中南民族大学
硕士学位论文
蕲艾鞣酸的提取分离、药理研究和结构鉴定
姓名：易筠
申请学位级别：硕士
专业：有机化学
指导教师：洪宗国
2011-05
中南民族大学硕士学位论文
摘 要
艾叶（Artemisiae argyi）为菊科（Asteraceae）蒿属(Artemisia)植物，主要分布于亚洲东部地区，普遍生长于路旁荒野、草地。只要是向阳而排水顺畅的地方就能生长，但以湿润肥沃的土壤生长较好。本属植物资源极其丰富，近年来研究发现该属植物具有明显的抗氧化、抗癌等药理作用，引起了众多学者对该属植物研究的兴趣。其中对艾叶（Artemisiae argyi）的研究比较广泛，从该植物中分离得到了大量化学成分，并探索出各种活性能力。
本文以中药艾叶为研究对象，探索提取艾叶鞣酸的最佳工艺方法，并测定了不同地区艾叶中总鞣酸的含量，研究了蕲艾鞣酸清除自由基的能力﹑体外凝血作用﹑以及抗肿瘤等药理作用，并分析了蕲艾中的有效成分，鉴定其化合物的结构，。具体工作如下：
1. 采用超声波法提取艾叶中鞣酸，通过四因素三水平正交试验探讨超声波提取艾叶中鞣酸的最佳工艺条件，并对湖北蕲春、安徽霍山、山东鄄城、江西樟树、河北安国五个产地艾叶中的总鞣酸含量进行分析比较，结果表明在超声温度60℃,超声功率150W，超声时间20min，固液比1:25，丙酮：水4:6的条件下鞣酸的提取率最高，其中湖北蕲春的艾叶总鞣酸含量达到13.29%，是所有研究品种中含量最高的，说明蕲春作为艾叶的地道产地具有实验依据。
2.通过Fenton反应产生·OH，连苯三酚自氧化产生O2－?模型，采用紫外分光光度法，研究蕲艾总鞣酸体外清除自由基的能力，结果表明蕲艾总鞣酸在1.0～10.0 mg/mL范围内对羟自由基和超氧阴离子自由基均具有清除作用，两者均呈现明显的量效关系，最有效的清除浓度均为8.0mg/mL，清除自由基能力均高于同等浓度的甘露醇，但低于同等浓度的抗坏血酸。
3.通过MTT法在体外检测不同浓度的蕲艾鞣酸对人肝癌细胞HepG2的细胞毒性作用，在此基础上以大孔树脂柱层析和薄层纯化对蕲艾总鞣酸正丁醇部位提取分离，得到6个不同极性的鞣酸馏分，并通过MTT法比较不同极性的各提取物对肝癌细胞的增殖影响。其结果显示蕲艾鞣酸使体外培养的人肝癌细胞HepG2的凋亡细胞数增加，增值效率下降且呈浓度与时间的依赖关系。6个不同极性的提取物均具有抑制肝癌细胞生长的作用，其中40%甲醇部位对肝癌细胞的生长抑制作用最强，是蕲艾鞣酸体外抗肝癌主要的活性部位。
4. 将蕲春艾叶中不同组分按照传统方法进行炮制或者提取分离，得到六个不同组分，分别为：5一叔丁基连苯三酚、艾炭、艾灰、艾叶挥发油、鞣酸和艾焦油，使用家兔对以上六个组分分别进行了体外凝血试验，结果显示蕲春艾叶鞣酸的凝血效果最好，是主要的凝血物质。
5. 针对蕲艾的活性成分进行了系统的提取分离和结构研究，在实验过程中
蕲艾鞣酸的提取分离、药理研究和结构鉴定
使用大孔吸附树脂层析﹑硅胶柱层析﹑反相硅胶柱层析﹑薄层层析等方法，从湖北蕲春艾叶中提取分离出两个纯净化合物，结合红外﹑紫外和核磁等现代仪器鉴定分析单体化合物为：（A）5,6-二羟基-3’4’5’-三甲氧基黄酮，（B）丙基-2-丁烯醚。以上两种化合物均首次从该植物中分离得到。
关键词：艾叶；鞣酸类化合物；抗氧化；黄酮；MTT；凝血
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ABSTRACT
The Artemisiae argyi belongs to Asteraceae Artemisia vegetation, mainly in the
eastern region of Asia. It generally grows at the roadside wilderness and grass. The
Artemisiae argyi can grow at any areas where there are enough sunshine and
drainage. But it can grow better in the moist fertile soil. The Artemisia vegetation
has rich resource in the world. The recent studies have found that the Artemisia
vegetation has a significant antioxidant, anticancer and other pharmacological effects,
this causing many scholars interested in the study of the Artemisia vegetation. Where
more extensive research is done on the Artemisiae argyi, a large number of chemical
components have been isolated from this plant, and found the ability of their various
activities.
In this paper, we use the Artemisiae argyi as the research object in order to
explore the optimal extraction process of tannins. Firstly we measured the total
tannins content of the Artemisiae argyi in different areas and analyzed the active
ingredients in Artemisiae argyi of Qichun. We identified the structure of the
compounds and do some research on the free radical scavenging ability of the QiAis
tannins. We also studied the pharmacological effects of the tannins in vitro blood
coagulation and anti-tumor aspects. The specific work as follows:
1.W e extract the tannins of the Artemisiae argyi by using the ultrasonic method
and research the optimum technology conditions of ultrasonic extraction process for
the Artemisiae argyi tannins extraction through the four factors and three levels
experiment and orthogonal experiment. We analyzed and compared the total content
of tannins in the Artemisiae argyi that come from five origin places (they are Qichun
country in Hubei, Zhangshu country in Jiangxi , Huoshan country in Anhui ,
Juancheng country in Shandong , Anguo country in Hebei). The experimental results
indicate that we can get the highest extraction rate under the conditions that the
℃r is 150W, ultrasonic time is 20min and the ultrasound at 60, ultrasonic powe
weight of ratio of solid to liquid was 1:25, the ratio of Acetone to Water was 4:6.
The total tannin content of the Artemisiae argyi that come from HuBei Qichun is
13.29%.That is the highest content in the five research objects. That result indicates
that we have trial basis to consider that the Qichun is the typical origin of the
Artemisiae argyi.
2.We research the free radical scavenging ability in vitro of tannins in the
Qichun Artemisiae argyi by using UV spectrophotometry, producing ?OH through
the Fenton reaction and producing O2? model through Pyrogallol Autoxidation. The
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results show that the total tannins content have scavenging effect on the hydroxyl radical and superoxide radical in the range of 1.0～10.0 mg/mL. The tannins show a clear dose dependent mode to the hydroxyl radical and superoxide radical. The most effective scavenging concentrations are both 8.0 mg/mL. The free radical scavenging capacity of the tannins is higher than that of the mannitol with the same concentration but lower than that of the vitamin C with the same concentration.
3.We detect the cytotoxicity of the Qichun Artemisiae argyi tannins of different concentrations to the human hepatoma cell HepG2 by using MTT method in vitro. On this basis the butanol in the Qichun Artemisiae argyi tannins is extracted through the column chromatography of macroporous resin and TLC purification method. Then five tannin distillation fractions with different polarity are obtained. We compare the proliferation effectiveness of the extracts with different polarities on the hepatoma cell by MTT method. The result shows that the Qichun Artemisiae argyi tannins make the hepatoma cell HepG2 in vitro increase in the number of apoptosis cells. The value-added efficiency decrease at the same time the concentration and time express the dependent relationship. The five different polar extracts all can inhibit the growth of the hepatoma cell. There is 40% methanol has strongest inhibition effect for the hepatoma cell growth. It is the major activity part in the Qichun Artemisiae argyi tannins to antitumor in vitro.
4.We obtained six different components of compounds through extracting and separating the Qichun Artemisiae argyi with traditional method. The compounds are: 5 a-tert-butyl pyrogallol, Ai charcoal, Ai ash, essential oil, tannins and Ai tar. By using the above six compounds to do coagulation tests in vitro on rabbits we find that the Qichun Artemisiae argyi tannins have the best effect in the blood clotting, it is the main material for blood coagulation.
5.We extract and separate and do some structure research on the active ingredient of the Qichun Artemisiae argyi. During the experiment we use many methods such as Macroporous resin chromatography ，Silica gel column chromatography，RP silica gel column chromatography and TLC. We extract and isolate two pure compounds from the Artemisiae argyi in Hubei Qichun, then we analyze and identify the two monomer compounds by using the modern equipment such as IR ,UV and NMR. We find the two compounds are (A) 5,6-Dihydroxy-3’4’5’-Trimethoxyflavone and (B)5-C butylene ether. These two compounds were first isolated from this plant.
Key words: Artemisiae Argyi; Antioxidant; tannins; fLavonids; MTT; blood coagulation.
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第一章 绪论
1.1艾叶的研究进展
1.1.1艾叶的植物学研究
艾叶(Artemisiae argyi)，菊科(Asteraceae)蒿属(Artemisia)植物的干燥叶，全国各地以及亚洲周边国家均有生长。但由于各地的气候、水质、土壤的差异，导致品种发生变异，形成各地各具特色的亚种。目前市场上较有名的有蕲艾（湖北蕲春）、北艾（河南汤阴）、海艾（浙江宁波）、祁艾（河北安国）、川艾（四川资阳）以及安徽霍山与江西樟树等品种。其中以蕲艾最为有名，品质最好，最具道地性。
在外观形态方面，完整艾叶片展平后呈卵状椭圆形，羽状深裂，裂片椭圆状披针形，边缘有不规则的粗锯齿；上表面灰绿色或深黄绿色，有稀疏的柔毛及腺点；下表面密生灰白色绒毛。质柔软,气清香，味苦[1]。林有润[2]等发现蕲艾与普通艾的不同之处在于蕲艾植株高大，可达1.8～2.5米，叶厚纸质，被密厚而长的毛，含挥发油多，香气浓郁。而普通艾高不及1.5米，叶纸质或薄纸质，虽被毛，但毛短。
1.1.2 艾叶的主要化学成分
艾叶中所含的化学成分种类繁多，成分复杂，包括有挥发油、黄酮类、鞣酸类、桉叶烷类、三萜类成分以及其他的微量元素。艾叶中主要的生物活性成分是挥发油(voLatiLe oil)、黄酮类(flavonoids)和鞣酸类(tannin)。
1.1.
2.1 挥发油类化合物
将艾叶阴干进行水蒸气蒸馏可提取挥发油，是一种草绿色或浅黄色橙明液体，有艾叶特征的浓郁草香气味。据报道[3]湖北蕲春、安徽霍山、江西樟树、山东鄄城和河北安国艾叶挥发油含量分别为 1.230%、0.2960%、0.4794%、0.3936%、0.6754%，以湖北蕲春艾叶的挥发油含量最高。蕲艾的采集期对艾油的出油率影响较大，端阳节前后若干天的中午采集可达到艾叶挥发油含量的最高值[4]。
艾叶挥发油是一种混合物，据报道[5]以水蒸气蒸馏法提取湖北蕲春、安徽霍山、江西樟树、山东鄄城和河北安国五个不同产地的挥发油，进行气相色谱分析，以归一化法计算各个峰的相对含量，用气相色谱-质谱法鉴定化学成分，
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并通过质谱计算机数据系统检索(质谱数据库:NIST,NBS)，人工谱图解析。鉴定出湖北蕲春、安徽霍山、江西樟树、山东鄄城和河北安国艾叶挥发油的化学成分数目分别为28、41、16、46、11，总归一化含量分别为94.048%、73.588%、72.996%、62.219%、75.158%，其中1,8-桉叶油素﹑龙脑和丁子香酚是五个产地艾叶的挥发油中共有的成分，含量最高的是1,8-桉叶油素。可见植物生长环境如海拔高度、温度、湿度、日照等条件都直接影响其挥发油成分。
艾叶中主要的挥发性成分，多为单萜类、倍半萜类及其含氧衍生物，是一类存在于自然界中具有抗菌﹑解热镇痛﹑抗氧化等多种生物活性的化合物[6]。韩秩[7]等人发现艾叶挥发油对呼吸道合胞病毒（RSV）有抑制作用。蕲艾挥发油灌胃可促进小鼠细胞的免疫能力，给小鼠食用蕲艾挥发油一个月后，可以提高小鼠的负重能力，减少肝糖原的消耗，可见其抗疲劳作用。
1.1.
2.2 黄酮类化合物
黄酮类化合物是一类在植物中广泛存在的天然物质，属植物次级代谢产物[8]，指具有色酮环与苯环为基本结构的一类化合物的总称，基本母核见图1.1。这类化合物在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有以游离形式存在的，包括山奈酚，槲皮素等。
O
O
图1.1
艾叶中黄酮类化合物含量较高，江丹等[9]用超声法提取湖北蕲春、安徽霍山、山东鄄城、江西樟树、河北安国不同地方艾叶中总黄酮，并以芦丁为对照品测定了这五个不同地方艾叶中总黄酮含量，其中以湖北蕲春总黄酮含量最高，含量为3.900%，具有道地性优势；河北安国总黄酮含量最低，含量仅为1.054%。、艾叶中已鉴定出的黄酮结构包括有5，7-二羟基-6，3'，4'-三甲氧基黄酮(eupatilin)，名泽兰林素、5-羟基-6，7，3'，4'-四甲氧基黄酮(5-hydroxy-6，7，3'，4'-tetram-ethoxyflavone)和柚皮素(naringenin)等[10]。
黄酮类化合物具有抗真菌﹑抗血管原型﹑增强机体免疫力等药理活性[11]，是植物药用的活性成分之一。吴娜[12]等人利用邻苯三酚—鲁米诺化学发光体系测定艾叶黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用，采用CuSO4—Phen—VC—H2O2体系测定艾叶黄酮清除羟自由基的能力，采用双氧水鲁米诺化学发光体系测定
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艾叶黄酮清除过氧化氢的能力，采用CuSO4—Phen—VC—H2O2—DNA化学发光体系测定艾叶黄酮对DNA损伤的保护作用。结果显示艾叶黄酮对以上的自由基均有很强的清除能力，可以有效地保护被自由基损伤的DNA，是一种高效的自由基清除剂，能够应用于医疗保健中。
1.1.
2.3 鞣酸类化合物
鞣酸类化合物又称为单宁，指的是分子量为500到3000的水溶性多酚类化合物[13]，据其化学结构可以分为三大类，一类为可水解鞣酸(hydrolysable tannins)（见图2.2）；一类为缩合鞣酸（condensed tannins）（见图3.3）；还有一类为复合鞣酸（compounds tannins ）。可水解鞣酸指的是棓酸及其氧化耦合产物与多元醇通过酯健或甙健形成的多酚，在酸﹑碱或酶的作用下可水解成多元醇或酚羧酸。缩合鞣酸结构特征为羟基黄烷类组成的缩水物，水解试剂处理不产生明显的低分子量化合物，相反在酸中趋向于聚合成无定性的化合物。复合鞣酸指的是可水解鞣酸和缩合鞣酸两种类型的结构单元的复合，具有两种单宁的特征。鞣酸是艾叶中仅次于挥发油的药效成分，生品艾叶的鞣酸含量可高达6.29%，主要成分为单宁酸或儿茶素[14]。
图2.2
图3.3
鞣酸类化合物具有较多邻位酚羟基，极性强，稳定性差。提取鞣酸的方法
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一般为溶剂法，甲醇﹑乙醇等溶剂均可使用，但以丙酮-水的混合溶剂法富集鞣酸，鞣酸的得率最高，且丙酮熔点低，易于回收。鞣酸与很多显色剂均可以反应，呈现出明显颜色，常用的鞣酸显色剂包括1%铁氰化钾-1%三氯化铁（1：1）显墨绿色﹑茴香醛-浓硫酸呈红色﹑明胶-氯化钠反应有沉淀生成。鞣酸的传统含量测定法包括有皮分法﹑络合滴定法﹑高锰酸钾法﹑干酪素法等，近年来也出现了一些更灵敏、高准确度的新测试法，如高效液相色谱法﹑高灵敏示波电位动力学分析法﹑原子吸收分光光度法[15]。植物中含有复杂的成分，为了达到鞣酸的分离纯化，常用的方法有大孔树脂层析法﹑葡聚糖凝胶柱色谱法﹑反相硅胶柱（ODS）﹑制备型高效液相色谱法﹑纤维素柱等。
鞣酸的多元酚结构使它能够与蛋白质﹑生物碱﹑多糖类化合物结合，可以与金属离子发生络合反应，从而表现出较强的生理活性，广泛应用于生物医药、食品和化工生产中。据研究5％鞣酸软膏可以达到预防新生儿尿布疹的作用[16]；童强[17]等通过MTT比色法以及流式细胞仪检测发现，鞣酸可以抑制食管癌细胞的 DNA复制和蛋白质合成，最终呈时间、剂量依赖性方式抑制食管癌细胞EC9706的增殖；鞣酸具有脂质过氧化的抑制能力，可以降低血脂浓度，应用于高血压的药物治疗中；鞣酸对自由基的抑制作用，已经被很多食品企业应用于葡萄酒的防腐中[18]；石碧[19]发现鞣酸具有对皮肤无刺激收敛性以及对紫外光较强的吸收作用，因此很多护肤产品中加入了鞣酸，对人类皮肤起到抗衰老保湿以及加强血液循环的美容作用；由于鞣酸可以和很多金属离子发生络合反应，使其可用于锅炉和热交换器的除垢剂，防止铝制品的腐蚀。从以上研究可以看出鞣酸应用方兴未艾,开发前景非常广阔。
1.1.
2.4 桉叶烷类化合物
艾叶桉叶烷类(eudesmane)主要成分有:柳杉二醇(cryptomeridiol)，魁蒿内酯(yomogin)，1-氧-4β-乙酰氧基桉叶-2，11(13)-二烯-12，8β内酯(1-oxo-4β-acetoxyeudesma-2,11(13)-dien-12，8β-olide)、1氧-4a-乙酰氧基桉叶-2，11(13)-二烯-12，8β-内酯(1-oxo-4α-acetoxyeudesma-2，11(13)dien-12，8β-olide) [20]。
1.1.
2.5 微量元素
据报道经过原子吸收光谱鉴定艾叶中含有的微量元素包括钾（K）、钠（Na）﹑钙（Ca）、镁（Mg）、铜（Cu）、铁（Fe）、锌（Zn）等[21]。
1.1.
2.6 其他化学成分
艾叶的其他化学成分包括有β一谷甾醇、豆甾醇、油酸乙酯、亚油酸乙酯和反式苯亚甲基丁二酸[22]。
1.1.3 艾叶的药理活性
艾是我国人民认识和使用较早的植物，作为药物在中国有很长的应用历史。
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人们对它最早的记载可追溯到公元前《诗经》[23]和战国末期著名诗人屈原撰写的《离骚》[24]，这两本公元前的著名诗集中均记载有“艾”，表示艾在公元前就已经被人们所了解。近年来随着药物提取工艺的标准化，国内外加大了对艾叶的开发研究[25] ，发现艾叶在临床上的广泛应用。
1.1.3.1抗菌消炎，抗病毒
艾叶燃烧物在免疫反应中起着积极的作用，有实验表明艾烟可以抑制化脓性细菌(绿脓杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和产碱杆菌)的生长[26]，同时也有资料[27]记录，艾烟对变形杆菌、白喉杆菌、伤寒及副伤寒杆菌和结核杆菌(人型H37RV)等也有抑制作用。杨梅[28]选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌为对象菌，采用滤纸片法测定了艾叶挥发油、艾叶燃烧产物重组分和焦油的抑菌作用，结果发现重组分、焦油和艾烟水提取液对四种菌种的抑菌性有选择性：焦油对大肠杆菌的作用最好，艾油对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强。这些发现为艾叶临床上用于治疗化脓性炎症、皮肤细菌损害、带状疱疹、上呼吸道感染等提供了理论与试验依据。
1.1.3.2 抗癌活性
传统的中医灸法的研究中，发现以艾叶为原材料进行的艾灸具有明显的抗肿瘤作用[29]。刘延庆[30]等证明野艾叶和蕲艾叶不同溶剂的提取物，对人肝癌细胞株SMMC-7721﹑胃癌细胞株SGC-7901﹑宫颈癌细胞株Heal有明显的细胞毒性，可抑制癌症细胞的生长。孙伟[31]发现低浓度的艾叶精油对人鼻咽癌细胞（CNE）株具有强大的抑制作用。
1.1.3.3 对呼吸系统的作用
艾叶提取物a-萜品烯醇具有平喘﹑止咳﹑祛痰的作用，可通过升高支气管平滑肌内cAMP的含量起到松弛气道的作用，能拮抗导致哮喘特征性气道炎症的效应细胞Eos[32]。艾叶挥发油具有抗过敏作用，对呼吸道过敏反应有保护作用，经过艾叶油灌胃后的豚鼠可明显减少咳嗽的次数，可见艾叶挥发油强大的镇咳作用[33]。
1.1.3.4对神经系统的作用
有研究表明艾叶油具有镇静作用，对家兔腹腔注射从低浓度到高难度的艾叶油后，家兔可出现从镇静到呼吸减慢最后死亡的不同反应。巴比妥类药物戊巴比妥钠灌胃后可对小鼠起到镇静催眠的效果，辅以艾叶油可以延长小鼠的睡眠时间，具有一定的协同作用[34]。
1.1.3.5 对免疫系统的作用
蕲艾挥发油可促进由植物血凝素（PHA）诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖，抑制小鼠单核细胞的吞噬功能，增强细胞的免疫功能[35]。朱文莲[36]等通过实验发现，若以艾灸小鼠的大椎穴，可以增强环磷酰胺小鼠巨噬细胞的吞噬能力。艾叶油中的成分2-萜品烯醇可以抑制由5-羟色胺引起的皮肤渗透性增强，阻释
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过敏介质的释放，起到免疫保护的作用[37]。
1.1.3.6 对消化系统的作用
口服艾叶挥发油3～5g可以增加食欲，大量则会引起胃肠的急性炎症[38]。李珍[39]发现用艾绒搓热后敷于儿童的肚脐上可以明显治疗脾肾阳虚泄虚。艾叶挥发油可通过降低转氨酶，恢复肝功能，保护慢性肝炎患者。同样艾叶油还可以增加胆汁流量，起到利胆的作用[40]。
1.1.3.7 其他作用
许多实验都证明了艾叶具补体激活作用，降压，抗疲劳，治疗妇科疾病，如痛经、宫外孕、胎动不安、崩漏等；皮肤科疾病如皮炎、湿疹、烧烫伤等作用[41]。
1.1.4 目前艾叶提取物的主要用途
近年来国内外加大了对艾叶活性成分提取工艺的研究力度，相继开发出蕲艾精、李时珍中药保健腰带、蕲艾蚊香、艾叶牙膏等，广泛应用于食品工艺、化工生产、生物医药和临床中，使艾叶的综合开发利用取得了显著的社会效益和经济效益。
1.1.4.1 作为医药中间体
目前世界药品市场正以每年30%的速率飞快增长，对以天然药物为中间体的开发是植物药研究的热点。艾叶油可明显抑制心脏收缩力，使心搏停止，显著减少心脉及冠状动脉血流量，使紧张状态下的主动脉得以松弛，显示出优良的抗心脑血管疾病的功效[42]，在国际医药贸易中的潜在市场巨大。
1.1.4.2 作为多功能食品添加剂
虽然现在食品添加剂的种类繁多，但是由于这些以化学材料为原料的添加剂价格高昂﹑来源狭窄﹑稳定性低使其在使用上受到了很大的限制，因此以毒副作用低的天然抗氧化剂代替化学添加剂已是如今工业化发展的趋势。袁慧慧[43]等人利用醇-水提取工艺，发现艾叶中的黄酮和多糖的含量较高，具有很强的抗氧化性，可作为潜在的食品抗氧化剂投入生产。
1.1.4.3 作为保健品原料和膳食添加剂
随着现代的生活节奏的加快，人们的生活越来越不规律，从而导致了自身抵抗力的下降，而做好自身的保健已是人们生活的幸福所系。鉴于艾叶良好的工艺品质和公认的多功能性，可开发出不同剂型﹑不同功能的保健产品。已经开发的产品有艾叶保健食品（抗肿瘤、抗衰老、防治心血管病），前景非常好，而且许多艾叶的营养保健品如艾叶饮片﹑艾叶食（健）字或药（健）字产品也已经投入生产。
1.1.4.4 作为化妆护肤产品
研究开发天然来源的化妆品是目前国际化妆品市场的发展趋势之一，近年
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来关于化妆品中含有类似于汞和其他有害重金属含量超标的报道屡见不鲜，使得人们对副作用小﹑疗效佳的植物化妆品的要求日益增加。据报道从艾叶中提取出来的叶绿素铜钠盐可用于化妆品的着色，是良好的细胞复合剂，且艾叶的活血化瘀作用，可以加快皮肤血液的循环，促进代谢废物和毒素的排除，从而起到护肤的功效[44] 。艾叶挥发油具有抗氧化过敏的能力，可阻止由自由基引发的氧化反应对皮肤的损失，起到防皱﹑祛色斑的功效，且艾叶挥发油散发出来的气味可以稳定情绪，松弛精神。
1.1.4.5 作为绿色饲料添加剂
随着人们生活水平的提高和食品安全意识的加强，人们要求食品饲料安全高效的愿望越来越迫切。有报道证实艾叶中蛋白质﹑氨基酸﹑脂类物质含量高，维生素以及矿物质种类繁多，并且富含植物杀菌素﹑生物碱﹑绿缘素等化学物质[45]。营养物质的存在充分证明了艾叶富含保健功能和高效的饲料价值，利于禽畜的生长发育﹑可提高动物的免疫水平﹑增加蛋白质等营养物质的消化能力，从而应用于家禽﹑家畜以及水产的饲料中。
由于市场对绿色保健植物的需求相当旺盛，因此无论从药用价值，还是从保健品食疗的角度，或是从化妆品应用角度去开发艾叶，都能适应市场的需求，具有广阔的应用前景。
1.2自由基的氧化伤害
1.2.1 自由基[46]
自由基(free radical)是人体组织中许多生化反应的中间代谢产物。在化学结构上，自由基是指含有未配对电子的基团、分子或原子，以小画点(·)来表示未配对电子。生物体内常见的自由基主要分为氧自由基（超氧阴离子自由基﹑羟自由基﹑氢过氧自由基等）﹑非氧自由基（有机自由基﹑氢自由基）以及氮自由基（一氧化氮﹑二氧化氮）。
1.2.2 自由基和活性氧对人体的伤害
人体内在氧的利用过程中，会因各种内因性或外因性原因而产生各种活性氧和自由基。人体内也有各种消除活性氧和自由基的防御系统，以免组织遭伤害，正常情况下两者维持着平衡。但当人体内出现各种各样负荷状态时，就会使活性氧和自由基形成和消除之间的平衡丧失，从而诱发各种组织损伤和疾病[47]。
活性氧(reactive oxygen species，ROS)是氧分子，还原成水时产生的许多活性中间体的统称，包括超氧阴离子自由基﹑羟自由基 过氧化氢等，由于自由基中含有未成对电子，具有很高能量，可以攻击细胞组织中脂质、蛋白质、糖类
蕲艾鞣酸的提取分离、药理研究和结构鉴定
和DNA等物质，这就造成脂质和糖类氧化、蛋白质变性、酶失活、DNA结构切断或碱基变化等种种改变，从而导致细胞膜、遗传因子等损伤， 据报道，由氧自由墓所引起的疾病，已超过100余种，主要包括[48]：胃动脉血流氧自由基增加引起肉眼胃粘膜损害，从而造成急性胃粘膜损伤、溃疡性结肠炎；氧自由基可导致花生四烯酸的释放，花生四烯酸经脂氧化酶代谢产生白三烯，而白三烯是呼吸道粘液分泌的有效刺激物，可引起微血管渗漏和粘膜水肿，还可参与炎症反应，普遍认为氧自由基反应是发生成人呼吸窘迫综台征和支气管哮喘的致病因子；近年来研究发现氧自由基与肿瘤的发生也有密切的关系，原因是细胞膜上的多不饱和脂肪酸被活性极强的氧化剂氧自由基作用生成脂质过氧化物，引起非特异性的氢抽提作用和由此引起的化学加成反应，最终破坏细胞的正常功能并诱发肿瘤。氧自由基还可引发管透过性亢进、细胞粘连、血小板凝集、高血压、缺血一再灌流障碍、老化、血流障碍、炎症、动脉硬化、早产儿视网膜症、糖尿病、自身免疫性疾病、地中海贫血、溶血性疾病等其他疾病。
1.2.3抗氧化剂清除自由基作用原理
为了抑制产品氧化的进行，除了利用包装隔绝空气和光线外，最有效的手段是添加抗氧化剂，自由基清除剂就是可以起到清除自由基作用的抗氧化剂。人工合成及天然的抗氧化剂主要分成两大类：供氢酚类抗氧剂和过氧化物分解剂，天然存在于植物中的抗氧化性成分大多属于供氢型酚类抗氧化型[49]。
1.2.3.1 清除羟自由基(OH·)研究法[50]
在生命活动的氧化代谢过程中不断产生各种自由基，其中羟自由基(OH·)是体内最活泼的活性氧，对细胞的危害最大，可直接损伤各种生物大分子和生物膜，导致多种疾病的发生。研究清除羟自由基的方法主要为分光光度法，该法简单﹑方便﹑易于操作，实验原理为：H2O2与Fe(Ⅱ)混合后产生的OH·的Fenton 反应中，OH·具有很高的反应活性，存活时间短，在反应体系中加入水杨酸，能有效地捕捉OH·并产生紫红色产物，该产物在510 nm处有强吸收，若加入羟自由基清除剂，可使有色产物的生成量减少，采用固定反应时间法，于510nm处测量含被测物的溶液吸光度，并与空白组对照，即可确定提取液对羟基自由基的清除作用。.
1.2.3.2 清除超氧阴离子自由基(O2－?)研究法[51]
研究清除超氧阴离子自由基的实验原理为：邻苯三酚发生自氧化反应，生成超氧阴离子自由基O2－?，与邻苯三酚氧化中间产物，该中间产物于λ=320 nm 处有一特征吸收峰。当加入抗氧化剂时，邻苯三酚自氧化过程受阻，O2－?的生成受到抑制，溶液在320 nm处吸收减弱，故通过测定吸光值变化可推断样品对O2－?
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的清除作用。
1.2.3.3 二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）清除法[52]
1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)自由基是一种合成的有机自由基,是有三个芳环结构的稳定自由基，在有机溶液中稳定存在，其未成对电子在517nm附近有强吸收(呈深紫色)，当自由基清除剂存在时，未成对电子被配对，吸收消失或减弱，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系，因此通过测定吸收减弱的程度，评价该自由基清除剂的活性。
1.2.3.4 TRAP法(Total peroxy Radical-trapping Antioxidant paramerer Assay) [53]
由于抗氧化物种类繁多，单个抗氧化剂对抗氧化的贡献并不能衡量他们在体内的相互协同作用，因此测定样品的总抗氧化能力为现在的主要趋势，即总自由基清除法，用来测定血浆和血清的抗氧化能力。此法是用2,2’-偶氮(2-脒基丙烷)盐酸(ABAP)产生过氧化物自由基与血浆中的抗氧化剂反应，来测定样品的抗氧化能力。
1.2.4 中药提取物清除自由基的研究
近年来社会上对自由基的相关报道越来越多，人们对自由基氧化伤害的了
解也逐步加深，关于如何清除自由基保护人类也是各国科学家的研究热点，而利用价格便宜﹑毒副作用小的中药提取物保护人类的身体健康已是现在的主要趋势。
梁丽丽[54]等人采用三种分光光度法，测定地榆提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇这四种不同极性的萃取剂，对由Fenton体系产生的OH·自由基的清除作用﹑邻苯三酚自氧化法研究对O2－?自由基的清除作用以及亚硝基R 盐( Nit- R)．Co2+ 褪色法研究对OH·基的清除作用,结果显示除了石油醚萃取部位其他各地榆提取物的萃取剂对OH·清除作用明显，但是对于O2－?自由基
的清除作用不明显。
据报道[55]蔷薇科植物月季花超声波提取其中的月季花黄色素，对超氧阴离子自由基和羟基自由基均有清除作用，且清除作用随黄色素浓度的增加而增大，但随时间的延长清除作用减弱，趋于平缓。
周本宏[56]教授通过罗丹明B—Cu2+一H202体系产生OH·，邻苯三酚自氧化体系产生O2－?，通过紫外分光度法分析石榴皮鞣酸提取物﹑鞣花酸一没食子酸和维生素C对以上两种自由基的抑制作用，实验结果表明在清除超氧阴离子自由基的实验中鞣花酸一没食子酸的清除作用不如石榴皮鞣酸提取物和维生素C，这两种物质均可以100%抑制自由基；在清除羟离子自由基的实验中，在0.1C/g·mL的浓度时，鞣花酸一没食子酸﹑石榴皮鞣酸提取物﹑维生素C均对羟离子自由基有相当于100%的抑制率。但高于这个浓度时，清除能力反而降低。
蕲艾鞣酸的提取分离、药理研究和结构鉴定
万政敏[57]以紫外分光光度法测定普通核桃青皮美国黑核桃青皮和不老屯核桃青皮对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除作用，结果发现在一定的浓度范围内，以美国黑核桃青皮清除自由基能力最强。
综上所述，众多植物药的提取物都具有清除自由基的能力，但现阶段研究多是植物药初提物的清除作用，相信进一步的分离纯化，探索单体的抗自由基能力会是未来的主要趋势。
1.3现代植物药在癌症治疗中的应用
1.3.1 MTT法的实验原理[58～60]
显色剂MTT是一种能接受氢离子的染料，化学名为3-（4,5-二甲基-2）-2,5-二苯基-四氮唑溴蓝﹝3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl tetrazolium bromide﹞，商品名为噻唑蓝。黄色的MTT可以被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原生成不溶性的结晶状深紫色产物Formazan沉积于细胞内和细胞周围，用二甲基亚砜DMSO完全溶解这些深紫色结晶后，通过酶联免疫检测仪测定指定波长附近的光密度，光密度值间接反映活细胞数量。若细胞增殖越多，则光密度越高；若细胞毒性越大，则光密度越低，从而计算出IC50（凋亡细胞与全部细胞数之比为50%时所对应的药物浓度，用来衡量药物诱导细胞凋亡的能力）。由于MTT法具有快捷﹑简便﹑重复性好、灵敏度较高等优点，被广泛使用于细胞增殖和细胞毒性的检测。
1.3.2 中药提取物在癌症治疗中的临床应用
现如今肿瘤仍是人类死亡的主要原因之一，常使用的化学治疗药由于毒副作用大以及逐渐出现的抗药性而降低了药效，例如顺铂﹑长春新碱等均通过细胞凋亡的方式抑制癌症细胞的生长，但其毒副作用限制了其临床应用[61]。因此为更好的治愈肿瘤，需要寻找低毒性的药物，已是当前进行肿瘤药物的研究热点，而中药在肿瘤治疗方面的独特优势受到了广泛关注。
从Eugenia jambols中分离得到的两种单宁化合物对HL-60细胞有明显的抑制作用，且IC50值很小，但是对SK—HEP-I和人淋巴及肝的正常细胞系毒性较小，因此可以说明这两种化合物可以选择性的抑制肿瘤细胞的凋亡[62]。
日本科学家oshida T. [63]等人发现Woodfordin C因为对DNA拓扑异构酶-Ⅱ显著的抑制性，可以干扰多种肿瘤细胞系的生长，因此对人口腔癌细胞株有较强的细胞毒性，显示出明显的时效与量效的抑制关系。
崔艳红[64]通过MTT法检测β-胡萝卜素对细胞活性的影响，用流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响，通过Western blot法从蛋白和mRNA水平检测β-胡萝卜素对细胞基因COX-2表达的影响。结果表明β-胡萝卜素可以诱导细胞内活性
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氧浓度的升高，破坏线粒体的生存，促进酶的失活，并且时间上显著下调细胞基因COX-2的表达，最终诱导癌细胞的凋亡和死亡。
通过MTT法和流式细胞仪测试不同浓度的中药紫苏提取物[65]对皮肤癌细胞HaCat细胞增殖和分化的影响，结果发现随着浓度的提高和时间的延长，药物对癌症细胞的抑制作用明显增强，说明紫苏具有具有良好的抗角质形成，抑制细胞增殖及诱导分化的作用。
罗文娟[66]等发现用从茄类植物龙葵中提取的螺甾皂苷类化合物处理人肝癌细胞株FHCC-98后，癌症细胞的生长率明显低于对照组，处理48h后，增殖受到明显抑制。
郭云蔚[67]等人研究中药紫草的有效药用成分紫草素及其衍生物对肝癌细胞HepG2的抑制作用，采用MTT比色法和实时荧光定量PCR法与常用肝癌治疗药物顺铂相比较，结果显示24h﹑48h﹑72h时紫草素和顺铂均对HepG2细胞有明显抑制作用，且24h﹑48h﹑72h 时紫草素的IC50分别为2 .11ug∕mL、0．83u g／mL、0．29ug／mL，小于同时间段顺铂的IC50，可见紫草素治疗肝癌时没有经典化疗药物的毒副作用大，应用前景广阔。
综上所述，植物药的提取物在抗肿瘤治疗中体现出诱人的前景，可以有效的抑制癌症病变的发生。因此我们有必要进一步开发各种植物药的潜在抗癌活性，为研究新一代的抗肿瘤药物提供理论依据。
1.4本课题研究的目的、意义和内容
1.4.1 研究的目的与意义
蕲春艾叶为艾属植物的一重要亚种类，其化学成分复杂，药理活性强，关于蕲艾的药理方面的研究近年来已引起许多化学和医学工作者的重视。并且以艾叶为原料的艾条近年来受到医药学者的广泛关注，而鞣酸则是艾条稳定燃烧和产生高热的物质基础，因此本实验室致力于对鞣酸结构的鉴定和药理功能的研究。但是到目前为止，人们对蕲艾的化学成分了解较少，有关蕲艾抗自由基、止血和抗肿瘤的报道更少。因此有必要进一步加强蕲艾化学成分的分离提取和结构鉴定，并对有效成分进行深入的药理研究，以期获得毒性小、疗效佳的药物。
为了弘扬李时珍科学精神，振兴蕲春医药经济，建立蕲春优质地道中药材“蕲艾”生产和质量管理体系，规范蕲艾GAP（蕲艾生产和质量管理体系建立项目）基地的种植，深度研发蕲艾精深加工系列产品，本实验室接受了蕲春县李时珍医药工作办公室的委托，参与湖北省科技攻关计划招标项目的部分工作。
本课题也希望利用各种科学技术分离、分析蕲艾的化学成分，并对其进行多种药理性研究，发现蕲艾具有药用价值的物质基础，为蕲艾的开发利用提供
蕲艾鞣酸的提取分离、药理研究和结构鉴定
理论和试验依据，大力推动艾叶的使用和国内外市场的开拓，从而促进我国中药事业的振兴和发展，振兴民族经济，提高农民收入。
综上所述，我们以“蕲艾鞣酸的提取分离、药理研究和结构鉴定”为题，对蕲艾鞣酸进行系统的提取和分离，并对蕲艾中的活性成分进行了一系列初步的药理研究，同时对所得的纯净化合物进行了结构鉴定，作为本论文的研究方向。
1.4.2 研究的内容
1.4.
2.1 不同产地艾叶中鞣酸含量比较研究
精选蕲春艾绒，通过四因素三水平正交试验探讨超声波提取蕲艾中鞣酸的最佳工艺条件，并在此最佳提取条件下，对湖北蕲春、江西樟树、安徽霍山、山东鄄城以及河北安国五个不同地方艾叶中鞣酸的含量进行分析，以此来验证蕲春艾叶的地道性。
1.4.
2.2 蕲艾总鞣酸对自由基的清除作用
通过Fenton反应产生·OH（羟自由基），邻苯三酚自氧化产生O2－?（超氧阴离子自由基）,利用紫外分光光度法研究蕲艾总鞣酸对这两种自由基的清除作用，并与同等浓度的甘露醇和抗坏血酸（Vc）进行比较。
1.4.
2.3 MTT法检测蕲艾鞣酸体外抗肿瘤的活性
利用超声仪提取蕲艾鞣酸，通过MTT检测法观察鞣酸对体外培养的人肝癌细胞HepG2的抑制作用，同时利用MTT检测法比较利用大孔树脂分离所得不同极性鞣酸提取物的抗肿瘤作用，以此探索出蕲艾鞣酸的细胞毒性作用以及鞣酸发挥抗肿瘤作用的主要活性部位。
1.4.
2.4 艾叶的体外凝血试验研究
精选蕲春艾叶，利用超声波提取法得鞣酸、暗火燃烧法得艾焦油、蕲艾油简式提取法得艾叶挥发油、暗火烧尽法得艾灰、武火炒制法得艾炭，将上述五种物质和市售的5一叔丁基连苯三酚共六个物质，用家兔进行体外凝血试验，并比较凝血时间长短，从而衡量各样品的凝血能力。
1.4.
2.5 蕲艾化学成分的分离及结构表征
针对蕲艾的活性成分进行了系统的提取分离，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等试剂萃取，在试验过程中主要采用了大孔吸附树脂层析、硅胶柱层析、反相硅胶柱层析和制备薄层层析等分离方法，从蕲春艾叶中共分离出两个纯净化合物，并通过红外、紫外、核磁等波谱技术和化学方法确定化合物结构。
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第二章 不同产地艾叶中鞣酸含量比较研究
2.1引言
鞣酸（tannins）又称单宁（tannin）,是一类多元酚类衍生物，广泛存在于植物的叶、芽以及未成熟的果实中[68]，单宁类化合物的结构中含有大量的酚羟基，是其具有众多生物活性如止血、抑制微生物、抗过敏、抗突变等的主要原因，尤其是它的涩味和收敛性受到了人们的重视[69]。
据文献报道[70]，植物中鞣酸的含量测定方法一般为在传统的溶液浸提工艺提取鞣酸后，以皮粉法测定含量，此法费时长且误差大。本工作采用超声波技术将艾叶中鞣酸-蛋白质间的连接健打开，再用丙酮-水体系提取鞣酸，通过对超声功率﹑超声时间﹑超声温度﹑固液比等因素进行优化实验，然后以络合法测定鞣酸的含量。继而对不同地区艾叶中的鞣酸进行提取分析，论证蕲艾的地道性，为蕲春地区的经济发展和蕲艾的开发利用打下基础。
2.2试验仪器与试剂
艾叶分别采自湖北蕲春、山东鄄城、江西樟树、河北安国、安徽霍山，采集日期均为2008年端阳节，品种鉴定由湖北省蕲春县医药工业办公室郭双喜（工程师）完成。实验试剂见表2.1，实验仪器见表2.2。
表2.1 主要药品和试剂
Table 2.1 Medicines and reagents
试剂名称规格厂家
丙酮、分析纯天津科密欧化学试剂有限公司
乙酸锌分析纯天津科密欧化学试剂有限公司
氨水分析纯天津科密欧化学试剂有限公司氯化铵、分析纯天津科密欧化学试剂有限公司乙二胺四乙酸二钠分析纯天津科密欧化学试剂有限公司铬黑T 分析纯天津科密欧化学试剂有限公司
蕲艾鞣酸的提取分离、药理研究和结构鉴定
表2.2 实验主要仪器
Table 2.2 Main instruments
仪器名称 仪器型号 生产厂家
数控超声波清洗器KQ-300DE昆山市超声仪器有限公司
分析天平FA 2104北京赛多利斯公司
循环水式多用真空泵SHB-III郑州长城科工贸有限公司旋转蒸发仪RE-52上海亚荣生化仪器厂
2.3试验方法
2.3.1 艾叶中鞣酸类物质提取
将艾叶充分粉碎成艾绒，称量2.000g，置于250mL容量瓶中，向其中加入一定比例的丙酮和蒸馏水的混合溶液60mL浸泡1 h后，在温度为30℃，功率为120W 的超声条件下超声提取30min，减压抽滤，作为待测溶液，混合萃取液的比例见表2.3。
表2.3 混合萃取液的体积比
Tab.2.3 the ratios of mixed extract
序号丙酮水
1 3 7
2 4 6
3 5 5
根据实验结果所确定最佳混合萃取液的体积比并按照四因素三水平的正交
试验方法选择一定的固液比（W
艾绒(g): V
混合液
(m L)），浸泡1 h后, 在一定超声
时间，超声温度以及超声功率下进行超声提取，因素水平表见表2.4。
表2.4 因素及水平
Tab.2.4 Factors and levels
水 平
因素
A
固液比
/(g/m L)
B
超声时间
/min
C
超声温度
/℃
D
超声功率
/W
1 1:25 20 40 120
2 1:35 40 50 150
3 1:45 60 60 180
2011届本科生毕业论文 题目芦丁的提取分离及鉴定作者单位陇东学院化学化工学院指导老师胡浩斌 作者姓名张娜娜 专业班级2007级化学本科(2)班提交时间二〇一一年四月
2011届本科生毕业论文 芦丁的提取分离及鉴定 张娜娜，胡浩斌 （陇东学院化学化工学院，甘肃庆阳745000）摘要：目的以芦丁为例学习黄酮类化合物的提取方法，掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮甙，甙元和糖的部分鉴定方法。方法采用水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法对芦丁进行提取分离，并对其进行定性分析及色谱鉴定。结果水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法，三种方法均可制的芦丁，且质量合格。结论从提高芦丁产率和纯度的角度出发，乙醇回流是较理想的提取方法。制得芦丁产率高，且测定方法简单、迅速、灵敏度高。 关键词：槐花米；芦丁；槲皮素；提取；分离；鉴定 Extraction, Seperation and Identification of Rutin Zhang Nana, Hu Haobin (College of Chemistry and Chemical Engineering, Longdong University, Qingyang 745000, Gansu) Abstraction: Objection Rutin as an example to learn the extraction of flavonoids square. Grasp the main properties and flavonoids ingredients flavonoids glucoside. Method W ith the water extraction method, buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) extraction to extraction and separation of rutin and chromatographic identification. Result With water formulation,Buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) method of extraction rutin backflow separation,three methods are made rutin and obtaining rutin quality qualified. Conclusion From improve yield and purity of rutin angle, ethanol refluxing was ideal extraction method. Preparation of rutin of high yield,high sensitivity. determination method is simple to rutin rapid. Key word: Sophora japonica; rutin; quercetin; extraction; separation; identification 引言 随着人们生活水平及质量的不断提高，心脑血管病的发病率也呈上升趋势，而且死亡率居各种疾病之首，因此，对治疗和预防心脑血管病的药品与保健品的开发研究就显得尤为重要， 1
槐花米中芦丁的提取与鉴定 背景知识 芦丁（Rutin）又称芸香苷，广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica L 的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高(含量可达12-16%)，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水形成的苷。 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有3分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10 000；沸水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液，酸化后又可析出，因此，本实验采用碱提取酸沉淀法提取芦丁。 芦丁具有维生素P样作用。能维持血管的正常通透性，减低血管的脆性，缩短流血时间，可作为高血压病的辅助治疗剂。亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。
一、实验目的 通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作；熟悉芦丁、槲皮素的结构性质和检识方法。 二、实验要求 独立完成实验，从槐花米中提取出芦丁并进行鉴定。 三、实验原理 芦丁属黄酮类化合物，分子中有较多酚羟基，具弱酸性，易溶于热碱中，酸化后又析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁，又利用芦丁在冷水和热水中溶解度相差较大的特性进行重结晶精制。 四、实验材料和器皿 【器皿】 烧杯（500ml）2个，试管2个，布氏漏斗1个，玻璃棒1根，抽滤瓶1个，滴管，移液管（10ml）1根，洗耳球1个，滤纸，pH试纸，电热炉，真空抽滤机。 【材料】 槐米花30 g，饱和石灰水，0.4%硼砂水溶液，镁粉，pH试纸，浓盐酸，95%乙醇，10% α萘酚乙醇溶液，浓硫酸，蒸馏水。 五、实验内容 操作步骤： 称取30g槐花米于研钵中研成粉状物，置于500mL烧杯中，加入饱和石灰水，加热至沸，并不断搅拌，煮沸30分钟后，趁热抽滤。然后用浓盐酸调节pH值为4~5。放置1-2h，使沉淀完全，抽滤，沉淀用水洗涤2~3次，得到芦丁的粗产物。 流程图：
材料与方法 样品 检测用试剂 1、Griess 试剂 溶液I称取磺胺酸0.5g，溶于150mL醋酸溶液(30％)中，保存于棕色瓶中。 溶液II称取α-萘胺0.5g，加入50mL蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％醋酸溶液150mL，保存于棕色瓶中。 格里斯试剂检验亚硝化菌方法：用滴管吸取2滴细菌培养液置于白瓷板上， 依次滴加格里斯试剂Ⅰ、Ⅱ各2滴，出现红色反应说明培养液中含有亚硝酸，有 亚硝酸细菌存在。 2、二苯胺-硫酸试剂（检测菌液中是否存在硝酸盐证明硝化细菌是否存在） 称取二苯胺1g，溶于20mL蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸lOOmL，保存于棕色瓶中。 由于亚硝基、硝基均能与二苯胺试剂起蓝色显色反应，所以在测定硝基前，必须去除培养液中的亚硝基。采用尿素+浓硫酸去除亚硝基是简单有效的方法，硝化菌检验具体操作步骤：取细菌培养液lml移入干净试管中，向试管中放半药勺的尿素混匀，然后再向试管中滴加10滴浓硫酸，此时可以看到试管中有大量气泡生成，反应很强烈，不断振动试管，使反应充分进行直至没有气泡产生。然后取试管中液体两滴，置于白瓷板上，用格里斯试剂检验是否变红，如果颜色没有变化，再滴加二苯胺试剂，如果变蓝，说明有硝基产生，有硝化菌存在。培养基 1、LB（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 酵母粉 5g 蛋白胨 10g NaCl 10g 蒸馏水 1000ml 灭菌前pH=7.3 2、KM（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 酵母浸提物 0.5g 蛋白胨 0.5g 牛肉膏 0.5g 蒸馏水 1000ml 灭菌前pH=7.3 3、PDA（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 马铃薯(除皮) 200g 蔗糖(或葡萄糖) 20g 水 1000mL 灭菌前pH自然 硝化细菌培养基
综合化学实验: 芦丁的提取分离和鉴定 芦丁简介: 芦丁（Rutin）又名芸香苷化学式: C27H30O16·3H2O，是一种浅黄色针状结晶有机化合物，广泛存在于自然界植物中，是一种被人们广泛使用的有机天然产物。目前已发现含有芦丁的植物至少在70种以上，常见的如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均有不同含量。尤其以中药槐米（豆科、槐属，槐树Sophorajaponica的花蕾）和荞麦中含量最高，因此槐米可作为大量提取芦丁的天然植物原料。 中药槐米（炒碳）味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。西医研究其主要有效成分为有机化合物“芦丁”而中药槐米中芦丁的含量可高达12~16%，是主要的芦丁天然来源。槐米中还含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。研究文献证明芦丁具有VitP（维生素P）样作用（VitP具有生物类黄酮的功能，可防止维生素C被氧化而受到破坏，增强维生素功效；增加毛细血管壁强度，防止瘀伤。有助于牙龈出血的预防和治疗，有助于因内耳疾病引起的浮肿或头晕的治疗等）。而芦丁具有类似作用如可降低毛细血管脆性和调节通透性等，在医学临床上常将其用作毛细血管脆性引起的出血症以及防治高血压病等的辅助治疗药物。 芦丁是由槲皮素（quercetin）3位上的羟基与芸香糖（rutinose，一种由葡萄糖glucose与鼠李糖rhamnose组成的双糖）脱水合成的苷，是一种浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无结晶水时188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 补充知识:
硝化细菌的分离与鉴定 要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。硝化细菌包括亚硝化 菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。实验结果 表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的亚硝酸盐含量下降到60％。实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的氨转化作用或硝化作用。 关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。 氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。 硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其 主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。可通过NH4+→NO2- → NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养 殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接 影响硝化效果和生物脱氨的效率。 研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细 菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。因此筛选出生 长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。 本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产 率和硝化细菌的利用率。通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍 ，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。国外在硝化细菌的培养方面 的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须 不断向反应器中补充流失的硝化细菌。硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚 硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将 氨直接转化为硝酸盐的细菌。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度 对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化
实验二芦丁的提取及鉴定 （一）概述 芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica 的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水合成的苷。 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁具有维生素P样作用。有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗剂，亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。实验目的和要求 实验目的 ①通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 ②通过芦丁结构的检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 ③了解UV及NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。 要求 ①要拿到以下三个化合物：芦丁、槲皮素、芦丁的全乙酰化合物。 ②能够拿根据化学试验及UV、NMR数据初步推断出芦丁的结构。并对黄酮类化合物的结构测定有一般性的了解。 试验方法 芦丁的提取与分离（见下图） 芦丁的鉴定 ①芦丁的定性反应 取芦丁3~4mg，加乙醇5~6ml使其溶解，分成三份作下述试验： A. 取上述溶液1~2ml，加2滴浓盐酸，在酌加少许镁粉，注意观察颜色变化情况。 B. 取上述溶液1~2ml，然后滴加2%柠檬酸的甲醇溶液，注意观察颜色变化情况，在继续向试管中加入2%ZrOCl2的甲醇溶液，并详细记录颜色变化情况。 C. 取上述溶液1~2ml，然后再加入10%α-等体积的萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，注意观察两液面产生的颜色变化。 ②芦丁的紫外光谱解析 取芦丁溶于色谱纯甲醇中，加入规定的试剂，测定其UV光谱，试解析光谱并初步判断其结构。
实验四槐米中芸香苷的提取分离与鉴定 芦丁(Rutin)亦称芸香甙(Rutisude)，广泛存在于植物界中。现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。 槐花米为豆科植物槐(Sophora japonica L。)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达12%~16%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性。临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。 槐花米中主要化学成分的结构及性质： 1.芦丁(Rutin) 淡黄色细小针状结晶，℃~178℃(含三分子结晶)，188℃(无水物)。 溶解度： 水：1:100(冷)，1:200(热) 甲醇：1:100(冷)，1:9(热) 乙醇：1:650(冷)，1:60(热) 吡啶：1:(冷)，易溶(热) 不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。 2. 槲皮素(Quercetin) 即芸香甙甙元，为黄色结晶，mp.313℃~314℃(含2分子结晶水)，316℃(无水物)。溶解度： 乙醇：1:290(无水乙醇)，1:23(热) 可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、吡啶、冰醋酸。不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚等。 3. 皂甙 粗品为白色粉末，mp.210℃~220℃(分解)。易溶于水、吡啶，能溶于200倍的甲醇中。酸水解后得白桦脂醇、槐二醇二种皂甙元及葡萄糖，葡萄糖醛酸及葡萄糖醛酸内酯。 (1) 白桦脂醇(Betulin) 无色针晶，℃~252℃。能溶于醋酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、
一株高效好氧反硝化菌的分离及特性研究 杨俊忠，倪砚，许尚营，徐可瀚，刘义，曾丽霞，刘德立? 华中师范大学生命科学学院，湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室，武汉 （430079） E-mail: deliliu2002@https://www.doczj.com/doc/d56274421.html, 摘要：利用富集培养的方法从南昌市郊某养鱼塘采样分离出22株反硝化细菌，其中8株反硝化率较高，从中选择一株效果最好的作为研究对象，命名为HS-N62。该菌在12h将培养基SC 中起始浓度为140mg/L的硝酸盐氮（NO3-N，10mmol/L）完全降解，并且没有NO2-的积累。对其生长特性进行了研究，最适生长温度的范围是30℃-37℃，最适生长的pH 值范围是6. 0～8. 0，最适C/N比为10：1，并能利用多种碳源生长。运用正交试验探讨了该菌株最适的反硝化条件。通过菌株形态观察、生理生化及16S rDNA 分子鉴定，菌株HS-N62与Pseudomonas sp.亲缘关系最为接近，同源性达99 %，初步鉴定该菌为Pseudomonas sp.。关键词：好氧反硝化；分离鉴定；特性研究 1. 引言 近几十年来，我国水产养殖业迅猛发展，但在水产养殖过程中的氨、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐等营养元素含量过高所造成的富营养化现象日益严重，结果造成大量鱼虾死亡，最终导致重大经济损失，因此，控制水体中的硝态氮和亚硝态氮成为规模化养殖成功的关键之一[1]。反硝化是将硝酸盐或亚硝酸盐还原成N O或N2的过程。传统观点认为：反硝化细菌大 2 都是兼性厌氧，细菌的反硝化作用是在无氧条件下发生。但近几年国内外的不少研究报道证明好氧反硝化菌的存在。细菌好氧反硝化的发现,突破了传统理论的认识，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路[2]。 具有反硝化能力的细菌就目前所知分布于50 多个属，许多菌属如假单胞菌属( Pseudomonas )、产碱菌属( Alcaligenes)和副球菌属( Paracoccus ) 都存在好氧反硝化现象[3]。本文从常年养鱼的池塘中采样筛选出多株好氧反硝化细菌，并研究了其生长条件及其反硝化效率，可为好氧反硝化脱氮的实际应用提供依据。 2. 材料与方法 2.1 培养基 富集培养基（SM，g/L）：NaNO3 0.85，丁二酸钠2.84，KH2PO4 1.36，MgSO4·7H2O 0.19，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。 反硝化培养基(SC，g/L)：NaNO3 0.85，丁二酸钠 4.72，酸水解酪素5.0，Na2HPO4 7.9，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.10，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。微量元素(g/L)：CuSO4·5H2O 4.0，FeSO4·7H2O 0.70，FeCl3·6H2O 7.0，CoCl3·6H2O 0.20，NaMO4·2H2O 3.4 0，CaCl2·2H2O 2.0，pH 7.0 [3-4]。 BTB培养基(g/L)：丁二酸钠4.72，NaNO3 0.85，KH2PO4 1.0，FeSO4·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.1，琼脂15，pH 7.0。 基金项目：教育部博士点基金项目(20060511002)和“211”重点学科建设项目；湖北省科技攻关计划项目(2007AA201C50，2007AA301C26)。
蛋白质提取、纯化、鉴定的方法（二） 一、层析技术 1.离子交换层析的亲和洗脱这种技术结合了离子交换与亲和层析。如在某一pH时，目的蛋白质带正(负)电荷，用阳(阴)离子交换剂吸附，这一过程去除了很大一部分不吸附的杂蛋自。然后用该目的蛋白质的配体来洗脱，该配体特异性地结合目的蛋白质并使之洗脱，但不洗脱其他吸附的蛋白质，达到纯化的目的。注意，该配体需带有一定量的阴(阳)电荷，有效降低目的蛋白质与阳(阴)离子交换剂之间的电荷相互作用。 2.固相金属亲和层析重组蛋白质可在C-或N-端引入组氨酸标签，一般为6个组氨酸残基(His-tag)。这些组氨酸残基与过渡金属(transitionalmetals)Ni2+或Co2+形成配位键。用固相化的Ni2+或Co2+(如商品化的树脂，Ni-NTA)可吸附带有His-tag的重组蛋白质，用含有咪唑(imidazole)的缓冲液可洗脱重组蛋白质。注意，有些含有较多组氨酸的蛋白质也可与吸附剂结台，但较弱，因此可用低浓度的咪唑洗脱；在层析过程中不能引入金属螯合剂如EDTA；避免使用还原剂如DTT或DTE，但可用低浓度的巯基乙醇。 该技术也用于提取磷酸化的蛋白质。将螫合剂交联到树脂，螯合三价铁或三价镓，该亲和吸附剂可吸附混合物中的磷酸化的蛋白质。洗去不吸附的非磷酸化蛋白质后，用磷酸缓冲液即可将磷酸化蛋白质从该亲和吸附剂上洗脱。要注意的是酸性蛋白质也可被不同程度地吸附。 3.凝胶过滤该技术过去也被称为分子筛。构成凝胶的小珠(bead)中有大小不一的孔，分子量大的分子能进入较大的孔而不能进入小的孔，分子量小的则不仅能进入较大的孔也能进入小的孔，因此在层析过程中，小分子经过的路程较长而大分子经过的路程较短，如此就可分离分子量不同的蛋白质。然而，分子量相近的蛋白质非常多，因此，用这种技术得到的蛋白质是分子量相近的混合蛋白质。然而这种技术在某些研究中很有用，如丙酮酸激酶M2(PKM2)由四个相同的亚基组成，PKM2在细胞中以三种形式存在——单体、二聚体、四聚体，这三种形式的功能不同，若要鉴定细胞中PKM2的各种形式的量，先用凝胶过滤技术分离细胞裂解液中的PKM2的三种形式，之后用Western blot对每一种形式的PKM2做相对定量。 4.反相层析该技术是指用疏水固相的一种层析技术。“反相”是相对“正相”而言，正相是指亲水的固相如硅胶表面带有硅羟基(silanol group)，硅羟基可与被分离的化台物相互作用，被分离的化合物的亲水性越强，则滞留在正相
实验一槐米中芦丁的提取、分离和鉴定 一、概述 槐米系豆科植物槐树（Sophora japonica L.）的花蕾（槐米）。具有清热、凉血、止血的功效，用于治疗便血、痔血，尿血、血淋，崩漏，赤血痢下，风热目赤，痛疽疮毒，还可用于预防中风。近年来被用作治疗高血压的辅助药物。 药理实验证明，槐花米具有调节毛细血管的渗透作用，抗炎作用，解痉、抗渍疡作用，影响脂质代谢，抗菌等多种生物活性。槐花米中主要含有黄酮苷，皂苷、甾醇和鞣质等成分，其中芦丁(Rutin)含量最高，达12～20%。 主要化学成分的结构及理化性质： 芦丁（rutin）：C 27H 30 O 16 ·3H 2 O，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子 水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。 槲皮素（quercetin）：C 15H 10 O 7 ·2H 2 O，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结 晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。 二、实验部分 （一）实验目的 1、通过芦丁的制备，掌握黄酮类化合物提取分离的原理和操作。 2、掌握酸水解将芦丁生成槲皮素的方法。 3、掌握芦丁与槲皮素的鉴别方法，聚酰胺薄膜的操作方法，电子天平的使用方法。 （二）实验原理 1、芦丁的提取原理：芦丁中含有多个酚羟基，具有酸性，故用碱提酸沉法。 2、芦丁的分离原理：芦丁在沸水中溶解，在冷水中析出。 3、芦丁的鉴定原理：芦丁与槲皮素分别为黄酮类化合物的苷与苷元，用Molish反应可以进行鉴别，也可以利用聚酰胺的氢键吸附性质进行定性分析，Rf值也应不同。 （三）实验药材、仪器与试剂 1、药材：槐米50g(每组)。
综合实验槐花米中芦丁的提取与鉴定 （一）实验目的 (1)通过芦丁的提取与精制，掌握碱溶酸沉法提取黄酮类化合物的原理和操作。 (2)掌握黄酮类化合物的主要性质及黄酮苷的检识方法。 (3)掌握薄层层析法的操作。 (4)掌握由芦丁水解制取槲皮素的方法。 （二）实验原理 芦丁((rutin)亦称芸香苷（rutinoside），为黄酮苷，广泛存在于植物中，其中以槐花米(为槐树Sophora japnica，的花蕾)和乔麦叶中含量较高。芦丁的主要药理作用有抗炎作用、维P样作用及抗病毒作用，具有维持血管抵抗力，释低其通透性，减少脆性的作用；对脂肪肝有去脂的作用，与谷胱甘肽合去脂作用更明显；对于放射性伤害所引起的出血症也有一定治疗作用；临床上只要作防治高血压的辅助药物，毛细血管性止血药。芦丁水解后可生成槲皮素，槲皮素有一定的平喘作用；此外还有降低血压，增强毛细血管抵抗力，减少毛细血管脆性，降血脂，扩张冠动脉，增加冠状动脉血流量的作用。 槐花米中含芦丁8%~28%，槐花米甲素sophorin A 14% ，槐花米乙素sophorin B 1. 25%，槐花米丙素sophorin C 0. 35%，也含槲皮素quercetin、白桦脂醇betulin，槐二醇sophoradiol等。 本实验以常用中药槐花米为原料，对其主要成分芦丁进行提取分离及鉴定。根据芦丁分子中具有酚羟基，显弱酸性，能与碱成盐而增大溶解度，以碱水为溶剂煮沸提取，其提液加酸后加酸酸化则芦丁游离析出(碱溶酸沉法)，然后也可通过快速柱层析法对粗品进行纯化。 (三)实验步骤 1.芦丁的提取 （1）于250mL烧杯中加入120 mL石灰水溶液，0. 5 g硼砂，置于石棉网上加热至微沸后，加入10g槐花米粗粉，保持微沸60 min(不断搅拌)后，趁热用纱布包裹挤压过滤。滤渣再用100mL石灰水溶液同法操作一次。合并滤液，然后在60∽70℃保温情况下，以15%盐酸液调节pH为3∽4。静置过夜，使沉淀完全。 （2）将静置过夜的滤液的上层清液小心倾倒到烧杯中，剩下的少量液体和沉淀混合物用离心分离法得到沉淀，小心倒出离心管上层清液，再加入蒸馏水，用玻棒搅拌洗涤沉淀，离心，倒出上层清液，重复上述操作，直至倒出的蒸馏水洗液为中性，将离心管和沉淀一起放入烘箱中干燥，称量。
水体中反硝化细菌的分离、筛选与初步鉴定 邵基伦环境工程专业 摘要：当今世界环境污染日益加重，尤其是水体污染已严重影响人们的日常生活与身体健康。水污染是多方面的因素综合作用，而以氨氮的污染最为广泛且严重。所以控制污水中的氨氮含量是污水处理中的重要内容。污水脱氮的基本原理是污水中的含氮有机物首先经过微生物的氨化作用转化为氨，硝化细菌的硝化作用，将氨氧化为亚硝酸盐，并继续氧化为硝酸盐。硝酸盐经过反硝化细菌的反硝化作用转化为氮气等环节成分而释放到大气中，从而实现污水脱氮。硝化作用是这一过程中的一个中间环节，也是一个重要环节。硝化作用是指氨经过微生物的作用氧化为亚硝酸和硝酸的过程，由硝化细菌完成。硝化细菌是一类好样化能自养细菌，包括亚硝化细菌和硝化细菌两个亚群。硝化细菌能够利用还原态无机氮化合物进行自养生长，硝化细菌的生命活动在污水脱氮中起重要作用。由于硝化细菌是化能自养菌，其生长速率很慢，因此硝化、亚硝化细菌的生命活动成为污水脱氮的关键步骤之一。它们能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接影响硝化效果和生物脱氨的效率。因为硝化细菌、亚硝化细菌在污水脱氮中的特殊意义，对这类微生物的研究受到广泛关注。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38 ℃，高于20℃时硝化细菌的活性较高，但超过38℃消化作用将会消失。当环境气温低于20℃时，氨的转化会受到影响。一般认为，适宜硝化菌和亚硝化菌生长介质的pH值分别为6.0～8.5和6.0～8.0。水体DO的高低影响到好氧、厌氧微生物的比例，大多数研究人员认为DO的浓度应当控制在1.0～2.0 mg/L,低于0.5 mg/L时硝化作用明显减弱。另外,碳氮比、碱度等对硝化及脱氨均有影响。 本实验采用人工培养基方法富集培养硝化细菌．研究了富集培养过程中硝化与亚硝化细菌的结构和性质变化。结果表明，在25-28℃，pH7．5～8.5，D0 2-5mg／L，氨氮浓度100—150mg ／L条件下，经过19d和15d的富集培养，可以得到硝化速率为4.18mg(NH3-N)-[g(MLSS)/h]和10.1mg(NH4-N)-[g(MLSS)/h]的硝化细菌培养物．在这种富集培养过程中，硝化细菌培养物的污泥色泽和结构、MLSS、SV30、SVI、硝化强度和硝化速率等均出现规律性变化且随培养方法不同表现出明显差异。
蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 来源：易生物实验浏览次数：2704网友评论0 条第一部分蛋白质的表达、分离、纯化克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作 结构与功能的研究。 第二部分蛋白质的鉴定电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。 关键词：蛋白质蛋白质表达克隆基因聚丙烯酰胺凝胶电泳氯霉素酰基转移酶十二烷基硫酸钠SDS聚丙烯酰 胺凝胶 第一部分蛋白质的表达、分离、纯化 目的要求 （1）了解克隆基因表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MC AC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材
一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. [2] 氨苄青霉素：100mg/mL [3] 上样 缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 [4] Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 [5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH 8.0 [6] IPTG 易生物仪器库：.ebioe./yp/product-list-42.html 易生物试剂库：.ebioe./yp/product-list-43.html 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1′10 cm） 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.
实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定 第一部分蛋白质的表达、分离纯化 目的要求 （1）了解重组蛋白表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离纯化对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时目的基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni2+）亲和层析介质加以分离纯化，称为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材 一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。 [2] 氨苄青霉素：100mg/mL。 [3] 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM β-巯基乙醇, pH8.0。 [4] 清洗缓冲液(UWB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。 [5] 洗脱液缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。 [6] IPTG 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1 10 cm），蠕动泵 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mL
实验一槐米中芦丁的提取、分离与鉴别 一、实验目的 （1）掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。 （2）掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。 二、实验原理 芦丁(Rutin)亦称芸香苷(Rutisude)，广泛存在于植物界中。现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。 槐花米为豆科植物槐(Sophora japonica L)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达23.5%，槐花开放后降至13.0%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性，临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。 芦丁(Rutin)为淡黄色细小针状结晶，mp.174℃~178℃(含三分子结晶)，188℃(无水物)。溶解度情况如下： 水：1:10000(冷)，1:200(热) 甲醇：1:100(冷)，1:9(热) 乙醇：1:300(冷)，1:30(热) 吡啶：1:11.7(冷)，易溶(热) 不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。 芦丁可溶于热水，难溶于冷水，其分子结构中具有较多的酚羟基，显弱酸性，在碱液中易溶解，而在酸性条件下，易析出沉淀，故本实验采用碱溶解酸沉淀的方法自槐米中提取芦丁。再利用其在冷热水中溶解度的差别采用沸水为结晶溶剂进行精制。利用芦丁可被稀酸水解，生成苷元和糖，通过颜色反应、薄层层析等方法进行检识和确认芦丁。 三、实验内容 （一）芦丁(芸香苷)的提取 1. 取1.5g石灰粉（CaO），置于干净的小研钵中，加入10mL水研成乳液备用。称取槐米20g，于1000m1烧杯中，加0.4%硼砂水溶液200mL，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH 8～9，加热至微沸，维持pH值20-30分钟，趁热抽滤，弃去滤渣，冷至60-70℃用浓盐酸调至pH4-5，放置过夜，减压过滤，得粗芦丁（滤
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同
槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定 槐米为豆科植物槐（Sophora japonica L ．）的未开放花蕾。味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。槐米常炒炭应用。 槐米的主要化学成分为芦丁，其含量可达12～16％，其次含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。芦丁具有Vitp 样作用，可降低毛细血管脆性和调节通透性。临床上用作毛细血管脆性引起的出血症，常作为高血压症的辅助治疗药。 [目的要求] 1．通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 2．掌握槲皮素的制备原理及操作。 3．熟悉紫外光谱在黄酮结构鉴定中的应用 4．通过芦丁的结构检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 [实验原理] 芦丁（rutin ）：C 27H 30O 16·3H 2O ，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。 槲皮素（quercetin ）：C 15H 10O 7·2H 2O ，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。 芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶热水、热乙醇， 较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择
实验二槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定 槐米为豆科植物槐（Sophora japonica L．）的未开放花蕾。味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。槐米常炒炭应用。 槐米的主要化学成分为芦丁，其含量可达12～16％，其次含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。芦丁具有Vitp样作用，可降低毛细血管脆性和调节通透性。临床上用作毛细血管脆性引起的出血症，常作为高血压症的辅助治疗药。 [目的要求] 1．通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 2．掌握槲皮素的制备原理及操作。 3．熟悉紫外光谱在黄酮结构鉴定中的应用 4．通过芦丁的结构检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。[实验原理] 芦丁（rutin）：C27H30O16·3H2O，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。 槲皮素（quercetin）：C15H10O7·2H2O，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。
芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶热水、热乙醇，较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择重结晶方法进行精制。芦丁可被稀酸水解生成槲皮素及葡萄糖、鼠李糖，依此进行制备槲皮素。通过纸色谱及紫外光谱进行黄酮及糖的鉴定。 [实验内容] 一、芦丁的提取分离及精制 方法⑴ 500ml 饱和石灰水，加热，并维持pH8～9 滤液 药渣 10分钟，维持pH8～9 pH 至4 ～5 沉淀 低温（80℃）干燥，称重。按1：200的比例加水， 加热使溶解，趁热滤过 滤液 静置，抽滤，减压干燥，计算收率 芦丁精制品