硝酸还原酶的测定
试剂：1、亚硝酸钠标准液：称取分析纯NaNO2 0.1000g水溶后定容至100毫升，吸取5毫升用水稀释定容至1000毫升。
2、0.1mol/lpH7.5的磷酸缓冲液K2HPO419.24g，KH2PO42.2g，加水溶解后定容至1000毫升。
3、1% 对氨基苯磺酸溶液：称取1.0g加入25毫升浓盐酸中，用蒸馏水定容至100毫升。
4、0.2% α—萘胺溶液：称取0.2g α—萘胺溶于25毫升冰醋酸中，用蒸馏水定容至100毫升。
5、30%三氯乙酸溶液：75.0g三氯乙酸，水溶后定容至250毫升。
6、KNO3·异丙醇·磷酸缓冲液混合液：称3.03g KNO3溶于300毫升0.1mol/l 的磷酸缓冲液中，再加3毫升异丙醇混匀。
方法
1、标准曲线的制作：取7支干洁的15毫升刻度试管按下表顺序加试剂，摇匀
蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 摇匀
4 4 4 4 4 4 4 摇匀1% 对氨基苯磺
酸
4 4 4 4 4 4 4 摇匀0.2% α—萘胺
溶液
每管含亚硝酸态0 0.2 0.1 0.8 1.2 1.3 2.0
2、酶反应和酶活性测定：
①取样：将材料洗净，用蒸馏水冲洗，滤纸吸干，剪成0.5-1.0平方厘米的小块，混匀后每个样品称0.5-1.0克3份，放入试管并编号。
②反应：向各试管中加入KNO3·异丙醇·磷酸缓冲液混合液9毫升，其中一管立即加1毫升30%三氯乙酸溶液，混匀（作对照）。然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气，反复几次直至叶片沉在管底。将各试管置30度下于黑暗中保温30分钟，分别向处理管加1毫升30%三氯乙酸溶液，摇匀终止酶活性。
③：比色：将各试管静止2分钟吸取上清液2毫升加入另一组试管，分别加入1% 对氨基苯磺酸溶液4毫升和0.2% α—萘胺溶液4毫升，摇匀显色30分钟，以对照为空白，在540nm波长比色，并计算酶活性。
酶活性（Nμg·g-1FW·h-1）=标准曲线查得值（μg）*分取倍数/ 样重（g）/时间（h）
实验9 硝酸还原酶活性的测定 一、目的 学会植物组织中硝酸还原酶活性的测定方法。 二、材料用具及仪器药品 木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、洗耳球 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）、0.2mol/L KNO3）；磺胺试剂、a-苯胺试剂，NaNO2 标准溶液： a—萘胺试剂配制：0.2克a—萘胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。 磺胺试剂配制：取1克磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml. NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解，定量至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水定量至1000ml，该溶液每ml含有NaNO25ug，用时稀释之。 磷酸缓冲液： 贮备液A：0.2mol/L NaH2PO4溶液（27.8g NaH2PO4·H2O配成1000ml）。 贮备液B：0.2 mol/L Na2HPO4溶液（53.65g Na2HPO4·7H2O或Na2HPO4·12H2O 配成1000ml）取A液16ml+B液84ml，用水稀释至200ml 三、原理 硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于NO—3还原于NO—2 NO—3+NADH+NO—2+NAD++H2O 产生的NO-2可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2的含量的高低，即表明酶活性的大小。 NO-2含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺sulfanil—amide）比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO2。 四、方法步骤 1．将新鲜叶片（蓖麻、烟草、木茨叶等）水洗，用吸水纸吸干水分，然后用1cm的钻孔器钻取的圆片，在天平上称取等量的叶圆片两份，每份0.5克，（或每份取50个叶圆片），分别置于含有下列溶液的三角瓶中，（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml。（2）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，叶圆片即沉于溶液中，（如果没有真空瓶，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器内,，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使之真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使叶圆片中的空气抽去，并沉于溶液中），将三角瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml，以测定NO-2含量。 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可在反应溶液中加入30μmol/L 的 3—磷酸甘油醛或1.6——二磷酸果糖，能显著增加NO-2的产生。 2．NO-2含量的测定 保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，先加入磺胺试剂2ml，后加入一
一、实验目的和要求 掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。 二、实验内容和原理 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸 盐： 产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定NO2-含量的增加，即表示该酶活性的大小。 NO2-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）反应产生重氮，再与α–萘胺（或萘基乙烯二胺）偶联形成紫红色的偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定，利用标准曲线确定溶液中NO2-含量。 三、主要仪器设备 1、实验仪器分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。 2、实验试剂0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液 3、实验材料在15-25℃蒸馏水培养一周的大麦苗两组，一组加KNO3，一组加NH4Cl，在白天置光照下处理。 四、操作方法和实验步骤 1、剪取新鲜的叶片两组，一组是处理苗0.51g，另一组是对照苗0.50g，叶片各剪为0.5~1cm的碎片，压实。 2、两组中各加入15ml的酶促反应液。 3、真空抽取10min，充分交换细胞内外液。 4、加盖在30℃的保温箱中保温20min。 5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。 6、比色：在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 7、空白管：4mlH2O +磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml 室温放置15min同样在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 五、实验数据记录和处理 称重：处理苗0.51g；对照苗0.50g OD值：处理苗0.513A；对照苗0.050A NO2- 含量标准曲线：Y=257.29X-4.8262（X=OD值；Y=NO2含量（nmol）） 有标准曲线得出NO2-的含量：处理苗：C NO2-=127.16nmol 对照苗：C NO2-=8.038nmlo 硝酸还原酶活力(nmol NO2-·g-1·h-1)= 根据OD值从标准曲线上查得的NO2（nmol）×3 ×15/4/m 硝酸还原酶活力：处理苗=2805 nmol NO2-·g-1·h-1对照苗=180.855 nmol NO2-·g-1·h-1 六、实验结果与分析
首都师范大学生命科学学院实验报告 实验题目硝酸还原酶活性的测定 一、实验原理 硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于 NO 使之还原为 NO 。 NO -+ NADH + H + — NO 2- + NAD + + H 2O 产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。 NO 含量的测定----磺胺法 NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。 —、实验用品 1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗 2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤 1. 分别配制反应液于小烧杯中 (1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml (2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2- 的获得 (1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。 (2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气， 内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。 3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。 4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。 5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓 度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。 课程名称植物生理实验 实验时间2010331 成绩 姓名唐倪文 班级_3 学号 1090800032 NaNO 浓度为横坐标。具
硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒使用说明 可见分光光度法50管/24样产品简介： NR（EC1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。 NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ+NADH+H＋→NO2ˉ+NAD＋+H2O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体20mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂五：标准储备液1mL，-20℃保存。 诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL 蒸馏水，充分混匀。
0.1umol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取0.1ml试剂五加9.9mL 蒸馏水，充分混匀。 操作步骤： 一、样品测定的前处理： 1、取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30min，取出样本，滤纸吸干。（根据需要进行诱导处理） 2、称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴研磨，4000g，4℃离心10min，取上清冰上放置待测。 二、NR测定操作： 1，分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 2，样本测定（在EP管中加入下列试剂） 试剂名称（μL）测定管对照管标准管空白管 样本100100 0.1μmol/mL NaNO2100 双蒸水500100 试剂一375375375 试剂二125125125 混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃(其他物种）水浴30min 试剂三250250250250 试剂四250250250250 混匀，显色20min，4000g常温离心10min，取上清，540nm下比色。
硝酸还原酶的测定方法 硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮简单易行，在一般条件下都能做到。红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。仪器药品721型分光光度计真空泵（或注射器）保温箱天平真空干燥器钻孔器三角烧瓶移液管烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml 蒸馏水器中。磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水器稀释至100ml。α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水器中，稀释至100ml。NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水器溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。操作步骤 1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测 3. ．绘制标准曲线与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水俗中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线。实验作业1．试比较不同植物的酶活性。2．试比较取样前植物处于照光或黑暗条件下酶活性的不同。参考文献1．陈薇、张德颐：1980。植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化，植物生理学通讯，1980(4)：45—49。2．周树、郑相穆：1985。硝酸还原酶体内分析方法的探讨，植物生理学通讯，1985(1)：47—49。3．Hageman,R.H.and D.P. ．Hucklesby:1971.Methods in Enzymology,23A:491—503. 4．Radin.J.W.:1973.Plant Physiology,51:332—336. 5．Snell,F.D.and C.T.Snell:1949.Colorimetric Methods of Analysis,Vol.II,802—807 （华东师范大学张志良）参考资料：硝酸还原酶活性的测定一、材料用具及仪器药品木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、
实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定 一、硝酸还原酶的测定 [原理]： 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 [试剂] 1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml； 3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）； 4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中； 5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中； 6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中； 7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。 [方法]； 摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。 2.样品中硝酸还原酶活力测定 1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。 2.称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm 左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中 1份作对照，另外2份作酶活性测定用。 3.反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml 0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再 抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。
货号：QS1800 规格：50管/24样硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒说明书 分光光度法 正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。 测定原理： O；产生的亚硝酸NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +N AD＋ +H 2 盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α- 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：液体4mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存，（如出现结晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）； 试剂四：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂五：标准储备液1mL，-20℃保存。 诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL 蒸馏水，充分混匀。 0.1μmol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取 0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。 样品测定的前处理： 组织的前处理： （1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30min，取出样本，滤纸吸干。（一般不要诱导处理，预测定结果没有活性则需要诱导处理） （2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 细菌或培养细胞的前处理： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 第1页，共2页
首都师范大学生命科学学院实验报告 课程名称植物生理实验实验时间2010.3.31 成绩 姓名唐倪文班级3 学号1090800032 实验题目硝酸还原酶活性的测定 一、实验原理 硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于NO 3 -使之还原为 NO 2 -。 NO 3- + NADH++ H+ → NO 2 -+ NAD++ H 2 O 产生的NO 2 -可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。因此，测定反 应液中NO 2 -含量的增加即表明酶活性的大小。 NO 2 -含量的测定----磺胺法 NO 2 -与磺胺和 -萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm下读取光密度值。 二、实验用品 1.材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗 2.仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液枪，tip头（两种规格：1000μl，200μl） 三、实验步骤 1.分别配制反应液于小烧杯中 (1)0.1M磷酸缓冲液5ml + 蒸馏水5ml (2)0.1M磷酸缓冲液5ml + 0.2MKNO 3 5ml 2. NO 2 -的获得 (1)称取新鲜叶片0.5g共四份,剪成小片,分别置于小烧杯内的反应液中。 (2)在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部,溶液即可渗入组织内取代其 中的空气,内部产生的NO 2 -可渗透到外部溶液中。 3.将小烧杯转到30℃温箱,使其不见光,保温20min。 4.用5μg/ml NaNO 2 母液配制标准梯度溶液5、4 、 3 、 2 、 1 、 0.5 、0.1、0 μg/ml。 5.吸取不同浓度的NaNO 2 1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α-萘胺试剂2ml，混合均匀，在60℃水浴中保温20min，于比色杯中，在520nm下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度—浓度曲线，以光密度为纵坐标，NaNO 2 浓度为横坐标。具体步骤及结果如下表和下图所示。
硝酸还原酶的测定 一、实验目的和要求 掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。 二、实验内容和原理 硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐: --产生的NO可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定NO含量的增加，即表示该酶活22 性的大小。 装 -NO含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸(或对–氨基苯磺酰2 订 胺)反应产生重氮，再与α–萘胺(或萘基乙烯二胺)偶联形成紫红色的偶氮化合物。生成的红色偶氮 线化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定，利用标准曲线确定溶液中NO2-含量。三、主要仪器设备 1、实验仪器分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。 2、实验试剂 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液 3、实验材料在15-25? 蒸馏水培养一周的大麦苗两组，一组加KNO3，一组加NH4Cl，在白天置光照下处理。 四、操作方法和实验步骤
、剪取新鲜的叶片两组，一组是处理苗0.51g，另一组是对照苗0.50g，叶片各剪为0.5~1cm的碎片，压1 实。 2、两组中各加入15ml的酶促反应液。 3、真空抽取10min，充分交换细胞内外液。 4、加盖在30?的保温箱中保温20min。 5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。 6、比色:在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 7、空白管:4mlH2O +磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml ,室温放置15min同样在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 五、实验数据记录和处理 称重: 处理苗0.51g;对照苗0.50g OD值:处理苗0.513A;对照苗0.050A - NO含量标准曲线:Y=257.29X- 4.8262(X=OD值;Y=NO2含量(nmol)) 2---有标准曲线得出NO的含量:处理苗:C NO=127.16nmol 对照苗:C NO=8.038nmlo 222--1-1硝酸还原酶活力(nmol NO?g?h)= 根据OD值从标准曲线上查得的NO2(nmol)× 3 × 15/4/m2 -1-1-1-1 --硝酸还原酶活力:处理苗=2805 nmol NO?g?h 对照苗=180.855 nmol NO?g?h22 六、实验结果与分析 1、实验结果分析:实验表明用硝酸钾处理的苗比用氯化铵处理的苗硝酸还原酶活力更强～而且根据测出 的亚硝酸的含量～处理苗是对照苗的10倍左右～远比旁边几组的高～因为可能是因为在取材的时候～取了粘有培养液的根部～但并没有用蒸馏水洗去吸附在上面的硝酸根、亚硝酸根～或者根部的硝酸还原酶活性更多,猜测,。 2、诱导时如用NaNO3 替代KNO3结果会如何，为什么,
第33卷第4期2010年7月 河北农业大学学报 J OU RNAL OF AGRICU LTU RAL UNIVERSITY OF H EBEI Vol.33No.4 Jul.2010 文章编号:1000-1573(2010)04-0001-04 棉花叶片硝酸还原酶活性的测定方法 刘洁,王省芬,张桂寅,吴立强, 李志坤,马峙英 (华北作物种质资源研究与利用省部共建实验室,河北省作物种质资源重点实验室,河北农业大学,河北保定071001) 摘要:本研究应用磺胺比色法测定棉花叶片硝酸还原酶活性(NR A),探讨了体内法测定棉花叶片NR A的最适条件。通过分析比较硝酸盐诱导、2,4-二硝基苯酚、三氯乙酸及煮沸等因素对N RA测定结果的影响,建立了体内法测定棉花叶片N RA的最佳条件,即用50mmol/L的KN O3溶液诱导棉花叶片48h、抽气前后分别加入2,4-二硝基苯酚和1,6-二磷酸果糖、暗保温35min后煮沸10min可以使N RA的活性达到最高。棉花叶片N RA测定方法的建立为进一步研究棉花的氮素代谢奠定了基础。 关键词:棉花;硝酸还原酶;酶活性测定 中图分类号:S562文献标志码:A Determination method of nitrate reductase activity in cotton leaves LIU Jie,WAN G Xin g-fen,ZHAN G Gu-i yin,WU L-i qian g, LI Zh-i kun,MA Zh-i ying (No rth China Key Labor ator y fo r Cro p G ermplasm Resources of M inistry of Educatio n,Key L abo rato ry o f Crop Ger mplasm Reso urces o f Hebei,Ag r icultural U niversit y of H ebei,Baoding071001,China) Abstract:T he method o f sulfonam ides color im etry w as used to deter mine the nitr ate reductase activity(NRA)in cotto n leaves.T he optim um factors fo r determ inatio n of NRA in cotton leav es by in vivo method w ere discussed.Thro ug h com parativ e analysis of several m ain factors of in vivo method such as nitrate induction,2,4-dinitr opheno l,3-chlor oactic acid and boiling etc.,the optimum condition w as identified for deter mination metho d o f NRA in co tto n leaves. The induction o f50mm ol/L KN O3solutio n fo r48h,appendment of2,4-dinitrophenol befo re elicitting air and of1,6-dipho sphate fructose after elicitting air,boiling10min after incubated fo r35m in at30e in the dark could o btain the highest NR activity.T he results sho w ed that in vivo method w as r eliable and easy to determine the NR activity of co tton leaves,and this meth-od lays the foundatio n fo r further study on nitro gen metabolism of co tton. Key words:cotton;nitr ate reductase;determination of enzym e activity 硝酸盐是植物重要的氮素来源,在其代谢过程中通过硝酸还原酶的作用转变为亚硝酸盐,然后再通过亚硝酸还原酶的作用转变成氮循环的重要原料-铵。植物吸收利用环境中的NO3-,需经过2个 1收稿日期:2010-05-01 基金项目:河北省科技支撑计划重大项目(06220113D);河北省自然科学基金重大项目(C2006001034).作者简介:刘洁(1984-),女,河北省廊坊市人,在读硕士生,主要从事分子遗传及其育种应用研究. 通讯作者:马峙英,教授,主要从事棉花育种研究.E-mail:mzhy@https://www.doczj.com/doc/cc16970576.html,
实验 6 植物体内硝酸还原酶活力的测定 硝酸还原酶（ nitrate reductase,NR ），是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐（ NO 3 ˉ +NADH+H ＋→ NO 2 ˉ +NAD ＋ +H 2 O ）。产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）及α - 萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下： 生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以 N μg ／（ g · h ）为单位。 NR 的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 Ⅰ离体法 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 水稻、小麦叶片、幼穗等。 （二）试剂 1 ．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO 2 0.9857 g 溶于无离子水后定容至 1000 mL ，然后再吸取 5 mL 定容至 1000 mL ，即为含亚硝态氮的 1 μg ／ mL 的标准液。 2 ． 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸缓冲液： Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 30.0905 g 与 NaH 2 PO 4 · 2H 2 O 2.4965 g 加无离子水溶解后定容至 1000 mL 。 3 ． 1 ％磺胺溶液： 1.0 g 磺胺溶于 100 mL 3mol/L HCl 中（ 25 mL 浓盐酸加水定容至 100 mL 即为 3 mol/L HCl ）。 4 ． 0.02 ％萘基乙烯胺溶液： 0.0200 g 萘基乙烯胺溶于 100 mL 无离子水中，贮于棕色瓶中。
硝酸还原酶活力的测定 一、试剂： （1）亚硝态氮标准溶液 称取1 g分析纯NaNO2溶于无离子水并定容至1000mL，然后再吸取 1mL定容至1000mL,即为1μg/mL亚硝态氮的标准液。 （2）0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液 称取30.0905 g Na2HPO4·12H2O与2.4965 g NaH2PO4·2H2O，加无离子水溶解后定容至1000mL。 （3）10 g/L磺胺溶液 称取1.00 g磺胺溶于100mL 3mol/L HCl中（取25mL浓盐酸加无离子水定容至100mL，即为3mol/L HCl）。 （4）0.2 g/L萘基乙烯胺溶液 称取0.0200 g 萘基乙烯胺溶于100mL无离子水中，贮于棕色瓶中。（5）0.1mol/L KNO3溶液 称取2.5275 g KNO3溶于250mL 0.1mol/L pH 7.5的磷酸缓冲液。（6）0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液 称取8.864 g Na2HPO4·12H2O和0.057 g K2HPO4·3H2O，溶于1000mL 无离子水中。 （7）提取缓冲液 称取0.1211 g半胱氨酸和0.0372 g EDTA，溶于100mL 0.025mol/L pH 8.7的磷酸缓冲液。 （8）2 mg/mL NADH溶液
称取2 mg NADH溶于1mL 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液(临用前配制)。 二．实验步骤 （一）标准曲线制作 取7支15mL干净的试管按表1顺序加入试剂，配成每管含0~2.0μg 亚硝态氮的系列标准溶液，摇匀后在25℃下保温30 min，然后在540nm下比色测定，以每管中亚硝态氮的量（μg）为横坐标（x），吸光度值（y）为纵坐标绘制标准曲线或建立回归方程。 （二）硝酸还原酶活力测定 1.酶液提取 取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加4mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,4000r/min离心15min,上清液即为粗酶提取液 2.酶反应 取粗酶液0.4mL加入10mL试管中，再加入1.2mL 0.1mol/L KNO3磷
硝酸还原酶(NR)提取液 简介： 硝酸还原酶(Nitrate reductase，NR)是一种氧化还原酶，可分为参与硝酸盐同化的同化型还原酶和催化以硝酸盐为活体氧化的最终电子受休的硝酸盐呼吸异化型(呼吸型)还原酶。硝酸还原酶是植物氮素代谢中氮素同化的关键酶，该酶与作物吸收利用氮肥有关，对作物的产量和质量有影响，因此可以把硝酸还原酶的活力当作营养诊断养、农田施肥或作物育种的生理生化指标。 Leagene 硝酸还原酶(NR)提取液主要用于裂解植物组织，提取样品中的丙酮酸脱羧酶。该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、蒸馏水 2、离心管或试管 3、匀浆器或研钵 4、低温离心机 操作步骤(仅供参考)： 1、取植物组织清洗干净，切碎，置于冰箱。 2、配制硝酸还原酶提取工作液：取出硝酸还原酶提取液液和PMSF，恢复至室温，混合，混匀，即配即用，不易久置，否则蛋白酶抑制剂PMSF 的效率会有所下降。 3、加入预冷的硝酸还原酶提取工作液，冰浴情况下充分匀浆或研磨。 4、离心，留取上清液即为硝酸还原酶粗提液，保存，用于硝酸还原酶的检测或其他用途。计算： 组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100% 注意事项：编号 名称CS0471 Storage 试剂(A):硝酸还原酶提取液500ml 4℃避光试剂(B):PMSF 1ml -20℃使用说明书1份
1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即使用，应存于-20-80℃。 2、硝酸还原酶容易失活，提取和测定时均应操作迅速，尽量在4℃操作。 3、如果测定植物样本，取样最好在晴天进行，最好提前一天施些硝态氮肥，取样部位应 一致。 4、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。 5、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用丙酮酸脱羧酶提取工作液稀释样品后重新测 定。 6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效。 相关： 编号名称 CS0001ACK红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer) DC0032Masson三色染色液 DF0135多聚甲醛溶液(4%PFA) NR0001DEPC处理水(0.1%) NR0002Trizol(总RNA提取试剂) PS0013RIPA裂解液(强) TC1167植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法)
土壤硝酸还原酶测定（专用）关松荫 酚二磺酸比色法—Sunny Zhao 1 方法原理 在硝酸还原酶和亚硝酸还原酶的作用下，土壤中硝态氮可还原成氨。测定土壤中这些酶的活性可了解土壤氮素转化中脱氨作用的强度。另外，硝酸还原酶还参与土壤中铁的还原作用。 土壤硝酸还原酶的活性测定方法的基本原理：硝酸盐在硝酸还原酶、亚硝酸还原酶和羟氨还原酶的催化作用下转化成氨，反应前后硝态氮的变化反应土壤硝酸还原酶的活性，硝态氮的变化可用酚二磺酸比色法测定。 2 试剂和材料 2.1 硝酸钾溶液[p KNO3=1 g/100 ml]：10.0 g分析纯KNO3溶于去离子水，稀释至1 L。 2.2 葡萄糖溶液[p C6H12O6=1 g/100 ml]：10.0 g分析纯葡萄糖溶于去离子水中，稀释至1 L。 2.3 CaCO3 2.4 铝钾矾[AlK(S04)2]饱和溶液。参考：（即明矾，不过明矾带12个结晶水，）明矾在20℃时溶解度是114 g/L。 2.5 酚二磺酸溶液：取3 g重蒸酚与20.1 ml浓硫酸混合，在沸水浴中加热回流6 h。（若无发烟硫酸，可用苯酚25.0 g，加浓硫酸225 ml，沸水浴加热6 h配成。试剂冷后可能析出结晶，用时必须重新加热溶解，但不可加水，试剂必须贮于密闭的玻璃棕色瓶中，严防吸湿。） 2.6 NaOH 溶液[p(NaOH)=10 g/100 ml]：50 g分析纯NaOH溶于去离子水，稀释至500 ml。 2.7 硝酸钾标准溶液[p（KNO3）=0.1 mg/ml]：精准称取分析纯KNO3 0.3258 g 溶于1 L水中，（1 L水中含有200 mg NO3-N即为0.2 mg/ml）。使用前将溶液稀释至0.1 mg/ml NO3-N。 标准曲线：吸取50.00 ml KNO3标准溶液于100 ml三角瓶中，在沸水浴上蒸干（或者烘干），残渣用2 ml酚二磺酸溶液处理10 min。加去离子水定容至500 ml，其NO3-N浓度为0.01 mg/ml。从其中分别吸收0，1.00，3.00，5.00，7.00，
活体法测定植物硝酸还原酶活性 一、试剂 1、亚硝酸钠标准液：称取分析纯NaNO20.1000g 溶于水，然后用蒸馏水定容至100ml 然后吸取5ml上述溶液，定容到1000ml，即为每ml含NaNO25ｕg 的标准液。 2、0.1mol/L的磷酸缓冲液：称取K2HPO4 19.24g, KH2PO4 2.2g，用水溶解后，用蒸馏水定容到1000ml。 3、1%的磺胺：1.0g 磺胺溶于25ml 浓HCL中，用蒸馏水定容到100ml。 4、0.2%的α-萘胺：称取0.2g萘胺溶于25ml冰醋酸中，用蒸馏水定容到100ml。 5、30%的三氯乙酸：75.0g三氯乙酸定容到250ml 6、KNO3(0.1mol/L)异丙醇（1%V/V）磷酸缓冲液（0.1mol/L）混合液：称取3.03g KNO3溶于300ml 0.1mol/L的磷酸缓冲液中，再加3ml 异丙醇混匀。 二、步骤 1、标准曲线制作 取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表加试剂，即配成系列标准液，摇匀后在30℃保温箱中或水浴中保温30分钟，然后在540nm比色，以亚硝态氮（μg）为 （1）取样：取叶片，用水洗净，再用蒸馏水冲洗，用滤纸吸干，剪碎混匀，称取0.5g，放入试管。 （2）反应：加混合液9ml，其中一管加1ml三氯乙酸做对照，放入真空泵中反复抽气，直至叶片沉至管底，将各试管置于30℃暗处保温30分钟，分别加1ml 三氯乙酸，摇匀终止酶反应。 （3）比色：静置2分钟，然后吸取上清液2ml，加4ml磺胺试剂，4ml萘胺试剂，摇匀后静置30分钟，然后在540nm处比色。 三、计算 样品中酶活性（μg·g-1·h-1）=C×V1/V2 W×t C——反应液催化产生的亚硝态氮总量（μg ）由曲线查得 V1——提取酶液时加入的混合液体积（ml） V2——酶反应时加入的粗酶液体积（ml） W——样品重 t——反应时间（h）
实验三：硝酸还原酶（NR）活性测定 一、实验目的 了解硝酸还原酶的活性测定的原理，掌握活体测定硝酸还原酶地方法 二、实验原理 硝酸还原酶是植物氮元素代谢过程中的关键酶，于作物的吸收和利用氮元素有关，他们作用于硝酸根，使之还原为亚硝酸根根：NO3-+NADH++H+ NR NO2-+NAD++H2O产生的亚硝酸根可以从组织内渗入到外界溶液中，从而测定溶液中亚硝酸根的含量的增加即为NR活性大小测定时间磺胺与亚硝酸钠形成重氮盐，再与α-奈氨偶联形成紫色物质。反应液的酸度和温度都会对反应产生影响。 三、试剂与器材 1、材料：小白菜叶片 2、试剂：0.1mol/L ph7.5磷酸缓冲液，磺胺试剂、α-奈氨、0.2mol/LKNO 3、 NaNO2标准溶液 3、器材：分光光度计、注射器、试管、天平、烧杯、移液管、恒温箱 四、实验步骤 1、按下列表格配置不同浓度的NaNO2溶液
2、另取7支试管编号，取上述配置好的溶液各1ml，分别加入磺胺2ml、α- 奈氨2ml摇匀静置30min，在520nm处比色以NaNO2终浓度为横坐标绘制标准曲线 3、将小白菜叶片剪成0.5cm2大小称取两分，每份各0.5g放入另个烧杯中， 一个烧杯中加入0.1ml/L磷酸缓冲液5ml再加入蒸馏水5ml，作为对照组。 林一个烧杯中加入0.1mol/L磷酸缓冲液5ml和0.2mol/LKNO3溶液5ml作为实验组。将材料与溶液混合置于射器中抽气至材料沉入溶液。 4、将含材料的烧杯置于30℃恒温箱中30min，之后分别取1ml溶液按第二 步进行NO2-含量测定 5、结果分析：酶活性（NO2- μg g-1h-1）=（实验组NO2-含量-对照组NO2-含量） /材料重量（g）/时间（h） 五、实验结果
实验5 硝酸还原酶活性的测定 【实验目的】 掌握硝酸还原酶活性测定的两种方法，加深对硝酸还原酶在植物体氮素代谢中作用的理解。 【实验原理】 硝酸还原酶（nitrate reductase,NR）是植物氮素同化的关键酶，它 催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，（NO 3-+NADH + H+→NO 2 -+NAD ++H 2 O）。 产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（or 对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（or 萘基乙烯二胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。其反应如下： 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般单位鲜重以Nμg/（g﹒h）为单位。 NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 Ⅰ离体法 【材料设备】 （三）试剂 1、NaNO 2标准溶液：准确称取分析纯NaNO 2 0.1g溶于无离子水后定 容至100ml，然后再吸取1ml用蒸馏水稀释成1000ml，该溶液每毫升含有NaNO 2 1μg，用时稀释之。
2、0.1mol/L PH7.5的磷酸缓冲液，Na 2HPO 4 ·12H 2 O 30.0905g与 NaH 2PO 4 ·2H 2 O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000mL。 3、1%（m/V）对氨基苯磺酸（磺胺酸）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶 于100ml 3 mol/L的HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol/LHCL）。 4、0.02%（m/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100mL 去离子水中，贮于棕色瓶中。 5、0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L Ph7.5的磷酸缓冲液中. 6、0.025mol/L Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.8640g Na 2HPO 4 ·12H 2 O， 0.0570g KH 2PO 4 .3H 2 O，溶于1 000ml去离子水中。 7、提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸，0.0372gEDTA溶于100mL0.025 mol/L pH7.8的磷酸缓冲液中。 8、2mg/mL的NADH溶液：2mg NADH溶于1mL 0.1 mol/L pH7.5磷酸缓冲液中（临用前配制，低温保存） 【实验步骤】 Ⅱ活体法 【材料设备】 （一）实验材料 丹参、银杏、黄芩…… （二）仪器设备 真空抽气泵，抽气用真空干燥器，小烧杯，玻璃瓶塞，其它用具同“离体法” （三）试剂 1、亚硝酸钠标准液（同离体法） 2、0.1mol/L KNO3溶液 3、1%对氨基苯磺酸溶液 4、0.02%（m/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100mL 去离子水中，贮于棕色瓶中。