病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定
发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ]
一、实验目的
系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。
二、知识背景
细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项：
1．病料采集
（1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为：
①全身感染→血液及内脏；
②局部感染→病患部位；
③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织
（2）病料的采集时间也应特别注意：
①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化；
②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。
2．无菌操作
无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。
无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。
无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可
干热灭菌，胶皮塞、培养基等则要高压灭菌。
3．培养基
培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。
（1）制作培养基的基本原则
依据细菌的物质代谢要求和营养需要，必须含有细菌生长繁殖所需要的碳源、氮源、矿物质以及生长环境条件。
（2）制作培养基的基本要求
①适宜的水分和各种营养物质；
②适宜的酸碱度与渗透压；
③不含抑制细菌生长的物质；
④应均质透明；
⑤应彻底灭菌；
⑥对某些微生物必须提供一些特殊物质。
（3）培养基的种类
①基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物质；可作为一些特殊培养基的基础成分。
②加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质（如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对营养要求高的微生物。
③选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物的目的。
④鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；从而达到区分不同的微生物。
⑤厌氧培养基：利用物理、化学或生物学方法，去除氧气后的培养基；可用于厌氧性细菌的分离和培养。
4．细菌在培养基上的生长情况
（1）固体培养基
单个细菌在培养基表面生长、繁殖到一定程度时形成的肉眼可见的子细胞群落称为菌落，它是由数以万计相同的细菌集合而成。众多细菌在固体培养基表面密集生长所形成的细胞群体称为菌苔。
①菌落的形态特征
大小、形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。
据细菌菌落表面特征不同，可将菌落分为3型：
光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，新分离的细菌大多呈光滑型菌落。
粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皱纹或颗粒状，边缘大多不整齐。R型菌落多为S型细菌变异失去菌体表面多糖或蛋白质形成。R型细菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型细菌弱。但也有少数细菌新分离的毒力株就是R型，如炭疽孢杆菌、结核分枝菌等。
粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光泽、似水珠样。多见于厚荚膜或丰富粘液层的细菌、结核杆菌等。
②菌落溶血特征
α溶血：又称草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；
β溶血：又称完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；
γ溶血：即不溶血，菌落周围的培养基没有变化，红细胞没有溶解或缺损。
③色素
有些细菌产生水溶性色素，使菌落和周围的培养基出现绿色、金黄色、白色、橙色、柠檬色等颜色，产生的色素有水溶性或脂溶性。
④气味
某些细菌在培养基中生长繁殖后可产生特殊气味，如铜绿假单胞菌（生姜气味）、变形杆菌（巧克力烧焦的臭味）、厌氧梭菌（腐败的恶臭味）、白色假丝酵母菌（酵母味）和放线菌（泥土
味）等。
（2）液体培养基
细菌在液体培养基中有3种生长现象：大多数细菌在液体培养基生长繁殖后呈均匀混浊；少数链状排列的细菌如链球菌、炭疽芽胞杆菌等则呈沉淀生长；枯草芽胞杆菌、结核分枝杆菌和铜绿假单胞菌等专性需氧菌一般呈表面生长，常形成菌膜。
（3）半固体培养基
半固体培养基主要用于细菌动力试验，有鞭毛的细菌除了沿穿刺线生长外，在穿刺线两侧也可见羽毛状或云雾状混浊生长。无鞭毛的细菌只能沿穿刺线呈明显的线状生长，穿刺线两边的培养基仍然澄清透明，为动力试验阴性。
5．分离细菌所要满足的培养条件
（1）适宜的培养基条件；
（2）适宜的温度条件；
（3）适宜的气体条件。
三、细菌的分离方法
细菌分离就是把病料中的病原菌或把目的菌从微生物的混合材料中分离培养出来，并获得目的菌的单一生长材料，从而进行诊断及有关研究工作。
1．待检材料的处理
无菌采集的病料不经处理可直接用于分离；污染较严重的病料，接种前必须处理后方可进行分离培养。
（1）加热处理法
当怀疑病原菌为芽胞菌时，可加入5-10倍灭菌生理盐水研磨(液体病料除外)，75℃水浴30min(或80℃ 15-20min)，可杀死细菌繁殖体(包括杂菌及病原菌)；然后将处理过的病料接种到适当的培养基上。
（2）接种易感动物
把病料接种易感动物，待其发病死亡后，取其血液或组织器官，接种到培养基上。利用此方法不但可以从污染的材料中分离出病原菌，而且还可以确定病原菌的毒力。
（3）化学药品处理
有些化学药品对某些细菌有极强的抑制力，而对另一些细菌则没有抑制作用或很小。因此可将适宜的化学药品加入培养基中。如龙胆紫则可抑制许多G＋菌的繁殖，有利于G－菌的分离培养；
2．平板划线分离培养法
（1）培养基平板的准备
取普通琼脂培养基或含有特殊成分的琼脂培养基，融化并让其冷却至50℃左右，倾入灭菌平皿中，每个平皿约15mL，使其分布均匀，冷却凝固后即为固体平板培养基。
（2）各种物品的准备
取出待检病料，置于工作台上；接种前准备好酒精灯、接种环、火柴、酒精棉球、试管架等。如有超净工作台，应先打开通风机，过滤除尘，如有紫外线灯应同时打开，10-15min后可开始工作。不论在桌面上还是在超净工作台上接种，都要事先作好准备工作，把所用的物品器械摆好。
（3）平板划线
以左手持平板，中指、无名指和小指托着平板底,拇指和食指打开上盖，使盖与底成30o角，以便划线。
右手握接种环，先灭菌铂丝部分，待丝烧红后，再于火焰上灭菌金属棒部分。把接种环上的病料涂在培养基一侧，一般作5-8次划线。将环上的多余细菌材料烧掉后，从第1次划线引出第2次划线；再从第2次划线引出第3次划线，如此反复3-4次划线后，即可把整个平板表面划满，注意每一次划线只能与上一次划线重叠，这样就可在最后的1-2次划线上出现多量的单个菌落，以便进行纯培养。
（4）培养物的观察
病料在接种培养基后，经过一段时间，应取出来检查其生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有，则需进一步检查菌落是否纯一。
当从临床病料中分离细菌时：多数情况下，沿划线生长较多的菌落，是待检病原菌的可能性较大；少数零散分布或不在划线上生长的菌落，多为杂菌。为慎重起见，可挑选若干个可疑菌落分别进行鉴定。
3．厌氧菌的分离培养法
通常使用物理去氧、化学去氧和生物去氧，实验室常用：厌氧培养箱、厌氧肉汤
4．细菌的纯培养与移植接种
分离培养的目的就是要获得纯培养。细菌的纯培养就是只含一种细菌的培养物，最理想的纯培养是一个细菌的后代。细菌的移植接种就是把某种细菌材料移种到一个新的培养基上，使它在其上生长。
四、细菌的培养技术
根据目的和要求的差异，可采取不同的培养方法
1、表面培养
又称固体表面培养。将细菌液均匀地接种于固体培养基表面,平放静置培养，然后收集菌苔。
2、深层培养
将细菌液接种于液体培养基进行培养。包括液体静置深层培养和生物反应器（发酵罐）深层培养。
3、透析培养
根据小分子能透过半透膜扩散，而将不同分子量的物质分离原理设计的一种细菌培养装置进行细菌培养。
五、细菌的生化试验
细菌由于其种类不同，对营养物质的吸收与排出，分解与合成的能力不同，这与细菌本身所固有的和环境诱导的酶有密切关系，细菌在自然界是一种巨大的生化动力，在它们的代谢过程中往往同时产生多种代谢产物，有些对人类有利，有些会引起动植物和人类疾病，细菌的这些合成和分解代谢产物具有种的特异性，我们可借此来进行细菌种的鉴定。
1、氧化型与发酵型（O/F）的测定
（1）原理
不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因是否有氧气的存在而异，有氧条件下称为氧化，无氧条件下称为发酵。这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。
（2）培养基
成分：蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，琼脂4g，葡萄糖10g，0.2%溴麝香草酚蓝（BTB）12mL，蒸馏水1000mL
制法：将蛋白胨、琼脂、盐类和水混合，加热融解，调pH为7.2，然后加葡萄糖和指示剂，
混合加热10min，分装试管，加塞包装，115℃高压蒸汽灭菌20min，取出使成琼脂柱。
（3）试验方法
①用18-24h斜面培养物接种于两管O/F培养基，穿刺接种，距管底有一定距离。
②加lmL灭菌的液状石蜡油到一个O/F试验管作发酵试验
③ 37℃下孵育48h或更长点时间
（4）结果判定
①只在没有覆盖石蜡油的一管发酵糖产酸或产酸产气者属氧化型（或呼吸型）
②两管均发酵糖产酸或产酸产气者为发酵型
2 、糖类分解（发酵）试验
（１）原理
细菌分解糖的能力是受遗传基因控制的，是细菌含有直接分解糖的酶或诱导产生的酶作用的结果，是细菌种的特征的表现，可帮助细菌的鉴定，含糖培养基中含有指示剂，若某细菌分解糖则产酸（发酵）或产酸产气（氧化），会使培养基的指示剂改变颜色，可判断细菌是否分解某种糖或醇或其他碳水化合物。
（２）培养基
需氧菌常用邓亨氏（Dunham）蛋白胨水溶液加0.5%-0.7%的琼脂＋1.6%溴甲酚紫酒精溶液+特定糖或醇（见附录）（有市售各种微量发酵管也可用）。厌氧菌用含胨、盐、硫羟代乙醇酸钠、琼脂的高层半固体培养基半指示剂同上。
（3）试验方法
①琼脂斜面培养物用接种针挑取少量菌穿刺接种于糖发酵管深部（勿穿到管底！）。
②若所要接种的细菌营养要求高，则需要先将糖发酵管加热融化后，再加几滴除菌的马血清（牛血清也可），摇匀待凝固后再行接种（如巴氏杆菌、布鲁氏菌等）。
③将接种管标记清楚放人37℃孵育，24-48h观察结果，有的菌对某一糖的发酵属迟缓作用，则需要培养一个月之久。
（4）结果判定
无变化－培养基不变色
产酸＋培养基变黄
产酸产气⊕培养基变黄并有气泡
3、淀粉水解试验
（1）原理
有的细菌具有淀粉酶，能水解培养基中的淀粉成麦芽糖。淀粉水解后遇碘液不再呈蓝紫色反应。
（2）培养基与试剂 3%可溶性淀粉琼脂平板（见附录）和革兰氏碘溶液（见附录一）
（3）试验方法
①将细菌划线接种于3%可溶性淀粉琼脂平板上，在37℃培养24h。
②取出平板，在菌落处滴加碘液少许，观察。
③培养基呈深蓝色，说明淀粉未被水解，即淀粉酶阴性。能水解淀粉的细菌其菌落周围有透明的环（即淀粉酶阳性）。
4、吲哚（靛基质）试验
（1）原理
有些细菌（如大肠埃希氏菌）能分解蛋白质中的色氨酸生成吲哚，后者与对位二甲基氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。
（2）培养基：邓亨氏蛋白胨水溶液（见附录）。
（3）试剂：
①欧立希氏（Ehrlich's）试剂②Kovac's试剂
对位二氨基苯甲醛 1g 对位二氨基苯甲醛 5g
无水乙醇 95ml 戊醇（或异戊醇） 75ml
浓盐酸 20ml 浓盐酸 25ml
先用乙醇溶解试剂后加盐酸，避光保存。
（4）试验方法
①试管试验法：以接种环将待检菌新鲜斜面培养物接种于邓亨氏蛋白胨水溶液中，置37℃培养24-48h （可延长4-5d）。于培养液中加入戊醇或二甲苯2-3mL，摇匀，静置片刻后，沿试管壁加入欧立希氏或Kovacs试剂2mL。在戊醇或二甲苯下面的液体变为红色者为阳性反应。
②斑点试验法：将一片滤纸放在培养皿的盖子上或一张载玻片上；滴加1-1.5ml试剂液于滤纸上使其变湿；取18-24h血琼脂平板培养物涂布于浸湿的滤纸上；在1-3min内棕色的试剂由紫红变为红色者为阳性。
③加热试验法：将一小指头大的脱脂棉，滴上两滴欧立希氏试剂，再在同一处加滴上两滴高硫酸钾（K2S2O8）饱和水溶液，置于含培养液的被检试管中，离液面约半寸；将被检试管放入烧杯或搪瓷缸水浴煮沸为止；脱脂棉上出现红色者为阳性。。
5、甲基红（M.R）试验／维倍（V-P）二氏试验。
（1）原理
甲基红是一种pH指示剂，pH的变色范围为pH4.4（红色）—pH6.2（黄色），当细菌分解培养基中葡萄糖产酸，且产酸量大致使培养基在加入甲基红指示剂后显红色为阳性。V-P试验则是某些细菌能使葡萄糖发酵而产生丙酮酸，丙酮酸再变为乙酰甲基甲醇，乙酞甲基甲醇又变成2,3,丁二烯醇，2,3,丁二烯醇在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用产生粉红色化合物。通常M.R和V-P试验是密切相关的，如果一个微生物M.R是阳性，则V-P是阴性；或者相反。这个试验对区别大肠埃希氏菌与肠杆菌是特别有用的。
（2）培养基葡萄糖蛋白胨水溶液（见附录）。
（3）试剂
① M.R试剂
甲基红 0.02g
95%酒精 60mL
蒸馏水 40mL
② V.P试剂
甲液：α萘酚酒精溶液（α萘酚5g无水乙醇100mL）
乙液：KOH溶液（KOH 40g，水100mL）
将甲液和乙液分装棕色瓶中，于4-10℃保存。
或
硫酸铜 1g
浓氨水 40mI
10%KOH 950mL
蒸馏水 10mL
待溶解后分装棕色瓶中备用。
（4）试验方法
? M.R试验：接种细菌于培养基中，在37℃培养24-48h后。于培养物中加入几滴试剂，变红色者为阳性反应，桔红到黄色则为阴性。
? V-P试验:取出培养24hV.P试验用葡萄糖蛋白胨溶液lmL。将6%小萘酚酒精溶液0.5mL加入，随后加16%KOH 0.5mL，轻摇，然后让其静置10-15min。在15min内出现红色者则为阳性，1h后可出现假阳性。
6、柠檬酸盐利用试验
（1）原理
在这个培养基中柠檬酸钠为唯一的碳源，磷酸铵是唯一的氮源，若细菌利用这些盐作为碳素和氮素来源而生长，利用柠檬酸钠则生成碳酸盐以及铵盐被利用所产生的NH3+转变为NH4OH，使培养基变碱，pH升高，指示剂溴麝香草酚蓝就显出深蓝色。
（2）培养基
西蒙氏（Simmon's）柠檬酸钠琼脂斜面培养基（见附录）。
（3）试验方法
将被检菌纯培养物或单个菌落划线于柠檬酸钠琼脂斜面并在37℃培养24-48h。肠杆菌、枸椽酸杆菌和一些沙门氏菌种产生阳性反应，可见菌体生长好或培养基显为深蓝色。
7、石蕊牛乳试验
（1）原理
石蕊是一种指示剂，当pH升至8.3时碱性显蓝色，pH降至4.5时酸性显红色；pH接近中性，
未接种的培养基为紫蓝色故称紫乳。石蕊也是一种氧化还原指示剂，可以还原为白色，所以，石蕊牛乳（紫乳）是用来测定被检细菌几种代谢性质的一种鉴别培养基。
（2）培养基
加石蕊酒精饱和溶液于新鲜脱脂乳中，分装小管，经流通蒸汽灭菌而成。
（3）试剂
石蕊酒精溶液的制备：8g石蕊在30mL的40%乙醇中研磨，吸出上清液，加乙醇研磨，连续两次。加40%乙醇总量100mL，并煮沸1min。取用上清液，必要时可加几滴1mol/L盐酸使呈紫色。现多用溴甲酚紫代替石蕊，即于100mL脱脂乳中加1.2mL 1.6%溴甲酚紫酒精溶液。
（4）试验方法与解释
将被检菌接种于紫乳，置37℃温箱培养，观察结果。若细菌分解乳糖产酸，指示剂变色（石蕊为红色，溴甲酚紫为黄色）。若产酸产气，使牛乳酸凝，气体使凝块中有裂隙，如产气荚膜梭菌呈“暴烈发酵”。若为紫色，表示乳糖虽未分解；若为蓝色表示乳糖虽未发酵，但细菌分解培基中所出现的氮源物质而产碱所致。若指示剂还原则为无色，常出现在酸凝块形成之后。
8、硫化氢试验
（1）原理
凡细菌能分解含硫氨基酸，产生H2S者，其所产生的H2S会使培养基中的醋酸铅（或含醋酸铅的湿润滤纸条）或FeCl3形成黑色的硫化铅或硫化铁。
（2）培养基
①醋酸铅琼脂（见附录）。
②三糖铁琼脂斜面（见附录）。
③营养肉汤，肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面。
（3）试验方法与解释
①用接种针蘸取纯培养物，沿试管壁作穿刺，37℃孵育24-48h或更长时间，培养基变黑者为阳性。
②或将纯培养物接种于肉汤，肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面，在试管壁和棉花塞间夹一6.5×0.6cm大小的试纸条（浸有饱和醋酸铅溶液＊），培养于37℃，观察，纸条变黑者为阳性。
9、硝酸盐还原试验
（1）原理
有些细菌能从硝酸盐提出氧而将其还原为亚硝酸盐（偶而还会形成NH3+ N2、NO、NO2和NH4OH 的其它产物），若向培养物中加入对氨基苯磺酸和α-萘胺，会形成红色的重氮染料对磺胺苯-偶氮-α-萘胺，这对鉴定细菌是有用的试验（锌也可还原硝酸盐为亚硝酸盐，而且对区别假阴性反应和真阴性反应是有用的）。
（2）培养基
①适用于需氧菌的硝酸钾蛋白胨水。
②适用于厌氧菌的硝酸盐培养基。
（3）试剂
甲液：甲基α-萘胺0.6g 5mo1/L冰醋酸100mL
稍加热溶解，用脱脂棉过滤，放棕色瓶中，4-10℃保存。
乙液：对氨基苯磺酸0.8g 5mol/L冰醋酸100mL
先用5mo1/L冰醋酸30mL溶解对氨基苯磺酸，再加冰醋酸至100mL。放入带玻璃塞的玻璃瓶中4-10℃保存。
（4）试验方法与解释
用纯菌培养物接种到硝酸盐培养基中，在37℃培养18-24h，再加试剂甲和乙各3-5滴，在30s内出现红色即为阳性。若无颜色出现，加少量锌渣，随后出现红色则是真正的阴性试验。
10、尿素酶试验
（1）原理
细菌分解尿素产生两分子氨，使培养基pH升高，指示剂酚红显示出红色，即证明细菌有尿素酶。
（2）培养基 Christensen's尿素琼脂培养基，内含尿素，蛋白陈和酚红指示剂（见附录）。
（3）试验方法
用接种环将待检菌培养物接种于尿素琼脂斜面，不要穿刺到底，下部留作对照。置37℃培养，于1-6h检查（有些菌分解尿素很快），有时需培养24h到6d（有些菌则缓慢作用于尿素）。
阳性反应，则琼脂斜面由粉红到紫红色。
11、接触酶试验
（1）原理
本试验是检测细菌有无接触酶的存在，过氧化氢的形成看作是糖需氧分解的氧化终未产物，因为H2O2的存在对细菌是有毒性的，细菌产生酶将其分解，这些酶为接触酶（过氧化氢酶）和过氧化物酶。
（2）试剂 3%H2O2（新配）。
（3）试验方法与解释
可用接种环将一菌落放于载玻片的中央，加一滴3%H2O2于菌落上，立即观察有无气泡出现，也可在菌落和H2O2混合物之上放一张盖玻片，可帮助检出轻度反应，还可降低细菌的气溶胶颗粒的形成。也可直接将3%H2O2加到培养琼脂斜面或平板上直接观察有无气泡出现（血琼脂平板除外）。
12、氧化酶试验
（1）原理
测定细菌细胞色素氧化酶的产生。阳性反应限于哪些能够在氧气存在下生长的同时产生细胞内细胞色素氧化酶的细菌。
（2）试剂
1%四甲基对苯二胺（Tetra-methy-p-phenylene diamine dihydrochloride），新鲜配制，装棕色瓶贮存4℃，一个月。
（3）试验方法
加2-3滴试剂于滤纸上，用一搅拌签挑取一个菌落到纸上涂布）观察菌落的反应。阳性反应在5-10s内由粉红到黑色，15min后可出现假阳性反应。也可将试液滴在细菌的菌落上，菌落呈玫瑰红色然后到深紫色者为阳性。也可在菌落上加试液后倾去，再徐徐滴加用95%酒精配制的1%的（α-萘酚溶液，当菌落变成深蓝色者为细胞色素氧化酶阳性。
（4）注意事项
①作时只能使用搅拌签（或铂金环），因为铁丝会出现假阳性反应。
②不要使用含葡萄糖培养基上生长的菌落，因为它的发酵作用会抑制氧化酶的活性，可能给予假阴性结果。
13、苯丙氨酸脱氨酶试验
（1）原理
若细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，能将培养基中的苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，酮酸能使三氯化铁指示剂变为绿色。变形杆菌和普罗菲登斯菌以及莫拉氏菌有苯丙氨酸脱氨酶的活力。
（2）培养基与试剂
①培养基：DL-苯丙氨酸2g，氯化钠5g，（L苯丙氨酸1g），琼脂12g，酵母浸膏3g，磷酸氢二钠1g，蒸馏水1000mL，分装于小试管内，121℃高压蒸汽灭菌10min，作成斜面。
②试剂：10% FeCl3水溶液
（3）试验方法
将被检菌18-24h培养物取出，向试管内注入0.2mL（或4-5滴）10%FeCl3，溶液于生长面上，变绿色者为阳性。
14、氨基酸脱羧酶试验
（1）原理
这是肠杆菌科细菌的鉴别试验，用以区分沙门氏菌（通常为阳性）和枸椽酸杆菌（通常为阴性），若果细菌能从赖氨酸或鸟氨酸脱去羧基（-COOH），导致培养基pH变碱，指示剂溴麝香草酚蓝就显示出蓝色，试验结果为阳性。若细菌不脱羧，培养基不变则为黄色。
（2）培养基
基础培养基：蛋白胨5g 酵母浸膏 3g
葡萄糖1g 蒸馏水1000mL
0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12mL
? 调整pH至6.8，在每100mL基础培养基内，加入需要测定的氨基酸0.5g，所加的氨基酸应先溶解于1.5%NaOH溶液内。
L-α赖氨酸0.5g＋1.5%NaOH溶液0.5mL
L-α乌氨酸0.5g＋1.5%NaOH溶液0.5mL
? 加入氨基酸后，再调整pH至6.8，分装于灭菌小试管内，每管1mL，121℃高压蒸
汽灭菌10min。
（3）试验方法
1）从琼脂斜面挑取培养物少许，接种于试验用培养基内，上面加一层灭菌液状石蜡。
2）将试管放在37℃培养4d，每天观察结果。
3）阳性者培养液先变黄后变为蓝色，阴性者为黄色。
15、β-半乳糖苷酶（ONPG）试验（Ortho-nitrophenyl-β-Dgalactopyranoside Test）
（1）原理
细菌分解乳糖依靠两种酶的作用，一种是β-半乳糖苷酶透性酶（β-galactosidase permease），它位于细胞膜上，可运送乳糖分子渗人细胞。另一种为β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），亦称乳糖酶（Lactase），位于细胞内，能使乳糖水解成半乳糖和葡萄糖。具有上述两种酶的细菌，能在24-48h发酵乳糖，而缺乏这两种酶的细菌，不能分解乳糖。乳糖迟缓发酵菌只有β-D-半乳糖苷酶（胞内酶），而缺乏β-半乳糖苷酶透性酶，因而乳糖进入细菌细胞很慢，而经培养基中1%乳糖较长时间的诱导，产生相当数量的透性酶后，始能较快分解乳糖，故呈迟缓发酵现象。ONPG可迅速进入细菌细胞，被半乳糖苷酶水解，释出黄色的邻位硝基苯酚（Ortho-nitrphenyl，ONP），故由培养基液变黄可迅速测知β-半乳糖苷酶的存在，从而确知该菌为乳糖迟缓发酵菌。
（2）培养基ONPG培养基
成分：邻硝基酚β半乳糖苷0.6g，0.01mol/L pH7.5磷酸缓冲液1000mL，pH7.5的灭菌1%蛋白胨水300mL。
制法：先将前两种成分混合溶解，滤过除菌，在无菌条件下与1%蛋白胨水混合，分装试管，每管2-3mL，无菌检验后备用。购不到ONPG时，可用5%的乳糖，并降低蛋白胨含量为0.2%-0.5%，可使大部分迟缓发酵乳糖的菌在1d内发酵。
（3）试验方法
取一环细菌纯培养物接种在ONPG培养基上置37℃培养1-3h或24h，如有β半乳糖苷酶，会在3h内产生黄色的邻硝基酚；如无此酶，则在24h内不变色。
16、明胶液化试验
（1）原理
明胶是一种动物蛋白质，某些细菌具有明胶液化酶，明胶经分解后，可呈现不同的特征，有利于细菌的鉴定。
（2）培养基明胶培养基（见附录）。
（3）试验方法与注意事项
①分别穿刺接种被检菌18-24h培养物于明胶培养基，置22℃下孵育，观察明胶液化状况。明胶低于20℃凝成固体，高于24℃则自行呈液化状态，因此孵育温度最好在．22℃，但有些细菌在此温度下不生长或生长极为缓慢，则可先放在37℃培养，再移置于4℃冰箱经30min 后取出观察，具有明胶液化酶者，虽经低温处理，明胶仍呈液态而不凝固。
②明胶耐热性差，若在100℃以上长时间灭菌，能破坏其凝固性，此点在制备培养基时应注意。
17、胆汁溶解试验
（1）原理
肺炎链球菌产生自溶酶，它能使正在生长的菌体溶解，使老龄菌落中心下陷，胆盐通过降低培养基与菌体细胞膜之间的表面能力而加速这一过程。本试验常用以鉴别肺炎链球菌和甲型溶血性链球菌。
（2）试剂 2%去氧胆酸钠溶液
（3）试验方法与解释
于被检菌血琼脂平板上找到单个分散的菌落，在其上加一滴试液。再置37℃培养箱中30min 后取出观察菌落，可见菌落消失，或尚有部分保留。培养菌在肉汤中生长，而且固体培养平板上菌落周围一个黑洞（孔）者是D群链球菌的指示。
六、细菌的毒力检测
1．毒力的概念
同种病原微生物不同菌株或毒株的不同程度的致病能力。即致病性的强弱。构成毒力的物质称为“毒力因子”
2．构成毒力的因素
细菌毒力的强弱主要取决于两大方面：侵袭力和毒素
（1）侵袭力
指微生物突破宿主机体防卫屏障，侵入宿主活组织并在其中生长繁殖和向四周扩散的能力。包括：侵袭性酶和菌体表面结构
①侵袭性酶属胞外酶，对细菌本身无毒性作用；但可破坏机体内的一些防止或减低异物向组织内渗透的物质，从而在感染过程中协助病原菌抗吞噬或扩散。
②菌体表面结构
G－菌：菌毛，受体是糖蛋白。
G+菌：菌体表面的突出物。如A型链球菌的膜磷壁酸,受体是类蛋白和糖蛋白
荚膜和微荚膜：有抗吞噬、抗体液中杀菌物质的作用，使病原菌能留在宿主体内迅速繁殖，产生病变。所以有荚膜的细菌的毒力比该种细菌失去荚膜时的毒力明显增强。
（2）毒素（Toxin）
有些病原微生物能产生强有力的特殊毒性物质，可大大增强微生物的毒害作用，这种毒性物质就叫做毒素。
（3）毒力岛（pathogenicity island，PAI）
毒力岛也称致病岛；是指细菌染色体上分子量较大(通常>30kb)、G+C mol%及密码使用与宿主菌染色体有明显差异的毒力基因簇。
许多病原菌中都存在毒力岛，毒力岛和病原菌的毒力进化密切相关。目前已在致病性大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耶尔森氏菌、幽门螺杆菌、霍乱弧菌等细菌中发现毒力岛的存在。
致病性大肠杆菌常见的毒力岛
① LEE毒力岛（locus of enterocyte effacement）
“黏附和抹平”（attaching and effacing，A/E）
②耶尔森氏菌强毒力岛（high pathogenicity island，HPI）
铁的摄取、色素沉着、鼠疫菌素
3．毒力因子的检测
（1）免疫学方法
（2）细胞试验
（3）动物试验
（4）毒力基因的检测
七、注意事项
微生物学工作必须在一个清洁卫生的环境中进行，实验室的整洁与否直接影响实验效果。在卫生状况差而零乱的实验室中不可能取得好的实验效果；实验室脏、乱，不但增加了污染的机会，同时也影响人的安全和情绪，所以，清洁、明亮的实验环境是顺利开展工作的保障之一；保持实验室清洁是学生进入实验应尽的责任。
学生姓名：班级：
动物种类：
发病情况：
病料来源：
疑似何种细菌感染：
需要提供的培养基：
需要提供的仪器：
预约实验时间：
提交：jsyzcdr@https://www.doczj.com/doc/de7553671.html,
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】
一、实验目的 熟悉水产细菌性病原的分离、培养、纯化与鉴定的基本方法，了解所分离细菌性病原的形态特征及培养特点，了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程。 二、实验材料 患白内障病虎纹蛙（或其他患细菌性疾病的水产动物）、健康虎纹蛙、脑膜炎败血黄杆菌（虎纹蛙白内障病的病原） 三、实验药品、用具 2216E 琼脂平板、 2216E 琼脂斜面、福尔马林、无菌蒸馏水、生理盐水、磷酸缓冲液、接种环、解剖刀、剪刀、镊子、滴管、纱布、白瓷盘、酒精棉球、灭菌试管、 96 孔板、注射器、酒精灯、离心机（包括离心管）、水族箱、记号笔 四、实验操作程序 （一）病原菌的分离与鉴定 1 ．培养基的制备 （ 1 ）普通肉汤培养基： 按以下剂量称取各种试剂（先称取盐类再称蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 5g 磷酸氢二钾 1g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 氯化钠 5g pH 7 . 4 ～ 7 . 6 初配好的培养基呈酸性故要用 NaOH 调整。将 pH 测定后的肉汤培养基用滤纸过滤，将过滤好的肉汤分装试管、盐水瓶、三角烧瓶等容器，待灭菌。 （ 2 ）普通营养琼脂培养基 普通肉汤 1000ml
琼脂 20g 琼脂是由海藻中提取得一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用，但在水中加温可融化，冷却后可凝固。在液体培养基中加入琼脂 1 . 5 ～ 2 ％即可固定培养基，如加入 0 . 3 ～ 0 . 5 ％则成半固体培养基。 将称好的琼脂加到普容肉汤中，加热煮沸，待琼脂完全融化后，将 pH 调至 7 . 4 ～ 7 . 6 。琼脂融化过程中需不断搅拌，并控制火力，不使培养基溢出或烧焦，并注意补充蒸发掉的水份。 加热溶解好的培养基可用滤纸进行过滤，固体培养基要用 4 层纱布趁热过滤（切勿使培养基凝固在纱布上），之后按实验要求，将配制好的培养基分装入试管或三角瓶中，包扎好待灭菌，将培养基置于高压蒸汽锅内，121 ℃ 灭菌 15 ～ 30min ，趁热将试管口一端搁在玻棒上，使之有一定斜度，凝固后即成普通琼脂斜面，也可直立，凝固后即成高层琼脂。 盐水瓶中的普通琼脂以手掌感触，若将瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持者，此即为倾倒平皿的合适温度（ 50 ～60 ℃ ），每只灭菌培养皿倒入约 15 ～ 20ml ，将皿盖盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即成普通琼脂平板。 培养基中的某种成分，如血清、糖类、尿素、氨基酸等在高温下易于分解、变性，故应过滤除菌，再按规定的量加入培养基中。 2 ．病原菌的分离与培养 分离病原菌的材料要求是具有典型患病症状的活的或刚死不久的患病生物，病原菌的分离方法如下。 体表分离：先将病灶部位表面用 70% 酒精酒精棉球擦拭消毒或取病灶部分小片或用经酒精灯灼烧的解剖刀烫烧消毒，再用接种环刮取病灶深部组织或直接挑取部分深部患病组织，接种于普通肉汤培养基增菌或直接在普通琼脂平板上划线分离。 内部组织器官：用 70 ％酒精浸过的纱布覆盖体表或用酒精棉球擦拭，进行体表消毒，无菌打开病鱼的腹腔，以肝、肠、心脏等脏器为材料，先将拟分离病原的部位表面用 70% 酒精棉球擦拭或用经火焰上灼烧
病原细菌的分离与鉴定.txt24生活如海，宽容作舟，泛舟于海，方知海之宽阔；生活如山，宽容为径，循径登山，方知山之高大；生活如歌，宽容是曲，和曲而歌，方知歌之动听。病原细菌的分离与鉴定 发布日期：2009-05-09 浏览次数：827 字号：[ 大中小 ] 一、实验目的 系统学习兽医临床病原细菌的分离与鉴定技术，促进学生系统掌握各类病原细菌的基本特性与实验诊断技术，增强学生应用所学知识解决生产实践过程中的传染病的诊断和防控问题的能力，为预防、控制和消灭畜禽病原微生物，保障畜牧业生产的健康发展服务。 二、知识背景 细菌分离是细菌学检验中的极其重要的环节。正确的分离有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断与防控至关重要。在细菌分离时应注意的事项： 1．病料采集 （1）病料的种类主要决定于疫病的性质，一般方法为： ①全身感染→血液及内脏； ②局部感染→病患部位； ③特殊病例→特殊处理。特殊情况的正确处理与操作者的专业知识有很大关系。无论全身或局部感染，均应采含菌最多或病变明显的组织 （2）病料的采集时间也应特别注意： ①活体病料→应考虑病原在疾病发展过程中部位的变化； ②患畜死后→应立即采集病料，越早越好。 2．无菌操作 无菌操作是指在微生物研究过程中，既要避免各种外界的微生物进入操作对象又要杜绝操作对象污染周围环境的操作技术。 无菌操作是对微生物学工作者最基本的要求，必须经过严格训练才能形成无菌操作素养。不论何种情况下，头脑中都应该有这个概念。 无菌操作贯穿于整个分离过程，例如：病料的采集、器材的准备、具体的操作。所用器械及物品均应事先灭菌备用，金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min，玻璃器皿可高压灭菌也可
从土壤里分离及鉴定细菌的实验方案 1实验材料：新鲜土壤。 a)培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基；高氏一号培养基；马铃薯蔗糖培养基； 细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培 养基；LB培养基 b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95% 乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等 c)仪器：有玻璃珠100ml三角瓶（1）、培养皿（50套）、试管（20支）、移液 管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U 型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无 菌操作台、灭菌锅、纱布，电子天平、记号笔，火材等 相关培养基的配方:
1.1实验总流程 1土壤取样：
2制备土壤稀释液： 2.1. 称取土壤1g，放入99mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，即为稀释10-2的土壤悬液。 2.2. 另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔分别编上10-3、10-－4、10-5、10-6。取已稀释成10-2的土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10-3的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10-3土壤稀释液。同法依次连续稀释至10-4、10-5 、10-6,10-7土壤稀释液。 在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管（或枪头） 3倒平板富集培养 3.1 按照配方分别在三种培养基上富集培养，每一个稀释梯度每一个培养做三个平行实验。 3.2吸取稀释液 取一吸管，以无菌操作法分别吸取10-4、10-5、10-6,10-7土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。 3.3涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。 3.4计算出每克土壤中细菌的数量。 细菌数=某一培养皿内真菌的菌落数×该培养皿接种液的稀释倍数即得 4分离 4.1配置LB培养基
肠道致病菌得分离与鉴定 一、实验目得 （1）掌握肠道致病菌得分离、鉴定得主要步骤 （2）掌握平板划线分离法 （3）掌握玻片凝集试验得操作方法以及实际意义 二、实验材料 （1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基（EMB）、克氏双糖铁培养基（KIA）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基 三、实验流程 （1）肠道致病菌得分离 ①待测标本得制作：把接种环放置于点燃得酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌得接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水得试管中，混匀。 ②细菌得分离接种：用接种环取适量配置好得细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMB培养基。将培养基置于37℃培养18~24小时。 （2）肠道致病菌得纯化 ①单菌落接种：从已培养待测细菌得EMB培养基上用已灭菌得接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37℃培养18~24小时。 ②待测细菌得初步判断：取出已纯化培养待测细菌得KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌就是致病菌或就是非致病菌。
（3）肠道致病菌得鉴定 ①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管内得小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌得接种针取已培养得KIA培养基上得培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37℃培养18~24小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ②动力检查：用已灭菌得接种针取KIA培养基上得培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37℃培养18~24小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌得接种环分别取KIA培养基上得培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经1~2min观察两格中有无凝集现象。注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧得酒精灯附近进行实验操作。 四、实验结果与分析 （1）EMB培养基现象与分析： ①培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。 ②分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中得物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与
竭诚为您提供优质文档/双击可除 病原菌的分离鉴定 篇一：常见病原菌采样分离过程 金黄色葡萄球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）奶样的采集： 采集有乳房炎和隐形乳房炎症状较明显的奶牛，消毒挤奶人手、奶牛乳头，弃2-3把乳，以乳样收集管无菌收集每个乳区乳样10-30mL，编好编号，4个乳区按：左前LF、左后Lh、右前RF、右后Rh编号，采集后尽快返回实验室，如不能尽快返回，应放在低温环境中带回。 （2）乳房皮肤拭子 用0.5mL肉汤润湿的消毒棉球拭子从乳房皮肤檫拭到乳头顶端，如果乳房土较多的话先檫掉土。拭子放入5mL离心管中，再放入冰盒中，迅速带回实验室处理。 （3）鼻腔拭子 用消毒棉球拭子插入动物鼻腔中，取出后放到盛有 0.5mL肉汤的5mL离心管中，放入冰盒中，迅速带回实验室
处理。 菌种的初步分离 首次分离时，用接种环蘸取样品在科玛嘉金黄色葡萄球菌显色平板上涂布接种，37℃，16-18小时培养后，从显色平板上挑取红色的单菌落，用脑心浸液（bhI）肉汤35℃培养18小时左右。 需要注意的是金葡菌初次分离时，接种显色培养基后培养时间最好不超过18h进行观察，因为超过24h后所有的葡萄球菌属细菌皆会导致显色培养基变色，进而出现假阳性。 2、菌种的保存 2mL灭菌离心管中加入400μL新鲜菌液+200μL60%灭菌甘油，-80℃（长期）或-20℃（临时）冻存。 3、菌种的复苏 如需再次纯化，或进行进一步实验，可将甘油保种的菌液在显色平板或哥伦比亚血琼脂平板上划线培养，或者将保种的菌液直接接入液体培养基培养。 肠球菌采样分离过程 1、样本采集及初步分离 （1）肛门拭子 以灭菌长棉签采集猪肛门拭子或蘸取新鲜粪便，棉拭子应以捻转方式插入肛门4-5厘米深，取出后放入1mL营养肉汤的灭菌离心管中，如不能立即接种，应放于低温环境中迅
JIANGXI AGRICULTURAL UNIVERSITY 本科毕业论文（设计） 题目：土壤中解磷细菌的分离与初步鉴定 学院：生物科学与工程学院 姓名： 学号： 专业：生物工程 年级： 指导教师：职称： 二0一一年五月
摘要 目的：通过分离、筛选与纯化，从土壤中筛选出具有解磷能力的菌株。方法：根据解磷圈大小判断其解磷能力。从桔子、柚子、石榴3种不同植物根系土壤中分离出降解无机磷的解磷菌，通过平板法进行初筛，根据水解圈直径和菌落直径比值大小筛选到水解圈直径和菌落直径比值较大的菌株,连续纯培养五代，选择遗传稳定的解磷菌,进一步通过液体摇瓶培养复筛，最后筛选出分解无机磷能力较强且能稳定遗传的菌株。结果：从桔子根际土壤中分离降解出了三株透明圈明显的解磷菌，筛选出两株水解圈直径(D)与菌落直径(d)比值较大的解磷菌，1号菌株水解圈直径(D)／菌落直径(d)为2.625，2号菌株水解圈直径(D)／菌落直径(d)为2.44，经过五代培养，将稳定性最好的菌株进行液体摇瓶培养7天，然后进行解磷能力测定，测得结果是菌株1号水溶性磷含量为31.13mg ∕L，菌株2号水溶性磷含量为25.43mg∕L，具有较强解磷能力。结论：通过菌落形态观察以及水溶性磷含量的测定结果可鉴定菌株为无机磷解磷细菌。 关键词：果树根际土壤，解磷菌，无机磷，分离，鉴定
Abstract Objective: the separation, purification, from screening and soil were XieLin ability with the strain. Methods: according to the size XieLin circle XieLin judge its ability. From orange, grapefruit, pomegranate 3 kinds of different plant roots isolated soil degradation of inorganic phosphorus XieLin bacteria, through the flat screen, according to early method of hydrolysis circle diameter and colonies diameter ratio size screening to hydrolysis circle diameter and the ratio of larger diameter strains colony, continuous pure cultivate generation, choose the genetic stability XieLin bacteria, further through the liquid wave flask culture after screen, finally selected decomposition inorganic phosphorus ability stronger and can stable genetic strain. Results: from orange rhizospheric soil degradation out isolated transparent circle obvious reason XieLin bacterium, two strains were hydrolyzed circle diameter (D) and colonies diameter (D) XieLin bacterium, the ratio of larger diameter strains hydrolysis circle 1 (D) / colonies diameter (D) for 2.625, 2 strains hydrolysis circle diameter (D) / colonies diameter (D) for 2.44, after five dynasties, the best training for liquid stability strains flask culture seven days, wave XieLin ability and determination of measurement results is, water-soluble phosphorus strains 1 for 31.13 mg/L, water-soluble phosphorus strains 2 for 25.43 mg/L XieLin ability, strong. Conclusion: through the colony morphology observation and the measured results of water-soluble phosphorus can be identified for inorganic phosphorus XieLin strains of bacteria. Keywords:Fruit trees rhizosphere, XieLin bacteria, inorganic phosphorus, separation, appraisal
乳酸菌的分离、纯化与鉴定 第一部分：乳酸菌的分离、纯化 一、实验器材: 1.实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g； 2.仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿（φ9或φ12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤： 1.培养基配制（BCG牛乳培养基）： （A）溶液：取脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml，混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min；（1.6%溴甲苯酚绿（BCG）乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成） （B）溶液：酵母膏10g，水500ml，CaCO3 10g，琼脂20g，加热溶解，用精密pH试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌 20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2.药品配制 2.1 结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中）20ml，1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。 2.2 卢哥氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘使之完全溶解，再加入蒸馏水300ml即成。 2.3 蕃红溶液：番红2.5g，95%乙醇100ml，溶解后存于密闭的棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。
肠道致病菌的分离与鉴定 一、实验目的 (1)掌握肠道致病菌的分离、鉴定的主要步骤 (2)掌握平板划线分离法 (3)掌握玻片凝集试验的操作方法以及实际意义 二、实验材料 (1)实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、 (2)实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝培养基(EMB、克氏双糖铁培养基(KIA)、葡萄糖发酵管、乳糖发酵管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基 三、实验流程 (1)肠道致病菌的分离 ①待测标本的制作：把接种环放置于点燃的酒精灯火焰处对其进行灭菌，用已灭菌的接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有5ml生理盐水的试管中，混匀。 ②细菌的分离接种：用接种环取适量配置好的细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于EMBt养基。将培养基置于37C培养18~24小时。 (2)肠道致病菌的纯化 ①单菌落接种：从已培养待测细菌的EMB培养基上用已灭菌的接种针挑取某单个菌落接种到KIA培养基上，一部分直接深入培养基中底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于37 C培养18~24小时。 ②待测细菌的初步判断：取出已纯化培养待测细菌的KIA培养基，观察现象，初步断定该细菌是致病菌或是非致病菌。
（3）肠道致病菌的鉴定 ①生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意管 内的小倒管则应充满液体，不含气泡），用已灭菌的接种针取已培养的KlA 培养基上的培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37 C培养18~24小时。取出并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ②动力检查：用已灭菌的接种针取KIA培养基上的培养物分别接种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37 C 培养18~24小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基 中，并观察记录现象。（注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进行灭菌） ③血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各取生理盐水一滴，再用已灭菌的接种环分别取KIA培养基上的培养物加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。（注意每次使用接种环前都应用酒精灯火焰进行灭菌）然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清，混匀不摊开，轻轻摇动玻片，经1~2min观察两格中有无凝集现象。注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因而可在燃烧的酒精灯附近进行实验操作。四、实验结果与分析 （1）EMB培养基现象与分析： ①培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面有细菌明显蔓延生长。 ②分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基中的物质并产出硫化氢气体，由于培养基中含铁，因而硫化氢能够与其结合成硫化铁，出现黑色现象；而上部因重力含铁量较少，产生的硫化氢气体又部分挥