往叶插和砍头株上滴加激素的行为和“快速繁殖”的性质和道理是一样的，所获得苗也是完全一样的。很多人并没有意识到这点，而觉得不同繁殖方式获得的苗性状会不同，其实差异只在于营养富集度，就是苗的饱满度而已，叶插的总是比砍头的弱一些，
性状呈现晚一些，这是所在部位的内源激素和营养导致的，但是基因组完全一致，不会出现性状漂移。只有嵌合性性状，比如斑锦，才可能在叶插和砍头之间存在“概率学”上的差异。 回头再说大众眼中的“组织培养”（实际上是离体快速繁殖），由于人为操控植物激素的动态变化，使得离体的植物组织可以按照人的意愿出芽，一个两个无数个，因为植物的无性繁殖被认为是无限的，所以在组织培养的“快速繁殖”模式中可以无限的扩增该品种种苗，这也是“危害”市场最致命的地方。不过，必须指出的是，组培苗的无限繁殖也是有成本的，不是像刘谦的魔术一样天上掉下来的，很多人认为组培无成本或低成本，一文不值等等言论，其实都是不了解组培。 如果想获得上万株的种苗，必须有专门的组织培养实验室或工厂，这个运行成本相当巨大，可以说一般的生产商是做不到的。迄今为止，大型的组培工厂都是ZF出资建立的，换句话说大多数搞组培苗生产的人，成本是国家掏腰包的。真正自己掏钱搞组培工厂，是玩不起的。 组培技术早在70年代就出现在欧美，广泛用于种苗繁育和小体型植物的生产。温度、光照、湿度、水、肥等的人工合成、调控技术的成熟，特别是高效植物补光灯的出现推动了组培快速发展。原来只能单层平面日光棚内养植的植物，现在可以在室内人造光环境中，使用多层立体组合栽培方式进行植物的繁育和生产。 “组织培养”（离体快速繁殖）到底好不好呢？ 快繁苗，由于几乎完全是激素调控获得的，这就导致一个问题，操控激素的人是否理解植物的特性、是否熟悉激素的理论和植物生理、是否有足够的经验来
第一章 1、植物组织培养：是指在离体条件下，利用人工培养基对植物的器官、组织、细胞、原 生质体等进行培养，使其长成完整植株 2、外植体：在植物组织培养中，由活体（in vivo）植物上提取下来的、接种在培养基上的 无菌细胞、组织、器官等均称为外植体。 3、愈伤组织：指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。 4、应用 一、农业上的应用 1. 种苗快速繁殖(rapid propagation) 2.无病毒苗(virus free)的培养 3.在育种上的应用(breeding) （1）倍性育种，缩短育种年限，杂种优势明显； （2）克服远缘杂交的不亲合性和不孕性（胚培养）； （3）保存种质 （4）创造变异 二、在遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工程、生物工程等方面的应用。用于基因工程技术创造植物新种质。用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。 三、利用组织培养材料作为植物生物反应器 第二章 1、细胞全能性（Totipotency）：指任何具有完整的细胞核的植物细胞都拥有形成一个完整植 株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 2、细胞分化（cell differentiation）：指导致细胞形成不同结构，引起功能或潜在的发育方式 改变的过程。 3、脱分化（Dedifferentiation）：指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构 和功能而恢复分生状态，形成无组织结构细胞团或愈伤组织 的过程。 4、再分化（Redifferentiation）：指脱分化的细胞重新恢复分化能力，形成具有特定结构和功 能的细胞、组织、器官甚至植株的过程。 5、植物组织培养中常遇到的问题以及解决措施 一、污染及防治： 1、真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉。但若是细菌污染，只 要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可使用。 2、用抗生素等杀菌药剂的处理，会影响植物材料正常生长。 二、褐变及防止 （1）选择合适的外植体 （2）合适的培养条件 （3）使用抗氧化剂 （4）连续转移 三、玻璃化问题及其防止
学号：20095071124 学院生命科学学院 专业生物科学 年级2009级 姓名张阿欠 论文（设计）题目植物组织培养及其应用研究概况指导教师张伟职称讲师 成绩 2012 年 6 月 9 日
目录 摘要 (2) 关键字 (2) Abstract (2) Keywords (2) 前言 (3) 1.植物组织培养的基本概念、原理和试验步骤 (4) 1．1植物组织培养的基本概念 (4) 1．2植物组织培养的基本原理 (4) 1．3植物组织培养的试验步骤 (4) 1．3．1选择和配制培养基 (4) 1．3．2灭茵 (4) 1．3．3接种 (5) l. 3．4培养 (5) 2. 植物组织培养的应用 (5) 2．1植物快速繁殖和无病毒种苗生产 (5) 2．2植物花药培养和单倍体育种 (5) 2．3植物胚胎培养 (6) 2．4植物愈伤组织或细胞悬浮培养 (6) 2．5细胞融合与原生质体培养 (6) 2．6植物细胞突变体筛选 (6) 2．7植物体细胞胚胎和人工种子 (7) 2．8 植物组织细胞培养物的超低温保存与种质库建立 (7) 2．9 植物组织培养与转基因技术的应用 (7)
3 .发展前景展望 (7) 参考文献： (8) 植物组织培养及其应用研究概况 学生姓名：张阿欠学号：20095071124 信阳师范学院生物科学专业 指导教师：张伟职称：讲师 摘要：主要讲了植物组织培养的基本概念，原理和实验步骤，在此基础上，讲了植物组织培养在植物快速繁殖和无病毒种苗生产、植物花药培养和单倍体育种、植物胚胎培养、植物愈伤组织或细胞悬浮培养、细胞融合与原生质体培养等方面的应用，最后展望了植物组织培养的发展方向。 关键字：植物组织培养；概念；原理；实验步骤；应用；发展前景 Abstrac t：About the basic concepts, principles and experimental procedures of plant tissue culture, on this basis, said plant tissue culture in plant rapid propagation and virus-free seed production, plant anther culture and haploid breeding, plant embryo culture, plantscallus or cell suspension culture, cell fusion and protoplast culture in the application, Finally, the future direction of development of plant tissue culture. Keywords:Plant Tissue Culture; concept; principle; experimental steps; applications; development prospects 前言 在世界各国科学家的不断努力下，近几十年来，植物组织培养技术迅速发展。利用组织培养，不仅可以大量生产优良无性系，获得人类需要的多种代谢物质，还可获得单倍体、三倍体、多倍体及非整倍体。通过细胞融合可以打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲合性，在植物新品种的培育和种性的改良中发挥了巨大作用。组织培养的植物细胞是在细胞水平上分析研究的理想材料，从植物快繁、花药培养发展到细胞器培养、原生质融合以及DNA重组技术等，植物组织培养技术广泛应用于植物科学的各个领域及农业、林业、工业、医药等多种行业，已经成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。
《植物组培快繁技术》 康乃馨植物组织培养 实 验 设 计 小组成员：陈梅20141641044 郑莉20141641002 雷雨田20141641043
康乃馨植物组织培养 一、实验目的 掌握植物离体快速繁育原理、方法和完整过程。 二、实验原理 香石竹（学名Dianthuscaryophyllus）又名康乃馨，花色艳丽，开花时间长，装饰效果好，是世界上最畅销的切花之一，具有较高经济价值。由于病毒病侵害，常使植株矮化，花朵变小，花色产生斑点，退色甚至不开花，影响切花产 量和质量。通过茎尖分生组织培养，能够获得“无病毒”的健康植株，对于引 进的少而新的脱毒种苗，再进行一次茎尖培养，进一步降低基础苗中的病毒含量，并通过组织培养的方法快速繁殖，在短期内，就可以获得大量的脱毒试管苗，使引入材料迅速在生产上推广应用，取得明显的经济效益。 三、实验仪器与材料 仪器：超净工作台、酒精灯、电炉、烧杯、玻璃棒、镊子、解剖刀、接种盘、 纱布、记号笔、标签纸 试剂：75%乙醇、0.1%升汞、无菌水、MS培养基、IAA0.1mg/L、BA0.5mg/L、pH5.8-6.0、蔗糖、琼脂 材料：康乃馨带芽外植体材料 四、实验步骤 （一）培养基的配方 1、康乃馨的生芽培养基 MS+IAA(0.1mg/L)+BA(2.0mg/L)+NAA(0.2mg/L)+蔗糖30g/L+琼脂(8g/L) pH5.8-6.0,配制300ml,用培养瓶分装10~15瓶。另外需要制备无菌水10瓶，培养瓶每人3~4瓶。纱布、碟子若干，后二者分别用报纸包好一同灭菌。
2、康乃馨的继代培养基 MS+BA(0.3mg/L)+NAA(0.2mg/L)+蔗糖30g/L+琼脂(8g/L)，pH5.8-6.0,配制300ml,用培养瓶分装10-15瓶。另外需要制备无菌水10瓶，培养瓶每人3-4瓶。纱布、碟子若干后二者分别用报纸包好一同灭菌。 3、康乃馨的生根培养基 MS+生根培养基为1/2MS+NAA(0.075mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(8g/L)， pH5.8-6.0,配制0.3L，用培养瓶分装10-15瓶。另外，需要制备无菌水10瓶，每人3-4培养瓶、纱布、碟子若干后二者分别用报纸包好一同灭菌。 （二）康乃馨的生芽培养 1、无菌操作准备 将培养基、无菌水、及各种接种用具放入超净工作台，开紫外灯照射消毒20-30min,开送风开关，关紫外灯，通风10min后，打开照明日光灯。洗手、换鞋，换实验服，戴口罩，进入接种室，开启超净工作台。用纱布吸取75%酒精擦手、擦拭超净台、擦拭培养基和无菌水瓶，点燃酒精灯，镊子、解剖刀、剪刀等接种工具放入灭菌锅灭菌，待冷却后使用。 2、外植体消毒 选取康乃馨叶腋间生出的侧芽为外殖体，用自来水冲洗半小时，将材料上的泥土和灰尘及杂质冲洗干净，用解剖刀切取所需组织放入大烧杯中，用75%的酒精浸泡消毒30s，用无菌水冲洗3次，再将材料移入0.1%升汞溶液浸泡10分钟,然后在超净台内用无菌水冲洗6次。材料消毒完成。 3、外植体的制备 将消毒好的材料用无菌滤纸吸去多余的水份,然后在无菌超净工作台上的接种盘内，借助解剖刀剥离茎尖，剥取茎尖大小通常在0.3mm左右。以上操作均
器官培养：即离体器官的培养。植株培养：对完整植株材料的培养。 组织或愈伤组织培养:是对植物体的各部分组织进行培养或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株. 细胞培养:是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养. 原生质体培养:是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。 初代培养：芽、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程植物组织培养：是指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。 愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面上产生。 外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。 植物细胞全能型：任何具有完成细胞核的植物细胞，能拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 脱分化:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。 再分化:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。胚状体：在离体过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。 褐变现象：指在接种后，其表面开始褐变，有事甚至会使整个培养基褐变的现象。 继代培养材料的玻璃化：当植物材料不断的进行离体繁殖时，有些培养物的嫩芽，叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常成为玻璃化。 人工种子：通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外被有特定的物质，在适宜的条件下可以发芽成苗的植株幼体。 植板密度：形成的细胞团数/植板的细胞总数×100% 对称融合：双方原生质体均带有核基因组和细胞质基因组的全部遗传信息。 非对称融合：指一方亲本的全部原生质与另一方亲本的部分核物质及细胞质物质重组产生不对称杂种。 继代培养：是初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。目的：繁殖出相当数量的无菌苗，最后达到边繁殖边生根的目的。 细胞悬浮培养：将游离的植物细胞按一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。根据培养基的类型分为: 固体培养（琼脂、卡拉胶等固化），半液半固体培养(固液双层)，液体培养（震荡、旋转或静置培养）。 液体培养的优点：不使用凝固剂，节约生产成本，营养吸收充分；操作过程简化。 组织培养按培养对象可分为：植株培养，器官培养，组织培养，细胞培养，原生质体培养。 植物组织培养一般过程:初代培养，继代培养，生根培养，驯化移栽。 植物组织培养的特点：培养条件可以人为控制，生长周期短，繁殖率高，管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。 组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。 1902年，德国著名的植物生理学家和植物学家哈伯兰特提出了高等植物细胞全能性。1958年，美国植物学家斯图尔德等人，用胡萝卜根韧皮部的细胞进行培养，得到了完整植株，证明了细胞全能性。 怀特于1943年发表了《植物组织培养手册》专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。 腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一，这一比例高时，产生芽，这一比例低时，则形成根，相等则不分化。 标准的组培实验室包括：1、洗涤室，器具的洗涤，干燥和消毒，2、配置室，进行药品的保存，配置，消毒，分装等，3、灭菌室，培养基及使用器具的消毒与灭菌，4、接种室，进行材料的接种，内置超净工作