实验一原子荧光光谱法测量条件的选择 一、实验目的 1．了解原子荧光光谱仪的基本结构及使用方法； 2．掌握原子吸收光谱分析测量条件的选择方法及测量条件的相互关系及影响，确定各项条件的最佳值。 二、方法原理 原子荧光光谱仪工作原理： 在一定工作条件下，荧光强度I F与被测元素的浓度c成正比，其关系如下： I F = K c 氢化物发生原理： BH4- + H++ 2As3+ +3H2O →2AsH3↑+H2↑+ BO33-生成的AsH3蒸汽在载气的带动下，经过火焰原子化，As原子接受由低压砷灯发出激发光照射，基态砷原子被激发到高能态，当返回到基态时辐射出共振荧光，此荧光经聚光镜聚焦于光电倍增管，实现光电转换，最后得到信号。 在原子荧光光谱分析中测量条件选择得是否正确，直接影响到分析方法的检出限、精密度和准确度。本实验通过砷的原子荧光光谱分析测量条件的选择，如灯电流、载气流量等，确定这些测量条件的最佳值。 三、仪器设备与试剂材料 1．PF6型原子荧光光谱仪（北京普析通用），砷高强度空心阴极灯。 2．试剂： （1）砷标准贮备液（1000u g?mL-1）：国家标准。 （2）砷实验工作溶液（1u g?mL-1）：由砷标准贮备液1000u g?mL-1逐级稀释得到。 （3）硫脲溶液（100g?L-1）：称取硫脲10g，加入80mL蒸馏水，水浴加热溶解，蒸馏水稀至100mL，摇匀。 （4）硼氢化钠-氢氧化钠溶液（15g?L-1）：称取5g氢氧化钠溶于200mL蒸馏水，加入15g硼氢化钠并使其溶解，用蒸馏水稀至1000mL，摇匀。 （5）2% 盐酸溶液（v/v）：移取20ml HCl（GR）,用蒸馏水稀释至1000mL，摇匀。 （6）（1+1）盐酸溶液（v/v）。 四、测量条件的选择 1．10ng?mL-1标准溶液的配制
三维荧光光谱分析法 荧光强度与激发波长Kex、发射波长Kem、衰变时间( t)、荧光寿命(S)、吸光系数(E)、偏振度(P ) 及待测组分浓度(c) 等因素有关。若主要研究荧光强度与Kex 和Kem 的关系, 就构成了Kex2K em2F 三维荧光光谱(EEM ) , EEM 光谱技术简化了复杂组分繁琐的分离过程, 提高了荧光分析的灵敏度、选择性和实用性, 还可进行指纹分析和技术鉴定。许金钩小组应用EEM 技术和方法,获得了生物大分子、有机小分子荧光探针、以及荧光探针分子与生物大分子相互作用的大量信息, 并运用Mon te2Carlo 数学模型对EEM 进行总体积分,建立了EEM 总体积分方法, 用于样品中有机物质和药物分子的定量分析, 获得满意的结果。除了使用EEM 技术和方法外, 还可以根据实际需要, 选择荧光衰变时间( t)、偏振度(P )、荧光寿命(S) 等参数,构成Kex2K em2x (待定参数) 三维荧光光谱, 从不同的角度出发来提高荧光分析的灵敏度、选择性。这种分析技术不仅被用来进行物质的定性和定量分析,而且被用于测定生物大分子的形状、大小、构象, 以及固态物质、生物大分子与有机分子和金属离子相互作用等的研究, 在临床医学、环境检测、法医鉴定、生命科学以及有序介质中生物大分子荧光探针光谱特性的研究等方面, 发挥着极为重要的作用。但由于多维荧光光谱技术中需要处理大量的实验数据,因此在研制仪器的同时, 还要开发许多有实用价值的数学处理方法和多维光谱软件120 世纪70 年代发展起来的同步导数荧光技术在混合物的连续测定中发挥着重要作用, 这一方法的特点是同时扫描激发波长和发射波长, 并对得出的图谱进行微分处理, 使容易重叠的波峰彼此完全分开, 便于得出可靠的测量结果。有人对人血尿中temopo rt in2po lyethylene glyno l 共轭物分别用HPLC、C I 和荧光光谱分析法进行测定, 发现荧光光谱分析法是其中最简便、迅速、灵敏的分析方法, 新一代荧光指示剂如酪氨
第一节 叶绿素荧光参数及其意义 韩志国，吕中贤（泽泉开放实验室，上海泽泉科技有限公司，上海，200333） 叶绿素荧光技术作为光合作用的经典测量方法，已经成为藻类生理生态研究领域功能最强大、使用最 广泛的技术之一。由于常温常压下叶绿素荧光主要来源于光系统II 的叶绿素a ，而光系统II 处于整个光合 作用过程的最上游，因此包括光反应和暗反应在内的多数光合过程的变化都会反馈给光系统II ，进而引起 叶绿素a 荧光的变化，也就是说几乎所有光合作用过程的变化都可通过叶绿素荧光反映出来。与其它测量 方法相比，叶绿素荧光技术还具有不需破碎细胞、简便、快捷、可靠等特性，因此在国际上得到了广泛的 应用。 1 叶绿素荧光的来源 藻细胞内的叶绿素分子既可以直接捕获光能，也可以间接获取其它捕光色素（如类胡萝卜素）传递来 的能量。叶绿素分子得到能量后，会从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。根据吸收的能量多少， 叶绿素分子可以跃迁到不同能级的激发态。若叶绿素分子吸收蓝光，则跃迁到较高激发态；若叶绿素分析 吸收红光，则跃迁到最低激发态。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，会在几百飞秒（fs ，1 fs=10－15 s ）内通过振动弛豫向周围环境辐射热量，回到最低激发态（图1）。而最低激发态的叶绿素分子可以稳定 存在几纳秒（ns ，1 ns=10－9 s ）。 波长吸收荧光红 B 蓝 荧光 热耗散 最低激发态较高激发态基态吸收蓝光吸收红光能量A 图1 叶绿素吸收光能后能级变化（A ）和对应的吸收光谱（B ）（引自韩博平 et al., 2003） 处于最低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径（图2）释放能量回到基态(韩博平 et al., 2003; Schreiber, 2004)：1）将能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后传递给反应中心叶绿素a ，用于进行光化 学反应；2）以热的形式将能量耗散掉，即非辐射能量耗散（热耗散）；3）放出荧光。这三个途径相互竞 争、此消彼长，往往是具有最大速率的途径处于支配地位。一般而言，叶绿素荧光发生在纳秒级，而光化 学反应发射在皮秒级（ps ，1 ps=10－12 s ），因此在正常生理状态下（室温下），捕光色素吸收的能量主要用 于进行光化学反应，荧光只占约3%～5%(Krause and Weis, 1991; 林世青 et al., 1992)。 在活体细胞内，由于激发能从叶绿素b 到叶绿素a 的传递几乎达到100％的效率，因此基本检测不到 叶绿素b 荧光。在常温常压下，光系统I 的叶绿素a 发出的荧光很弱，基本可以忽略不计，对光系统I 叶 绿素a 荧光的研究要在77 K 的低温下进行。因此，当我们谈到活体叶绿素荧光时，其实指的是来自光系 统II 的叶绿素a 发出的荧光。
1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。
原子荧光分析技术讲座—电子技术 1、原子荧光法原理 分光光度法 原子汲取法 等离子发射光谱法 聚光原子荧光
原子化器 2、方法特点 测定Hg、As、Bi、Se、Sb、Be、Te、Ge(Sn、Pb、Cu)等最可靠、最有前途的方法。不使用SnCl2作还原剂，而使用NaBH4（KBH4）作还原剂。 要紧特点： （1）光谱干扰少； （2）基体阻碍阻碍易于消除； （3）通过氢化物发生达到分离和富集的目的； （4）依照所测元素的还原性质不同，可进行价态分析； （5）气相干扰少； （6）线性范围宽，测汞可达三个数量级； （7）灵敏度远远高于冷原子汲取法。 3、测定过程中的注意事项 由于灵敏度专门高，防止试剂、器皿的沾污和扣除空白是实验成败的关键之一（这点比其他方法更为重要）。
（1）小的光电倍增管电压，可减少噪声水平； （2）观测高度直接阻碍测量灵敏度和数据的稳定性，建议使用6~8mm（不同仪器标尺可能不同）； （3）载气及流量：原子荧光法只能使用Ar气，这点与冷原子荧光法不同，Ar气纯度专门重要，达到1%时，会导致Hg（As、Bi、Se、Sb、Te、Ge）灵敏度降低约5%； （4）载气流量过大会冲稀测定成分的浓度，过小不能迅速将测定成分带入石英炉，一般以0.4~0.6L/min为宜； （5）屏蔽气体：屏蔽气体可防止周围空气进入火焰产生荧光淬灭，一般在0.6~1.6L/min范围选择； （6）仪器都有峰高和峰面积测量的功能，用峰高好； （7）选择最佳延迟时刻和积分时刻是得到最佳测量效果的重要因素； （8）还原剂：NaBH4是强还原剂，必须避光保存（溶液也应避光），如发觉浑浊，须经热酸浸泡并洗净的玻璃砂过滤（注意承接滤液瓶的洗净）。NaBH4（或KBH4）一般在含NaOH（KOH）0.5~1%的介质中才能稳定；NaBH4（或KBH4）在酸介质中才能起到还原
一、原子荧光分光光度计 技术参数 1、工作条件要求 1.1电源: 220V，50Hz 1.2温度: 15～35℃ 1.3相对湿度: 10-75% 2、技术能力要求 2.1用途：用于食品卫生检验、环境样品检验、城市给排水检测、农产品检验、地质冶金检验、化妆品检验、土壤肥料饲料检验等样品中As、Sb、Bi、Hg、Se、Te、Sn、Ge、Pb、Zn、Cd元素的痕量分析。 2.2分析方法：非色散光学系统,进行两道元素同时测量 *2.2.1氢化物发生进样方式：双注射泵联合进样，蠕动泵主动排废 2.2.2检测能力：适用于As、Hg、Se、Pb、Ge、Sn、Te、Bi、Sb、Cd、Zn等十一种元素的痕量测定 2.2.3检测限(D.L.)：As、Pb、Se、Bi、Sn、Sb、Te、Hg≤0.01μg/L；Hg（冷原子测汞）、Cd≤0.001μg/L；Ge≤0.05μg/L;Zn≤1.0μg/L *2.2.4相对标准偏差（RSD)：≤0.8% 2.2.5线性范围：≥三个数量级 *2.3光学光源系统：双光束、实时监控，脉冲恒流或集束脉冲供电，无色散光学系统，自识空心阴极灯 2.4气路设计（气路控制模块）： 2.4.1控制方式：质量流量控制器（MFC） 2.4.2连续可调：气体流量控制，气路自动保护装置，自动控制气路并可自动诊断，关机可自动切断气源 2.4.3气路控制：载气、屏蔽气流量分别自动控制（控制精度可达1ml/min） *2.5双检测系统：高信噪比光电倍增管双检测系统 2.6内置式两个独立注射泵进样：一路进样品载流，一路进还原剂（自动配制标准曲线，高浓度自动稀释，自动清洗，单标自配标准曲线，在线智能提示，自动在线加载还原剂、掩蔽剂） 2.7 在线分析功能：自动炉高调节、自动负高压设置、自动气路设置、在线动态
叶绿素荧光研究背景知识介绍 前言 近些年来，叶绿素荧光技术已经逐渐成为植物生理生态研究的热门方向。荧光数据是植物光合性能方面的必要研究内容。目前这种趋势由于叶绿素荧光检测仪的改进而得到发展。然而荧光理论和数据解释仍然比较复杂。就我们所了解的情况来看，目前许多研究者对荧光理论不是很清楚，仪器应用仅仅限于简单的数据说明的基础上，本文在此基础上，目的在于简单明晰地介绍相关理论和研究要点，以求简单明确地使用叶绿素荧光检测设备，充分分析实验数据，重点在于植物生理生态学技术的应用和限制。 荧光测量基础 植物叶片所吸收的光的能量有三个走向：光合驱动、热能、叶绿素荧光。三个过程之间存在竞争，其中任何一个效率的增加都将造成另外两个产量的下降。因此，测量叶绿素荧光产量，我们可以获得光化学过程与热耗散的效率的变化信息。尽管叶绿素荧光的总量很小(一般仅占叶片吸收光能总量的1-2%)，测量却非常简单。荧光光谱不同于吸收光谱，其波长更长，因此荧光测量可以通过把叶片经过给定波长的光线的照射，同时测量发射光中波长较长的部分光线的量来实现。有一点需要注意的是，这种测量永远是相对的，因为光线不可避免会有损失。因此，所有分析必须把数据进行标准化处理，包括其进一步计算的许多参数也是如此。 调制荧光仪的出现是荧光研究技术的革命性的创新。在这类仪器中，测量光源是调制(高频率开关)的，其检测器也被调谐来仅仅检测被测量光激发的荧光。因此，相对的荧光产量可以在背景光线(主要是指野外全光照的条件下)存在的条件下进行测量。目前绝大多数的荧光仪采用了调制系统，同时也强烈建议选择调制荧光仪(Kate Maxwell,2000)。 为什么荧光产量会发生改变？Kautsky效应和Beyond 叶绿素荧光产量的变化最早在1960年被Kautsky和其合作者发现。他们发现，当把植物叶片从黑暗中转入光下，荧光产量瞬间上升(大约在1秒左右)这种上升可以解释为光合途径中电子受体的还原(可接受电子的受体的减少)。一旦PSII吸收光能，初级电子受体Q A(质体醌)接受了电子，它将不能再接受电子，直到它把电子传递给下一级电子载体Q B。此期间，反应中心是关闭的，反应中心关闭的比
原子荧光光度法测定水体中的锌 一、实验目的 （1）了解双道原子荧光光度计的基本构造和原理。 （2）学习仪器的基本操作。 二、实验原理 原子荧光是原子蒸汽受具有特征波长的光源照射后，其中一些自由原子被激发跃迁到较高能态，然后去活化回到某一较低能态（通常为基态）而发射出特征光谱的物理现象。当激发辐射的波长与产生荧光波长相同时，称为共振荧光，它是原子荧光分析中最主要的分析线。另外还有直跃线荧光、阶跃线荧光、敏化荧光等。各种元素都有其特定的原子荧光光谱，根据原子荧光强度的高低可测得试样中待测元素含量。这就是原子荧光光谱分析。 原子荧光强度与试样浓度以及激发光源的辐射强度等参数存在以下函数关系： I f = ΦI 理想情况下： I f = ΦI0AK0lN = Kc 三、仪器与试剂 1 仪器：原子荧光光度计（北京吉天仪器有限公司AFS-820） 2 试剂：（1）Zn标准贮备液（1mg/mL）：准确称取1.000g高纯锌粉，用20mL1:1（V/V）HNO3低温加热溶解后，去离子水定容至1000mL，摇匀，此溶液浓度为1mg/mL。 （2）Zn标准使用液（5.0μg/mL）：移取10mL 1mg/mL标准贮备液，用1%（V/V）HCl定容至10mL，此溶液Zn浓度为100 μg/mL；再移取5mL 100μg/mL标准液，用去离子水定容至100mL，此溶液即为5.0μg/mL的标准使用液。 （3）还原剂：称取0.5g KOH（分析纯）放入去离子水中，待完全溶解后再加入2g KBH4，溶解后摇匀（现用现配为宜，配置顺序不可颠倒）。
（4）载流液：即与标液基体相一致的等浓度酸溶液，用于推动样品至反应系统参与反应并清洗整个进样系统。 2%HCl（V/V）：量取20mL浓盐酸（优级纯），用去离子水定容至1000mL（酸的纯度达不到要求时可适当降低浓度）。 四、主要仪器条件参数 负高压：300-320V；灯电流：60-80mA；原子化器高度：8mm； 原子化器温度：200℃；载气流量：600mL/min；屏蔽气流量：600mL/min； 读数时间：10.0s；延迟时间：0.5s；进样量：0.1 mL 五、标准溶液配制与测定 1 标准溶液配制： 2 溶液测定（仪器操作）： （1）打开灯室盖，将待测元素的空心阴极灯插头仔细插入灯座； （2）开启气瓶，使次级压力为0.2-0.3MPa之间；
第27卷第5期 唐山师范学院学报 2005年9月 Vol. 27 No.5 Journal of Tangshan Teachers College Sep. 2005 ────────── 收稿日期：2005-04-02 作者简介：孙继红（1969-），男，河北丰南人，唐山第九中学中教一级教师。 - 19 - 荧光分析技术新进展 孙继红1，钱丹青2 （1.唐山第九中学，河北 唐山 063000；2.唐山学院 机电系，河北 唐山 063000） 摘 要：荧光分析法因具有灵敏度高,线性范围宽等优点。综述了近年来荧光分析技术的发展情况，并对各种荧光分析新技术的特点和应用进行了归纳。 关键词：荧光分析；HPLC ；离子色谱 中图分类号：O657.3 文献标识码：B 文章编号：1009-9115（2005）05-0019-02 近年来荧光分析研究发展迅速，年文献量不断增加。主要应用领域有中西药、临床、生物大分子、食品营养和添加剂等试样。激光诱导荧光法诊断恶性肿瘤，显微荧光法研究药物与细胞的相互，DNA 编序及含量的荧光法测定均是目前受到关注的热点问题。 1 荧光分析新技术 近些年更多的研究者转向充分利用或开发仪器软件技术，以期提高发光分析的选择性和灵敏度，这方面年均论文数量增长了约两倍。刘绍璞先生等率先研究了分子二级散射光谱、共振荧光光谱、共振瑞利散射光谱的分析应用并取得了丰硕成果。郑飞跃等利用解卷积法、黄俊利用相调制技术研究了荧光寿命的测量。潘利华等[1-3]研究了激光诱导荧光寿命测量以及在稀土元素测定中的应用。其它关于金属配合物及镁、铝测定[4][5]及塑封料中铀的测定也有报道[6]。 导数光谱、多维光谱、偏振光谱、磁效应、时间分辨技术、恒能量、固定波长或可变角荧光法等，单独或几种方法的结合并借以化学计量学手段，在提高分析选择性方面具有很大的优越性，而且论文日趋增多，在医药临床、环境检测、石油勘探等领域得到广泛应用。吡哌酸的固体表面延迟荧光测定具有较好的灵敏度[7]。高灵敏检测器以及荧光成像技术对提高分析灵敏度、从有限样品中获取更丰富的化学信息显 示出大的威力。电感偶合检测器件（CCD ）[8-10]、增强型CCD （ICCD ）[11][12]结合毛细管电泳及激光诱导荧光技术，使得分析检出限显著降低。荧光成像技术[13]可望获得单细胞的化学信息。国外单细胞或单分子检测的研究非常活跃，而上述技术的联合应用对此是必不可少的。 荧光免疫及生化分析持续好的势头。赵启仁等[14]研究了铕标记抗癌胚抗原单克隆抗体C17的应用。周四元等[15]提出对氟苯酚2过氧化氢2辣根过氧化物酶体系酶联荧光免疫法，并用于人血清中乙肝表面抗原和表面抗体测定。姚凤姬等[16]用非标记铕络合物荧光免疫法测定了血清中金属硫蛋白。王敏灿等[17]合成了荧光免疫分析中增强22萘甲酰三氟 丙酮。李建中等用新合成的荧光标记试剂KLUK 标记靶细胞K562，采用时间分辨技术，测量了NK 细胞毒性，具有很好的应用前景。 2 荧光检测技术与其它仪器联用 荧光分析法因具有灵敏度高，线性范围宽等优点，愈来愈引起人们的重视，尤其是近年来激光、计算机、电子学等新技术的飞速发展，加速了荧光分光光度计与其它技术的结合而形成多种多样的新型荧光分析。 荧光分光光度计的联用技术与紫外可见分光光度计的联用技术有许多相似之处。首先它可以作为一种仪器的检测器，其次可以作为一个独立的主体与其它附件相连接，形成一种新的测试系统，最后它还可以与其它分析技术相结合构成一种新型的分析仪器。 2.1 荧光检测与HPLC 联用 液相色谱检测器种类很多，灵敏度较高、选择性较好的荧光检测器在进行微量分析中经常使用。如许多芳香族化合物如蒽、菲、芴等在特定条件下发出特征荧光，利用HPLC 的荧光检测器可以同时测定上述物质。Tanabe 等[18]设计一种供HPLC 用的多波长荧光检测系统，有4个干涉滤光片和光电倍增管通道;Gluckman 等[19]研制的荧光检测器，流通池为150μL ，可用于毛细管HPLC 和超临界色谱，其最小检测量为0.2pg 。 2.2 荧光检测与离子色谱联用 Mho 等人[20]研制一套供离子色谱用的双光束激光激发间接荧光检测器，它用具有荧光的淋洗离子维持恒定背景信号，当待测离子淋出时，信息观测信号减少。这种荧光检测器可以检测纳克级阴离子，方法灵敏度非常高。 2.3 激光光源引入荧光分光光度计 激光光源引入荧光计在我国开发较早，也是目前应用比较成熟的仪器之一，如测铀仪就是其中的代表[21]。时间分辨激光荧光分光光度计的研制成功，大大改善了荧光仪器的性能，这类仪器已广泛应用于环境监测、稀土分析、冶金、化
第四章原子吸收光谱法与原子荧光光谱法 4-1 . Mg原子的核外层电子31S0→31P1跃迁时吸收共振线的波长为285.21nm,计算在2500K 时其激发态和基态原子数之比. 解: Mg原子的电子跃迁由31S0→31P1 ,则 g i／g0=3 跃迁时共振吸收波长λ=285.21nm ΔEi=h×c／λ =（6.63×10-34）×（3×108）÷（285.31×10-9） =6.97×10-19J 激发态和基态原子数之比： Ni／N0＝（g i／g0）×e-ΔEi／kT 其中: g i／g0=3 ΔEi／kT=-6.97×10-19÷〔1.38×10-23×2500〕 代入上式得： Ni／N0＝5.0×10-9 4-2 .子吸收分光光度计单色器的倒线色散率为1.6nm／mm，欲测定Si251.61nm的吸收值，为了消除多重线Si251.43nm和Si251.92nm的干扰，应采取什么措施？ 答： 因为: S1 =W1/D = (251.61-251.43)/1.6 = 0.11mm S2 =W2/D =（251.92-251.61）/1.6 =0.19mm S1＜S2 所以应采用0.11mm的狭缝. 4-3 .原子吸收光谱产生原理，并比较与原子发射光谱有何不同。 答： 原子吸收光谱的产生：处于基态原子核外层电子，如果外界所提供特定能量（E）的光辐射恰好等于核外层电子基态与某一激发态（i）之间的能量差（ΔEi）时，核外层电子将吸收特征能量的光辐射有基态跃迁到相应激发态，从而产生原子吸收光谱。 原子吸收光谱与原子发射光谱的不同在于： 原子吸收光谱是处于基态原子核外层电子吸收特定的能量，而原子发射光谱是基态原子通过电、热或光致激光等激光光源作用获得能量；原子吸收光谱是电子从基态跃迁至激发态时所吸收的谱线，而原子发射光谱是电子从基态激发到激发态，再由激发态向基态跃迁所发射的谱线。
荧光光谱分析技术概述....................................................................................................................... 1荧光光谱分析原理.1 ................................................................................................................................... 4荧光分析法.2 ........................................................................................................................ 4定性分析法.2.1 4 ......................................................................................................................... 2.2定量分析法 荧光光谱分析原理1光谱法是辐射能与物质组成和结构的相光学分析法 分为光谱法和非光谱法，不涉及能级跃非光谱法不包含物质内能的变化，互作用，以光谱的出来为基础，迁，而是辐射方向和物理性质的改变。 光学分析方法分类 1表分析法特征具体方法 射线荧光光谱、分子荧X光谱法原子发射光谱、原子荧光光谱、光的发射光光谱、分子磷光光谱、化学发光、电子能谱、俄歇电子能谱射线原子吸收光谱、紫外-可见分光光度法、红外光谱、X光的吸收吸收光谱、核磁共振光谱、电子自旋共振光谱、光声光谱拉曼光谱光的散射 比浊法、散射浊度法光的散射非光谱法 折射法、干涉法光的折射 X射线衍射、电子衍射光的衍射 旋光色散法、偏振法、圆二向色法光的转动 , 光波愈短荧光发光机理可按量子理论通俗解释: 光具有波动、粒子二重性, 当某些物质受到紫外线或较短波长其光子能量愈强; 反之波长愈长其能量则弱。当, , 吸收了全部或部分光能量, 使其分子的能级升高而处于亚稳定状态光照射其中一部分化为热量, , 这些分子就会立即释放多余的能量恢复到稳定的基态时因为有部分能, 向基态跃迁时是以“光”形式释放而消失。但对某些物质而言, 光波愈, 量被消耗所以重新发出的光能量总比吸收的能量要小。由于能量愈小, , 所以物质所激发的荧光总比照射它的光波要长。磷光的能量较荧光还要小长, 这就是两者的区别。寿命可达数小时之久所以它的波长比荧光要长, , 如果物质的分子吸收了紫外和可见区电磁辐射后，它的电子能跃迁至激发本身又回复到基态如果吸收辐然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，态，再发射的波射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量， 长可以同分子所吸收的波长相同，也可以不同，这一现象称为光致发光。最常见的两种光致发光现象是荧光和磷光。这两种光致发光的机理不同，荧光发光过程 -3s-10s的时间间隔。而磷光则往往能延续10因在激发光停止后10s内停止发光，此，可通过测定发光寿命的长短来区分荧光和磷光。 一些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射(即发光)称之为荧光。可产生荧光的分子
原子荧光的测定与注意事项 【摘要】科学技术日新月异，在我国原子荧光法成为了新型监测手段，原子荧光法可以对日常生活中涉及到的无机元素进行有效监测。但在进行原子荧光法监测时往往会受到一些因素的影响，如电倍增管负高压、观测高度、空心阴极灯灯电流、载气流量、屏蔽气流量等，如果任何因素没有达到监测条件，都会影响原子荧光监测的数据。本文首先介绍原子荧光的定义，并提出原子荧光测定中选择最佳的工作参数。 【关键词】原子荧光测定选择最佳工作参数 【Abstract】Science and technology change rapidly, in our atomic fluorescence method has become a new monitoring means, atomic fluorescence spectrometry can be effective monitoring of the inorganic elements involved indaily life. But in atomic fluorescence spectrometry monitoring is often affected by some factors, such as the photomultiplier high voltage, observation height,hollow cathode lamp current, flow rate of carrier gas, the shielding gas flow rate, if any factors did not achieve monitoring conditions, will influence theatomic fluorescence monitoring data. This paper introduces the definition of atomic fluorescence, and puts forward the choice of the best work parametersin the determination of atomic fluorescence. 【Keywords】to select the optimum parameters were determined by atomic fluorescence 引言：近20年来，科学技术的进步发展提高了对无机元素监测的技术，作为新型监测分析技术原子荧光法，以其据对的优势提高了对无机元素的监测，同时选择最佳的工作参数能够为原子荧光测定精确性提供有利依据，主要涉及到原子荧光测定中空心阴极灯、观测高度、载气流量、屏蔽气的具体流量、选择其他条件以及最佳的氢化反应条件的参数选择。 一、原子荧光的定义 原子荧光法是测定无机元素的仪器，主要是对原子在跃迁返回基态时，发散出的荧光。通常原子吸收也可以检定原子在能级跃迁高能态时，吸收的能量，但原子荧光法较之原子吸收有更大的优势，其分析技术本身具备了原子吸收法和发射光谱法两种方法的优点。 作为新型监测分析手段，原子荧光法的基本原理是当原子受到特征波长的光照射时，处于基态的电子跃迁到激发态，被激发的原子由激发态回到基态时，其吸收的能量将以特征波长的荧光放出，测得无机元素的成分。通常原子荧光可以测定各类样品中汞、砷、锑、铋、硒、碲、铅、锡、锗、锌、镉等11种元素的痕量或超痕量分析。 二、原子荧光分析技术发展状况 原子荧光分析技术在20 世纪60 年代被提出并且获得了迅速的发展，直至80 年代痕量分析技术才逐渐开始得到应用。原子荧光在1956 年逐步开始对物理与化学过程进行研究，在火焰中提出了激发原子的分析方法，以及测量存在于火焰中的共振双线荧光量子效率试验的相关设备，并且预计了原子荧光分析技术在未来的化学工作中获得应用。美国研究者在1963 年提出并且证实了一种全新的原子荧光火焰分析方法，同时，有关研究人员对原子荧光分析技术实行了更加深入的研究与改进，从此以后，原子荧光分析法进入了非常迅速的发展时期，凭借着一种基于仪器分析的全新方法逐渐应用在各个领域的多种元素之中，特别是在具有挥发性元素工作中具有强大实力。近些年来原子荧光领域的研究与应用非常活跃，在实际工作中获得的很好的成绩。 原子荧光分析法将原子荧光作为重要基础，也就是原子蒸汽通过吸收一定的辐射波长从而被激发，之后受激原子经过去活化，最后发射出原子荧光。原子荧光分析法拥有极高的灵
原子荧光光谱仪 原子荧光光谱仪，测量元素的原子蒸气在辐射能激发下所发射的荧光强度，以测定物质成分中元素含量的仪器。 编辑摘要 由激发光源（高强度空心阴极灯或无极放电灯），原子化器，单色仪或用干涉滤光片配合使用“日盲”光电倍增管和光电检测系统组成。其原理是：分析试样在原子化器中转化为低能级的原子蒸气，吸收由一合适的激发光源发射出的同类原子特征光辐射后，一部分被激发至高能级，在跃迁至低能级的过程中，以辐射的形式释放出能量，形成原子荧光。原子荧光经光电检测系统转换为电信号被记录下来。原子荧光的强度与激发态的原子数有关，也即与试样中分析元素的浓度成正比。原子荧光光谱仪的优点是能同时测定多种元素,特别是As，Sb，Bi，Cd,Hg等元素。一般情况下，测定下限比原子吸收法低。在地质学中用于测定岩石、矿石和矿物中易挥发元素和硒、碲等元素。 原子荧光光谱仪- 原子荧光光谱仪-概述 atomic fluorescence spectrometry 利用原子荧光谱线的波长和强度进行物质的定性与定量分析的方法。原子蒸气吸收特征波长的辐射之后，原子激发到高能级，激发态原子接着以辐射方式去活化，由高能级跃迁到较低能级的过程中所发射的光称为原子荧光。当激发光源停止照射之后，发射荧光的过程随即停止。原子荧光可分为3类：即共振荧光、非共振荧光和敏化荧光，其中以共振原子荧光最强，在分析中应用最广。共振荧光是所发射的荧光和吸收的辐射波长相同。只有当基态是单一态，不存在中间能级，才能产生共振荧光。非共振荧光是激发态原子发射的荧光波长和吸收的辐射波长不相同。非共振荧光又可分为直跃线荧光、阶跃线荧光和反斯托克斯荧光。直跃线荧光是激发态原子由高能级跃迁到高于基态的亚稳能级所产生的荧光。阶跃线荧光是激发态原子先以非辐射方式去活化损失部分能量，回到较低的激发态，再以辐射方式去活化跃迁到基态所发射的荧光。直跃线和阶跃线荧光的波长都是比吸收辐射的波长要长。反斯托克斯荧光的特点是荧光波长比吸收光辐射的波长要短。敏化原子荧光是激发态原子通过碰撞将激发能转移给另一个原子使其激发，后者再以辐射方式去活化而发射的荧光。
氢化物（蒸气）发生 -原子荧光 原子荧光的发展史 ●原子荧光谱法(AFS)是原子光谱法中的一个重要分支。从其发光机理看属于一种原子发 射光谱(AES)，而基态原子的受激过程又与原子吸收(AAS)相同。因此可以认为AFS是AES和AAS两项技术的综合和发展，它兼具AES和AAS的优点。 ●1859年Kirchhoof研究太阳光谱时就开始了原子荧光理论的研究，1902年Wood等首 先观测到了钠的原子荧光，到20世纪20年代，研究原子荧光的人日益增多，发现了许多元素的原子荧光。用锂火焰来激发锂原子的荧光由BOGROS作过介绍，1912年WOOD 年用汞弧灯辐照汞蒸气观测汞的原子荧光。Nichols和Howes用火焰原子化器测到了钠、锂、锶、钡和钙的微弱原子荧光信号，Terenin研究了镉、铊、铅、铋、砷的原子荧光。 1934年Mitchll和Zemansky对早期原子荧光研究进行了概括性总结。1962年在第10次国际光谱学会议上，阿克玛德(Alkemade)介绍了原子荧光量子效率的测量方法，并予言这一方法可能用于元素分析。1964年威博尼尔明确提出火焰原子荧光光谱法可以作为一种化学分析方法，并且导出了原子荧光的基本方程式，进行了汞、锌和镉的原子荧光分析。 ●美国佛罗里达州立大学Winefodner教授研究组和英国伦敦帝国学院West教授研究 小组致力于原子荧光光谱理论和实验研究，完成了许多重要工作。 ● 20世纪70年代，我国一批专家学者致力于原子荧光的理论和应用研究。西北大学杜 文虎、上海冶金研究所、西北有色地质研究院郭小等均作出了贡献。尤其郭小伟致力于氢化物发生(HG)与原子荧光(AFS)的联用技术研究，取得了杰出成就，成为我国原子荧光商品仪器的奠基人，为原子荧光光谱法首先在我国的普及和推广打下了基础。 幻灯片3 国外AFS仪器发展史 ＊1971年Larkins用空心阴极灯作光源，火焰原子化器，采用泸光片分光，光电倍增管检测。测定了A u、B i、Co、H g、M g、N i 等20多种元素； ＊1976年Technicon公司推出了世界上第一台原子荧光光谱仪AFS-6。该仪器采用空心阴极灯作光源，同时测定6个元素，短脉冲供电，计算机作控制和数据处理。由于仪器造价高，灯寿命短，且多数被测元素的灵敏度不如AAS和ICP-AES，该仪器未能成批投产，被称之为短命的AFS-6。 ＊20世纪80年代初，美国Baird公司推出了AFS-2000型ICP-AFS仪器。该仪器采用脉冲空心阴极灯作光源，电感耦合等离子体(ICP)作原子化器，光电倍增管检测，12道同时测量，计算机控制和数据处理。该产品由于没有突出的特点，多道同时测定的折衷条件根本无法满足，性能/价格比差，在激烈的市场竞争中遭到无情的淘汰。 ＊20世纪90年代，英国PSA公司开始生产HG-AFS。
原子荧光形态分析仪技术参数 1、用途与要求 根据元素形态分析的特殊要求设计的一体化机，可实现对包括色谱泵、消解系统、蒸气发生和检测系统的统一协同自动控制。同时具备砷（As）、汞（Hg）、硒（Se）、锑（Sb）等元素形态分析功能和砷（As）、锑（Sb）、铋（Bi）、汞（Hg）、硒（Se）、碲（Te）锗（Ge）、锡（Sn）、铅（Pb）、锌（Zn）、镉（Cd）等元素的总量分析功能。 2、技术性能指标要求 2.1 内置式管内在线消解装置：全封闭一体化结构，管内在线消解，无需氧化剂，大大缩短管路，避免柱后峰形展宽，提高仪器分析性能。 2.2 气液分离装置：降低进入原子荧光检测器的水汽含量，提高分析灵敏度，降低噪声，降低检测限。 2.3 专用的液相色谱和氢化物发生原子荧光光谱仪接口：可以把柱后流出液和氢化物发生液体混合。 2.4 配接专用的液相色谱-原子荧光检测软件，可以实现连续的检测，实时采集数据，实现软件的统一协同自动控制。 2.5 数据处理也可以直接配接色谱工作站，具有谱图处理功能，操作简单方便。 2.6 可检测的砷形态 可定性定量检测： 砷酸盐[As(V)]、亚砷酸盐[As(III)]、一甲基砷酸[MMA(V)]、二甲基砷酸[DMA(V)]、砷甜菜碱(AsB)、砷胆碱(AsC)、饲料中的有机砷制剂(阿散酸p-ASA和洛克沙生Roxarsone） 可定性半定量检测： 一甲基亚砷酸[MMA(III)]、二甲基亚砷酸[DMA(III)]、二甲基砷酸的硫代物 可定性检测： 砷糖(AsS） 以上均须有使用该型号仪器实际分析样品图谱举例。 2.7 可检测的硒形态
可定性定量检测： 亚硒酸盐[Se(IV)]、硒酸盐[Se(VI)]、硒代胱氨酸(SeCys)、硒甲基硒代半胱氨酸(SeMeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet） 以上均须有使用该型号仪器实际分析样品图谱举例。 2.8 可检测的汞形态 可定性定量检测： 无机汞(Hg2+)、甲基汞(MetHg)、乙基汞(EtHg)、苯机汞(PhHg) 以上均须有使用该型号仪器实际分析样品图谱举例。 2.9可检测的锑形态 可定性定量检测： 锑酸盐[Sb(V)]、三价锑[Sb(III)] 以上均须有使用该型号仪器实际分析样品图谱举例。 2.10 技术指标 2.10.1、检出限： As（Ⅲ）＜0.04ng、DMA＜0.08 ng、MMA＜0.08 ng、As（Ⅴ）＜0.2 ng SeCys＜0.3 ng、SeMeCys＜1 ng、Se(IV) ＜0.1 ng、SeMet＜2 ng Hg(II) ＜0.05 ng、MeHg＜0.05 ng、EtHg＜0.05 ng、PhHg＜0.1 ng Sb(III) ＜0.1ng Sb(V) ＜0.5ng 2.10.2、精密度＜5% 2.10.3、线性范围三个数量级 2.10.4、相关系数：>0.999 3. 液相泵技术参数 3.1输送模式: 具有主动和辅助活塞的双柱塞输送泵，具有突出的流速稳定性； 3.2柱塞反冲: 虹吸自动冲洗； 3.3可更换泵头式设计，10ml与50ml泵头两种可选； 3.4.溶剂接触材料:宝石、PEEK和不锈钢； 3.5.流速范围: 10 ml 泵头0.001 –9.999 ml/min； 3.6.流量精度: <0.1%（1ml/min，12 MPa）；
原子荧光光谱法从机理看来属于发射光谱分析，但所用仪器及操作技术与原子吸收光谱法相近,上篇文章我们介绍论了原子吸收分光光度计的构造原理，这篇我们主要介绍原子荧光分光度计。 原子荧光光谱法是以原子在辐射能激发下发射的荧光强度进行定量分析的发射光谱分析法。根据荧光产生机理的不同，原子荧光的类型达到十余种，但在实际分析中主要有: 共振荧光 处于基态或低能态的原子, 吸收光源中的共振辐射跃迁到高能态, 处于高能态的原子在返回基态或相同低能态的过程中, 发射出与激发光源辐射相同波长的荧光,这种荧光称为共振荧光。 直跃线荧光
当处于基态的价电子受激跃迁至高能态(E2)，处于高能态的激发态电子在跃迁到低能态(E1)(但不是基态)所发射出的荧光被称为直跃线。 阶跃线荧光 当价电子从基态跃迁至高能态(E2)后, 由于受激碰撞损失部分能量而降至较低的能态(E1)。从较低能态(E1)回到基态(E0)时所发出的荧光称为阶跃线荧光。 热助阶跃线荧光
基态原子通过吸收光辐射跃迁至高能态(E2), 处于高能态的价电子在热能的作用下进一步激发, 电子跃迁至与能级E2相近的更高能态E3。当去激发至低能态(E1)(不是基态)时所发出的次级光被称为热助阶跃线荧光. 敏化荧光 当受激的第一种原子与第二种原子发生非弹性碰撞时, 可能把能量传给第二种原子, 从而使第二个原子被激发, 受激的第二种原子去激发过程中所产生的荧光叫敏化荧光.
原子吸收和原子荧光结构类似，也可以分成四部分：激发光源、原子化器、光学系统和检测器。
1、激发光源： 可用连续光源或锐线光源。常用的连续光源是氙弧灯，常用的锐线光源是高强度空心阴极灯、无极放电灯、激光等。连续光源稳定，操作简便，寿命长，能用于多元素同时分析，但检出限较差。锐线光源辐射强度高，稳定，可得到更好的检出限。 空心阴极灯-工作原理 空心阴极灯是一种特殊的低压放电现象，在阴阳两极之间加以300~500V的电压，这样两极之间形成一个电场，电子在电场中运动，并与周围充入的惰性气体分子发生碰撞, 使这些惰性气体电离。气体中的正离子高速移向阴极，阴极在高速离子碰撞的过程中溅射出阴极元素的基态原子，这些基态原子与周围的的离子发生碰撞被激发到激发态，这些被激发的高能态原子在返回基态的过程中会发射出该元素的特征谱线 . 空心阴极灯–特点 ?灯结构简单、空心阴极灯制作工艺成熟; ?工作性能稳定,寿命一般可以大于3000mA?h ,发光稳定性1小时漂移在±2%以内发射强度基本可以满足常规分析要求; ?对仪器的光源部分的电源无特别要求，也不需要其他辅助设施; ?价格便宜.
1.1 时间分辨荧光分析技术 时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。 本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。 1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质 稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。 1020 152530355 E N E R G Y ,103c m -1 6 H 5/2 G 5/2 6 H 15/2 7 F 0 F 2D 0 5D 1 7F 6 F 5 4 5D 3 13/2 4 9/2 Sm 3+ Eu 3+ Tb 3+ Dy 3+ H 9/2 图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图 Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions 大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物内由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。以铕(III)配合物为