毕业论文（设计）
学生姓名：
指导教师：
专业名称：园林技术
所在系部：园林系
2010年 3 月 9 日
辽宁林业职业技术学院毕业论文评审书
蝴蝶兰品种组织培养技术
摘要：被誉为“洋兰王后”的蝴蝶兰，几年来一直都处于花卉销售的首位，一直受到花迷们的青睐。近年来除了盆花，还大量被用作切花材料，切花中除我们常见的插花用途之外，还是制作胸花的好材料，在开会庆典场合备受瞩目，至于用来制作新娘捧花，也是目前国内流行的新风潮，深受广大消费者的好评，这就使得高品质的蝴蝶兰需求量逐年增加。但目前由于专业性培育蝴蝶兰的整体水品不是很高，关键的生产环节技术薄弱，造成蝴蝶兰生产成本较高繁殖系数偏低，工业化生产效率不高，许多名贵品种短缺，品质较低，且市场售价较高。因此建立和完善蝴蝶兰组培快繁技术是解决这一问题的关键环节.本文针对植物组织培养中常见的褐变现象,详细地分析了其产生的机理及影响因素,并提出了相应的对策,为科研和生产提供了一定的理论和实践依据。
关键词：蝴蝶兰；快繁技术；养殖；褐变
目录
前言……………………………………………………………………………………………
第一章蝴蝶兰的生态习性…………………………………………………
第二章蝴蝶兰的快速繁殖技术…………………………………………………
2.1茎尖培养…………………………………………………
2.2蝴蝶蝶兰的诱导培养基为ＶＷ、ＫＣ、ＭＳ、ＢＫ……………………………2.3叶片培养…………………………………………………
2.4花梗腋培养…………………………………………………
2.5根尖培养…………………………………………………
2.6 原球茎的继代培养与育苗…………………………………………………
第三章蝴蝶兰的栽培管理…………………………………………………
3.1栽培介质…………………………………………………
3.2温度……………………………
3.3浇水………………………………………………………………………
3.4光照……………………………………………………………………
3.5通风……………………………………………………………………
3.6营养………………………………………………
3.7花后管理………………………………………
第四章蝴蝶兰褐变产生的影响因素…………………………………
4.1植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型……………………………………
4.2外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同……………………………………
4.3培养基成分…………………………………………………………………
4.4培养条件…………………………………………………………………
第五章防止外植体产生褐变的对策…………………………………
5.1适当外植体的选择…………………………………………………………………5.2对外植体的处理………………………………………………………………
5.3适宜的培养基………………………………………………………………
5.3.1适当的无机盐浓度………………………………………………………
5.3.2适当和适量的激素………………………………………………………
5.3.3培养基的硬度………………………………………………………
5.3.4培养基中水的硬度………………………………………………………
5.3.5培养基的pH值………………………………………………………
5.3.6培养条件………………………………………………………
5.4添加褐变抑制剂和吸附剂………………………………………………
5.5进行细胞筛选和多次转移………………………………………………
总结………………………………………………………………………………………致谢………………………………………………………………………………………参考文献…………………………………………………………………………………
1 蝴蝶兰的生态习性
喜高温、高湿、半阴环境，越冬温度不低于18度。由于蝴蝶兰出生于热带雨林地区，本性喜暖畏寒。生长适温为15～20℃，冬季10C以下就会停止生长，低于5℃容易死亡。蝴蝶兰的气根颇多，其根尖翠绿，相当敏感，要细心加以保护，切不可触动损伤，否则，就好像打坏了人的嘴巴，要正常进食就困难了。蝴蝶兰喜欢潮湿和半阴的环境，要求空间经常保持湿度50％～70％，盆内不能淋水过多。在夏秋季节不能让阳光直射。但早上的朝阳对它生长最好，应充分加以利用。如果春季阴雨天过多，晚上要用光管给它增加光照，以利日后开花。蝴蝶兰对病虫害的抵抗力较弱，经常会发生叶斑病和根腐病，可采用农药百菌清或达仙冲1000倍溶液喷射，每隔七八天喷1次，连喷3次。这些药液沾在叶上留有白色痕迹，可不必抹去，以利于继续发挥杀菌作用。
2蝴蝶兰的快速繁殖技术
2.1茎尖培养
将除去叶的茎用流水冲洗干净，再用10%的漂白粉表面消毒15min，除去叶原基后，用5%漂白粉用业灭菌10min,用无菌水冲洗干净。在无菌条件下将茎尖及叶基部腋芽切成大小约2～3mm的方块，进行接种。
2.2蝴蝶蝶兰的诱导培养基为ＶＷ、ＫＣ、ＭＳ、ＢＫ
用培养基附加15%的椰乳进行液体和固体培养。液体培养时，至于以160转/min速度震荡培养，10d左右更新新的培养液。培养温度为25℃，光强2000LX，每天光照16～24h，1个月左右诱导出原球茎，这时可转到固体培养基上继续培养。也可取试管苗植株的直径约为0.30mm的茎尖，不需要消毒接种在MS+BA3mg/1的培养基上，培养温度为23-27℃，光强1500LX,14d后茎尖膨大，颜色转绿，三个月后，原球茎直径生长达6mm。
2.3叶片培养
取试管实生苗片尾外植体，实生苗年龄以3～4个月为最好，其诱导率及每个外植体上的原球增殖的个数最高。对于120d的小苗，可将整叶切下直接插入培养基中，效果比将叶切断好。并且取自第1叶的外植体，原球茎形成率较老叶好；将幼叶骗切断进行培养时，中间部分原球茎形成率比顶部和基部好；成年植株用叶片基部好；切断大小与诱导率直接相关，切断太小成活率低，以0.50cm 左右为最好。原球茎的诱导培养基选用。
2.4花梗腋培养
增殖，最后分化成苗。另一种培养方式是不切下腋芽，取带叶芽的花梗先进行消毒，想消毒后的芽接种到卡特兰属1号培养基上并在培养基中加入10%的香蕉匀浆。也可用VW液体培养基震荡培养一段时间后，产生原球茎，进行切割转移、取带腋芽的花梗节。消毒后直接插入培养基上，接种7天后，侧芽膨大并向外伸长。
2.5根尖培养
将150天实生苗根尖培养在附加肌醇100mg/l、烟酸1mg/l、VB6 mg/l、VB110 mg/l、蔗糖30g/l,PH=5.5的B5培养基上，或以30转/min的转速液体震荡培养，培养温度5℃，光强2000lx
每天光照12h，结果光培养与暗培养的诱导率差异不大，KT10mg/l和NAA5mg/Ld的激素配比诱导率最高达70%。原球茎的增殖在同样的培养基上，6个月后可形成幼苗。
2.6 原球茎的继代培养与育苗
继代培养基可选用诱导培养基，也可选用KC、KYOTO。可适当加人某些附加物质及调整激素含量以促进原球茎的生长。育苗时用培养基可选用继代培养基，加入一定量复合添加物质促进小植株的发育，如香蕉匀浆或椰乳，也可加人少量的维生素，促进根的生长。进行球茎增殖时，将需要转移的球茎切成几小块，转人新培养基进行增殖培养，培养一段时间后，再进行切割转移，通过这种方式原球茎成倍增长。不需继代的原球茎在继代培养基或育苗培养基上分化出芽，并逐渐发育成丛生小植株，切开丛生小植株，转人育苗培养基上，不久小植株生根，等长到一定大小时可移人温室。切离丛生小植株时，基部未分化的原球茎及刚分化的小芽不要丢弃，收集起来植人另一育苗培养基中，作为种苗。异端时间后将长大的种苗挑出，种植，小苗和原球茎可继续增殖分化。这样既能得到大量的种苗，又能得到大量的不断分化的试管苗。
3蝴蝶兰的栽培管理
3.1栽培介质
蝴蝶兰常见的栽培介质主要以水草、苔藓为主。
3.2温度
蝴蝶兰喜欢高温高湿的环境，生长时期最低温度应保持在15℃以上，蝴蝶兰适宜生长温度为16℃至30℃。秋冬和冬春之交以及冬季气温低时应注意增温。夏季温度偏高时需要降温，并注意通风，若温度高于32℃，蝴蝶兰通常会进入半休眠状态，要避免持续高温。春节前后为盛花期，适当降温可延长观赏时间，开花时夜间温度最好控制在13℃至16℃之间，但不能低于13℃。
3.3浇水
蝴蝶兰原产于原始森林中，雾气较多，温度较高。zB Wlwm)9蝴蝶兰没有粗大的假球茎储存养分，如果空气中温度不足，则叶面发皱且软弱无力。因此，蝴蝶兰宜在通风、湿度高的环境中栽培养护。蝴蝶兰适宜生长空气湿度为50％至80％。
3.4光照
尽管蝴蝶兰较喜阴，但仍需要使兰株能接受部分光照，尤其花期前后，适当的光可促使蝴蝶兰开花，使开出的花艳丽持久，一般应放在室内有散射光处，勿让阳光直射。
3.5通风
蝴蝶兰的正常生长需要流动的新鲜空气，尤其是在夏季高湿期，一定要以良好的通风来防暑，同时也能避免病虫害的感染。
3.6营养
蝴蝶兰要全年施肥，除非低温持续很久，否则不应停肥。冬天为蝴蝶兰的花芽分化期，停肥很容易导致无花或花少。春夏期间为生长期，可每隔7天至10天施用一次稀薄液肥，宜用有机肥，也可施用蝴蝶兰专用营养液，但有花蕾时勿施，否则容易提早落蕾。夏天长叶（即花期过后），可以追施氮肥和钾肥。秋冬花茎生长期则可用磷肥，但要稀薄，约每隔2周至3周施用一次。施肥的时间在下午浇水以后，施肥数次后，要用大量水冲洗兰盆及兰株，以免残留的无机盐类危害根部。3.7花后管理
花期一般在春节前后，观赏期可长达2个月至3个月。当花枯萎后，须尽早将凋谢的花剪去，这样可减少养分的消耗。
4蝴蝶兰褐变产生的影响因素
影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。
4.1植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型
植物种类及基因型不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。
4.2外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同
外植体部位及生理状态外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。
4.3培养基成分
培养基成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要。另外，其pH
值也与褐变程度有较大关系。
4.4培养条件
温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素[1]。
5防止外植体产生褐变的对策
从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质——氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。
5.1适当外植体的选择
取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。用无菌苗不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。
5.2对外植体的处理
通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5℃的低温下处理12-24小时，再用升汞或70酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出，3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。用抗坏血酸预处理吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。
5.3适宜的培养基
培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型。
5.3.1适当的无机盐浓度在组织培养防止褐变所进行的试验中，4种培养基的无机盐以改良MS(大量元素减半)和1/2MS的效果最好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变的程度。
5.3.2适当和适量的激素在组织培养过程中，培养基中添加1mg/LBA 0.5mg/L2,4-D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。培养基中添加1mg/LBA 1mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松，增殖也快。
5.3.3培养基的硬度在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，褐变率低，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。
5.3.4培养基中水的硬度硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡。这可能是配制培养基的水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。
5.3.5培养基的pH值在细胞培养中，pH值为4.5-5.0时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为5.5-
6.0时，愈伤组织严重褐变。一般来说，酸性环境(pH 值为4.5-5.0)不利于褐变过程的发生。
5.3.6培养条件如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，细胞内CO32-增多，CO32-与细胞膜上的CO32-结合，使有效CO32-减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。
5.4添加褐变抑制剂和吸附剂
褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚[12]。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子
中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2 结合，从而降低了其活力。
常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等,从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变。
5.5进行细胞筛选和多次转移
在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题。
5总结
植物组织培养既是植物遗传工程的基础和关键环节之一，也是一种实用性极强的高新技术。通过学习植物组织培养技术我了解了了蝴蝶兰组织的常规问题和培养基成分，繁殖方法。在许多植物组织培养过程中，常遇到褐变问题。褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。学习了这门课程是我受益匪浅，对我以后进一步的学习以及以后的工作都有很大的帮助。
致谢
感谢刘老师对我的教育培养。她细心指导我的学习与研究，在此，我要向老师深深地鞠上一躬。老师为我提供了良好的研究条件，谨向各位同仁表示诚挚的敬意和谢忱。生活的关心和帮助。感谢他对我的理解与支持。他严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样；他们循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪。感谢我的刘老师，这片论文的每个实验细节和每个数据，都离不开你的……
参考文献
[1]陈超；王桂兰；乔永旭；孙晓燕；蝴蝶兰无菌播种方法的比较研究北方园艺；2006年01期
[2]杨美纯；周歧伟；许鸿源；蝴蝶兰的种子培养广西农业生物科学；2002年04期
[3]范成五；黄燕芬；久兰；刘建英；蝴蝶兰无菌播种繁殖试验贵州农业科学；2006年04期
[4]胡海英；王建宇；陈卫民；北方地区蝴蝶兰瓶苗出瓶后的栽培与管理北方园艺；2004年06期
[5]丁峰；徐建新；孙莉；朱秀琴；蝴蝶兰无菌播种快繁技术江苏农业科学；2005年04期
[6]廖福琴；黄萍萍；张永柏；张添峰；蝴蝶兰无菌播种快繁技术闽西职业大学学报；2004年01期
[7]洪玉；蝴蝶兰无菌播种繁殖技术中国花卉园艺；2005年06期