河南科技大学本科生毕业论文
芍药Actin基因原核表达载体的构建
摘要
肌动蛋白是细胞骨架的重要成分，在细胞中的表达量大且恒定。大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，大肠杆菌表达外源基因是最常用的一种异源表达系统。本研究应用限制性内切酶Bam H I和Hin d III对pMD18-T-Actin重组质粒和空载体pET-32a进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后用凝胶回收试剂盒纯化目的基因Actin和空载体pET-32a，然后将二者用连接试剂盒连接并转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布在含有Amp 的LB平板上进行过夜培养。挑取生长良好的单菌落，接种于含有Amp的LB培养基中用于菌落PCR鉴定。经菌落PCR初步检测后，挑取阳性单菌落过夜培养后提取质粒，质粒PCR进一步检测后，最后再进一步用Bam H I和Hin d III酶切重组质粒，结果表明酶切产生的两条DNA条带与载体条带和目的条带的大小一致，进一步说明原核表达载体构建成功。由此表明我们成功构建了芍药Actin基因的原核表达载体，为下一步应用大肠杆菌原核表达系统诱导表达芍药肌动蛋白奠定了基础。
关键词：芍药，Actin，原核表达载体
芍药Actin基因原核表达载体的构建
Construction of Prokaryotic Expression Vector of Peony Actin Gene
ABSTRACT
Actin is an important component of cytoskeleton, expressed largely and constantly in the cell. The cultivation of E. coli is simple, the growth and reproduction is fast, and cost is low, exogenous genes expressed in E.coli is the most commonly used one of heterologous expression systems. For the material of pMD18-T-Actin recombinant plasmid and empty carrier pET-32a, firstly, using Bam H I and Hin d III to have a double enzyme digestion, secondly after agarose gel electrophoresis using gel recycling kit to purificate actin gene and empty carrier pET-32a, connecting and transforming competent E. coli DH5 alpha, besmearing on LB tablet containing Amp, and conducting the overnight culture.Picking single colony which is growing well, vaccinating in LB culture medium containing Amp for colony PCR. After preliminary inspection by colony PCR, extracting plasmid from positive single colony after the overnight train, and conducting PCR detection of plasmid. Eventually use Bam H I and Hin d III enzyme to construct recombinant plasmid. According to the experimental results, two DNA bands which is produced by enzyme digestion and the carrier belt and purpose belts is of the same size, further clarificating that the construction of Prokaryotic expression vector is successful. Thus indicated that we successfully build the prokaryotic expression vector of herbaceous peony Actin gene, laid the foundation for further application of E. coli prokaryotic expression system inducing expression of paeonia lactiflora Actin.
KEY WORDS：Peony, Actin, prokaryotic expression vector
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目录
摘要......................................................................................................................................... I ABSTRACT .............................................................................................................................. II 目录...................................................................................................................................... III 符号说明................................................................................................................................... V 第一章文献综述.. (1)
1.1 芍药概述 (1)
1.2 肌动蛋白的研究 (1)
1.3 原核表达载体 (3)
1.4 大肠杆菌原核表达系统 (4)
1.5 本项研究的目的和意义 (5)
第二章实验部分 (6)
2.1 实验材料、仪器与试剂 (6)
2.1.1 菌株材料 (6)
2.1.2 主要药品与试剂 (6)
2.1.3 主要仪器 (6)
2.1.4 主要溶液及配制 (6)
2.2 实验方法 (7)
2.2.1 对重组质粒和表达载体的双酶切 (7)
2.2.2 回收重组质粒和表达载体的酶切产物 (7)
2.2.3 目的片段的连接 (7)
2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 (7)
2.2.5 热激法转化大肠杆菌 (8)
2.2.6 菌落PCR检测 (8)
2.2.7 质粒DNA的提取 (9)
2.2.8 质粒PCR检测 (10)
2.2.9 酶切鉴定 (10)
2.3 结果与分析 (11)
2.3.1对重组质粒和表达载体的双酶切 (11)
2.3.2 Actin基因和表达载体的回收纯化 (12)
2.3.3 阳性克隆鉴定 (12)
2.3.4 Actin基因的酶切验证 (13)
2.4 讨论 (14)
2.5 结论 (14)
芍药Actin基因原核表达载体的构建
参考文献 (16)
致谢 (19)
附录 (20)
英文翻译 (21)
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符号说明
缩略词中文
EDTA Amp 乙二胺四乙酸氨苄青霉素
LB Luria-Bertani培养基
PCR Tris
聚合酶链式反应三羟甲基氨基甲烷
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第一章文献综述
1.1 芍药概述
芍药（Paeonia lactiflora Pall.）为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia L.）芍药组（Sect. Paeonia）的多年生宿根草本植物，是原产我国的传统名贵花卉，也是世界著名花卉，享有“天下第一娇”的美称，是重要的观赏性植物和资源植物。另外还是常用的中草药。我国是世界上芍药属植物的自然分布中心和多样性中心，资源极其丰富。芍药在我国有3000多年的栽培历史。中国曾以芍药为荣而被世界誉为“芍药之母”[1-2]。
芍药是典型的温带植物，但其生态适应幅度大，因此分布广，枝叶苍翠欲滴，花朵娇艳美丽，在园林中被广泛应用，耐寒怕热亦耐热，冬季可耐-46．5℃的低温。芍药喜光，光照充足，才能生长繁茂，花色艳丽，但也能耐一定的树荫，在花期遮荫能避免阳关灼晒，延长花期。芍药是长日照植物，秋冬短日照季节分化花芽，春天长日照下开花，花蕾发育和开花，均需在长日照下进行，若日照时间过短（8~9 h），会导致花蕾发育迟缓，叶片生长加快，开花不良，甚至不能开花。耐干旱不需多灌溉，但若缺水财花朵瘦小，花色不艳。深根系植物，要求土壤深厚，适宜疏松且排水良好的砂质壤土，以中性或微酸性土壤为宜，土壤含氮量不宜过高以防枝叶徒长，生长期可适当增加磷、钾肥以促使枝叶茁壮生长、开花美丽[3]。
因为其花朵硕大，花色艳丽，花形美观，花香馥郁，所以芍药深受我国百姓喜爱，常被喻为人民富贵吉祥、国家繁荣昌盛的象征；不仅如此，芍药在引种到国外后，同样符合西方的审美观念，象征着正义和仁慈，代表着幸福与甜美，目前已在美国、法国、荷兰等50多个国家广为种植，成为世界性的名花[4]。
1.2 肌动蛋白的研究
肌动蛋白[5-10]是细胞中一种重要的蛋白质，是细胞骨架的成分。肌动蛋白最初是1941年在脊椎动物骨骼细胞中发现并命名的。在肌肉细胞中，肌动蛋白聚合成丝状，组成肌肉的细丝，与由肌球蛋白形成的粗丝相互滑动，产生宏观的肌肉收缩现象。1952年，Loewy从粘菌中提取到肌动球蛋白。这是从非肌细胞中分离到的第一种球蛋白。1963年，我国阎隆飞等人首次报道了高等植物中存在肌动蛋白，并对肌动蛋白的研究工作做出了重要的贡献。
生物体中包含7个肌动蛋白基因，编码不同的肌动蛋白同工蛋白质。等电聚焦电泳分析表明存在着A-、B-和C-肌动蛋白。它们含有较多的酸性氨基酸，其等电点约为5.5，A-肌动蛋白的等电点最低（p I=5.4）。等电点的不同是由于其氨基端的残基的变化所引起的[11-13]。肌动蛋白（Actin）由多个基因组成的家族所编由375~377个氨基酸残基组成，
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分子量42 KD左右的球形蛋白质，并且是由一个大的、高度保守的基因编码[14-18]。氨基酸序列分析资料表明，肌动蛋白异型包含两大类主要肌动蛋白:细胞质来源的和肌肉来源的肌动蛋白。除了线虫类精子细胞，在所有的真核细胞当中均发现有该蛋白质。肌动蛋白是真核细胞中最丰富的蛋白质。所有的器官组织均有细胞质来源肌动蛋白，通常是用于构成细胞微丝。在肌细胞中，肌动蛋白占总蛋白的10%，即使在非肌细胞中，肌动蛋白也占细胞总蛋白的1%~5%。在肌原纤维中肌球蛋白居第一位，而肌动蛋白约占总蛋白的1/4（20%-25%），居第二位。肌动蛋白肌纤维组成直径约36-37 nm的双螺旋。肌肉中的肌动蛋白形式主要是纤维形式即F-肌动蛋白，这是G-肌动蛋白的多聚形式。肌动蛋白上有三个结合位点，一个是ATP结合位点，另两个都是与肌动蛋白结合的结合蛋白结合位点[19-20]。
肌动蛋白，是微丝的结构蛋白，以两种形式存在，即单体和多聚体。单体的肌动蛋白是由一条多肽链构成的球形分子，又称G-肌动蛋白（globular actin，G-actin），外形类似花生果。肌动蛋白一般以其多聚化的形式发挥功能。在多聚化过程中，结合的ATP 分子水解为ADP[21-23]。
肌动蛋白至少表达成6种异构形式，分为α、β、γ三种类型根据等电点的不同可将高等动物细胞内的肌动蛋白分为3类，α分布于各种肌肉细胞中，β和γ分布于肌细胞和非肌细胞中。有三种α肌动蛋白（骨骼肌、心肌和平滑肌）、一种β肌动蛋白和两种γ肌动蛋白（γ平滑肌和γ非平滑肌）。肌动蛋白在镁、钾离子和ATP作用下，可以形成具有极性的双螺旋丝状聚合体，肌动蛋白以聚合状形式完成生理功能。在生物分子演化当中，肌动蛋白是被高度保留下来的蛋白质分子之一，从藻类细胞到人体细胞肌动蛋白只有不到20%的变化。肌动蛋白是一种高度保守的蛋白质，是生物体中微丝的一个单节结构，而微丝则是细胞骨架三大组成结构之一，肌动蛋白还构成了肌细胞中具有收缩功能的组织[24-26]。简单的真核生物，如酵母或粘菌，通常含单个肌动蛋白基因，仅合成一种肌动蛋白，大多数真核生物细胞含有多个肌动蛋白基因，其表达产物组成肌动蛋白异构体。肌动蛋白主要存在于细胞质中，是细胞骨架微丝的主要成分，对于多种细胞功能都是必需的，在细胞中肌动蛋白结合蛋白调控下，肌动蛋白微丝的长度、极性、稳定性和三维结构处于动态变化之中，并将肌动蛋白纤维与细胞浆和细胞膜的其它成分相连接，从而调节肌动蛋白的理化状态，藉以完成多种细胞功能，参与细胞分裂、细胞运动、细胞迁移、细胞形态维持、细胞生长、内吞和外排作用以及其他重要生理事件[27-30]。
高等植物肌动蛋白与动物及真菌肌动蛋白基因一样，属于多基因家族基因，由多基因编码[31]。不同生物肌动蛋白具有高度保守性，这些基因高度相似，通过多轮复制由一个基因祖先进化而来[32]。细胞质来源肌动蛋白，构成细胞微丝，肌肉中的肌动蛋白主要是纤维形式即F－肌动蛋白。肌动蛋白基因编码序列是高度保守的，而非编码序列有较大的差异，反映其进化上的时间进程。高等植物肌动蛋白在进化过程中保持高度的保守性和同源性，且具有组织和器官特异性的表达。人们已经克隆出花粉发育后期表达基因且在转基因植物中得到表达。将营养细胞特异的番茄花药发育后期表达基因lat52导入
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烟草，可与报告基因融合，获得转基因烟草。Mascarenhas（1989）使用Northern杂交技术研究玉米和紫鸭跖草花粉肌动蛋白基因的表达，发现肌动蛋白基因的表达受发育的控制。在四分体和小孢子时期，肌动蛋白基因不转录，直到花粉形成的早期才开始表达，并且mRNA不断地积累，当花粉形成时，肌动蛋白的表达最旺盛。拟南芥（Arabidopsis thaliana）的肌动蛋白基因分两类——营养体基因和生殖细胞基因，在发育后期由营养体基因的表达转为花粉特异肌动蛋白基因的表达，从而满足受精的需要。以肌动蛋白基因为目标的雄性不育基因已构建并且在转基因小麦和番茄上得到正确表达，这不仅为雄性不育基因工程开辟了一条新途径，而且为这两种重要经济作物的杂种优势打开了方便之门，还为包括单子叶作物和双子叶作物在内的所有自花授粉作物的杂种优势利用提供了理论和实践的重要参考。随着越来越多的肌动蛋白基因的克隆和序列测定，对基因本身结构、功能和表达的分析越来越精确，从而促进了肌动蛋白基因在作物改良上的应用研究。
动物的β肌动蛋白基因一般位于染色体2q。应用原位DNA/染色体杂交技术定位了鸡的β一肌动蛋白和GH基因。大量的基因序列资料表明，肌动蛋白有一些引人注目的特征，其编码序列是高度保守的，而非编码序列有较大的差异，反映其进化上的时间进程。对30多种不同异型肌动蛋白的原始氨基酸序列（最长的375个氨基酸）分析表明，最多只有32个残基可以被取代。不同动物的肌肉特异性和非肌肉特异性的异型肌动蛋白编码基因之间具有保守程度的不同；虽然有6个或更多个基因编码肌动蛋白，但该蛋白质具有高度保守的氨基酸序列。
拟南芥中共有10个肌动蛋白基因家族，产生肌动蛋白基因家族的原因还不十分清楚，或许是小基因片段的复制，或许是基因组的大量重排，它们分散于4条染色体上（1，2，3，5）。通过对肌动蛋白基因家族的系统分析，将其分为营养型肌动蛋白（vegetative actin）和生殖型肌动蛋白（reproductive actin），其表达具有组织特异性，并且在大多数组织和器官中往往有2种以上的肌动蛋白异型体同时大量表达[33]。
细胞骨架参与植物体内许多动态的生理过程，由肌球蛋白（myosin）以及动蛋白（kinesin）基因家族所构成的分子马达在将化学能转变为机械能的过程中发挥着重要作用[34]。细胞对信号刺激产生反应的过程，直接与微丝骨架密切相关，很多重要的生理过程依赖于单体肌动蛋白的聚合、聚合微丝网络的形成与定位、微丝的解聚以及单体肌动蛋白库的维持[35]。
1.3 原核表达载体
使已经被克隆的外源基因在细胞中实现表达无论对理论研究还是实践应用都具有
十分重要的意义[36]。克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，克隆目的基因表达出的编码蛋白可供结构与功能研究之用。有些具有特定生物活性的蛋白质在医学上和在工业上都是很有应用价值的，可以克隆其基因使之在宿主细胞中大量表达而获得。要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将它放入带有基
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因表达所需要的各种调控元件的载体中，这种载体就称为表达载体。
表达载体的结构比克隆载体复杂，除了必须具备与克隆载体相同的复制原点、多克隆位点和筛选标记基因以外，还必须具备控制目的基因表达的调控序列，包括启动子、转录终止子等。此外，克隆到表达载体上的目的基因也必须具有完整的起始密码子、终止密码子和核糖体结合位点，才能产生完整的目的蛋白。表达载体分为四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。构建有效的表达载体[37-39]将是表达目的基因之前提条件，同时也是影响表达水平及蛋白活性重要因素。
本实验选用的表达载体是pET-32a空载体。pET系列载体是带有T7噬菌体启动子的载体，包括如pET5、pET15、pET16、pET28、pET30、pET32、pET42等，每套均由a、b、c 3个载体组成，以方便目的基因以与His6序列同框的方式插入。pET系列载体的优点是：一是大肠杆菌通常在进行原核表达实验时，选择使用PET系列载体居多。PET系列载体不带有GFP基因，其上的His Tag标签是专门用于分离纯化的。二是PET 系列的表达水平高，因为PET是使用T7启动子，是目前原核启动子中表达水平最高的启动子。三是PET系统成功的主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌RNA聚合酶识别的T7启动子之下，因此在加入T7 RNA聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到PET 载体上的基因实际上是关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由Lac UV5控制的T7RNA聚合酶的表达宿主中，并加入IPTG诱导表达。T7噬菌体启动子，具有高度的特异性，只有T7RNA聚合酶才能使其启动，故可以使克隆在载体上的基因独立于宿主细菌基因组之外得到表达。T7RNA聚合酶的效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。T7噬菌体RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素有抗性。使用大肠杆菌启动子系统（如tac，lac，trc，pL）有困难的许多基因已经在PET系统中稳定克隆和表达。T7RNA聚合酶的选择性和活性使得几乎所有的细胞资源都为目标基因表达。诱导后及小时目标产物就可超过细胞总蛋白的50%。
1.4 大肠杆菌原核表达系统
外源基因表达的宿主细胞可用大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、培养的哺乳类动物细胞、以至整体动物。经过长期的研究，人们对大肠杆菌的特性和遗传背景了解得最清楚。大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌作为外源基因的表达工具已有二十多年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质原核表达系统。大肠杆菌作为外源基因表达系统的优点是：遗
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传背景清晰，相关的基因克隆操作比较成熟；所需营养简单、操作方便、遗传稳定、生长速度较快，外源蛋白的表达丰度较高（可达蛋白总量的30%），可在短期内获得大量的目的蛋白；可将目标蛋白与标签序列融合表达以增强目标蛋白的可溶性并能简化后续的纯化过程；全基因组测序完成，共有4405个开放型阅读框架；被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。但是由于中缺少真核生物的翻译后修饰系统，所得蛋白产物往往以无活性包涵体的形式表达。由无活性的包涵体恢复生物活性要经过复杂的变性和复性处理。另外，细菌表达系统与目标基因的所使用的密码子的偏爱性往往存在差异，为使目标蛋白得到有效的表达，常需对外源基因的原始遗传序列进行修饰。
外源基因表达的产物可能会对大肠杆菌有毒害作用，会影响细菌的生存繁殖，所以大多数表达载体都带有诱导性表达所需要的元件，即有操纵子序列以及与之配套的调控基因等。外源基因还应当插入到适合于表达的位置，所以表达载体中要设有适合的多克隆位点。此外还应具备基因克隆筛选的条件，包括在细胞中复制必需的复制起始序列、筛选标志如抗药性基因等[36]。
1.5 本项研究的目的和意义
肌动蛋白（Actin）是真核生物细胞中普遍存在的一种重要的蛋白质，构成细胞骨架中的微丝（microfilament）系统，参与参与细胞分裂、细胞运动、细胞迁移、细胞形态维持、细胞生长、内吞和外排作用以及其他重要生理事件。
Higheower等[40]研究表明，植物和动物肌动蛋白之间存在11%~15%的差异，水稻与玉米肌动蛋白之间的氨基酸存在8%~10%的氨基酸取代，大豆异形体之间仅存在
6%~9%的氨基酸取代，由此可见，肌动蛋白基因是相当保守的。内参基因是在研究其他基因表达模式的时候作为参照的一个基因，在植物中常用16S RNA、组蛋白H3、GAPDH 基因以及肌动蛋白基因等。在动物中，肌动蛋白基因主要由细胞质来源与肌肉来源两大类组成[41]。高等植物的Actin基因是一种高度保守的看家基因，克隆Actin基因可以做为内参研究芍药代谢相关其他基因。
本研究构建Actin原核表达载体，为金属亲和纯化Actin重组蛋白，制备多克隆抗体，建立芍药Western杂交体系奠定基础。
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第二章实验部分
2.1 实验材料、仪器与试剂
2.1.1 菌株材料
大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli) DH5α，pET-32a空载体，pMD18-T-Actin重组质粒。
2.1.2 主要药品与试剂
限制性内切酶Hin d III和Bam H I(宝生物工程（大连）有限公司)；
DL 2000 DNA Marker（宝生物工程（大连）有限公司）；
质粒提取试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）；
DNA凝胶回收试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）；
Taq DNA聚合酶(宝生物工程（大连）有限公司)；
引物：Actin-F：5'- ATGGCCGATGCTGAGGAT-3'
Actin-R：5'- TTAAAAGCACTTCCTGTG-3'
其他试剂均为国产分析纯。
2.1.3 主要仪器
高速冷冻离心机，台式离心机，超低温冰箱，低温冰箱，恒温水浴锅，气浴恒温振荡器，烘箱，涡旋振荡器，微量移液器，PCR仪，电泳仪，电泳槽，紫外分析仪，紫外分光光度计，超净工作台，灭菌锅，液氮罐，凝胶成像分析系统。
2.1.4 主要溶液及配制
1、LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone) 10g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，加水至总体积1 L，高压下蒸气灭菌15 min。
2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12 g琼脂粉，高压灭菌
3﹑感受态细胞制备所需试剂：
高压灭菌的0.1 mol/L CaCl2：先配制1 mol/L的母液，即147 g CaCl2·2H2O，加水到1 L，使用时稀释；高压灭菌过的30％甘油。
4﹑质粒DNA抽提所需试剂：
溶液I (pH8.0)：50 mmol/L葡萄糖；25 mmol/L Tris-HCl；10 mmol/L EDTA；
溶液II：0.2 mol/L NaOH和1%SDS (现用现配)；
溶液III (pH4.8)：5 mol/L乙酸钾60 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL，混匀。
5﹑氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)：无菌水配置成100 mg/mL溶液，用滤膜抽滤，-20℃保存。
6﹑琼脂糖凝胶电泳所需试剂：
5×TBE缓冲液：54g Tris，27.5g硼酸，20mL 0.5mol/L EDTA，ddH2O补充至1L。
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7﹑SDS-PAGE电泳所需试剂：
（1）分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris-HCl （pH8.9）；
（2）浓缩胶缓冲液：0.5 mol/L Tris-HCl （pH6.8）；
（3）10% （W/V）过硫酸铵；
（4）1×TE：10 mmol/L Tris-HCI （pH8.0），1 mmol/L EDTA （pH8.0），灭菌。
（5）10% SDS 溶液：10g SDS，定容至100 mL，室温保存。
（6）染色液：0.2g考马斯亮蓝R-250+42 mL乙醇+10 mL冰乙酸，定容至100 mL。
（7）脱色液：5 mL冰乙酸+45 mL乙醇+50 mL水。
（8）30%胶贮液：每100 mL中含有丙烯酰胺29.2 g，亚甲基双丙烯酰胺0.8 g，过滤备用。
（9）200 mg/mL IPTG：取2 g IPTG溶于8 mL的无菌水中，再加水补至10 mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1 mL，-20℃贮存。
（10）2×上样缓冲液：0.5 g SDS，1mL 2-β-巯基乙醇，4 mg溴酚蓝，1 mol/L Tris-HCl （pH6.8） 2 mL，用蒸馏水溶解并定容至10 mL。
（11）10×SDS电泳缓冲液：3 g Tris，14.4 g Gly，0.5 g SDS，加水定容至500 mL，调pH至8.3。
8、引物设计
应用Primer Premier 5.0软件设计引物如下，引物序列由华大基因公司合成。
Actin-F：5'- ATGGCCGATGCTGAGGAT-3'
Actin-R：5'- TTAAAAGCACTTCCTGTG-3'
2.2 实验方法
2.2.1 对重组质粒和表达载体的双酶切
pET-32a空载体及pMD18-T-Actin的Bam H I和Hin d III双酶切体系为60 μL，其中10×Buffer 6 μL ，Bam H I 9 μL，Hin d III 9 μL ，质粒36 μL。于37℃培养箱内酶切8 h。
2.2.2 回收重组质粒和表达载体的酶切产物
用1%琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳，用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.3.0.纯化空载体及目标片段
2.2.3 目的片段的连接
空载体与Actin基因的连接体系为15 μL，其中包括空载体1.5 μL，目的基因6 μL，Solution I 7.5 μL，在16℃恒温水浴中连接1 h。
2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
A．用接种环直接取-80℃超低温冰柜冻存的大肠杆菌DH5а细胞，在LB培养基（含Amp）表面划线，于37℃培养16 h；
B．挑取一个单菌落，转到3~5 mLLB液体培养基里，于37℃培养过夜；
C．将该菌种悬液以1:100的比例接种培养100 mL（含Amp）培养基里，37℃振
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荡培养2～3 h，直到A600 = 0.3~0.4。
D．将培养大肠杆菌的三角瓶置于冰浴中，预冷10 min；
E．在超净工作台里，将大肠杆菌菌液转入10ML离心管中，在冰上放置10 min；
F. 4℃，4000 r/min 条件下，离心10 min，轻轻倒掉上清液，回收细胞，放在冰上拿回超净工作台；
G．然后用4 ml 预冷的0.1 M CaCl2悬浮沉淀，冰上预冷30 min；
H. 4℃，4000 r/min离心10 min，弃上清液；
I．在超净工作台中，在离心管中加入0.8ml预冷的0.1 M CaCl2，悬浮沉淀加入0.2 mL75%的甘油（甘油终浓度为15%），混匀，每管分装0.2 mL，于-80℃保存。
2.2.5 热激法转化大肠杆菌
1﹑固体LB培养基的制备：提前制备好含100 μg/mL Amp的LB固体培养基。
2﹑将10 μL连接液加入100 μL解冻后的感受态细胞中。
3﹑轻轻混匀，冰浴30 min，42℃水浴中热激90 s，然后迅速冰上放置3~4 min。
4﹑立即向上述管中加入0.8 mL LB液体培养基，混匀后于37℃振荡培养1.5-2 h，使含有重组子的大肠杆菌产生氨苄抗性(Amp r)。
5、将上述菌液转至1.5 mL干净的离心管中，4000 rpm离心5min，先吸取600 μL 上清，再将细胞吹散成细胞悬液。
6﹑在超净工作台中将上述悬液直接涂布在含有氨苄的LB固体培养基上，做好相应标记，如基因名称和日期等。
7﹑待培养基表面菌液完全被培养基吸收后，将培养皿倒置于37℃培养箱中过夜培养。
8﹑观察单菌落的生长情况，待菌落生长至适当大小时挑取单菌落进行阳性克隆的检测。
2.2.6 菌落PCR检测
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表2-1 菌落PCR扩增体系
组分处理/μL
10×Buffer 2.0
dNTP 2.5 mmol/L 1.6
Mg2+ 25 mmol/L 1.6
Taq 酶0.4
引物-F 10 pmol/μL 0.6
引物-R 10 pmol/μL 0.6
菌落（水代替） 1
ddH2O 12.2
总体积20
PCR扩增程序为95℃预变性5 min，然后95℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸1 min 10 s，共35个循环，然后72℃延伸7 min，最后10℃冷却59 min。用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。
2.2.7 质粒DNA的提取
挑取菌落PCR结果为阳性的单菌落于37℃摇床过夜摇菌，用Takara公司的质粒提取试剂盒提取质粒。具体方法如下：
（1）从平板上挑取菌落，接种到1~4 ml的含Amp的LB培养基中，37℃过夜培养。
（2）取2 ml过夜培养菌液，12000 rmp 2 min.
（3）重复上述步骤
（4）加入250微升的Sollution l，震荡器振荡使菌体充分悬浮。
（5）250微升的Sollution ll,上下翻转，使菌体充分裂解。
（6）350微升的Sollution lll，室温静置2 min
（7）12000 rmp 10 min，取上清。
（8）500微升的Buffer BL 于Spin Column 中，12000 rpm 1 min，弃上清。
（9）将步骤7中的上清转到Spin Column 中，12000 rpm 1 min，弃上清。
（10）500微升Buffer WA于Spin Column 中，12000 rpm 1 min，弃上清。
（11）700微升Buffer WB于Spin Column 中，12000 rpm 1 min，弃上清。
（12）重复步骤11。
（13）空离一次
（14）加入30微升灭菌蒸馏水，静置1 min
（15）12000 rpm 1 min，洗脱DNA。
芍药Actin基因原核表达载体的构建
2.2.8 质粒PCR检测
表2-2 质粒PCR扩增体系
组分处理/μL
10×Buffer 2.0
dNTP 2.5 mmol/L 1.6
Mg2+ 25 mmol/L 1.6
Taq 酶0.4
引物-F 10 pmol/μL 0.6
引物-R 10 pmol/μL 0.6
质粒DNA（水代替） 1
ddH2O 12.2
总体积20
PCR扩增程序为95℃预变性5 min，然后95℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸1 min 10 s，共35个循环，然后72℃延伸7 min，最后10℃冷却59 min。用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。
2.2.9 酶切鉴定
所使用的pET-32a载体在插入位点两侧分别有1个Bam H I和Hin d III的酶切位点，目的片段经PCR后在其两端引入这两个酶切位点，即双酶切后两者具有相同的黏性末端，可进行重组，重组的质粒经Bam H I和Hin d III双酶切后经琼脂糖凝胶电泳后会出现两条带，即载体和目的片段条带。
1﹑如下表所示配好酶切体系(20μL)；
2﹑混匀后，37℃恒温反应3 h；
3﹑加入1.5μL 6×loading buffer混匀，以0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测结果。
表2-3 酶切体系
组分体积(μL)
10×Buffer 2
重组质粒 2
Bam H I 1
Hin d III 1
ddH2O 14
河南科技大学本科生毕业论文
2.3 结果与分析
2.3.1对重组质粒和表达载体的双酶切
pMD18-T-Actin 重组质粒的酶切产物电泳结果如图2-1，从图中可以看出，重组质粒被切成两个片段，一个是目的基因Actin ，一个是比目的基因大一些的质粒。
图2-1 重组质粒酶切产物电泳图
空载体pET-32a 的酶切产物电泳图如2-2
图2-2 pET-32a 空载体酶切电泳图
芍药Actin 基因原核表达载体的构建
2.3.2 Actin 基因和表达载体的回收纯化
图2-3为纯化后的Actin 基因琼脂糖凝胶电泳图，从图中可以看到，条带清晰，说明Actin 基因纯度较高。
图2-3 Actin 基因的纯化电泳图
图
2-4为pET-32a 载体酶切纯化后的琼脂糖凝胶电泳图，从图中可以看到，条带清晰，纯度较高。
图2-4 pET-32a 纯化电泳图
2.3.3 阳性克隆鉴定
图2-5为芍药Actin 基因的菌落PCR 扩增。从图中看出，大部分都是阳性菌，可以
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提取质粒进行进一步的阳性鉴定。
图
2-5 芍药Actin 基因菌落PCR 的琼脂糖凝胶电泳图
质粒PCR 的琼脂糖凝胶电泳结果如图2-6，条带清晰明亮，说明所选的19、20号菌的质粒都是阳性的，可以进行下一步的双酶切鉴定。
图2-6 芍药Actin 基因的质粒PCR 的琼脂糖凝胶电泳图
2.3.4 Actin 基因的酶切验证
重组的质粒经Bam H I 和Hin d III 双酶切后经琼脂糖凝胶电泳后出现两条带，即载体和目的片段条带，进一步说明原核表达载体构建成功。
芍药Actin 基因原核表达载体的构建
图2-7 芍药Actin 基因的质粒的双酶切的琼脂糖凝胶电泳图
2.4 讨论
本实验在进行的过程中，经历了多次的失败与尝试，主要出现的问题有以下几方面：
（1） 配制试剂的过程中，刚开始进行实验的时候，由于计划不完备，造成实验药品配制过量，造成了药品的浪费，尤其是那些不宜放置的溶液或试剂，如感受态制备过程中所需要的CaCl 2 溶液。因为感受态细胞的制备对CaCl 2 的要求很高，所以尽可能做到CaCl 2 溶液是无菌预冷的新溶液。
（2） 感受态细胞的质量是做转化实验的关键。在本实验中制作感受态细胞和转化尝试了好多次，浪费了大量时间，在尝试了多次之后总结出做感受态细胞时要保证菌种充分活化，严格控制其OD 600值，使细胞处于对数生长期，因为制作感受态细胞的时候外界温度较高，因此要尽可能使称放菌体的离心管处于低温状态下。
2.5 结论
本试验是基于已经构建好的芍药Actin 基因的重组质粒pMD18-T-Actin ，经过重组质粒及空载体pET-32a 的双酶切，采用凝胶回收试剂盒回收纯化Actin 基因及空载体，然后连接并转化感受态大肠杆菌DH5α，涂在含有Amp 的LB 平板上。挑取生长良好的单菌落，接种于含有Amp 的LB 培养基中，经过菌落PCR
初步检测，再提取质粒，质粒
“基因表达载体的构建”教学设计
专题1 1.2基因工程的基本操作程序之基因表达载体的构建 一、目的基因和运载体的连接 二、利用标记基因筛选含目的基因的受体细胞 三、目的基因和启动子的相对位置关系 附件1： 附件2：
【教学反思】 基因表达载体的构建是基因工程的关键步骤，空间想象难度大，科学理论和技术实践密切联系，思维跨度也大。福州屏东中学学生程度一般，正因如此，处理不好会提高学习难度，令学生视高科技为畏途，导致教学流于形式。本节课用微课和模型成功地化解了难点。 一方面基于学生课前微课的“先学”，学生对表达载体的构建有个整体的认识，然后以此为支架在课堂上填充和拓展内容，当学生在课堂上遇到相关问题时，能尽快到达“最近发展区”，获得进一步的发展，使学生逐渐对细节有更丰富更具体的理解，这种先整体后局部的处理符合学生的认知规律。基于微课的先学后教模式实质上是利用微课为学生创设一个情境，使学生带着思考和疑惑走进课堂，节省课堂的热身时间，从而使高效率大容量的课堂教学目标得以实现。 另一方面高二学生具有抽象思维，但是仍然需要感性知识，形象知识作为支持，所以教师精心设计纸质模型，基于教材原有的学习完“DNA重组的基本工具”后的纸圈模拟活动，再设计了双酶切的活动，化微观为直观，一系列问题的发生都源自学生自己亲手构建的模型，从模型中发现问题，进而逐步由浅入深。学生像科学家一样思考问题、解决问题，获得成功的体验。由于是带着问题的探究模拟活动，使学生的课堂参与是形式之上思维的积极参与。学生获得的体验是：基因工程这么高深的原理原来我也能想得到。学生的纸质模型立体、科学、易操作，但不好展示，而教师利用不同颜色的磁贴，随着课程的逐步推进，简洁明了地逐步在黑板上呈现，让整个环节衔接自然，师生互动流畅。直观的教学手段——模型构建，减轻了学生掌握这些知识的阻力，激发了学习积极性，使学生在轻松愉快的氛围中突破了重难点，强化了学生交流合作意识。 总之，作为教师，应该想学生之所难，积极探索有效途径，一堂成功的课不是展示教师的才智、形象、语言，更要通过学生的成功来反映。
如何阅读基因载体图谱 基因载体是基因工程的核心，也是基因治疗中强有力的生物工具，我们先来认识和阅读载体图谱吧。 一、载体分类及载体组成元件 载体分类 1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体 病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。可发生于完整活体或是细胞培养中。可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。用于基因治疗和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件： （1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒； （2）介导外源基因的转移和表达； （3）对人体不致病； （4）在环境中不会引起增殖和传播。 非病毒载体一般是指质粒DNA。 2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。 3、按功能分类：克隆载体、表达载体 克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。 表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）有关的元件即成为表达载体。 载体组成元件 1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ （1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
（2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮霉素β失活。 3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。还要再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 4、P/E：启动子/增强子 5、Terms：终止信号 6、加poly（A）信号：可以起到稳定mRNA作用 示例阅读载体： pENTER载体 1）human ORF + pENTER载体 2） CMV启动子，T7启动子 3） ORF的C端融合了Flag和His tag 4) 多克隆位点，常用AsisI 和 MluI(人源基因上不常见的)
真核生物基因表达的调控远比原核生物复杂，可以发生在DNA水平、转录水平、转录后的修饰、翻译水平和翻译后的修饰等多种不同层次（图真核生物基因表达中可能的调控环节）。但是，最经济、最主要的调控环节仍然是在转录水平上。（一）DNA水平的调控 DNA水平上的调控是通过改变基因组中有关基因的数量、结构顺序和活性而控制基因的表达。这一类的调控机制包括基因的扩增、重排或化学修饰。其中有些改变是可逆的。 1、基因剂量与基因扩增 细胞中有些基因产物的需要量比另一些大得多，细胞保持这种特定比例的方式之一是基因组中不同基因的剂量不同。例如，有A、B两个基因，假如他们的转录、翻译效率相同，若A基因拷贝数比B基因多20 倍，则A基因产物也多20倍。组蛋白基因是基因剂量效应的一个典型实例。为了合成大量组蛋白用于形成染色质，多数物种的基因组含有数百个组蛋白基因拷贝。 基因剂量也可经基因扩增临时增加。两栖动物如蟾蜍的卵母细胞很大，是正常体细胞的一百倍，需要合成大量核糖体。核糖体含有rRNA分子，基因组中的rRNA基因数目远远不能满足卵母细胞合成核糖体的需要。所以在卵母细胞发育过程中，rRNA基因数目临时增加了4000倍。卵母细胞的前体同其他体细胞一样，含有约500个rRNA基因（rDNA）。在基因扩增后，rRNA基因拷贝数高达2×106。这个数目可使得卵母细胞形成1012个核糖体，以满足胚胎发育早期蛋白质大量合成的需要。 在基因扩增之前，这500个rRNA基因以串联方式排列。在发生扩增的3 周时间里，rDNA不再是一个单一连续DNA片段，而是形成大量小环即复制环，以增加基因拷贝数目。这种rRNA基因扩增发生在许多生物的卵母细胞发育过程中，包括鱼、昆虫和两栖类动物。目前对这种基因扩增的机制并不清楚。 在某些情况下，基因扩增发生在异常的细胞中。例如，人类癌细胞中的许多致癌基因，经大量扩增后高效表达，导致细胞繁殖和生长失控。有些致癌基因扩增的速度与病症的发展及癌细胞扩散程度高度相关。 2．基因丢失 在一些低等真核生物的细胞分化过程中，有些体细胞可以通过丢失某些基因，从而达到调控基因表达的目的，这是一种极端形式的不可逆的基因调控方式。如某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育到一定阶段后，许多体细胞常常丢失整条染色体或部分染色体，而只有在将来分化生殖细胞的那些细胞中保留着整套的染色体。在马蛔虫中，个体发育到一定阶段后，体细胞中的染色体破碎，形成许多小的染色体，其中有些小染色体没有着丝粒，它们因不能在细胞分裂中正常分配而丢失，在将来形成生殖细胞的细胞中不存在染色体破碎现象。但是，基因丢失现象在高等真核生物中还未发现。 3．DNA重排（基因重排） 基因重排(gene rearrangement)是指DNA分子中核苷酸序列的重新排列。这些序列的重排可以形成新的基因，也可以调节基因的表达。这种重排是由基因组中特定的遗传信息决定的，重排后的基因序列转录成mRNA，翻译成蛋白质。 尽管基因组中的DNA序列重排并不是一种普通方式，但它是有些基因调控的重要机制，在真核生物细胞生长发育中起关键作用。
真核生物基因表达的调控 一、生物基因表达的调控的共性 首先，我们来看看在生物基因表达调控这一过程中体现的共性和一些基本模式。 1、作用范围。生物体内的基因分为管家基因和奢侈基因。管家基因始终表达，奢侈基因只在需要的时候表达，但二者的表达都受到调控。可见，调控是普遍存在的现象。 2、调控方式。基因表达有两种调控方式，即正调控与负调控，原核生物和真核生物都离不开这两种模式。 3、调控水平。一种基因表达的调控可以在多种层面上展开，包括DNA水平、转录水平、转录后加工水平、翻译后加工水平等。然为节省能量起见，转录的起始阶段往往作为最佳调控位点。 二、真核生物基因表达调控的特点 真核生物与原核细胞在结构上就有着诸多不同，这决定了二者在运行方面的迥异途径。真核生物比原核生物复杂，转录与翻译不同时也不同地，基因组与染色体结构复杂，因而有着更为复杂的调控机制。 1、 2、 3、 4、多层次。真核生物的基因表达可发生在染色质水平、转录起始水平、无操纵子和衰减子。 大多数原核生物以负调控为主，而真核生物启动子以正调控为主。 个体发育复杂，而受环境影响较小。真核生物多为多细胞生物，在转录后水平、翻译水平以及翻译后水平。
生长发育过程中，不仅要随细胞内外环境的变化调节基因表达，还要随发育的不同阶段表达不同基因。前者为短期调控，后者属长期调控。 从整体上看，不可逆的长期调控影响更深远。 三、真核生物基因表达调控的机制 介于真核生物表达以多层次性为最主要特点，我们可以分别从它的几个水平着眼，剖析它的调控机制。 1、染色质水平。真核生物基因组DNA以致密的染色质形式存在，发生在染色质水平的调控也称作转录前水平的调控，产生永久性DNA序列和染色质结构的变化，往往伴随细胞分化。染色质水平的调控包括染色质丢失、基因扩增、基因重排、染色体DNA的修饰，等等。a.基因丢失：丢失一段DNA或整条染色体的现象。在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除这些基因的活性。某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许多体细胞常常丢失掉整条或部分的染色体，只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直保留着整套的染色体。如马蛔虫2n＝2，但染色体上有多个着丝粒。第一次卵裂是横裂，产生上下2个子细胞。第二次卵裂时，一个子细胞仍进行横裂，保持完整的基因组，而另一个子细胞却进行纵向分裂，丢失部分染色体。目前，在高等真核生物（包括动物、植物）中尚未发现类似的基因丢失现象。 b.基因扩增：基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。如非洲爪蟾卵母细胞中rDNA的基因扩增是因发育需要而出现的基因扩增现象；基因组拷贝数增加，即多倍性，在植物中是非常普遍的现象。基因组拷贝数增加使可供遗传重组的物质增多，这可能构成了加速基因进化、基因组重组和最终物种形成的一种方式。 c.基因重排：将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因的表达。在人类基因组中，所有抗体的重链和轻链都不是由固定的完整基因编码的，而是由不同基因片段经重排后形成的完整基因编码的。
真核基因表达调控的特点 尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。 真核基因表达调控的环节更多 如前所述：基因表达是基因经过转录、翻译、产生有生物活性的蛋白质的整个过程。同原核生物一样，转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节。但真核基因转录发生在细胞核（线粒体基因的转录在线粒体内），翻译则多在胞浆，两个过程是分开的，因此其调控增加了更多的环节和复杂性，转录后的调控占有了更多的分量。 图中标出了真核细胞在分化过程中会发生基因重排（gene rearrangement），即胚原性基因组中某些基因会再组合变化形成第二级基因。例如编码完整抗体蛋白的基因是在淋巴细胞分化发育过程中，由原来分开的几百个不同的可变区基因经选择、组合、变化、与恒定区基因一起构成稳定的、为特定的完整抗体蛋白编码的可表达的基因。这种基因重排使细胞可能利用几百个抗体基因的片段，组合变化而产生能编码达108种不同抗体的基因，其中就有复杂的基因表达调控机理。 此外，真核细胞中还会发生基因扩增（gene amplification），即基因组中的特定段落在某些情况下会复制产生许多拷贝。最早发现的是蛙的成熟卵细胞在受精后的发育程中其rRNA 基因（可称为rDNA）可扩增2000倍，以后发现其他动物的卵细胞也有同样的情况，这很显然适合了受精卵其后迅速发育分裂要合成大量蛋白质要求有大量核糖体的需要。又如MTX （methotrexate）是叶酸的结构类似物，能竞争性抑制细胞对叶酸的还原利用，因而对细胞有毒性，但当缓慢提高MTX浓度时，一些哺乳类细胞会对含有利用叶酸所必需的二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)基因的DNA区段扩增40-400倍，使DHFR的表达量显著增加，从而提高对MTX的抗性。基因的扩增无疑能够大幅度提高基因表达产物的量，但这种调控机理至今还不清楚。 真核基因的转录与染色质的结构变化相关 真核基因组DNA绝大部分都在细胞核内与组蛋白等结合成染色质，染色质的结构、染色质中DNA和组蛋白的结构状态都影响转录，至少有以下现象： 染色质结构影响基因转录细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内，称为常染色质（euchromatin），松散的染色质中的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后不像其他部分解旋松开，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质（hetrochromatin），其中从未见有基因转录表达；原本在常染色质中表达的基因如移到异染色质内也会停止表达；哺乳类雌体细胞2条X染色体，到间期一条变成异染色质者，这条X染色体上的基因就全部失活。可见紧密的染色质结构阻止基因表达。 组蛋白的作用早期体外实验观察到组蛋白与DNA结合阻止DNA上基因的转录，去除组蛋白基因又能够转录。组蛋白是碱性蛋白质，带正电荷，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而遮蔽了DNA分子，妨碍了转录，可能扮演了非特异性阻遏蛋白的作用；染色质中的非组蛋白成分具有组织细胞特异性，可能消除组蛋白的阻遏，起到特异性的去阻遏促转录作用。 发现核小体后，进一步观察核小体结构与基因转录的关系，发现活跃进行基因转录的染色质区段常有富含赖氨酸的组蛋白（H1组蛋白）水平降低、H2A、H2B组蛋白二聚体不稳定性增加、组蛋白乙酰化（acetylation）和泛素化（obiquitination）、以及H3组蛋白巯基等现
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，
移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：
一、真核基因组的复杂性 与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下。 1. 真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在 109bp数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。 2. 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传 成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。 3. 原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体。 4. 如前所述，细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元， 共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。 5. 原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中 仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。 6. 原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码 的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。 7. 原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组 中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。用复性动力学等实验表明有三类重复序列：1）高度重复序列(highly repetitive sequences)，这类序列一般较短，长10－300bp，在哺乳类基因组中重复106次左右，占基因组DNA序列总量的10－60%，人的基因组中这类序列约占20%，功能还不明了。2）中度重复序列(moderately repetitive sequences)，这类序列多数长100－500bp，重复101－105次，占基因组10-40%。例如哺乳类中含量最多的一种称为Alu的序列，长约300bp，在哺乳类不同种属间相似，在基因组中重复3×105次，在人的基因组中约占7%，功能也还不很清楚。在人的基因组中18S/28SrRNA基因重复280次，5SrRNA基因重复2000次，tRNA基因重复1300次，5种组蛋白的基因串连成簇重复30-40次，这些基因都可归入中度重复序列范围。3）单拷贝序列(single copy sequences)。这类序列基本上不重复，占哺乳类基因组的50-80%，在人基因组中约占65%。绝大多数真核生物为蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因。 从上述可见真核基因组比原核基因组复杂得多，至今人类对真核基因组的认识还很有限，使现在国际上制订的人基因组研究计划(human gene project)完成，绘出人全部基因的染色体定位图，测出人基因组109bp全部DNA序列后，要搞清楚人全部基因的功能及其相互关系，特别是要明了基因表达调控的全部规律，还需要经历很长期艰巨的研究过程。 二、真核基因表达调控的特点 尽管我们现在对真核基因表达调控知道还不多，但与原核生物比较它具有一些明显的特点。
第十章作业 1. 简述真核生物基因表达调控的7个层次。 ①染色体和染色质水平上的结构变化与基因活化 ②转录水平上的调控，包括基因的开与关，转录效率的高与低 ③RNA加工水平的调控，包括对出事转录产物的特异性剪接、修饰、编辑等。 ④转录后加工产物在从细胞核向细胞质转运过程中所受到的调控 ⑤在翻译水平上的控制，即对哪一种mRNA结合核糖体进行翻译的选择以及蛋白质成量的控制 ⑥对蛋白质合成后选择性地被激活的控制，蛋白质和酶分子水平上的剪接等的控制 ⑦对mRNA选择性降解的调控 2. 真核基因表达调控与原核生物相比有何异同？ 相同点：①与原核基因的调控一样，真核基因表达调控也有转录水平调控和转录后水平的调控，并且也以转录水平调控为最重要； ②在真核结构基因的上游和下游(甚至内部)也存在着许多特异的调控成分，并依靠特异蛋白因子与这些调控成分的结合与否调控基因的转录。 不同点：①原核细胞的染色质是裸露的DNA，而真核细胞染色质则是由DNA与组蛋白紧密结合形成的核小体。 ②在原核基因转录的调控中，既有激活物参与的正调控，也有阻遏物参与的负调控，二者同等重要。 ③原核基因的转录和翻译通常是相互偶联的，即在转录尚未完成之前翻译便已开始。 ④真核生物大都为多细胞生物，在个体发育过程中发生细胞分化后，不同细胞的功能不同，基因表达的情况也就不一样，某些基因仅特异地在某种细胞中表达，称为细胞特异性或组织特异性表达，因而具有调控这种特异性表达的机制。 3. DNA 甲基化对基因表达的调控机制。 甲基化抑制基因转录的机制：DNA甲基化会导致某些区域DNA构象改变，包括甲基化后染色质对于核酸酶或限制性内切酶的敏感度下降，更容易与组蛋白H1相结合，DNaseⅠ超敏感位点丢失，使染色质高度螺旋化, 凝缩成团, 直接影响了转录因子与启动区DNA的结合效率的结合活性，不能启始基因转录。DNA的甲基化不利于模板与RNA聚合酶的结合，降低了转录活性。 4. 转录因子结合DNA的结构基序（结构域）有哪几类？ ①螺旋-转折-螺旋 ②锌指结构 ③碱性-亮氨酸拉链 ④碱性-螺旋-环-螺旋 5. 真核基因转调控中有几种方式能够置换核小体？ ①占先模式：可以解释转录时染色质结构的变化。该模型认为基因能否转录取决于特定位置上组蛋白和转录因子之间的不可逆竞争性结合。 ②动态模式该模型认为转录因子与组蛋白处于动态竞争之中，基因转录前染色质必须经历结构上的改变，即转换核小体中的全部或部分成分并重新组装，这个耗能的基因活化过程称为染色质重构 6. 简述真核生物转录水平调控过程。 真核生物在转录水平的调控主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成过程：①转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的
基因表达调控 一、选择题 （一） A 型选择题 1 ．基因表达调控的最基本环节是 A ．染色质活化 B ．基因转录起始 C ．转录后的加工 D ．翻译 E ．翻译后的加工 2 ．将大肠杆菌的碳源由葡萄糖转变为乳糖时，细菌细胞内不发生 A ．乳糖→ 半乳糖 B ． cAMP 浓度升高 C ．半乳糖与阻遏蛋白结合 D ． RNA 聚合酶与启动序列结合 E ．阻遏蛋白与操纵序列结合 3 ．增强子的特点是 A ．增强子单独存在可以启动转录 B ．增强子的方向对其发挥功能有较大的影响 C ．增强子不能远离转录起始点 D ．增强子增加启动子的转录活性 E ．增强子不能位于启动子内 4 ．下列那个不属于顺式作用元件 A ． UAS B ． TATA 盒 C ． CAAT 盒 D ． Pribnow 盒 E ． GC 盒 5 ．关于铁反应元件（ IRE ）错误的是 A ．位于运铁蛋白受体 (TfR) 的 mRNA 上 B ． IRE 构成重复序列 C ．铁浓度高时 IRE 促进 TfR mRNA 降解 D ．每个 IR E 可形成柄环节构 E ． IRE 结合蛋白与 IRE 结合促进 TfR mRNA 降解 6 ．启动子是指 A ． DNA 分子中能转录的序列 B ．转录启动时 RNA 聚合酶识别与结合的 DNA 序列 C ．与阻遏蛋白结合的 DNA 序列 D ．含有转录终止信号的 DNA 序列 E ．与反式作用因子结合的 RNA 序列 7 ．关于管家基因叙述错误的是 A ．在同种生物所有个体的全生命过程中几乎所有组织细胞都表达 B ．在同种生物所有个体的几乎所有细胞中持续表达 C ．在同种生物几乎所有个体中持续表达 D ．在同种生物所有个体中持续表达、表达量一成不变 E ．在同种生物所有个体的各个生长阶段持续表达 8 ．转录调节因子是 A ．大肠杆菌的操纵子 B ． mRNA 的特殊序列 C ．一类特殊的蛋白质 D ．成群的操纵子组成的凋控网络 E ．产生阻遏蛋白的调节基因 9 ．对大多数基因来说， CpG 序列高度甲基化 A ．抑制基因转录 B ．促进基因转录 C ．与基因转录无关 D ．对基因转录影响不大 E ．既可抑制也可促进基因转录 10 ． HIV 的 Tat 蛋白的功能是 A ．促进 RNA po l Ⅱ 与 DNA 结合 B ．提高转录的频率
原核生物和真核生物基因表达调控特点的比较1.相同点:转录起始是基因表达调控的关键环节2.不同点:A.原核基因的表达调控主要包括转录和翻译水平 真核基因的表达调 控主要包括染色质活化、转录、转录后加工、翻译、翻译后加工多个层次B.原核基因表达调控主要为负调控,真核主要为正调控C.原核转录不需要转录因子,RNA聚合酶直接结合启 动子,由sita因子决定基因表的的特异性 真核基因转录起始需要基础特异两类转录因子 依赖DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用 调控转录激活D.原核基因表达调控主要采用操纵子模型 转录出多顺反子RNA 实现协调调节 真核基因转录产物为单顺反子RNA 功能相关蛋白的协调表达机制更为复杂。真核生物基因表达调控的环节主要在转录水平 其次是翻译水平。原核生物基因以操纵子的形式存在。转录水平调控涉及到启动子、sita因子 与RNA聚合酶结合 、阻遏蛋白 负调控 、正调控蛋白、倒位蛋白、RNA聚合酶抑制物、衰减子等。翻译水平的调控涉及SD序列、mRNA的稳定性 不稳定(5’端和3’端的发夹结构可保护不被酶水解mRNA的5’端与核糖体结合 可明显提高稳定性)、翻译产物及小分子RNA的调控作用。真核生物基因表达的调控环节较多 在DNA水平上可以通过染色体 丢失、基因扩增、基因重排、DNA甲基化、染色体结构改变影响基因表达。在转录水平主要通过反式作用因子调控转录因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与转录因子-DNA复合物的结合及转录起始复合物的形成。在转录后水平主要通过RNA修饰、剪接及mRNA运输的控制来影响基因表达。在翻译水平有影响起始翻译的阻遏蛋白、5’AUG、5’端非编码区长度、mRNA 的稳定性调节及小分子RNA。真核基因调控中最重要的环节是基因转录 真核生物基因表达需要转录因子、启动子、沉默子和增强子。葡萄糖存在 乳糖不存在 此时无诱导剂
真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein V ector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞
运载体与基因表达载体的区别 1、不同点： ⑴“运载体”泛指基因工程操作中能将目的基因送达受体细胞的工具。如细菌质粒等。 相对“基因表达载体”而言，“运载体”主要是强调它能运输目的基因这一功能，只要能运输目的基因就算是运载体，并不计较是不是真正运输了目的基因。 ⑵“基因表达载体”，是实施了运输目的基因、并且要保证目的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。 这样看来，运载体、基因表达载体二者之间就不能完全等同。 2、联系： “基因表达载体”是在”运载体”的基础上构建成的。 基因表达载体的构成：目的基因+ 启动子+ 终止子+ 标记基因。 3、表达载体上的启动子和终止子是本身具有还是后加上去的呢？ 这个问题，教科书中并没有明确说明，但我个人的观点是：这要看获取目的基因的方法，而问题的根源在于基因的结构。关于基因的结构，在新课程标准中也不再做为教学的要求了。 （人类）结构基因的基本结构：上游非编码区+ 启动子+ 编码区+ 终止子+ 下游非编码区 人类结构基因4个区域： ①前导区，位于编码区上游，相当于RNA5’末端非编码区（非翻译区）； ②编码区，包括外显子与内含子； ③尾部区，位于RNA3’编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）； ④调控区，包括启动子和增强子等。基因编码区的两侧也称为侧翼顺序（图1－１）。 ⑴启动子：启动子（promoter）能促进转录过程。也有人将启动子称为“RNA聚合酶识别位点”。 包括下列几种不同顺序： ①TATA框（TATA box）：其一致顺序为TATAATAAT。它约在基因转录起始点上游约-30-50bp 处，基本上由A-T碱基对组成，是决定基因转录始的选择，为RNA聚合酶的结合处之一，RNA聚合酶与TATA框牢固结合之后才能开始转录。 ②CAAT框（CAAT box）：其一致顺序为GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的调节区，位于转录起始点上游约-80-100bp处，可能也是RNA聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。 ③GC框（GC box）：有两个拷贝，位于CAAT框的两侧，由GGCGGG组成，是一个转录调节区，有激活转录的功能。 此外，RNA聚合酶Ⅲ负责转录tRNA的DNA和5SrDNA，其启动子位于转录的DNA 顺序中，称为下游启动子。
表达载体的构建方法及步骤 一、载体的选择及如何阅读质粒图谱 目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。一个合格质粒的组成要素： （1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而 真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。 （2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ （3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 （4）P/E 启动子/增强子 （5）Terms 终止信号 （6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目 的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。 载体选择主要考虑下述3点： 【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb 选质粒。（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。 综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载 体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA 进行切割，获得线性载体分子，以便于与目的基因片段进行连接。 如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活
原核生物基因表达调控概述 基因表达调控是生物体内基因表达调节控制机制，使细胞中基因表达的过程在时间，空间上处于有序状态，并对环境条件的变化做出适当的反应复杂过程。 1.基因表达调控意义 在生命活动中并不是所有的基因都同时表达，代谢过程中所需各种酶和蛋白质基因以及构成细胞化学成分的各种编码基因，正常情况下是经常表达的，而与生物发育过程有关的基因则需在特定的时空才表达，还有许多基因被暂时的或永久的关闭而不来表达。 2.原核基因表达调控特点 原核生物基因表达调控存在于转录和翻译的起始、延伸和终止的每一步骤中。这种调控多以操纵子为单位进行，将功能相关的基因组织在一起，同时开启或关闭基因表达即经济又有效，保证其生命活动的需要。调控主要发生在转录水平，有正、负调控两种机制在转录水平上对基因表达的调控决定于DNA的结构，RNA 聚合酶的功能、蛋白质因子及其他小分子配基的相互作用。细菌的转录和翻译过程几乎在同一时间内相互偶联。 细胞要控制各种蛋白质在不同时期的表达水平，有两条途径：（1）细胞控制从其DNA模板上转录其特异的mRNA的速度，这是一条经济的途径，可减少从mRNA合成蛋白质的小分子物质消耗，这是生物长期进化过程中自然选择的结果，这种控制称为转录水平调控。（2）在mRNA合成后，控制从mRNA翻译肽链速度，包括一些与翻译有关的酶及其复合体分子缔合的装配速度等过程。这种蛋白质合成及其基因表达的控制称为翻译水平的调控。 二.原核生物表达调控的概念 （1）细菌细胞对营养的适应
细菌必须能够广泛适应变化的环境条件。这些条件包括营养、水分、溶液浓度、温度，pH等。而这些条件须通过细胞内的各种生化反应途径，为细胞生长 的繁荣提供能量和构建细胞组分所需的小分子化合物。 （2）顺式作用元件和反式作用元件 基因活性的调节主要通过反式作用因子与顺式作用元件的相互作用而实现。反式作用因子的编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列在同一个DNA分子上。RNA聚合酶是典型的反式作用因子。 顺式作用元件是指对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其 自身同处于一个DNA分子上的基因；这种基因DNA序列通常不编码蛋白质， 多位于基因旁侧或内含子中。位于转录单位开始和结束位置上启动子和终止子，都是典型的顺式作用元件。 （3）结构基因和调节基因 结构基因是编码蛋白或RNA基因。细菌的结构基因一般成簇排列，多个结 构基因受单一启动子共同控制，使整套基因或者都不表达。结构基因编码大量功能各异的蛋白质，其中有组成细胞核组织器官基本成分的结构蛋白，有催化活性的酶和各种调节蛋白等。调节基因是编码合成那些参与基因表达调控的RNA和蛋白质的特异性DNA序列。调节基因编码的调节物通过与DNA上的特定位点 结合控制转录是调控关键。 （4）操纵基因和阻遏蛋白 操纵基因是操纵子中的控制基因，在操纵子上一般与启动子相邻，通常处于开放状态，使RNA聚合酶能够通过并作用于启动子启动转录，阻遏蛋白是负调控系统中由调节基因编码的调节蛋白，它本身或与辅阻遏蛋白物一起合成于操纵基因，阻遏蛋白操纵因子结构基因的转变，阻遏蛋白可被诱导物变构失活，从而导致不可阻遏或去阻遏。
如何构建载体 1 启动子的选用和改造 外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。 目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。 在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。 2 增强翻译效率 为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容： 2.1添加5｀-3｀-非翻译序列 许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa 蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。Ingelbrecht等曾对多种基因的 3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。 2.2 优化起始密码周边序列 虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。例如，有一个细菌的几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG，当被修饰为ACCAUGG，其在烟草中的表达水平提高了8倍。因此，利用非植物来源的基因构建表达载体时，应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造。 2.3对基因编码区加以改造