青海农林科技?专 题 综 述?2001年第4期
小麦蛋白质品质研究进展
车永和,马晓岗
(青海省农林科学院作物所, 青海 西宁 810016)
摘 要:小麦是人类重要的蛋白质来源。小麦蛋白质对小麦营养品质和加工特性都有非常重要的影响,它是小麦国际贸易和品质评价中的基本指标。本文就小麦蛋白质品质的蛋白质含量、蛋白质质量、麦谷蛋白和麦醇溶蛋白、面筋含量和质量、沉淀值等有关蛋白质品质的几个主要方面研究情况进行了综述和讨论,以期为小麦品质育种提供参考。
关键词:小麦;蛋白质;品质
中图分类号:S152.1+233 文献标识码:A 文章编号:100429967(2001)0420023203
小麦是人类重要的蛋白质来源(约占总谷物蛋白质的38.4%),它提供着世界约35%人口的主要食物,小麦品种的品质水平状况,不仅是小麦商品粮的品质基础,也是专用面粉生产和食品加工企业生产优质食品的重要物质基础,小麦产量和品质的多少与优劣,直接关系到人类食物的满足程度和生产水平的提高,影响着人类的营养平衡。小麦蛋白质品质对小麦营养品质和加工特性都有非常重要的影响,是小麦国际贸易和品质评价中的基本指标,也是目前研究最为广泛和深入的小麦品质指标。本文就小麦有关蛋白质品质的几个主要方面的研究做一综述,以期为小麦品质育种研究工作提供参考。
1 蛋白质含量
小麦籽粒蛋白质含量与湿面筋含量具有很好的相关性,与加工品质密切相关。不同用途的小麦面粉对小麦蛋白质含量要求不同,对馒头小麦品种的面粉粗蛋白含量一般要求以高于12.5±1%为宜〔1〕;中国面条(加碱黄色面条)一般要求小麦中蛋白质与淀粉的含量与质量,以及小麦的各种品质指标都要适中,过高、过低都不行(M iskelly,1989)〔2〕。黄东印(1990)指出,面粉蛋白质含量与干面条断裂强度呈极显著正相关,林作楫(1994)〔3〕研究也发现,蛋白质含量不仅与煮面强度高度相关,而且与煮熟面条的外观表现和总评价值呈显著负相关。因此,一般认为中国面条适宜的蛋白质含量应为中等,即12%～13%左右;小麦蛋白质含量在8%～20%范围内,蛋白质含量与面包体积呈线性关系,烘烤品质较好(尹应哲,1990;李志西等,1998)。
据李鸿恩〔4〕(1995)对我国小麦种质资源品质现状分析来看,蛋白质平均含量为15.10%,变异幅度为7.50%～28.90%。我国首批面包小麦品种蛋白质含量为14.64%～18.61%〔5〕。我国冬小麦蛋白质含量高于春小麦,晚熟品种高于早熟品种。蛋白质含量还存在地域差异,我国北方品种高于南方品种,北方小麦基本上呈现为连片的高蛋白含量区〔4〕。一般情况下,蛋白质含量除受基因型作用外,很大程度上取决于环境条件,尤其是肥力影响。成熟前15d 是温度影响蛋白质含量的关键时期(Smika等,1973; Blumenhal等,1993;Ciaff等,1996)。降雨不利于蛋白质的积累,长日照对小麦籽粒蛋白质的形成和积累是有利的〔4〕。
2 蛋白质质量
蛋白质质量决定着小麦的食品加工品质(K osm olak等,1980;Lagudah等,1987)。清蛋白和球蛋白约占蛋白的10%,主要存在于糊粉层、胚和种皮中,是可溶性蛋白。许多研究结果表明,清蛋白氨基酸组成比较平衡,特别是赖氨酸、色氨酸和蛋氨酸含量较高,但清蛋白与谷蛋白、干面筋含量、面包体积、面包评分呈显著或极显著负相关,与拉伸长度呈显著负相关。小麦制粉后,保留在面粉中的蛋白质主要是醇溶蛋白和谷蛋白,因此,清蛋白和球蛋白营养价值虽高,但对蛋白质的加工品质作用微小。
醇溶蛋白和谷蛋白为贮藏蛋白质,是组成面筋的主要成分,约占小麦籽粒蛋白质的80%左右,二者的数量和比例关系决定着面筋质量,醇溶蛋白约占蛋白质总量的40%～50%,富有粘性、延展性和膨胀性。谷蛋白约占小麦蛋白质总量的35%～45%,决定面筋的弹性,其在面粉、面筋中的含量多少和质量好坏与面包烘烤品质有关〔6〕。舒卫国(1996)研究认为谷蛋白与面包体积,面包评分呈显著正相关。
小麦中还存在着大量不能被水、盐、乙醇或稀碱溶解的剩余蛋白质〔8〕,剩余蛋白质的数量与面团强度和面包烘烤品质之间存在着很好的正相关关系,对小麦品种品质具有重要影响(赵友梅等,1989)。
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3 麦谷蛋白和麦醇溶蛋白研究
蛋白质品质与表谷蛋白和麦醇溶蛋白分子量分布及其组分的比例关系极为密切,麦谷蛋白和麦醇溶蛋白的含量,组成互作与面团的弹粘性和延展性密切相关,可以说决定着加工品质的优劣。
小麦贮藏蛋白质组成具有高度的遗传稳定性,品种间的醇溶蛋白和麦谷蛋白电泳图谱存在着明显的差异,且不受环境条件的影响〔9〕。根据醇溶蛋白在酸性条件下的电泳迁移率可将其分为α2、β2、γ2、ω2四种类型。Payne〔10〕(1984)报导,含有γ2醇溶蛋白45带和ω2醇溶蛋白35带的品种,其通心面煮熟品质都好。黄思棣(1988)等发现,面条品质与醇蛋白亚基组成有关。G alterio(1990)发现,通心面煮熟品质与麦谷蛋白/醇溶蛋白的比值有关,并认为其比值应小于1.5;面条品质与低分子量/中分子量麦谷蛋白比值也呈极显著正相关(r=0.96)。
利用S DS聚丙烯酰胺凝胶电泳,可将麦谷蛋白分为高分子量的麦谷蛋白亚基(H MW2G S)和低分子量的麦谷蛋白亚基(LMW2G S)。不同亚基组合的品种的H MW2G S在总蛋白比例没有显著变化,其含量也没有显著差异(Bedo等,1995)H MW2G S组成和质量与烘烤品质关系密切〔5,6,7〕,Payne和Lawrence (1983年)总结了大约300种面包小麦的等位基因顺序,表明在G lu2A1位点有3种等位基因(1,23,null), G lu2B1位点有11种等位基因(编码14种不同的多肽)。在G lu2D,位点有6种等位基因(编码8种不同的多肽)。Paynet等〔9〕(1987年),根据各品种的烘焙表现,比照品种的H MW2G S的存在与否,给予各亚基适当的品质分数,最好的质量亚基是基因对1D5+10(相对于1D2/9+12而言)。烘烤品质的好坏既受H MW2G S的影响,又与LW M2G S有关,两者之间的相互作用对品质的影响非常明显。研究表明,面包小麦品种都含有1A染色体控制的1或23亚基,多数品种含有1D染色体控制的5+10亚基,部分品种含1B染色体控制约17+18或13+18或7+8亚基,这些亚基组合对烘烤品质具有重要的正效应。
H MW2G S组分对馒头体积和白度也有一定影响(张春庆等,1993)。
由于贮藏蛋白具有高度异质性和复杂性,需要高效的分离技术,这方面的研究一直受到国内外的高度重视。目前多采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS2 PAGE、A2PAGE)和高效液相色谱(HP LC)分离醇溶蛋白和谷蛋白。采用反相高效液相色谱(RP2HP LC)技术〔11〕可将小麦按其种子醇溶蛋白色谱图上后期洗脱的四个相互排斥的组分峰,把它们分为两类,其中具有A1、A2、A4三个组分峰的品种面筋强度大,烘烤性能好,而只有A3组分峰的品种面筋强度弱,烘烤性能差。近年来,高效毛细管电泳(HPCE)技术、声振和大小排阻高效液相色谱(SE2HP LC)等分离技术得到迅速发展,并已在多肽、蛋白质、核酸等大分子物质的分离分析中发挥了重要作用。最近,HPCE已开始引入谷物贮藏蛋白质分析,并对小麦醇溶蛋白和谷蛋白亚基分离条件、效果及与面包烘烤体积之间的关系作了一定探讨(S ingh等,1990;晏月明, 1998)。
4 面筋含量与质量
面筋是小麦品质的基本因素,小麦面筋主要由醇溶蛋白和谷蛋白组成,醇溶蛋白赋予面筋延展性,而谷蛋白赋予面筋弹性,面筋的特性如何,取决于这两种蛋白的组合。
总体讲,蛋白质含量越高的小麦,其湿面筋含量也高(顾尧臣,1998)。因而,可在品质育种的早代省去面筋含量的测定。瑞典谷物协会研究表明:小麦的湿面筋含量和凯氏法蛋白质含量的相关系数为0.983,湿面筋含量基本代表了小麦蛋白质含量的高低。我国在“十五”国家重点科技项目的研究中,测定的国产小麦湿面筋含量和蛋白质含量的相关系数为0.92。小麦面筋含量与面团吸水率、面团形成时间,面团稳定时间、面包体积、纹理结构等密切相关(D ong等,1992;李志西等,1997)。
面筋的弹性和延展性使面包、馒头、蛋糕等食品保持较大的体积,形状完整,有弹性,食品的这些特性和面筋质量的优劣呈正相关(顾尧臣,1998)。在籽粒化学组分对馒头质量指标影响作用中,影响总评分的是湿面筋、直链淀粉含量(复相关系数为0.528)〔12〕。
面筋的质量通常称为筋力,根据筋力大小可将面粉分为高筋粉,中筋粉和低筋粉。高筋粉适宜烧烤面包,低筋粉适宜制作糕点和饼干,目前使用的面筋质量指标有面团稳定时间,面筋溶胀值和面筋指数。稳定时间和面筋筋力具有很好的相关性,稳定时间越长,面筋筋力越好。
面筋含量一般呈中间遗传,但有时也出现超亲现象,其遗传力中等(李宗智,1991)。S wena认为至少有8个基因控制面筋含量,Nedelea(1974和1976)分析了42个杂交组合的第一至第三代后指出,在决定面筋含量中起最大作用的遗传方式是基因的累加作用。显性是不完全的、单向性的,同低面筋含量相联系。Boyd等(1967)确定,面筋的合成,一部分是由染色体1D决定的,而在A组和B组染色体上也有该基因的重复。面筋含量的一般配合力的效应大,杂种同亲本的面筋含量密切相关。特殊配合力的效应和正反效应都不显著(Nedelea,1976)。
5 沉淀值
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沉淀值最早由Z eleny(1947)提出,它是指单位重量面粉于弱酸条件下,在一定时间内蛋白质吸水膨胀所形成的悬浮沉淀数量的多少,沉淀值可以正确反映小麦蛋白质的质和量及面团变学特性,预测面粉的烘烤品质,在小麦品质改良中具有相当重要的地位。
很多研究表明,沉淀值比其它方法能更深刻地反映出遗传差异,而且它与面粉食品加工品质性状有显著或极显著相关性。它同蛋白质含量(r=0.30～0.90),面包体积(r=0.35～0.62),粉质仪记分(r =0.25～0.65)之间均呈正相关Clonkhuijsen等, 1992;Atkins,1965;王光瑞等,1985;张彩英等,1989)。沉淀值与小麦蛋白质组分含量之间的关系表明,清蛋白、球蛋白和醇蛋白与沉淀值相关性很小,麦谷蛋白与沉淀值呈极显著正相关。沉淀值与高分子量麦谷蛋白亚基组成的变异有密切关系,不同亚基对S DS沉淀值的贡献不同,具有优质亚基5+10,1或23的品种往往是有较高的沉淀值和优良的烘烤品质〔13,14〕。马传喜(1995)认为按沉淀值的大小进行品质选择,非常有利于保存具有17+18亚基的单株,而17+18亚基对面包品质的作用明显大于7+8亚基。可见,沉淀值能深刻地反映小麦品种的加工品质,决定面粉的最终用途。
根据沉淀值可将小麦品质由优到劣分为大于50ml、49～35ml、34～20ml、小于20ml四级(李宗智, 1991)。欧美一些国家还规定,在小麦面粉分级时,沉淀值大于50ml的为高强度面粉,小于30ml的为低强度面粉,界于二者之间的为中强度面粉〔15〕。李宗智(1993)认为沉淀值在50ml以上的小麦品种为特优种质。
沉淀值在小麦品种间存在较大的差异,这可能是由于麦谷蛋白亚基的品质不同所致(Bedo等, 1995;许自成,1998)。在我国不同地区小麦硬度和沉淀值有从南向北逐渐增大的趋势〔16〕。多数研究结果表明,沉淀值具有较高的遗传力,将沉淀值作为早代选择指标有利于协调品质性状之间的关系。沉淀值可以与早熟、抗倒伏及较高水平的产量因素相结合(李宗智,1990;刘广田等,1990)。
综上所述,小麦蛋白质品质是个非常重要和复杂的问题,许多方面仍需进一步深入探索研究,随着分子生物学、遗传工程等高科技手段的不断发展和应用,小麦品种品质研究将会取得更大成就。
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动植物蛋白源替代鱼粉的研究进展 1 鱼粉 1.1 鱼粉的特点 由于鱼粉具有必需氨基酸和脂肪酸含量高,碳水化合物含量低,适口性好,抗营养因子少以及能够被养殖动物很好的消化吸收等特点，一直以来是水产饲料中不可或缺的优质蛋白源。鱼粉在饲料中的营养作用主要是提高氨基酸平衡性和利用效率,与其它蛋白原料相比，有比较显著的优势。但鱼粉的作用不仅在于其蛋白、氨基酸的作用优势, 还在“未知生长因子”、维生素、微量元素等方面具有营养作用优势。 1.2 无鱼粉或低鱼粉饲料技术对策 在所有的饲料原料中，鱼粉在促进养殖动物生长、提高饲料利用效率方面的效果是最为明显的。在配合饲料中，是否使用鱼粉及使用量不同所获得的养殖效果会有很大的差异，即饲料中鱼粉的使用量与养殖鱼产品的生长速度、饲料效率具有显著的正相关关系, 鱼粉在配合饲料中的使用对配合饲料的质量有非常直接的关系。如在草鱼、武昌鱼饲料中基本不用鱼粉，但是使用1% ~2%的鱼粉后,鱼生长速度可以提高10%以上,同时鱼体的生理机能也会得到改善。因此，在不使用鱼粉或低鱼粉饲料中考虑的技术处理主要包括以下几方面的内容。 1.2.1 配合饲料中氨基酸的平衡性和有效性 蛋白质的营养实际上是通过氨基酸的营养作用来实现的，因此,在无鱼粉或低鱼粉饲料中优先考虑的技术处理是氨基酸的平衡性。由于鱼类对单体氨基酸的利用效果很差, 在部分种类鱼中使用单体赖氨酸、蛋氨酸是没有效果的。对于饲料氨基酸的平衡就只能依赖于饲料原料中氨基酸的互补作用来实现, 在设计无鱼粉或低鱼粉饲料配方时可以选择肉粉、肉骨粉、豆粕、菜粕、棉粕等通过比例调整来实现必需氨基酸的平衡。氨基酸平衡效果的评判可以采用必需氨基酸模式相关系数的大小来判定,即以养殖对象鱼肌肉必需氨基酸模式作为标准模式, 将配方中必需氨基酸模式与此进行比较, 计算两组模式的相关系数, 相关系数越大, 表明配方中必需氨基酸的平衡效果越好。但要考虑氨基酸的利用率问题, 即必需氨基酸的有效性问题。有些原料虽然蛋白含量很高, 但消化利用率很低, 如羽毛粉、皮革粉蛋白含量可以达到80% 以上, 但消化率只有30%左右, 无论是单独使用或是加人鱼粉(掺假鱼粉)中, 均会使配方中必需氨基酸的有效性显著降低。因此,在计算必需氨基酸平衡效果时, 尽可能选择消化率高的饲料原料组成配方来进行必需氨基酸的平衡。
?综述与专论? 2014年第1期 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 随着基因组计划的完成，生命科学研究开始进入以基因组学、蛋白质组学、营养组学、代谢组学等“组学”为研究标志的后基因组时代。蛋白质组（proteome）一词最早是由澳大利亚科学家Wilkins 和Williams 于1994年提出［1］，1995年7月最早见诸于Electrophoresis 杂志［2］，意指一个细胞或组织中由基因组表达的全部蛋白质。蛋白质组学（proteomics）是一门大规模、高通量、系统化的研究某一类型细胞、组织、体液中的所有蛋白质组成、功能及其蛋白之间的相互作用的学科。 虽然基因决定蛋白质的水平，mRNA 只包含了转录水平的调控，其表达水平并不能代表细胞内活 收稿日期：2013-09-05基金项目：甘肃省科技计划基金资助项目（0708NKCA129），兰州大学第二医院医学研究基金项目（YJ2010-08）作者简介：尹稳，女，硕士，研究方向：蛋白质组学；E -mail ：yinwen0508@https://www.doczj.com/doc/d65731994.html, 通讯作者：伏旭，男，硕士，研究方向：生物化学与分子生物学；E -mail ：fuxu0910@https://www.doczj.com/doc/d65731994.html, 蛋白质组学的应用研究进展 尹稳1 伏旭2 李平1 （1.兰州大学第二医院，兰州 730030；2.兰州大学第二医院急救中心，兰州 730030） 摘 要： 蛋白质组学（Proteomics）是一门大规模、高通量、系统化的研究某一类型细胞、组织或体液中的所有蛋白质组成及其功能的新兴学科。虽然基因决定蛋白质的水平，但是基因表达的水平并不能代表细胞内活性蛋白的水平，蛋白质组学分析是对蛋白质翻译和修饰水平等研究的一种补充，是全面了解基因组表达的一种必不可少的手段。蛋白质组学相关技术的发展极大地推动了蛋白质组学的研究进展，使其在各研究领域得到了广泛的应用。对蛋白质组学相关技术及其在各领域的应用进行了综述，最后对蛋白质组学的发展趋势和应用前景作出展望。 关键词： 蛋白质组学 双向凝胶电泳 质谱 生物信息学 应用现状 Application Research Progress of Proteomics Yin Wen 1 Fu Xu 2 Li Ping 1 （1. Lanzhou University Second Hospital ，Lanzhou 730030；2. Department of Emergency ，Lanzhou University Second Hospital ，Lanzhou 730030） Abstract: Proteomics is an emerging discipline for studying proteins composition and function in a type of cell, tissue or body fluids in a large -scale, high -throughput and systematic level. While genes determine the level of protein, but the level of gene expression can not represent the intracellular reactive protein levels. Proteomic analysis is a complement to the study of translation and modification and also an indispensable tool for a comprehensive understanding of genome expression. The development of proteomic technologies has greatly promoted the progress of proteomic research, and it has been widely used in various research fields.This paper revieweded the proteomic technologies and the applications in various fields are also briefly reviewed. Finally, some future issues are presented. Key words: Proteomics Two -dimensional gel electrophoresis Mass spectrometry Bio -informactics Application status 性蛋白的水平［3］，且转录水平的分析不能反应翻译后对蛋白质的功能和活性起至关重要作用的蛋白修饰过程［4］，如酰基化、泛素化、磷酸化或糖基化等。而蛋白质组学除了能够提供定量的数据以外，还能提供包括蛋白定位和修饰的定性信息。只有通过对生命过程中蛋白质功能和蛋白质之间的相互作用以及特殊条件下的变化机制进行研究，才能对生命的复杂活动具有深入而又全面的认识。近年来，蛋白质组学技术取得了长足的发展，随着新技术的不断涌现，其应用范围也不断扩大。本文对蛋白质组学相关技术及其在各研究领域的应用进行了简要的归纳和评述，并对蛋白质组学的发展趋势和应用前景
蛋白质工程的现状发展及展望 摘要: 蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词: 蛋白质工程;定点诱变; 定向进化 20世纪70年代以来, 对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域, 通过对蛋白质分子进行突变, 得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1.理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术, 通过在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。Markus Roth通过同源性比对和定点突变技术, 对EcoR DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键, Caho通过定点突变研究, 发现将五个氨基酸残基置换之后的酶, 由6- 16 : 0- ACP脱氢酶变成9- 18 : 0- ACP脱氢酶。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacillus stear other mophilus分离出来的嗜热菌蛋白酶突变, 得到的突变体稳定性提高了8倍, 100 在变性剂存在的情况下还能发挥作用,但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构, 从而造成很大的影响, 所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术, 用于改造蛋白质分子。[1] 2.非理性进化 非理性蛋白质进化, 又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程, 利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性, 结合高通量筛选技术, 使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质, 而是人为地制造进化条件, 在体外对酶的编码基因进行改造, 定向筛选, 获得具有预期特征的改良酶, 在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足, 具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于
蛋白质工程及其应用研究进展 摘要：蛋白质工程是生物工程中五大工程之一，本文对蛋白质工程作了简要概述，介绍了蛋白质工程的特点，并从蛋白质结构分析结构、功能的设计和预测、蛋白的创造和改造等方面对蛋白质工程研究内容进行详细论述，并以实例作了蛋白工程的应用。 关键词：蛋白质工程特点；研究内容；实际应用；展望 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在的天然蛋白质，有的往往不尽人意，需要进行改造。由于蛋白质是由许多氨基酸按一定顺序连接而成的，每一种蛋白质有自己独特的氨基酸顺序，所以改变其中关键的氨基酸就能改变蛋白质的性质。而氨基酸是由三联体密码决定的，只要改变构成遗传密码的一个或两个碱基就能达到改造蛋白质的目的。蛋白质工程的一个重要途径就是根据人们的需要，对负责编码某种蛋白质的基因重新进行设计，使合成的蛋白质变得更符合人类的需要。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。 蛋白质工程是在基因重组技术、生物化学、分子生物学、分子遗传学等学科的基础之上，融合了蛋白质晶体学、蛋白质动力学、蛋白质化学和计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。其内容主要有两个方面：根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系。在此基础之上，实现从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新的蛋白质，这也是蛋白质工程最根本的目标之一。 目前，蛋白质工程尚未有统一的定义。一般认为蛋白质工程就是通过基因重组技术改变或设计合成具有特定生物功能的蛋白质。实际上蛋白质工程包括蛋白质的分离纯化，蛋白质结构和功能的分析、设计和预测，通过基因重组或其它手段改造或创造蛋白质。从广义上来说，蛋白质工程是通过物理、化学、生物和基因重组等技术改造蛋白质或设计合成具有特定功能的新蛋白质。 1概念 按人们意志改变蛋白质的结构和功能或创造新的蛋白质的过程。包括在体外改造已有的蛋白质，化学合成新的蛋白质，通过基因工程手段改造已有的或创建新的编码蛋白质的基因去合成蛋白质等。为获得的新蛋白具备有意义的新性质或新功
蛋白质工程的主要研究方法和进展 李 强 施碧红* 罗晓蕾 左祖祯 邢佩佩 刘 璐 (福建师范大学生命科学学院,福建福州 350108) 摘 要:蛋白质工程是用分子生物学手段对蛋白质进行分子改造的技术。介绍了蛋白质工程的几种常用方法及其基本原理和研究进展。 关键词:蛋白质工程;定点诱变;定向进化 中图分类号 Q816 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2009)05-47-02 Advances in The Techni q ues of P rotein Engineering L i Q iang et al (Co llege o f L ife Sc iences,Fu jian N or m a lU n i versity,Fuzhou350108,Chi na) Ab strac t:P ro tein eng ineer i ng is a techn i que used to i m prove prote i n m o l ecular In th i s paper,seve ra l m ethods and t he ir pr i nci p les and their advantag es f o r m olecu lar m odifica ti on have been rev ie w ed K ey words:P rote i n eng i neer i ng;site-d i rected m utag enesis;d irected evoluti on 20世纪70年代以来,对蛋白质的分子改造渐渐进入研究领域,通过对蛋白质分子进行突变,得到具有新的表型和功能或者得到比原始蛋白相对活力更高的突变体,对蛋白质的分子改造技术逐渐纯熟。蛋白质工程的主要技术分为理性进化和非理性进化,已经在农业、工业、医药等领域取得了较大的进展。 1 理性进化 理性进化主要是利用定点诱变技术,通过在已知D NA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片段达到定点突变氨基酸残基的目的。运用该技术已有不少成功改造蛋白质的例子。M arkus Rot h通过同源性比对和定点突变技术,对E c o R DNA甲基化酶进行改造,使其对胞嘧啶的亲和性增加了22倍[1]。定点突变还主要应用于蛋白质结构和功能的研究方面。酰基载体蛋白(ACP)的主要作用是在单不饱和脂肪酸的特定位置引入双键,Cahoo 通过定点突变研究,发现将五个氨基酸残基置换之后的酶,由 6-16:0-ACP脱氢酶变成 9-18:0-ACP脱氢酶[2]。Van den Burg利用蛋白同源建模和定点突变技术结合的方法将从Bacill us stear other m oph il us分离出来的嗜热菌蛋白酶突变,得到的突变体稳定性提高了8倍,100在变性剂存在的情况下还能发挥作用[3],但是大部分单个氨基酸的改变对于整个蛋白的影响比较小,很难在高级结构上改变蛋白质的三级结构,从而造成很大的影响[4],所以在定点突变的基础上又出现了许多新的技术,用于改造蛋白质分子。 2 非理性进化 非理性蛋白质进化,又称定向进化或者体外分子进化,在实验室中模拟自然进化过程,利用分子生物学手段在分子水平增加分子多样性,结合高通量筛选技术,使在自然界中需要千百万年才能完成的进化过程大大缩短,在短期内得到理想的变异。这种方法不用事先了解蛋白质结构、催化位点等性质,而是人为地制造进化条件,在体外对酶的编码基因进行改造,定向筛选,获得具有预期特征的改良酶,在一定程度上弥补了定点诱变技术的不足,具有很大的实际应用价值。一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的改造。绿色荧光蛋白由于本身独特的发光性质,被应用到细胞生物学当中,作为体内原位跟踪蛋白质的一个极其有效的工具。D i sc oso m a红色荧光蛋白(Ds R ed)在荧光共振能量转移技术(fl uoresce nce resonance e ner gy tr ansfer)中可以和绿色荧光蛋白一起作用,作为研究两种蛋白质相互作用的有效工具,但是野生型的D s Red由于显色速率较慢,而且稳定性较差,B r oo ke B evi s建立随机突变文库,在103-105个转化子中筛选到了大大提高显色效率的突变体,使显色效率提高了10-15倍[5-6]。 易错PCR是利用DNA聚合酶不具有3!-5!校对功能的性质,在PCR扩增待进化酶基因的反应中,使用低保真度的聚合酶,改变四种d NTP的比例,加入锰离子并增加镁离子的浓度,使DNA聚合酶以较低的比率向目的基因中随机引入突变,并构建突变库。M oor e等对鼠伤寒沙门菌Sal m onella t yph m i uri u m产生的门冬氨酰二肽酶(asp art yld i pepti dase)进行改良,经两次易错PCR引入随机突变,并结合D NA改组和正向选择筛选,得到的pepEm3074突变株,其酶活力比野生菌提高47倍[7]。 D NA改组(DNA shuffli ng)技术克服了随机突变的随机性较大的限制,能够直接将多条基因的有利突变直接重组到一起,它的原理是使用D N ase?酶切或超声波断裂多条具有一定同源关系的蛋白编码基因,这些小片段随机出现部分片段的重叠,产生的片段在不加引物的情况下进行几轮PCR,通过随机的自身引导或在组装PCR过程中重 47 安徽农学通报,Anhu iAgri Sci Bu ll 2009,15(5) 作者简介:李强(1983-),男,辽宁抚顺人,硕士研究生,研究方向:分子遗传育种。*通讯作者 收稿日期:2009-01-15
《蛋白质结构解析研究进展》 一、蛋白质结构分类 人类对于进化的认识及蛋白质结构相似性比较的研究使蛋白质结构分类成为可能，而且近年来取得的研究进展表明，大部分蛋白质可以成功的分入到适当数目的家族中。目前国际上流行的蛋白质结构分类数据库基本上采取两种不同的思路，一种是数据库中储存所有结构两两比较的结果；第二种思路是致力于构建非常正式的分类体系。由于所有分类方法反映了各研究小组在探究这个重要领域的不同角度，所以这些方法是同等有效的。目前，被广泛应用的四种分类标准是：手工构造的层次分类数据库SCOP，全自动分类的MMDB和FSSP，和半手工半自动的CATH。 蛋白质结构自动分类问题可以被纳入机器学习的范畴，通过提取分析蛋白质结构的关键特征，构造算法来学习蕴含于大量已知结构和分类的数据中的专家经验知识，来实现对未知蛋白质结构的分类预测。目前，对蛋白质结构的不同层次分类，结果比较好的机器学习方法是：神经网络多层感知器、支持向量机和隐马尔可夫模型。支持向量机应用于分类问题最终归结于求解一个最优化问题。上世纪90 年代中期，隐马尔可夫模型与其他机器学习技术结合，高效地用于多重比对、数据挖掘和分类、结构分析和模式发现。多层感知器即误差反向传播神经网络，它是在各种人工神经网络模型中，在机器学习中应用最多且最成功的采用BP学习算法的分类器。 二、蛋白质结构的确定 蛋白质三维空间结构测定方法主要包括X射线晶体学分析、核磁共振波谱学技术和三维电镜重构，这三种方法都可以完整独立地在原子分辨水平上测定出蛋白质的三维空间结构。蛋白质数据库PDB中80%的蛋白质结构是由X射线衍射分析得到的，约15%的蛋白质结构是由核磁共振波谱学这种新的结构测定方法得到。 1、X射线晶体学
蛋白质工程的基本原理蛋白质工程的研究与进展 蛋白质工程的研究与进展摘要: 蛋白质是生命的体现者，离开了蛋白质，生命将不复存在。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。它所取得的进展向人们展示出诱人的前景。 关键词:蛋白质工程；研究；进展；蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。 1、蛋白质工程 1.1蛋白质工程的定义所谓蛋白质工程，就是利用基因工程手段，包括基因的定点突变和基因表达对蛋白质进行改造，以期获得性质和功能更加完善的蛋白质分子。 1.2蛋白质工程的由来蛋白质工程是在基因工程冲击下应运而生的。基因工程的研究与开发是以遗传基因，即脱氧核糖核酸为内容的。这种生物大分子的研究与开发诱发了另一个生物大分子蛋白质的研究与开发。这就是蛋白质工程的由来。它是以蛋白质的结构及其功能为基础，通过基因修饰和基因合成对现存蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。这种新型蛋白质必须是更符合
人类的需要。因此，有学者称，蛋白质工程是第二代基因工程。其基本实施目标是运用基因工程的ＤＮＡ重组技术，将克隆后的基因编码加以改造，或者人工组装成新的基因，再将上述基因通过载体引入挑选的宿主系统内进行表达，从而产生符合人类设计需要的“突变型”蛋白质分子。这种蛋白质分子只有表达了人类需要的性状，才算是实现了蛋白质工程的目标。 1.3蛋白质工程的原理由于基因工程的发展，人们已经可以运用基因重组等理论和方法去设计并制造出预想的各种性能的蛋白质。这种改变蛋白质的操作可以在蛋白质水平上，也可以在基因水平上。如基因水平的改变，是在功能基因开发的基础上，对编码蛋白质的基因进行改造，小到可改变一个核苷酸，大到可以加入或消除某一结构的编码序列。蛋白质水平的改变则主要是对制造出的蛋白质进行加工、修饰，如磷酸化、糖基化等。蛋白质的化学修饰条件剧烈，无专一性，而基因操作则比较方便，在实施基因操作时，必须预先知道是哪个氨基酸或哪几个氨基酸影响着蛋白质的性状。就现代生物技术发展水平看，大量新蛋白质通过检测，来确定改变的蛋白质是否具有预期的性状，技术上已是可行的。 1.4蛋白质工程的基本途径目前，在蛋白质工程中最常采用的技术是定点诱变技术，即在特定的位点改变基因上核苷酸的种类，从而达到改变蛋白质性状的目的。蛋白质工程发展至当代，利用专一改
《蛋白质工程》 （课程论文）题目名称：蛋白质组学技术的研究进展及应用 所在学院：生命科学与技术学院 专业（班级）：生技131班 学生姓名：梁健 授课教师：韩晓菲
蛋白质组学技术的研究进展及应用 生技131班梁健13772025 摘要：随着人类基因组计划全部测序的初步完成，研究重点转到对基因功能的研究上。蛋白质作为基因功能的主要体现者，对其表达模式和功能的研究成为热点，出现了蛋白质组学。研究蛋白质组学有助于了解蛋白的结构、细胞的功能、生命的本质及活动规律，为疾病的诊断、治疗、疫苗及新药开发提供科学依据。关键词：蛋白质组学；进展；应用 蛋白质组学(proteomics)是产生于20世纪90年代中期的一门新兴学科，以 细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象，是后基因组时代生命科学研究的核心内容。蛋白质组学的产生与发展经历了一个漫长的过程，在这个过程中，研究者不断修正蛋白质组学的发展方向和推进蛋白质组学相关支撑技术的快速 发展，进而拓展蛋白质组学在整个生命科学和生物医学研究中的应用，成为后基因组时代重要的研究新领域，并成功地应用到基础研究及医学研究等各个领域，推进其迅速发展。 1 蛋白质组学的概念及研究内容 1.1蛋白质组学的概念 蛋白质组(proteome)源于protein和genome两词的杂合，最早是由澳大利亚 的WILKINS等于1995年提出，其定义为“一种基因组所表达的全部蛋白质”。早期相对狭义的蛋白质组的概念是指在某一特定的时间和空间条件下，1个细胞的基因组所表达的蛋白质数目的总和。随着研究的深入，人们提出了广义的蛋白质组的概念，用来描述1个细胞、组织、器官或1个物种的生命个体，在其不同的生存及发育条件下所表达的各种蛋白数目的总和。所以蛋白质组所含的蛋白数目及其表达量是随着时间和空间的不同而不断发生变化的。蛋白质组学最有价值的优势是它可以观察在特定的时间下一个完整的蛋白质组或蛋白亚型在某种生理 或病理状态中，发生的相应的变化。 1.2 研究内容 根据研究内容的不同，蛋白质组学可分为差异蛋白质组学(或称表达蛋白质 组学)、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学，其中差异蛋白质组学在蛋白质组学 研究中十分常用且应用广泛。差异蛋白质组学主要是研究比较在2种或多种不同条件下蛋白质组表达的差异变化。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析。蛋白质表达模式的研究是蛋白质组学研究的基础内容，主要研究特定条件下某一细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能和蛋白
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002) 作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
蛋白质组学的研究进展及应用 21世纪是生命科学的时代随着人类基因组序列的完成和生命科学进入后基因组时代，研究这些基因的表达和调控已成为首要任务。因此，蛋白质组学研究已成为21世纪生命科学的战略任务蛋白质组学是所有或部分蛋白质在生命活动过程中的功能和作用。可以说，这是现代生物学研究的一个必不可少的手段。本文分析了蛋白质组学的内涵和研究进展，并介绍了蛋白质组学的应用领域，以帮助人们更好地理解蛋白质组学的意义，促进蛋白质组学的更好发展。 关键词蛋白质组学；研究；应用文件识别码A，文件识别码R341于 ，文号XXXX，是一门以生物体的全部或部分蛋白质为研究对象，研究生物体、细胞(组织)或基因组的蛋白质变化规律的学科。蛋白质组学可以在整体水平上研究蛋白质表达和调控的水平和调控，旨在了解蛋白质与 相互作用的关系，为生命活动规律提供理论和物质基础，也为人类健康带来理论基础和解决方案 随着人类基因组序列的完成，生命科学研究的重点已经转移到基因表达产物即蛋白质的研究上。蛋白质组学已成为21世纪生命科学研究的战略任务和重点1.2蛋白质组学 的研究内容传统的蛋白质研究侧重于单个蛋白质的研究，而蛋白质组学则侧重于生物体全部或部分蛋白质的研究随着学科的逐步发展，蛋白质组学的研究内容也在不断更新和完善。蛋白质研究中的翻
译后修饰已经成为蛋白质组学研究的重要组成部分，因为翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要途径在不同的发育阶段、生长阶段和不同的病理条件下，不同细胞类型的基因表达是不同的，因此有必要对细胞甚至亚细胞进行准确的蛋白质组学研究。最后，双向电泳被用来分离蛋白质。根据等电点和分子量的不同，用双向电泳分离不同种类的蛋白质。通过技术分离和处理的蛋白质可以在质谱系统中分析，以获得蛋白质的定性数据。1.3蛋白质组学的进展 蛋白质组学的主要任务是建立基于获取和分析蛋白质状态和规律的技术为了满足这些要求，需要高吞吐量技术。在研究技术方面，目前我国已经出现了高灵敏度、高效率的蛋白质分离和鉴定方法，如二维色谱-串联质谱 谱(2D-高效液相色谱/质谱-质谱)、电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF/质谱)等。，获得了国际认可，具有一定的优势。其中，飞行时间电离质谱(MALDI-TOF/MS)是近年来广泛应用的软电离质谱，具有高准确度、高分辨率和低成本的特点。因此，蛋白质组学的发展离不开研究技术和方法的不断改进。 目前，中国已先后建立了一批蛋白质组学研究中心或实验室，如复旦大学蛋白质组学研究中心和中国科学院蛋白质组学重点实验室，为中国蛋白质组学研究提供了更加专业、便捷的技术服务平台。1.4蛋白质组学研究的意义 蛋白是生理功能的执行者和生命现象的直接体现。对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生理或病理条件下生命的变化机制。蛋白质