08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
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是一个以分子生物学实验及对实验结果进行处理为核心，以生物技术前沿发 展为导向的一个专业型科学技术讨论社区。 本着“共分享，同成长”的理念，给广大生物科研工作者一个交流经验、分 享资料的平台。
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实验技术交流（实验互助） 实验结果处理（生物信息学） 实验之余的生活 螺旋网的特色： 1、毕赤酵母表达系统； 2、发酵工艺 3、螺旋课堂； 4、Seminar； 5、生物学科研究进展； 6、实验交流及生物信息学。
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08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
2008 年螺旋课堂的课程计划！
2007 年已悄然逝去，2008 年已向我们扑面而来。08 年是共和国发展的关键 一年，也是螺旋网抓住机遇，加快发展的关键一年。今年螺旋网将为各位螺友提 供大量的关于生命科学的讨论主题，让各位螺友对生命科学的灵感相互碰撞，达 到共鸣。还有螺旋网将联合一批一线生命科学人员为您的研究保驾护航。同时还 将为大家提供各种资源包括各类电子书、生命科学研究进展、生物软件等。 为此，螺旋课堂 08 年的课程将围绕着最新的研究方法、研究进展进行课程 设置。具体安排如下： 第一期：荧光定量 PCR 技术 第二期：原位杂交技术 第三期：引物的设计原理及方法 第四期：BAC 库的构建技术 第五期：手把手教你进行序列分析
..................... 除以上技术外，欢迎大家点播！
以上讲座的具体时间详见论坛通知!
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08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
螺旋课堂第一课－－荧光定量 PCR 技术
Janson
PCR 技术的发明极大地推动了分子生物学的发展，而且迅速被推广和应用 到生命科学的各个领域， 可以说它是目前核酸分子水平的基础及应用研究中使用 最广泛的一项技术。 常规 PCR 中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增 产物进行定性的分析，无法对 PCR 扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板 准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插 入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒 DNA/RNA 的精确 copy 数等，如 此，荧光定量 PCR 技术便应运而生。 本文将分为三大部分向大家介绍，首先是理论篇：首先了解荧光定量 PCR 的理论知识，如荧光定量 PCR 技术的原理、方法等；随后为实践篇：如实验的 操作流程、注意事项、方法选择、结果分析与处理等；第三部分为问题分析与解 答篇：荧光定量 PCR 过程中有哪些常见问题，我们如何避免和解决。
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08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
第一章 理论篇
一、荧光定量 PCR 技术发展史
1993 年，日本 Higuchi 等人首次采用动态 PCR 方法和封闭式检测方式对 目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量 PCR 技术的概念。当时他使 用了 EB（溴乙锭）作为荧光标记染料，采用一台经过改良的热循环仪，用 UV 射线照射样品然后通过 CCD 相机检测产生的荧光值，利用了 PCR 反应中的数 学函数关系， 再结合加入标准品的方法， 达到了对检测样品进行准确定量的目的， 但由于这种方法由于有着在实验仪器资金上巨大的耗费，一些非特异的 PCR 产 物同样能被检测到并包含在被测的荧光信号值总量之中而导致定量不准确等因 素，最终使这种实验技术在当时没能成为主流的实验技术。 1995 年美国 PE 公司成功研制了 TaqMan 技术， 1996 年又推出了首台荧光 定量 PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用 Ct 值进行分析， 荧光定量 PCR 才很快得到大家的接受，并广为应用。 近年来，荧光定量 PCR 技术不断完善，取得了突飞猛进的发展。由于其具 有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，而被广泛应用 于基础科学研究、药物研发、临床诊断、转基因研究、基因检测等各个领域研究 当中。
二、荧光定量 PCR 概述
1、荧光定量 PCR 概念 所谓定量 PCR 技术（real-time PCR） ，是指在 PCR 反应体系中加入荧光基 团，利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知 模板进行定量分析的方法（图 1） 。 图 1 荧光定量 PCR 反应原理
荧光基团
Ct值
荧光检测元件
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2、荧光定量 PCR 与普通 PCR 的主要区别 常规 PCR 中，PCR 产物通过凝胶电泳，然后进行成像分析，常规 PCR 只 能通过终点法对扩增产物进行定性分析，而不能进行定量分析（图 2） ；荧光定 量 PCR 中，PCR 反应体系中加入了荧光分子，通过荧光信号的变化来反应扩增 产物的变化，使 PCR 产物的实时检测成为可能。相对常规 PCR 而言，荧光定 量 PCR 的主要优点使准确地确定初始模版拷贝数和较高的检测灵敏度；荧光定 量 PCR 不仅可用于定性，如判断一段序列的有无，也可用于定量，如确定起始 模版的拷贝数； 图 2 终点法定量 PCR 的缺陷
理论上 PCR 是一个指数增长的过程，但是实际的 PCR 扩增曲线并不是标 准的指数曲线，而是 S 形曲线。这是因为随着 PCR 循环的增多，扩增规模迅速 增大，Taq 酶、dNTP、引物，甚至 DNA 模板等各种 PCR 要素逐渐不敷需求， PCR 的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的 Taq 酶都被饱和 以后，PCR 就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的 PCR 反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化， 难以精确控制。 所以， 即使是 96 次 PCR 重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（图 2） 。 常规 PCR 的定量方法，测定的都是 PCR 的终产物，而不是起始 DNA 拷贝 数。由于 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系（图 2） ，所以不能根 据最终 PCR 产物的量直接计算出起始 DNA 拷贝数。虽然加入内标后，可部分 消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作 半定量、粗略定量的方法。 而从图 2 也可以看出，虽然相同模版在同一台 PCR 仪上进行 96 次扩增， 终点处检测产物量不恒定，但 96 次 PCR 扩增曲线都有一个共同的拐点，即荧 光定量 PCR 中 Ct 值的重现性，恒定的 Ct 值为荧光定量 PCR 的分析提供了理
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08 年第一期螺旋课堂--“荧光定量 PCR 技术”
论依据。 前面我们对荧光定量 PCR 的历史、 荧光定量 PCR 概念和与常规 PCR 区别 有了大致的了解， 但你可能心中存在许多疑惑： 什么是扩增曲线？什么是 Ct 值？ 它们有什么特点？我们如何来判定荧光定量 PCR 反应中的 Ct 值，原理是什 么？。。。 。。。 为了使大家更好的理解、掌握荧光定量 PCR 技术，在介绍荧光定量 PCR 检测方法、动力学原理和数据分析方法前，有必要先介绍几个最基本的概念。 3、荧光定量 PCR 的几个基本概念 3．1 扩增曲线 为了更好的理解荧光定量 PCR 原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。描 述 PCR 动态进程的曲线即扩增曲线。 PCR 的扩增曲线实际上并不是一条标准的 指数曲线，而是呈 S 型曲线（图 3） 。图 3 中，X－轴表示 PCR 循环数，Y－轴 表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。
图 3 荧光定量 PCR 扩增曲线示意图
荧光阈值
从图 3 可以很直观的看出，荧光定量 PCR 扩增曲线可以分成三个阶段：荧 光背景信号阶段（基线期） ，荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基 线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而 在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之 间没有线性关系， 所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。 只 有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性 关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。 3．2 荧光阈值
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在介绍荧光阈值之前，先了解一下荧光本底信号（图 3） ，我们一般把荧光 PCR 的前 15 个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期） ，即样本的荧光 背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值， 它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任 意位置上，荧光域值的缺省设置是 3～15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍 （机器自动设置） 。我们在做荧光定量 PCR 实验时，经常采用手动设置，手动设 置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值， 同时要尽量选择进 入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值（图 4） 。 图 4 手工调整荧光阈值示意图
3．3 Ct 值 了解了荧光阈值的概念后， 值就很好理解了。 代表 Cycle，代表 threshold， Ct C t 所谓 Ct 值就是在荧光 PCR 扩增过程中， 当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值 时所经过的扩增循环次数。如图 3 所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超 过黑色线时所经历的循环数即为 Ct 值。从这也可以了解到 Ct 值是可以变化的， 我们实验时带有一定的人为因素。 而荧光定量 PCR 后面的数据处理要用到 Ct 值 来计算，所以有关荧光阈值的设置就显得尤为重要。一般说来，新手按荧光 PCR 仪的自动设置为好，而如果你非常有经验，一般会手动设置荧光阈值。因为 Ct 值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系， 起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct 值也就越小，反之亦然。正常的 CT 值范围在 18-30 之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。 前面也提到过，同一模板经过 96 次 PCR 扩增，扩增产物虽然不恒定，但 Ct 值极具重现性。根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的 Ct 值做出标准曲线， 只要在同一次 PCR 实验中得到未知样品的 Ct 值， 就可以根 据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。 接下来我们就来看看通过 Ct 值算出拷贝数的数学原理是怎样的： 首先我们来回顾一下PCR扩增原理 （图 5） 从PCR原理图中我们也可以很清 ，
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楚的知道理想的PCR反应是以 2n次方增长的方式扩增，即： X=X0×2n 但由于 PCR 反应体系是一个有限的体系，也就是我们加入到 PCR 反应体系 中的物质是有限的，例如酶、引物、Buffer 等，只有在对数增长期时，PCR 的扩 增效率才等于 1，大部分时候扩增效率小于一，有时甚至等于零。因此 PCR 扩 增的真正情况是： X=X0 (1+Ex)n 其中 n：扩增反应的循环次数；X：第 n 次循环后的产物量 X0：初始模板量；Ex：扩增效率 在扩增产物达到阈值线时所经历的循环数为Ct个循环，此时的产物量为 XCt=X0 (1+Ex)Ct =M 其中XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后, 它是一个常数，我们设为M， 对方程式两边同时取对数得 logM=logX0 (1+Ex)Ct，我们对该方程式做简单 的数学运算后得到： log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M 其中 M 为常数，Ex 为常变数，也就是说 Ex 在 PCR 反应中的某一个循环中 是一个常数，但不同的循环数中，Ex 的数值会发生变化。因此从上式可以推出： Log 浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即 Ct 值就可计 算出样品中所含的模板量。 图 5 PCR 原理图
3．4 标准曲线 在绝对定量中， 未知样本的量如基因拷贝数可通过梯度稀释的已知量的标准 品的 Ct 值推算出。在实验过程中，我们可以将已知浓度的标准品进行梯度稀释 （5－6 个稀释梯度） ，将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光 PCR 实验中
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