2011届本科生毕业论文 题目芦丁的提取分离及鉴定作者单位陇东学院化学化工学院指导老师胡浩斌 作者姓名张娜娜 专业班级2007级化学本科(2)班提交时间二〇一一年四月
2011届本科生毕业论文 芦丁的提取分离及鉴定 张娜娜，胡浩斌 （陇东学院化学化工学院，甘肃庆阳745000）摘要：目的以芦丁为例学习黄酮类化合物的提取方法，掌握黄酮类成分的主要性质及黄酮甙，甙元和糖的部分鉴定方法。方法采用水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法对芦丁进行提取分离，并对其进行定性分析及色谱鉴定。结果水提法、碱水(石灰水) 提取法、有机溶剂(乙醇) 回流法，三种方法均可制的芦丁，且质量合格。结论从提高芦丁产率和纯度的角度出发，乙醇回流是较理想的提取方法。制得芦丁产率高，且测定方法简单、迅速、灵敏度高。 关键词：槐花米；芦丁；槲皮素；提取；分离；鉴定 Extraction, Seperation and Identification of Rutin Zhang Nana, Hu Haobin (College of Chemistry and Chemical Engineering, Longdong University, Qingyang 745000, Gansu) Abstraction: Objection Rutin as an example to learn the extraction of flavonoids square. Grasp the main properties and flavonoids ingredients flavonoids glucoside. Method W ith the water extraction method, buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) extraction to extraction and separation of rutin and chromatographic identification. Result With water formulation,Buck (limewater) extraction,organic solvent (alcohol) method of extraction rutin backflow separation,three methods are made rutin and obtaining rutin quality qualified. Conclusion From improve yield and purity of rutin angle, ethanol refluxing was ideal extraction method. Preparation of rutin of high yield,high sensitivity. determination method is simple to rutin rapid. Key word: Sophora japonica; rutin; quercetin; extraction; separation; identification 引言 随着人们生活水平及质量的不断提高，心脑血管病的发病率也呈上升趋势，而且死亡率居各种疾病之首，因此，对治疗和预防心脑血管病的药品与保健品的开发研究就显得尤为重要， 1
槐花米中芦丁的提取与鉴定 背景知识 芦丁（Rutin）又称芸香苷，广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica L 的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高(含量可达12-16%)，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水形成的苷。 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有3分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10 000；沸水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液，酸化后又可析出，因此，本实验采用碱提取酸沉淀法提取芦丁。 芦丁具有维生素P样作用。能维持血管的正常通透性，减低血管的脆性，缩短流血时间，可作为高血压病的辅助治疗剂。亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。
一、实验目的 通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作；熟悉芦丁、槲皮素的结构性质和检识方法。 二、实验要求 独立完成实验，从槐花米中提取出芦丁并进行鉴定。 三、实验原理 芦丁属黄酮类化合物，分子中有较多酚羟基，具弱酸性，易溶于热碱中，酸化后又析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁，又利用芦丁在冷水和热水中溶解度相差较大的特性进行重结晶精制。 四、实验材料和器皿 【器皿】 烧杯（500ml）2个，试管2个，布氏漏斗1个，玻璃棒1根，抽滤瓶1个，滴管，移液管（10ml）1根，洗耳球1个，滤纸，pH试纸，电热炉，真空抽滤机。 【材料】 槐米花30 g，饱和石灰水，0.4%硼砂水溶液，镁粉，pH试纸，浓盐酸，95%乙醇，10% α萘酚乙醇溶液，浓硫酸，蒸馏水。 五、实验内容 操作步骤： 称取30g槐花米于研钵中研成粉状物，置于500mL烧杯中，加入饱和石灰水，加热至沸，并不断搅拌，煮沸30分钟后，趁热抽滤。然后用浓盐酸调节pH值为4~5。放置1-2h，使沉淀完全，抽滤，沉淀用水洗涤2~3次，得到芦丁的粗产物。 流程图：
综合化学实验: 芦丁的提取分离和鉴定 芦丁简介: 芦丁（Rutin）又名芸香苷化学式: C27H30O16·3H2O，是一种浅黄色针状结晶有机化合物，广泛存在于自然界植物中，是一种被人们广泛使用的有机天然产物。目前已发现含有芦丁的植物至少在70种以上，常见的如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均有不同含量。尤其以中药槐米（豆科、槐属，槐树Sophorajaponica的花蕾）和荞麦中含量最高，因此槐米可作为大量提取芦丁的天然植物原料。 中药槐米（炒碳）味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。西医研究其主要有效成分为有机化合物“芦丁”而中药槐米中芦丁的含量可高达12~16%，是主要的芦丁天然来源。槐米中还含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。研究文献证明芦丁具有VitP（维生素P）样作用（VitP具有生物类黄酮的功能，可防止维生素C被氧化而受到破坏，增强维生素功效；增加毛细血管壁强度，防止瘀伤。有助于牙龈出血的预防和治疗，有助于因内耳疾病引起的浮肿或头晕的治疗等）。而芦丁具有类似作用如可降低毛细血管脆性和调节通透性等，在医学临床上常将其用作毛细血管脆性引起的出血症以及防治高血压病等的辅助治疗药物。 芦丁是由槲皮素（quercetin）3位上的羟基与芸香糖（rutinose，一种由葡萄糖glucose与鼠李糖rhamnose组成的双糖）脱水合成的苷，是一种浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无结晶水时188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 补充知识:
蛋白质的提取和分离专题训练 一．选择题 1．下列有关蛋白质的提取和分离的操作，其中排序正确的是()。 A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定 2．下列对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作不正确的是()。 A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐 B．让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面 C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱 3．在蛋白质的提取和分离中，下列对样品处理过程的分析正确的是()。 A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐 B．洗涤时离心速度过小，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的结果 C．洗涤过程选用质量分数0.1%的NaCl溶液(生理盐水) D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质 4．下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是()。 A．可采集猪血作为实验材料B．用蒸馏水重复洗涤红细胞 C．血红蛋白释放后应低速短时间离心 D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液 5．蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列叙述不正确的是()。 A．根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离 B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳分离蛋白质 C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质 D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质 6．凝胶色谱法分离蛋白质时使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶(SephadexG—75)，其中G、75的含义分别是()。 A．G表示凝胶的使用量，75表示加75 g水 B．G表示凝胶的交联程度，75表示需加热75 ℃ C．G表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，75表示每克凝胶膨胀时吸水7.5 g D．G表示凝胶的膨胀体积，75表示每克凝胶膨胀后体积可达75 cm3 7．用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质()。 A．路程较长，移动速度较慢B．路程较长，移动速度较快 C．路程较短，移动速度较慢D．路程较短，移动速度较快 8．下列关于蛋白质提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是()。 A．红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心 B．血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌 C．分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心，过滤后，用分液漏斗分离 D．透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h 9．下列各项中不属于电泳使样品中各分子分离的原因的是()。 A．分子带电性质的差异B．分子的大小C．分子的形状D．分子的变性温度10．下列有关提取和分离血红蛋白的程序叙述错误的是()。 A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液 B．通过透析可以去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取 C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化 D．可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度 11．下列有关蛋白质提取和分离的叙述中，错误的是()。 A．透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性 B．采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物分离开来 C．离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离 D．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相同的电极移动
大豆活性肽的分离纯化和生理活性 大豆蛋白肽是利用酶法或微生物发酵法将大豆蛋白降解成多肽、短肽和氨基酸的混合物。大豆蛋白肽是一种重要的肽来源。大豆蛋白肽与蛋白质相比较，多肽具有如下特点：在较宽的pH 范围内溶解度高，容易在体内消化和吸收；渗透压低，能够避免高渗透压导致的腹泻；不容易导致过敏。Rerat 等研究表明，短肽的特点是吸收速度快、消耗能量低、载体不易饱和，不同肽之间运转没有竞争和抑制。 随着生物技术与生命科学的不断进步与发展，大豆多肽的功能越来越多的被人们所发掘，而某些活性肽的结构与生理功能也逐渐被人们所认识和了解，这对活性肽的研究起到了推动作用，更有利于人类对大豆活性肽进行研究与开发。 迄今为止，从大豆蛋白中已分离出降血压肽、免疫调节肽、抗氧化肽、降胆固醇肽、抗血栓形成、促进钙磷及微量元素的吸收等多种纯化的大豆蛋白生物活性肽，对这些大豆活性肽的研究情况进行了综述，以期为大豆活性肽的应用提供参考。 1 大豆蛋白活性肽的分离和纯化目前，生产大豆活性肽的方法主要三种有：酶解法、微生物发酵法和化学法，最为先进的是微生物发酵法，它不仅能修饰肽的苦味。还能将原料中的KTI 和BBI 等影响消化和口味的抗营养因子降解。 大豆蛋白肽的活性易受到外界条件的影响，在过强的酸碱、较
高的温度与剧烈震荡等条件下都有可能失活。初始的肽液成分相对较复杂，目标产物的浓度也比较低，一般低于5%，含有大 量杂质，某些杂质的理化性质和目标产物有相似之处，这就提高了大豆肽的分离纯化的难度。传统多肽分离工艺，如吸附沉淀、溶媒、萃取和离子交换法等步骤繁多，耗时，原料消耗量大，耗能高，得到的产品较少。生物技术的发展与人们对大豆肽结构和功能研究的不断深入，大豆肽分离检测技术也获得了突飞猛进的发展，出现了反相高效液相色谱法、凝胶过滤色谱法、毛细管电泳法、膜分离法、各种技术手段的联用等许多高效的分离纯化技术和手段。 1.1反相高效液相色谱（RP—HPLC法 反相高效液相色谱是一种色谱洗脱法，它以非极性的反相介质为固定相，流动相是水溶液或甲醇、乙腈等极性有机溶剂。根据流动相中被分离溶质疏水性的不同，与固定相发生的作用大小的差异，使被分离物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数，从而进行分离纯化。 如果大豆多肽是疏水性较弱的分子，它和固定相之间的作用比较小，能够较快流出；反之，如果大豆多肽分子疏水性比较大，流出会比较靠后。反相高效液相色谱法分离纯化大豆活性肽时采用三氟乙酸- 乙氰这种挥发性冲剂作为流动相，其纯化产品不需脱盐，这样就简化了操作步骤，对于分子量在lOOODa以下的小分子大豆肽类物质的分离和纯化尤为重要。 反相高效液相色谱分离和纯化大豆活性肽时多采用增加流动相
实验二芦丁的提取及鉴定 （一）概述 芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica 的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。芦丁是由斛皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水合成的苷。 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁具有维生素P样作用。有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗剂，亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。实验目的和要求 实验目的 ①通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 ②通过芦丁结构的检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 ③了解UV及NMR在黄酮类化合物结构鉴定中的应用。 要求 ①要拿到以下三个化合物：芦丁、槲皮素、芦丁的全乙酰化合物。 ②能够拿根据化学试验及UV、NMR数据初步推断出芦丁的结构。并对黄酮类化合物的结构测定有一般性的了解。 试验方法 芦丁的提取与分离（见下图） 芦丁的鉴定 ①芦丁的定性反应 取芦丁3~4mg，加乙醇5~6ml使其溶解，分成三份作下述试验： A. 取上述溶液1~2ml，加2滴浓盐酸，在酌加少许镁粉，注意观察颜色变化情况。 B. 取上述溶液1~2ml，然后滴加2%柠檬酸的甲醇溶液，注意观察颜色变化情况，在继续向试管中加入2%ZrOCl2的甲醇溶液，并详细记录颜色变化情况。 C. 取上述溶液1~2ml，然后再加入10%α-等体积的萘酚乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，注意观察两液面产生的颜色变化。 ②芦丁的紫外光谱解析 取芦丁溶于色谱纯甲醇中，加入规定的试剂，测定其UV光谱，试解析光谱并初步判断其结构。
实验四槐米中芸香苷的提取分离与鉴定 芦丁(Rutin)亦称芸香甙(Rutisude)，广泛存在于植物界中。现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。 槐花米为豆科植物槐(Sophora japonica L。)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达12%~16%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性。临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。 槐花米中主要化学成分的结构及性质： 1.芦丁(Rutin) 淡黄色细小针状结晶，℃~178℃(含三分子结晶)，188℃(无水物)。 溶解度： 水：1:100(冷)，1:200(热) 甲醇：1:100(冷)，1:9(热) 乙醇：1:650(冷)，1:60(热) 吡啶：1:(冷)，易溶(热) 不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。 2. 槲皮素(Quercetin) 即芸香甙甙元，为黄色结晶，mp.313℃~314℃(含2分子结晶水)，316℃(无水物)。溶解度： 乙醇：1:290(无水乙醇)，1:23(热) 可溶于甲醇、乙酸乙酯、丙酮、吡啶、冰醋酸。不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚等。 3. 皂甙 粗品为白色粉末，mp.210℃~220℃(分解)。易溶于水、吡啶，能溶于200倍的甲醇中。酸水解后得白桦脂醇、槐二醇二种皂甙元及葡萄糖，葡萄糖醛酸及葡萄糖醛酸内酯。 (1) 白桦脂醇(Betulin) 无色针晶，℃~252℃。能溶于醋酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、
蛋白质的提取与纯化 一，蛋白质的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等
中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
实验一槐米中芦丁的提取、分离和鉴定 一、概述 槐米系豆科植物槐树（Sophora japonica L.）的花蕾（槐米）。具有清热、凉血、止血的功效，用于治疗便血、痔血，尿血、血淋，崩漏，赤血痢下，风热目赤，痛疽疮毒，还可用于预防中风。近年来被用作治疗高血压的辅助药物。 药理实验证明，槐花米具有调节毛细血管的渗透作用，抗炎作用，解痉、抗渍疡作用，影响脂质代谢，抗菌等多种生物活性。槐花米中主要含有黄酮苷，皂苷、甾醇和鞣质等成分，其中芦丁(Rutin)含量最高，达12～20%。 主要化学成分的结构及理化性质： 芦丁（rutin）：C 27H 30 O 16 ·3H 2 O，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子 水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。 槲皮素（quercetin）：C 15H 10 O 7 ·2H 2 O，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结 晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。 二、实验部分 （一）实验目的 1、通过芦丁的制备，掌握黄酮类化合物提取分离的原理和操作。 2、掌握酸水解将芦丁生成槲皮素的方法。 3、掌握芦丁与槲皮素的鉴别方法，聚酰胺薄膜的操作方法，电子天平的使用方法。 （二）实验原理 1、芦丁的提取原理：芦丁中含有多个酚羟基，具有酸性，故用碱提酸沉法。 2、芦丁的分离原理：芦丁在沸水中溶解，在冷水中析出。 3、芦丁的鉴定原理：芦丁与槲皮素分别为黄酮类化合物的苷与苷元，用Molish反应可以进行鉴别，也可以利用聚酰胺的氢键吸附性质进行定性分析，Rf值也应不同。 （三）实验药材、仪器与试剂 1、药材：槐米50g(每组)。
蛋白质的提取和分离 【教学目标】 1．知道蛋白质分离和提取技术的基本原理。 2．能进行血清蛋白的提取和分离。 3．尝试提取和检测牛奶中的酪蛋白。 4．尝试卵清蛋白的分离。 【教学重难点】 1．知道蛋白质分离和提取技术的基本原理。 2．能进行血清蛋白的提取和分离。 【教学过程】 一、蛋白质分离提纯技术 1．将生物体内的蛋白质提取出来并加以分离，就可以得到高纯度的、甚至是单一种类的蛋白质。 2．蛋白质分离提纯技术包括离心技术、层析技术和电泳技术等。其中，电泳技术最为快捷灵敏、简便易行。 二、电泳技术及分离蛋白质的原理 1．电泳现象：带电粒子在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动。电泳常用的支持物是聚丙烯酰胺凝胶，由此而来的技术称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。 2．电泳技术分离蛋白质的原理： （1）蛋白质含有游离的氨基和羧基，是两性电解质，在一定pH条件下带有电荷。 （2）蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，分子量越小，则移动越快。 （3）不同蛋白质的混合溶液，在经过同一个电场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹。每一种带纹可能就是一种蛋白质。将这些带纹一个一个地剪下来，分别予以洗脱，然后对洗脱液中的蛋白质做进一步的分离。如果待测洗脱液不能再分离，则这个带纹中很可能含有一种单纯蛋白质。如果待测洗脱液还能再分离，则这个带纹中含有多种蛋白质，需要作进一步分离，直至提纯。 三、血清蛋白的提取和分离 1．新鲜血液在体外凝固后，会析出清亮的淡黄色液体——血清。血清中含有丙种球蛋白、
凝集素等多种蛋白质。 2．过程： （1）点样：取新制血清与蔗糖溶液及溴酚蓝指示剂等体积混匀后，小心加到电泳样品槽的胶面上。 （2）电泳。 （3）染色：取出凝胶，放入质量分数为0.05%的考马斯亮蓝R250染色液中。染色与固定同时进行，使染色液没过胶板，染色30min。 （4）脱色：用体积分数为7%的醋酸溶液浸泡漂洗数次，每隔1~2h更换脱色液，直至底色脱净，背景清晰。 （5）制干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡3~4h，然后放在两层透气玻璃纸中间，自然干燥即可获得血清蛋白的电泳谱带。 四、其他蛋白质的提取与分离 1．牛奶中酪蛋白的提取与检测： 当pH=4.8时，酪蛋白的溶解度降低，并析出沉淀。用酒精除去酪蛋白沉淀中的脂肪后，即得到纯的酪蛋白。 酪蛋白中含有酪氨酸，能与米伦试剂起颜色反应，首先生成白色沉淀，加热后变成红色。 2．卵清蛋白质的分离： 选取鸡、鸭、鹅、鹌鹑等动物的新鲜卵清做实验材料。采用电泳法分离卵清蛋白质。 自主思考： 可否利用蛋白质的提取与分离技术快速诊断早期癌变？ 提示：可以。只需从早期患者的尿液、血液或细胞裂解液中提取少量蛋白质样品，采用蛋白质指纹图谱技术，就可以更加快速、简便、准确地对细胞癌变做出诊断。 探究一：蛋白质的分离原理 问题导引： 为年老多病的人注射丙种球蛋白，可以在一定程度上增强其身体的抵抗力。在动物体内，丙种球蛋白和许多蛋白质混在一起。要获得纯净的丙种球蛋白，就必须进行提取和分离。你能提供分离蛋白质的思路吗？ 提示：可根据蛋白质各种特性的差异，如分子的大小、所带电荷的性质和多少等来分离不同种类的蛋白质。 名师精讲： 蛋白质的分离方法：
蛋白质提取与制备具体操作方法 1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间 隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。小量的 也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局 部往往生热导致变性或pH显著变化，尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损 失。 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。
优选精品资源欢迎下载选用 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以20**r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L 的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。
大孔吸附树脂在生物活性肽分离纯化中的应用 吕红1，卢建中2，张璐1，颜梅1 （1 江西中医学院，南昌，330006，2江中药业股份有限公司，南昌，330096）摘要：随着生物活性肽的的开发和利用，对生物活性肽的分离纯化也越来越引起人们的重视，大孔吸附树脂在生物活性肽分离纯化中的应用报道较少，但其条件温和，设备简单、操作方便的特性，值得在生物活性肽的分离纯化中得到推广和应用，本文就近年来的一些大孔吸附树脂在生物活性肽中的应用进行概述。 关键词：大孔吸附树脂，生物活性肽，抗氧化肽，抗菌肽，抗高血压肽 大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的一类有机高分子聚合物吸附剂，具有很好的大孔网状结构和较大的比表面积，可通过物理吸附从水溶液中有选择的吸附有机物[1]。 1 大孔吸附树脂的性能 大孔吸附树脂是一类新型非离子型高分子吸附剂，是以苯乙烯和丙酸酯为单体，在0.5%的明胶溶液中，加入乙烯苯为交联剂，甲苯、二甲苯为致孔剂，它们相互交联聚合形成的高分子网状孔穴结构，在整个颗粒内部及外部都具有表面活性。其性质介于天然吸附剂(活性炭、硅胶和硅藻土)和离子交换剂之间，吸附特性与天然吸附剂类似，比离子交换剂更容易再生[2]。 大孔吸附树脂具有以下优点：(1)选择性良好，无机盐的存在有利于吸附； (2)分离和浓缩有机物，得到的化合物灰份低；(3)物理化学稳定性高，不溶于酸、碱及有机溶剂，机械强度好；(4)吸附和解吸较快，吸附容量大；(5)品种规格多，可根据化合物的性质来选择适当结构或极性的吸附剂；(6)吸附树脂呈小球状，直径为0.2-0.8mm，因此流体阻力比活性炭小，流速较快[3]。 2 大孔吸附树脂的原理 大孔吸附树脂的吸附实质为一种物体高度分散或表面分子受作用力不均等而产生的表面吸附现象，这种吸附性能是由于范德华引力或生成氢键的结果。同时由于大孔吸附树脂的多孔结构使其对分子大小不同的物质具有筛选作用。通过上述这种吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定溶剂洗脱而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。 大孔吸附树脂按其极性大小和所选用的单体分子架构不同，可以分为非极性、中等级性和极性三类，它们的结构和吸附性各不相同。非极性吸附树脂是由偶极距很小的单体聚合制得，不带任何功能基，孔表的疏水性较强，可通过与小分子内的疏水部分的作用吸附溶液中的有机物，最适于极性溶剂中吸附非极性物质，也称为芳香族吸附剂。中等极性的吸附树脂是含酯基的吸附树脂，且用多功能团的甲基丙烯酸酯作为交联剂，其表面兼有疏水和亲水两部分，即可极性溶剂中吸附非极性物质，又可由非极性溶剂中吸附极性物质，也称为脂肪族吸附剂。极性大孔吸附树脂是指含酰胺基、氰基、酚羟基等含氮、氧、硫极性功能基的吸附树脂，通过静电相互作用吸附极性物质，适用于非极性溶剂中吸附极性物质。 3 大孔吸附树脂在生物活性肽分离纯化中的应用 肽是指分子结构介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，是由20种天然氨基
第一节蛋白质的提取和分离 一、蛋白质分离提纯技术 常用的蛋白质分离提纯技术包括离心技术、层析技术和电泳技术等。其中电泳技术最为快捷灵敏、简便易行。 二、电泳技术分离蛋白质的原理 1．蛋白质中含有游离的氨基和羧基，是两性电解质，在一定pH条件下带有电荷。 2．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷相反的电极方向移动。 3．蛋白质所带的电荷数越多，移动得越快；电荷数相同时，分子量越小，移动越快。 三、结果分析 不同蛋白质的混合溶液经过同一电场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹，每种带纹可能就是一种蛋白质。 四、“血清蛋白的提取和分离”活动程序 1．点样：取新制血清5微升、质量浓度为0.4克/毫升的蔗糖溶液和质量分数为0.1%的溴酚蓝指示剂等体积混匀后，用微量加样器吸取5 μL样品加到电泳样品槽的胶面上。 2．电泳。 3．染色：用质量分数为0.05%的考马斯亮蓝R250染色液对凝胶进行染色。 4．脱色：用体积分数为7%的醋酸溶液对凝胶板进行浸泡漂洗，至底色脱净。 5．制干胶板：将已脱色的凝胶板放在保存液中浸泡3 h～4 h后，放在两层透气的玻璃纸中间自然干燥。 预习完成后，请把你认为难以解决的问题记录在下面的表格中 问题1 问题2 问题3 问题4
一、蛋白质分离提纯的方法 1．蛋白质分离的基本过程 破碎细胞―→抽提(粗制品)―→纯化蛋白质 2．破碎细胞的方法 在分离与纯化蛋白质之前，必须采用适当的方法使蛋白质呈溶解状态释放出来：通常先将生物组织进行机械破碎，再根据细胞的特点，选择不同的破碎细胞方法(常用的有研磨法、超声波法、酶解法)。 3．抽提 细胞破碎后，各种蛋白质被释放出来，再根据蛋白质的不同性质，选择不同的溶剂进行抽提。 4．纯化 (1)原理：纯化主要是指根据蛋白质之间以及蛋白质与其他物质之间在分子大小、溶解度大小、所带电荷的多少、吸附性质等方面存在的差异进行的。 (2)方法：①透析法——分子大小 ②离心沉淀法——分子大小、密度大小 ③电泳——所带电荷多少 二、“血清蛋白质的分离”实验中应注意的问题 1．由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。 2.将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝R250染色液中染色30 min后，多次更换脱色液至背景清晰。脱色后，可将凝胶浸于保存液中，长期封装在塑料袋内使其不会降低染色强度。为保存永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。 电泳的原理及应用 如图为某些氨基酸在pH为6时进行电泳的结果，请回答：
实验一槐米中芦丁的提取、分离与鉴别 一、实验目的 （1）掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。 （2）掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。 二、实验原理 芦丁(Rutin)亦称芸香苷(Rutisude)，广泛存在于植物界中。现已发现含芦丁的植物约有70余种，如烟叶、槐花米、荞麦叶、蒲公英中均含有大量的芦丁。尤以槐花米和荞麦叶中含量最高，可作为提取芦丁的原料，使用最多的是槐花米。 槐花米为豆科植物槐(Sophora japonica L)的花蕾，所含主要成分为芦丁，含量可达23.5%，槐花开放后降至13.0%，其次含有槲皮素、三萜皂甙、槐花米甲素、乙素、丙素等。芦丁具有维生素P样作用，可降低毛细血管前壁的脆性和调节渗透性，临床上用于毛细血管脆性引起的出血症，并常作高血压症的辅助治疗药。 芦丁(Rutin)为淡黄色细小针状结晶，mp.174℃~178℃(含三分子结晶)，188℃(无水物)。溶解度情况如下： 水：1:10000(冷)，1:200(热) 甲醇：1:100(冷)，1:9(热) 乙醇：1:300(冷)，1:30(热) 吡啶：1:11.7(冷)，易溶(热) 不溶于乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等溶剂，易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。可溶于浓硫酸、浓盐酸，加水稀释复析出。 芦丁可溶于热水，难溶于冷水，其分子结构中具有较多的酚羟基，显弱酸性，在碱液中易溶解，而在酸性条件下，易析出沉淀，故本实验采用碱溶解酸沉淀的方法自槐米中提取芦丁。再利用其在冷热水中溶解度的差别采用沸水为结晶溶剂进行精制。利用芦丁可被稀酸水解，生成苷元和糖，通过颜色反应、薄层层析等方法进行检识和确认芦丁。 三、实验内容 （一）芦丁(芸香苷)的提取 1. 取1.5g石灰粉（CaO），置于干净的小研钵中，加入10mL水研成乳液备用。称取槐米20g，于1000m1烧杯中，加0.4%硼砂水溶液200mL，在搅拌下小心加入石灰乳调至pH 8～9，加热至微沸，维持pH值20-30分钟，趁热抽滤，弃去滤渣，冷至60-70℃用浓盐酸调至pH4-5，放置过夜，减压过滤，得粗芦丁（滤
实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 (1)样品处理 ①红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的:去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，如500r/min离心2min，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白;离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 ②血红蛋白的释放将洗涤好的红细胞倒人烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。蒸馏水和甲苯作用:使红细胞破裂释放出血红蛋白。 ③分离血红蛋白溶液将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的液体分为4层。第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 ④透析取lmL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋故人盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。 (2)凝胶色谱操作 ①凝胶色谱柱的制作 ②凝胶色谱柱的装填将色谱柱垂直固定在支架上。计算所用凝胶量，并称量。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙臂打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装。装填完后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密。 ③样品的加入和洗脱打开色谱柱下端的流出口。使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，加样时使吸管管口沿管壁环绕移动，注意不要破坏凝胶面。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。
槐米中芦丁及槲皮素的提取分离及鉴定 槐米为豆科植物槐（Sophora japonica L ．）的未开放花蕾。味苦性凉、具清热凉血、止血之功。常用于治疗多种出血症：肠风便血、痔血、尿血、衄血、崩漏下血、赤血下痢等。槐米常炒炭应用。 槐米的主要化学成分为芦丁，其含量可达12～16％，其次含有槲皮素、三萜皂苷、槐花米甲素、槐花米乙素、槐花米丙素等。芦丁具有Vitp 样作用，可降低毛细血管脆性和调节通透性。临床上用作毛细血管脆性引起的出血症，常作为高血压症的辅助治疗药。 [目的要求] 1．通过芦丁的提取与精制掌握碱酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 2．掌握槲皮素的制备原理及操作。 3．熟悉紫外光谱在黄酮结构鉴定中的应用 4．通过芦丁的结构检识，了解苷类结构研究的一般程序和方法。 [实验原理] 芦丁（rutin ）：C 27H 30O 16·3H 2O ，浅黄色针状结晶，mp174～178℃（含三分子水）；188℃（无水物）。难溶于冷水（1：8000～10000），可溶于热水（1：180～200），热甲醇（1：10），冷甲醇（1：100），热乙醇（1：60），冷乙醇（1：650）；难溶于乙醚、三氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，易溶于碱液。 槲皮素（quercetin ）：C 15H 10O 7·2H 2O ，黄色结晶，mp313～314℃（2分子结晶水），316℃（无水物）。能溶于冷乙醇（1：290），易溶于沸乙醇（1：23），可溶于甲醇、乙酸乙酯、冰醋酸、吡啶、丙酮等；难溶于水、苯、石油醚等溶剂。 芦丁为黄酮苷，分子中具有酚羟基，显酸性，可溶于稀碱液中，在酸液中沉淀析出，可利用此性质进行提取分离。利用芦丁易溶热水、热乙醇， 较难溶于冷水、冷乙醇的性质选择