冠突散囊菌黑茶发酵液对消化酶活性影响的研究
黄 群
*
陈林杰 李彦坡 车 科
(吉首大学食品科学研究所 吉首 416000)
摘要:在模拟人体胃肠环境中研究不同发酵时期的冠突散囊菌黑茶发酵液对淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影响。结果表明冠突散囊菌黑茶发酵液能显著提高 淀粉酶、蛋白酶活力,并有效抑制脂肪酶活力。冠突散囊菌发酵液利于淀粉、蛋白质消化吸收,抑制脂肪分解吸收,为解释茯砖茶的保健功能提供了理论依据。关键词:冠突散囊菌,黑茶发酵液,淀粉酶,蛋白酶,脂肪酶,酶活
中图分类号:TS201 5 文献标识码:A 文章编号:0253 2654(2007)05 0917 04
Study on the Effect o f Dark Tea Fermentation Liquid
with Eurotium cristatum on the Activity of Digestive Enzyme
HUANG Qun * C HEN Li n Jie LI Yan Po C HE Ke
(In stitute o f Food Scien ce ,Jishou U ni versit y ,Jishou 416000)
Abs tract :The effect of d ark tea fermentation liqu id wi th Eu rot iu m Crista tum on the activity of di ges ti ve enzyme was research ed ,as fellowi ng a mylase,p rotease,lip ase.The resul ts sh owed that dark tea fe rmentation liqu id wi th Eu rotiu m Crista tum may i ncrease remarkably the activi ty of amylase and p rotease,bu t decrease effi cien tly th e acti vi ty of lip ase.Th e fermen tati on liq uid i mp roves the di ges ti on an d ab sorp tion of starch and p rotein,bu t i nhib its the decomp osition an d ab sorp tion of fat,so i t can explain the mechanis m of Fu b rick tea s health function s.K ey words :Eurotium Crista tum ,D ark tea fermentation li quid ,A mylase,Protease,Lipase,Enz yme activity
*
通讯作者 Tel:0743 *******,E mai l:huangqunlaos hi@126 co m
收稿日期:2006 12 22,修回日期:2007 03 19
茯砖茶属紧压黑茶,主销西北少数民族地区,能 消腥肉之腻,解青稞之热 ,并补充人体维生素
[1,2]
。茯砖茶加工的 发花 过程是其形成独特品
质的关键工艺,实质是通过控制外界条件促进优势菌 冠突散囊菌的生长繁殖,产生金黄色闭囊壳,俗称 金花
[3~5]
,消费者历来根据 金花 的质量
和数量判断茯砖茶品质的优劣,有 茶好金花开,花多茶质好 之说。
目前对冠突散囊菌的研究主要集中在菌种鉴定、固体培养等方面,而有关冠突散囊菌在茯砖茶促消化功能中所起作用及机理却鲜见报道。本实验在模拟人体胃肠环境中,研究不同发酵时期的冠突散囊菌黑茶发酵液对淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影响,为进一步研究茯砖茶调节人体消化功能机理提供理论依据。
1 材料与方法
1 1 材料
1 1 1 菌种与原料:冠突散囊菌,实验室保存;黑毛茶,茯砖茶,绿茶等市售。
1 1
2 酶制剂:淀粉酶(Diastase,2000U g),胰蛋白酶(Trypsin,2500U mg ),胃蛋白酶(Pepsin,1000U mg),脂肪酶(Lipase,3000U g)等购自中国医药(集团)上海化学试剂公司。
1 1 3 主要试剂:氢氧化钠、盐酸、磷酸氢二钠、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、碳酸钠、三氯乙酸、磷酸二氢钠、乳酸、乳酸钠等均为分析纯;二甲基甲酰胺、甲醇、冰醋酸等为色谱纯。1
2 主要仪器与设备
722 S 型分光光度计,ZD 2型自动电位滴定仪,SHA C 型水浴恒温振荡器,YXQ.SG46 280型高压蒸汽灭菌器,GZX 9146MBE 型电热恒温鼓风干燥箱,
BI OF 2000型机械搅拌发酵罐。
1 3 方法
1 3 1 酶液制备与稀释:胰蛋白酶酶液:用蒸馏水稀释至500倍;胃蛋白酶酶液:用蒸馏水稀释至250倍。
1 3
2 模拟胃液配制[6]:10 0%的盐酸16 4mL,加水稀释至pH值为1,1 105Pa灭菌30min,冷却至40 以下,每100mL加入1mL胃蛋白酶酶液、0 5g 脂肪酶,混匀后备用。
1 3 3 模拟肠液配制[6]:磷酸二氢钾6 8g,加水500mL溶解,用0 4%氢氧化钠溶液调pH值至6 8,加水稀释至1000mL,1 105Pa灭菌30min,冷却至50 以下,每100mL加入1mL胰蛋白酶酶液、0 5g 脂肪酶、0 5g淀粉酶,混匀后备用。
1 3 4 冠突散囊菌黑茶发酵液制备:称取80g黑毛茶(茶梗16%)磨碎试样于铝锅中,加沸蒸馏水8L,立即移到电炉上保持沸腾,浸提45min(每10min搅拌1次),立即减压过滤,残渣用少量蒸馏水洗2~3次,合并滤液加蒸馏水定容至8L。将液体培养基倒入10L发酵罐中,通入蒸汽加热,1 105Pa灭菌30min,并使液体培养基液面达10L刻度处,循环水冷却至37 ,接入冠突散囊菌孢子悬液(5 0~6 0 108个 mL)100m L,30 、100r min培养108h后终止发酵,取不同发酵时间液体过滤即得发酵液。
1 3 5 茶汁与茶多酚复合物制备:茶汁制备:分别称取4 000g黑毛茶(茶梗占16%)、绿茶、茯砖茶磨碎试样于500mL三角瓶中,加入沸蒸馏水450m L,立即移入沸水浴,浸提45min(每10min摇动1次),减压过滤,残渣用少量蒸馏水洗2~3次,合并滤液于500mL容量瓶,冷却后用蒸馏水定容至刻度。
茶多酚复合物制备:茶多酚复合物A:按茯砖茶茶多酚含量配制,即含茶多酚复合物48 73mg 100mL;茶多酚复合物B:按茯砖茶茶多酚含量的2倍配制,即含茶多酚复合物97 46mg 100mL。
1 3 6 对消化酶活性影响:取10mL模拟胃液或模拟肠液置于25mL容量瓶中,分别加5m L冠突散囊菌黑茶发酵液和各种茶汁,37 水浴保温30min后测定 淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活力。
1 3 7 测定方法
淀粉酶活力测定:参考文献[7];蛋白酶活力测定:参考文献[8];脂肪酶活力测定:参考文献[9];氨基酸测定:茚三酮比色法[10];茶多酚测定:酒石酸铁比色法[11];茶色素测定:分光光度计法[12]。
儿茶素测定:高效液相色谱法[11],色谱柱Inertsie ODS 3(5 m,4 6mm 250mm),检测器UV280nm,样品采用梯度洗脱,洗脱液由A、B两相组成,A为水相,B为二甲基甲酰胺:甲醇:冰醋酸= 40 2 1(V V V),流速1 0mL min,柱温35 ,进样量20 L。
2 结果与分析
2 1 发酵液与茶样主要成分比较
黑茶发酵液及各种茶样的主要理化成分测定结果如表1所示。由表分析可知,绿茶中茶多酚、儿茶素和氨基酸含量最高,茶黄素含量也较高,而茶褐素含量最低;黑毛茶中茶多酚、儿茶素和氨基酸含量较高,仅次于绿茶;与绿茶和黑毛茶相比较,茯砖茶和发酵液中茶多酚、儿茶素和氨基酸含量低得多,而茶红素、茶褐素含量相对较高,茯砖茶中茶黄素含量也较高,发酵液中茶黄素相对较低;发酵液中茶多酚、儿茶素、茶黄素和茶红素等随发酵时间延长均呈下降趋势,茶褐素含量则随发酵时间延长而增加。
表1 冠突散囊菌黑茶发酵液和各种茶的主要成分
样品
含量(mg 100mL)
茶多酚氨基酸茶黄素茶红素茶褐素儿茶素绿茶汁261 5520 262 0415 959 82162 42黑毛茶汁123 728 341 5216 0837 6361 90茯砖茶汁48 731 952 3422 3534 2928 40发酵液A(36h)81 545 541 7923 3439 1434 51发酵液B(72h)64 861 870 8723 3441 3524 36发酵液C(108h)52 572 485*21 4548 7919 95注:*含量极少或没有,不能检出。
2 2 对 淀粉酶活性影响
在模拟肠液中,冠突散囊菌黑茶发酵液和各种茶样对 淀粉酶活力影响见表2。结果表明,黑茶发酵液和各种茶汁均能提高 淀粉酶活力,激活效果为:发酵液C>发酵液B>茯砖茶汁>发酵液A>绿茶汁>茶多酚复合物B>黑毛茶汁>茶多酚复合物A>对照。
茶多酚复合物也能提高 淀粉酶活力,并随浓度增大有所升高,这是由于茶多酚为大分子物质,
在一定条件下其羟基能与 淀粉酶的酶蛋白络合,使 淀粉酶的活性中心暴露,易与底物结合,加快了酶促反应的速度。与茶多酚复合物相比,发酵液和茯砖茶样对 淀粉酶的激活效果更显著,可能与发酵液和茯砖茶的茶色素和有机酸有关,在茯砖茶 发花 及黑茶液发酵过程中,茶多酚类物质在冠突散囊菌的作用下氧化聚合,转化为更具酶催化活性的聚合物,对 淀粉酶而言茶色素比茶多酚更具生物活性,具体机理有待进步研究。此外,有研究表明有机酸也能提高 淀粉酶活性。
表2 冠突散囊菌黑茶发酵液及各种茶对
淀粉酶活力的影响
试验组合 淀粉酶活力
(U mL)
与对照的
倍数关系
模拟肠液(未加茶汁的对照)2 9271 00
模拟肠液+绿茶汁3 9231 34
模拟肠液+黑毛茶汁3 5851 22
模拟肠液+茯砖茶汁4 2791 46
模拟肠液+发酵液A(36h)4 1281 41
模拟肠液+发酵液B(72h)4 6641 59
模拟肠液+发酵液C(108h)4 6841 60
模拟肠液+茶多酚复合物A3 3081 13
模拟肠液+茶多酚复合物B3 6291 24
2 3 对蛋白酶活性影响
在模拟胃液和模拟肠液中,冠突散囊菌黑茶发酵液和各种茶样对蛋白酶活力影响见表3。模拟胃液中激活效果为:发酵液B>发酵液C>茯砖茶汁>发酵液A>黑毛茶汁>绿茶汁>茶多酚复合物B >茶多酚复合物A>对照;模拟肠液中激活效果为:发酵液C>发酵液B>茯砖茶汁>发酵液A>黑毛茶汁>茶多酚复合物B>绿茶汁>茶多酚复合物A >对照。发酵液和茯砖茶汁在模拟胃液和模拟肠液中均能显著提高蛋白酶活力,机理与促淀粉酶活力相似。此外,发酵液在模拟胃液中要比在模拟肠液中促蛋白酶效果更显著,这与两种模拟液pH值相差较大有关,在酸性环境中更利于蛋白酶活性提高。
2 4 对脂肪酶活性影响
在模拟胃液和模拟肠液中,冠突散囊菌黑茶发酵液和各种茶样对脂肪酶活力影响见表4。分析可知,发酵液和各种茶样对脂肪酶活性均有不同程度
表3 冠突散囊菌黑茶发酵液及各种茶对
蛋白酶活力的影响
试验组合
蛋白酶活力
(U mL)
与对照的倍数
关系
模拟胃液(未加茶汁的对照)23 351 00
模拟胃液+绿茶汁58 612 51
模拟胃液+黑毛茶汁67 952 91
模拟胃液+茯砖茶汁87 803 76
模拟胃液+发酵液A(36h)82 663 54
模拟胃液+发酵液B(72h)92 933 98
模拟胃液+发酵液C(108h)89 663 84
模拟胃液+茶多酚复合物A35 961 54
模拟胃液+茶多酚复合物B46 001 97
模拟肠液(未加茶汁的对照)13 081 00
模拟肠液+绿茶汁19 881 52
模拟肠液+黑毛茶汁25 901 98
模拟肠液+茯砖茶汁37 542 87
模拟肠液+发酵液A(36h)33 622 57
模拟肠液+发酵液B(72h)45 133 45
模拟肠液+发酵液C(108h)47 223 61
模拟肠液+茶多酚复合物A15 831 21
模拟肠液+茶多酚复合物B31 211 57表4 冠突散囊菌黑茶发酵液及各种茶对
脂肪酶活力的影响
试验组合
脂肪酶活力
(U mL)
与对照的倍数
关系
模拟胃液(未加茶汁的对照)4 951 00
模拟胃液+绿茶汁4 370 88
模拟胃液+黑毛茶汁3 960 80
模拟胃液+茯砖茶汁3 010 63
模拟胃液+发酵液A(36h)4 160 84
模拟胃液+发酵液B(72h)2 680 54
模拟胃液+发酵液C(108h)2 210 45
模拟肠液(未加茶汁的对照)24 851 00
模拟肠液+绿茶汁22 550 91
模拟肠液+黑毛茶汁17 820 77
模拟肠液+茯砖茶汁21 480 87
模拟肠液+发酵液A(36h)23 170 93
模拟肠液+发酵液B(72h)21 390 86
模拟肠液+发酵液C(108h)25 641 03
的抑制作用。模拟胃液中抑制效果为:发酵液C>
发酵液B>茯砖茶汁>黑毛茶汁>发酵液A>绿茶汁>对照;模拟肠液中抑制效果为:黑毛茶汁>发酵液B>茯砖茶汁>绿茶汁>发酵液A>对照>发酵液C。此外,发酵液在模拟胃液中抑制脂肪酶活性的效果要比模拟肠液中更显著,这是因为两种模拟液pH值相差较大,在酸性环境中更利于抑制脂肪酶活性,该效应是否与酶分子的结构有关,尚待进一步研究。
3 结论
在模拟肠液中,发酵液、茶汁和茶多酚复合物均能提高 淀粉酶活力,但发酵液的激活效果更明显。在模拟胃液和模拟肠液中,发酵液和茯砖茶汁均能显著提高蛋白酶活力,且促酶效果远大于黑毛茶汁、绿茶汁等对照样。冠突散囊菌发酵液可促进 淀粉酶对淀粉的酶解、胃蛋白酶和胰蛋白酶对蛋白质的酶解,有利于淀粉、蛋白质消化吸收,改善人体肠道功能。在模拟胃液中,冠突散囊菌发酵液抑制脂肪酶活力的效果明显优于黑毛茶汁、绿茶汁等对照样,而在模拟肠液中抑脂肪酶活力效果为:黑毛茶汁>发酵液B>茯砖茶汁>发酵液A>发酵液C>绿茶汁。冠突散囊菌发酵液能抑制脂肪在消化系统中的降解、吸收,为茯砖茶降脂减肥功能提供了理论依据。冠突散囊菌黑茶发酵液对消化酶活性影响的机理、动力学过程尚不清楚,有待进一步研究探索。
参考文献
[1]陈晓阳.茶叶通讯,1997,1:41~42
[2]杨抚林.茶叶科学技术,2005,1(186):4~7
[3]王志刚,童 哲,程苏云,等.食品科学,1992,5:29~33
[4]刘作易.贵州农业科学,1992,1:36~40
[5]齐祖同,孙曾美.真菌学报,1990,9(3):176~179
[6]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(第
二部).北京:化学工业出版社,附录XA72~74
[7]中华人民共和国行业标准.QB1805 1 93 淀粉酶制剂.
[8]中华人民共和国行业标准.QB1805 3 93蛋白酶活力的试验方
法.
[9]中华人民共和国行业标准.QB1805 4 93脂肪酶活力的试验方
法.
[10]周传云.微生物实验技术.长沙:湖南农业大学.2002.
[11]黄意欢.茶学实验技术.北京:中国农业出版社.1997.
[12]中华人民共和国国家标准.GB8313 87茶多酚测定.
稿件规范化与标准化
论文中计量单位的表示方法
为执行国务院发布的 关于在我国统一实行法定计量单位的命令 的规定,计量单位和单位符号按国家技术监督局发布的 量和单位 GB3100-3102-93执行。单位符号均用英文小写(正体),不允许随便对单位符号进行修饰。现将本刊常用计量单位和符号介绍如下,希望作者参照执行。
时间:年用a;日用d;小时用h;分钟用min;秒用s等表示。
溶液浓度:用mol L,不用M(克分子浓度)和N(当量浓度)等非许用单位表示。
旋转速度:用r min,不用rpm。
蒸汽压力:用Pa或kPa、MPa表示。
光密度:用OD(斜体)表示。
生物大分子的分子量:蛋白质用D或kD,核酸用bp或kb表示。
图表中数值的物理量和单位:用量和单位的比值表示数值,即物理量符号(斜体)与单位(正体)之间用斜线隔开,例如:t h(表示时间,单位是小时)。
带数值的计量单位:计量单位不能省略,例如:20cm 0 3cm,不能写成20 0 3c m;3 ~5 不可写成3~5 ;3%~6%不可写成3~6%等。
食品微生物课程论文 题目乳酸菌的代谢、发酵及其在食品工业中的应用姓名费鹏学号2013309010006 专业食品科学评分 指导教师谢笔钧职称教授 中国·武汉 二○一三年十二月
乳酸菌的代谢、发酵及其在食品工业中的应用 摘要：乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是最早被人类用于食品储藏加工的微生物之一，其通过发酵糖类，主要产生乳酸，被广泛应用于发酵肉制品、酱油、白酒、饮料等行业。本文对其代谢过程、发酵条件及其在食品中的应用进行了综述。 关键词：乳酸菌；代谢；发酵；食品工业 Abstract: Lactic acid bacteria is one of microorganisms which human being earliest used in food storage and processing. It can produce lactic acid by fermenting saccharides, which were applied in the field of fermented meat product, soy, wine, beverage and so on. This paper introduced the metabolism, fermentation conditions of LAB and its application in food industry. Keywords: Lactic acid bacteria; metabolism; fermentation; food industry 乳酸菌是一类能利用可发酵性碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称[1]。乳酸菌不是分类学上的名词，属于真细菌纲(Eubacteriac)真细菌目(Eabacteriales)中的乳酸细菌科(lactobacillaceae )。在伯杰氏系统细菌分类学上，目前已发现的乳酸菌，至少分布于乳杆菌属(Lactobacillus )、链球菌属(Strptococcus )、明串珠菌属(Leuconostoc )，乳球菌属(Lactococcus)等19个属的微生物中。其中，在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要分布在乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等七个属种。 乳酸菌是革兰氏阳性，不形成芽孢(个别属除外)，不运动或少运动，不耐高温，但耐酸的球菌或杆菌，乳酸菌是一种兼性厌氧菌，适合于在氧含量低或无氧的环境中生长[2]。与其它细菌相比，乳酸菌对营养的要求比较严格，除了要供给适量的水分、充足的碳源、氮源和无机盐类外，还需要加入维生素、氨基酸和肤等生长因子。乳酸菌都能发酵一定的糖类产生乳酸(分同型乳酸发酵和异型乳酸发酵)，但分解蛋白质和脂肪能力微弱，过氧化氢酶反应呈阴性，适宜在偏酸的环境中生长，其结果可使培养基pH值降到5.0以下，产酸及耐酸能力都较强。 1. 乳酸菌的代谢 微生物的代谢是指发生在活细胞中的各种分解代谢（catabolism）和合成代谢（anabolism）的总和。其中分解代谢过程将复杂的有机物分子通过分解代谢
淮北师范大学信息学院 07生物工程 实验课题：利用黑曲霉生产柠檬酸的 实验设计方案 设计成员：万纹纹王磊 陈晨夏柱宝 指导老师：高翔
利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案 实验步骤： 筛选 → 诱变 → 培养基条件 → 发酵→ 产品分离纯化 一、 菌种的筛选： 1、 土壤采样： 采样人： 万纹纹 王磊 陈晨 夏柱宝 采样时间： 采样地点： 环境条件： 用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm 处的土样10～25g ，装入事先准备好的塑料袋内扎好。应在三处不同的地点进行采样，将采集好的样品带回实验室备用。 2、 倒平板： 将PDA 培养基加热融化，待冷却至55-60℃倒平板15皿。 PDA 培养基配方： 马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 自然 3、 制备土壤稀释液：各称土样10g ，迅速倒入带玻璃珠的90mL 无菌水的三角瓶中(玻璃珠 用量以充满瓶底力最好)，振荡约20min ，使土样充分打散，用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后在用无菌吸管从此试管中 吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管里，混合均匀，以此类推制成110-、210-、3 10-、410-、510-、610-不同稀释度的土壤溶液。
4、 涂布：将倒好平板的底面用记号笔标上4 10-、5 10-和6 10-三种稀释度，然后用无菌吸 管分别由4 10-、5 10-和6 10-三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温静置5-10min ，使菌液吸附进培养基。 5、 培养： 将涂布好的平板倒置于35℃的培养箱中培养3-5d. 6、 挑菌落：黑曲霉形态特征：在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。孢子区域为黑 色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐，菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成1层或2层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。 用灭菌后的接种环在单个菌落上挑取少许要分离的细胞，接种到PDA 培养基的斜面上。置于35℃的培养箱中培养，待菌苔长出后观察其特征是否一致。 7、 划线分离： 用灭菌后的接种环挑取斜面培养基上的菌落在培养皿中划线。此步需要9 个培养皿。（注意：接种的过程最好在接种箱内进行。）将已划线的培养皿置于35℃的培养箱中培养3-5d 。观察菌落特征是否一致。 8、 镜检：在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已 产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。（试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液；仪器用具：无菌吸管，载玻片，盖玻片，解剖针，镊子，50%乙醇及显微镜等） 9、 制备母斜面：用灭菌的接种环将三种划线平板中的纯种黑曲霉接种到斜面上，作为母斜 面，35℃培养，备用。 10、产酸能力的检测： 将培养基50ml 分装到250ml 三角瓶内，灭菌后接入斜面孢子2环，于30~33℃培养。旋转式摇床的转速为300r/min ，往复式摇床振幅6cm ，频率为120
乳酸菌及其乳酸菌发酵食品 发酵是一种古老、传统的食品储存与加工的方法，凡利用微生物的作用而制得的食品都可以称为发酵食品。发酵食品是人类巧妙地利用有益微生物加工制造的一类食品，具有独特的风味和营养价值，丰富了我们的饮食生活。发酵食品因在食品加工过程中有微生物参与作用，进而可以形成一些特异性风味物质和营养因子，如乳酸菌参与牛乳发酵，产生乙醛、丁二酮、丙酮、3-羟基丁酮、挥发性酸等芳香物质，以及胞外多糖、乳酸菌素、γ-氨基丁酸等营养因子。 乳酸菌是发酵食品最主要的有益微生物之一，人类对于乳酸菌的应用历史非常久远，在远古人类就在酿造食品方面不自觉地利用了乳酸菌。但是，人类能主动地去研究和掌握乳酸菌的生活规律，并加以应用，还是近百年的事。 1 乳酸菌 1.1 乳酸菌的分类 乳酸菌是一类以糖为原料产乳酸为主的细菌的总称，乳酸菌不是分类学上的名词，属于真细菌纲(Eubacteriac)真细菌目(Eabacteriales)中的乳酸细菌科(lactobacillaceae)。在伯杰氏系统细菌分类学上，目前已发现的乳酸菌，至少分布于乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Strptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)，乳球菌属(Lactococcus)等19个属的微生物中。其中，在食品、医药等领域应用较多的乳酸菌主要分布在乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等七个属种。 1.2 乳酸菌的基本特性 乳酸菌是革兰氏阳性，不形成芽孢(个别属除外)，不运动或少运动，不耐高温，但耐酸的球菌或杆菌，乳酸菌是一种兼性厌氧菌，适合于在氧含量低或无氧的环境中生长。与其它细菌相比，乳酸菌对营养的要求比较严格，除了要供给适量的水分、充足的碳源、氮源和无机盐类外，还需要加入维生素、氨基酸等生长因子。乳酸菌都能发酵一定的糖类产生乳酸，但分解蛋白质和脂肪能力微弱，过氧化氢酶反应呈阴性，适宜在偏酸的环境中生长，可使培养基pH 值降到5.0以下，产酸及耐酸能力都较强。 1.3 乳酸菌的发酵类型 乳酸菌的发酵根据产物的不同，分为三种类型：同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧发酵。同型乳酸发酵是指发酵终产物中90%以上为乳酸的乳酸发酵过程，以乳酸链球菌和多数乳酸杆菌为主。异型乳酸发酵是指发酵终产物中除乳酸外,还有乙醇、二氧化碳等成分的乳酸发酵过程，以明串珠菌属的乳酸菌以及某些乳酸杆菌,如肠膜明串珠菌、短乳杆菌、甘露醇乳杆菌等。双歧发酵是双歧杆菌的产能模式，双歧杆菌是一类特殊的严格厌氧菌,对营养要求较高,它们对葡萄糖的代谢也可归入异型乳酸发酵,但与其他乳酸菌的异型发酵不同。 1.4 乳酸菌的代谢产物 乳酸菌发酵的代谢产物主要有有机酸类、细菌素类、乙醛等芳香物质、胞外多糖、γ-氨基丁酸等。有机酸类主要有乳酸、乙酸，及少量的甲酸、丙酸等，具有抗菌防腐的作用，并带给食品酸性的口感；细菌素又称乳酸菌素，具有固定抗菌谱，对病原菌和腐败菌具有很强的抑制能力；乙醛等芳香物质给乳酸菌发酵食品带来独特的发酵风味；胞外多糖作为生命物质的重要组成部分，广泛参与细胞的各种生命现象及生理过程的调节；γ-氨基丁酸是神经系统中重要的抑制性神经递质，具有改善脑机能，调节情绪抗焦虑，降低血压等方面具有重要作用。
黑曲霉发酵生产α-淀粉酶 前言： α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。自从日本研究者 YasujiMinoda等人用黑曲霉生产耐酸性α-淀粉酶以来，各国都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究。 通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。整个实验按照“菌种的培养空消实消接种发酵放罐”的发酵过程进行。在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。 正文： 一、实验目的 1．了解发酵罐的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。 2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤 3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤 4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法 二、实验原理 1.蒸汽系统： 蒸汽发生器：主要用于灭菌，分为自动加水和手动加水两种方式。 2.温度系统： (1) 夹套升温：蒸汽通入夹套。 (2) 夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。 (3) 发酵过程自动控温系统 3.空气系统： 空气除菌设备：空压机贮气罐油水分离器空气流量计空气过滤器发酵罐 4.补料系统：补加培养基、消泡剂、酸碱等。 5.在线控制系统 6.进出料系统：进料口（接种口）、出料口（取样口） 7.管道：包括水流通管道和气流通管道
关于酸奶发酵剂的综述报告 摘要随着现代生活水平的逐渐提高，人们对于乳制品的需求越来越高。而酸奶作为乳制品中的重要成员之一，以其独特的风味、极高的营养价值倍受人们青睐，成为人们必不可少的一种饮品。酸奶发酵剂指的是制做酸奶和乳酸菌饮料而调制的特定微生物的培养物。酸奶发酵剂的优劣与产品质量的好坏有极为密切的关系。酸奶发酵剂一般由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌这两种乳酸菌组成。本论文简述了酸奶的历史、国内外发酵剂的研究概况、酸奶发酵剂的种类、制备方法以及乳酸菌的益处。 关键词酸奶；发酵剂；乳酸菌的益处；发酵剂的制备 酸奶是由生活在公元前3500年左右的保加利亚人祖先色雷斯人发明的，其用羊皮口袋装牛奶系在腰上，体温使牛奶里的细菌繁殖、发酵，从而生成酸奶。尽管酸奶有很悠久的历史，但实现工业化却是在乳酸菌被发现以后的事。1857年巴斯德发现了导致牛初乳发酵变酸的乳酸菌，人类才开始真正认识乳酸菌的真面目。20世纪初期，诺贝尔奖获得者梅契柯夫提出了“酸奶长寿说”，认为酸奶中的乳酸菌有利于健康长寿，这一学说推动了酸奶在欧美的普及，促进了对乳酸菌的研究。保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等逐步应用于酸奶，其性质也得到了广泛的研究。【1】 在国际上，根据酸奶发酵剂的产品性能将其分为3种类型：YO-Flex酸奶发酵剂、AB发酵剂和NU-Trish发酵剂。【2】YO- Flex酸奶发酵剂：丹麦汉森中心实验室通过分离、筛选、驯化、培育，在1988年底研制出的一种新型酸奶发酵剂，商业名为YO- Flex。此发酵剂也是由嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌组成。生物酸奶发酵剂-AB发酵剂：AB发酵剂中的A和B代表嗜酸乳杆菌和双歧杆菌。现已公认嗜酸乳杆菌和双歧杆菌能在人肠内定殖，前者在小肠内存活，后者寄居于大肠内。 NU-Trish发酵剂：虽然AB发酵剂生产的酸奶营养保健作用很好，但这2种乳酸菌发酵时只生成乳酸、醋酸和少量甲酸、乙醇、琥珀酸，不产生其他芳香物质，产品风味差。用嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌分别培养成工作发酵剂，在接种这2种工作发酵剂的同时，接种冻干直接使用型AB发酵剂。由于接种了普通酸奶发酵剂，发酵过程容易控制，缩短了发酵时间，产品具有纯正的酸奶风味。此类发酵剂现有4种，由4种单菌种嗜热链球菌与AB发酵剂菌种混合而成，也可称为ABT发酵剂。 在国内，根据酸奶发酵剂的发展大致可分为天然型、传统人工型和浓缩型3种。
乳酸菌发酵剂生物工程技术的研究 乳酸菌,其属于一类微生物,通过代谢乳糖方式产生乳酸,能够促使发酵产品pH值降低,在乳球菌属、明串球菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属及片球菌属中均含有乳酸菌微生物,除片球菌属外,以上菌属在发酵乳生产中获得广泛应用。随着发酵乳产品的发展,其已经成为人们日常饮食的重要部分,发酵乳制品逐渐发展为酸牛奶、干酪、发酵稀奶油等多种形式。应用乳酸菌发酵剂生物工程技术,能够有效提高发酵乳制品安全性、可口性及健康性。本文重点对乳品发酵工业中生物工程技术的应用及生物工程育种进行探索。 1 乳品发酵工业中生物工程技术的实际应用分析随着生物工程技术的不断发展,其在乳品发酵工业中的应用越发广泛,具体应用主要表现在以下方面:噬菌体抗性菌株分子育种、干酪风味及质构增强、提高干酪成熟速度、生产细菌素及生物胶、控制风味缺陷、生产食品级酶、异源蛋白质生产、降低干酪棕色化、发展冷敏感型发酵剂及发展低脂肪乳制品发酵剂等。本文以噬菌体抗性、细菌素、增加干酪成熟速度及异源蛋白质生产为重点,对生物工程技术在乳品发酵工业的应用进行分析。 噬菌体抗性噬菌体的存在,多会给乳品发酵业带来一定损失,其容易导致发酵风味不良,严重则会带来不发酵问题,尤其是针对干酪生产及嗜温发酵乳。产酸慢乳酸菌与中温性乳球菌其在生产中十分容易受到噬菌体影响。为此,进行乳酸菌噬菌体抗研究成为了乳酸菌生物工程技术发展的重要课题。为解决噬菌体污染问题,传统作业所采取的方法为:进行发酵剂系统轮换应用、对发酵剂进行无菌增殖、采取分离的噬菌体抗性菌株、应用抗噬菌体培养基以及保障生产卫生环境等。虽然采取这些方法能够实现对噬菌体污染的控制,但其并没有解决噬菌体污染及增值的根本问题。随着基因工程技术的发展,为噬菌体抗性乳球菌构建提供了技术支撑。通过应用生物工程技术,切实防治噬菌体污染及增值问题。当前,其技术研究主要集中于干扰噬菌体对细胞吸附、限制及修饰、流产感染、应用反义RNA技术等实现噬菌体污染防治。如通过应用循环不同限制及修饰机理与流产性抗性机理,进行抗噬菌体菌株构建,实现了培养基中污染的噬菌体有效控制。 细菌素乳酸菌细菌素从本质上而言,其属于蛋白质,将其作为防腐剂,容易被胃酶讲解,存在着良好的抑菌特性及理化特性。其中较为典型的nisin
活性乳酸菌发酵剂 活性乳酸菌发酵剂事实上就是酸奶发酵剂，主要是制作酸奶使用的特定的微生物培养材料。平时喝的酸奶产品的味道就是由活性乳酸菌发酵剂产生的，而活性乳酸菌发酵剂的质量也直接决定了酸奶的好坏，如果对生物反应比较了解，不难理解活性乳酸菌发酵剂制作酸奶的过程。 酸奶发酵剂是制作酸奶所用的特定的微生物培养材料。发酵剂在酸奶生产过程中的作用非常重要，发酵剂是酸奶产品产酸和产香的基础和主要原因。酸奶质量的好坏主要取决于酸奶发酵剂的品质类型及活力。 ★制作方法 液体酸奶发酵剂由于其品质不稳定且易受污染，已经逐渐被大型酸奶厂家所淘汰，只有一些中小型酸奶工厂还在联合一些大学或研究所进行生产；深冷冻酸奶发酵剂因其深冷冻链的费用比较高，使用的广泛性受到限制；而直投式酸奶发酵剂在其价格逐渐为国内厂家所接受后，已经开始在一些大型酸奶厂家推广使用。
在以前的酸奶生产过程中，酸奶发酵剂的菌种要在酸奶生产厂家单独设一菌种车间，以完成“纯菌→活化→扩大繁殖→母发酵剂→中间发酵剂→工作发酵剂”这一工艺过程，该过程工序多、技术要求严格，一般厂家由于生产条件有限，经常出现质量问题。所以，在乳业发达国家，酸奶生产厂家不自制发酵剂，由专门生产发酵剂的企业提供酸奶发酵剂，来满足发酵乳制品厂家的要求。丹麦的汉森中心实验室1988年底生产出超浓缩的直投式酸奶发 酵剂。 直投式酸奶发酵剂(Directed Vat Set, DVS)是指一系列高 度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，可直接加入到热处理的原料乳中进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其它预处理工作。直投式酸奶发酵剂的活菌数一般为1010 - 1012 CFU/g。由于直投式酸奶发酵剂的活力强、类型多，酸奶厂家可以根据需要任意选择，从而丰富了酸奶产品的品种，同时省去了菌种车间，减少了工作人员、投资和空间，简化了生产工艺。直投式酸奶发酵剂不需扩大培养，可直接使用，便于管理。直投式酸奶发酵剂的生产和应用可以使发酵剂生产专业化、社会化、规范化、统一化，从而使酸奶生产标准化，提高酸奶质量，保障了消费者的利益和健康。
黑曲霉发酵提取柠檬酸 实验一黑曲霉保藏菌的复苏 实验目的：了解黑曲霉保藏菌的生长状况和保藏菌的活化处理过程。实验原理：能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉中的一些菌株都能够利用淀粉质原料大量积累柠檬酸。目前国内主要利用黑曲霉（Aspergillus niger）通过固体发酵或液体深层发酵生产柠檬酸。发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是微生物产生糖化霉首先将淀粉转变为葡萄糖，葡萄糖经过糖酵解途径（EMP）转变为丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A，然后在柠檬酸合成酶的作用下乙酰辅酶A和草酰乙酸合成为柠檬酸。产生的柠檬酸经碳酸钙作用形成柠檬酸钙沉淀，再经稀硫酸作用释放出柠檬酸。 实验步骤：1、观察保藏菌的生长状况，记录PH 2、黑曲霉复苏培养基的配制 （1）、分别称取蔗糖30g，KNO3 1g, K2HPO4 1g, 麸皮10%，MgSO4.7H2O 0.5g, KCL 0.5g, FeSO4.7H2O 0.01g, 于500ml搪瓷缸中。 （2）、加蒸馏水100ml，调节pH至7.0-7.2 （3）、牛皮纸包扎，灭菌 3、保藏菌的活化扩增 （1）配制5oBe’麦芽琼脂培养基 （2）20℃麦芽汁，糖度为5
（3）加0.7%的琼脂 （4）加热，使其沸腾 （5）分装与试管中，每管约3ml （6）包扎灭菌，制成斜面培养基 （7）在超净工作台上划菌，包扎 （8）置于28~30℃培养箱中培养 实验要求：分析复苏和保藏培养基的区别，原因，营养成分的差异和操作的目的和意义。并加注参考文献。
实验二黑曲霉一级种子的制备 实验目的：了解种子扩大培养的程序，比较复苏均至一级种子的生境变化。 实验原理：黑曲霉在生长过程中不仅需要有充足的营养成分，而且还需要一定的氧气环境等。通过拌菌等增加菌种与培养基营养成分的充分接触，获得良好的生长。 实验步骤：1、观察活化的保藏菌生长状况，并记录。 2、在超净工作台上，将2-4管/组，活化的保藏菌分别加入约3mL双蒸水。 3、在混匀器上，将活化的保藏菌制成孢子悬液。 4、在超净工作台上，将孢子悬液一次倒入察氏培养基中。 5、用灭过菌的玻棒，将菌液和培养基充分拌匀。 6、测定此时的pH值，并记录。 7、取5ml充分拌匀的菌液培养基，用滤纸过滤。 8、收集滤液于20ml 离心管中。 9、3000r/min, 离心5min。 10、收集上清于试管中，标记后置于-4℃冰箱中。 11、每隔2天，用灭过菌的玻棒，在超净工作台上拌菌。同时测定pH，并取5ml样品，以上述做法，将收集的上清液保藏于-4℃冰箱中。注意：标记时，要标明实验日期，组别，班号。
利用黑曲霉发酵生产柠檬酸 摘要：柠檬酸是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一，它的用途非常广泛，需求日益增长。目前国内柠檬酸年产量约2.5×105吨，其中半数以上供出口之用。80年代，我国国内的柠檬酸消费急剧上升，速度远远超过了西方发达国家。随着人民生活水平的提高，对食品和饮料等含柠檬酸制品的需求量猛增，但就人均消费量来看，我国的柠檬酸消费还是很低的，以用于食品和饮料的柠檬酸为例，我国的人均消费量远低于美国和日本，市场潜力巨大，因此增加柠檬酸生产不仅可以满足国内日益增长的需要，也是换取外汇的重要手段之一。 柠檬酸是葡萄糖经柠檬酸循环而形成的最有代表性的代谢产物，早已发展成大规模的商用生产。常用的菌种是黑曲霉，产酸浓度在每升发酵液中＞150g。 关键词：黑曲霉，柠檬酸，三羧酸循环 1、柠檬酸用途 柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。柠檬酸的盐类、酯类和衍生物也各具特点，用途极为广泛而有良好的发展前景。 2、黑曲霉 黑曲霉，子囊菌亚门，丝孢目，丛梗孢科中的一个常见种。广泛分布于世界各地。食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、
柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。 3、柠檬酸循环（citric acid cycle，CAC） 又称三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），Krebs循环，由诺贝尔获奖者（1953年）、德国学者H.A.Krebs于1937年提出。是指由丙酮酸经过 一系列环节作循环式反应而被彻底氧化、脱羧，形成CO 2、H 2 O和NADH 2 的过程。 这是一个广泛存在于各种生物体中的重要生物化学反应，在各种好氧微生物中普遍存在。在真核微生物中，柠檬酸循环的反应在线粒体内进行，其中的大多数酶定位于线粒体的基质中；在原核生物中，大多数酶位于细胞质内。只有琥珀酸脱氢酶属于例外，它在线粒体或原核细胞中都是结合在膜上的。 3.1 TCA循环的调节作用 3.1.1 TCA循环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA循环的第一个特点。顺乌头酸酶失活，阻断TCA循环是柠檬酸积累的必要条件。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低。 3.1.2黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA循环被阻断）。3.1.3氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧导致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少。 4.发酵机理 4.1以薯干粉、玉米粉或淀粉等糖类为原料经黑曲霉柠檬酸产生菌糖化后产生高浓度的葡萄糖。 4.2黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸：葡萄糖以糖酵解途径、磷酸戊糖循环两种途径产生丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧形成乙酰CoA，另一方面经CO2固定化反应后生成草酰乙酸，最后草酰乙酸和乙酰CoA缩合产生柠檬酸。 4.3生理调节：柠檬酸是黑曲霉的良好碳源，故柠檬酸的积累是菌体代谢失调
黑曲霉发酵生产纤维素酶实验 一、实验目的 1、了解纤维素酶的生产工艺和原理 2、掌握液体发酵和固体发酵工艺 3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理 二、实验原理 纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。 以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。 三、材料与试剂配制 1、生产菌种：黑曲霉 2、斜面（活化）培养基：酵母膏0.4%，蛋白胨0.6%，可溶性淀粉1%，葡萄糖0.9%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水（或人工海水）配制，pH7.0-7.4。 3、人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4·7H2O = 7.0 g/L ;NH4NO3= 1 g/L ;KCl = 0.7 g/ L ; NaH 2PO 4 = 2.0 g/ L ;Na 2 HPO 4 =3.0 g/ L ,pH7.4。 4、微量元素液：FeSO4·7H2O 5.0mg/L，MnSO4·H2O 1.6mg/L， ZnSO 4· 7H 2 O 1.4mg/L，CoCl 2 2.0mg/L，加蒸馏水200ml使之溶解。 5、液体发酵产酶培养基：麸皮作碳源 3 g，氯化铵或硫酸铵作无机氮源1 g，蛋白胨0.05g作有机氮源，人工海水100 ml（含1%微量元素液），自然pH值。 6、固体发酵产酶培养基：麸皮：稻草粉=2：1作碳源5 g，人工海水
黑曲霉发酵生产柠檬酸 柠檬酸（citric acid ）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸（2-hydroxytricarboxylic acid ）、2--羟基丙烷-1，2，3-三羧酸（2-hydroxy propane-1，2，3-tricarboxylic acid ）。商品柠檬酸有两种形式：一种为无色透明，有光泽的含一个结晶水的晶体，其分子式为C 6H 807·H 2O,相对分子质量为210.14。另一种为无色半透明全对称晶体的无水柠檬酸，分子式为C 6H 8O 7，相对分子质量192.13。柠檬酸因无毒、水溶性好、酸味适度、易被吸收和价格低廉等优点，被广泛应用于食品、医药、化工、化妆品、清洗（洗涤）、建筑等工业部门。1893年前，人们主要从柑橘、菠萝和柠檬等果实中制取柠檬酸。1893年后发现微生物可产生柠檬酸，1951年美国Miles 公司首先采用深层发酵法生产柠檬酸。我国在20世纪40年代初期开始浅盘发酵生产柠檬酸，60年代开始采用薯干粉直接深层发酵法生产柠檬酸。 能够产生柠檬酸的微生物很多，青霉、毛霉、木霉、曲霉、葡萄孢菌及酵母中的一些菌株都能够利用淀粉质原料或烃类大量积累柠檬酸。至今世界上消费的柠檬酸主要采用发酵法，而最具商业竞争优势的是采用黑曲霉（Asp.niger ）、文氏曲霉(Asp.Wentii )和解脂假丝酵母等菌种的深层液体发酵。目前国内外普遍采用黑曲霉的糖质原料发酵生产柠檬酸。 本实验以薯干粉或玉米粉为原料，采用黑曲霉，通过深层液体（摇瓶）发酵产生柠檬酸。柠檬酸发酵液经过滤除去菌丝体和残存杂质，过滤液中加入碳酸钙中和，生成柠檬酸钙沉淀。将获得柠檬酸钙再用稀硫酸酸解生成柠檬酸和硫酸钙沉淀而制得粗制柠檬酸液，粗制柠檬酸液再经活性碳脱色、离子交换脱盐制得精制柠檬酸液。精制柠檬酸液经真空浓缩、结晶制得符合英国药典BP-98版标准的无水或一水柠檬酸。 5.3.1 柠檬酸发酵 1、 实验目的 了解柠檬酸发酵原理及过程，掌握柠檬酸深层液体发酵及发酵过程中生化指标的分析方法。 2、实验原理 黑曲霉发酵法生产柠檬酸的代谢途径被认为是：黑曲霉生长繁殖时产生的淀粉酶、糖化酶首先将薯干粉或玉米粉中的淀粉转变为葡萄糖；葡萄糖经过酵解途径（EMP ）和HMP 途径转变为丙酮酸；丙酮酸由丙酮酸氧化酶氧化生成乙酸和CO 2，继而经乙酰磷酸形成乙酰辅酶A ，然后在柠檬酸合成酶（柠檬酸缩合酶）的作用下生成柠檬酸。黑曲霉在限制氮源和锰等金属离子条件下，同时在高浓度葡萄糖和充分供氧的条件下，TCA 循环中的ɑ-酮戊二酸脱氢酶受阻遏，TCA 循环变成“马蹄型”,代谢流汇集于柠檬酸处,使柠檬酸大量积累并排出菌体外。其理论反应式为: O H O H C O O H C 27862612625.1+→+ 柠檬酸理论得率为106.7%，若以含一个结晶水的柠檬酸计为116.7%。 3、实验装置材料与流程 （1） 实验装置与材料 ① 实验装置 旋转式摇床、恒温培养箱、高速离心机（4000-6500r/min ）。 ② 菌种 黑曲霉（Asp.niger ）柠檬酸生产菌株Co8-27。 ③ 材料 麸皮、马铃薯 、薯干粉、蔗糖、玉米粉、大麦芽、大米、琼脂、淀粉酶（中温酶与高温酶）。 ④ 器皿 15mL 试管、100mL 三角瓶、2000mL 烧杯、500mL 三角瓶、离心管若干。 ⑤ 试剂 0.1429mol/L NaOH 、1%酚酞试剂、斐林甲、乙溶液、0.01%标准葡萄糖溶液。 （2） 试剂
酸奶的发酵过程 酸奶：一般指酸牛奶，它是以新鲜的牛奶为原料,经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加有益菌（发酵剂)，经发酵后,再冷却灌装的一种牛奶制品。目前市场上酸奶制品多以凝固型、搅拌型和添加各种果汁果酱等辅料的果味型为多。酸奶不但保留了牛奶的所有优点，而且某些方面经加工过程还扬长避短，成为更加适合于人类的营养保健品. 酸奶发酵的工艺流程:酸奶生产的工艺流程和关键控制点。 工艺操作及各步要点: 1.原料乳质量要求原料乳色泽应呈乳白或略带微黄；组织状 态应呈均匀的胶态流体，无沉淀、无凝块、无肉眼可见杂质 和其他异物；对于滋气味的要求是应具有新鲜牛乳固有的香 气，无其他异味．理化指标：脂肪≥3.2％,蛋白质≥2。８％，干物质≥1０.8%，酸度16~18 度原料奶的体细胞数应小于4× 107个／mＬ。不得使用有抗生素、有效氯以及清洗剂等残留的 生鲜乳。不得使用患有乳房炎的牛的牛乳。
2.标准化处理 ⑴乳脂均质化的最佳浓度约为3．５％, 对这样浓度的乳脂进行均质化后会对发酵乳的风味产生积极的影响。 ⑵国内奶的总固体含量为１1.5％，为了提高酸奶的粘稠度, 可以采用添加乳粉、浓缩物、乳清粉等方式。 3.均质均质是酸奶生产的重要程序，目的在于： ( 1) 促 进乳中成分均匀，提高酸奶的粘稠性和稳定性; ( 2）使乳 中的脂肪球破碎、变小, 与酪蛋白膜结合, 提高脂肪球的密度， 降低脂肪球聚集的趋势, 使其均匀地悬浮在液体中。 4.杀菌酸奶的杀菌一般采取9０～95℃、5ｍin, 其目的 是：( 1）杀灭乳中的大部分微生物或全部致病菌；（２） 除去原料乳中的氧从而降低氧化还原电位, 助长乳酸菌的发育; （３）改善酸乳硬度和组织状态；（ 4）防止乳清析出. 5.菌种的选择菌种的选择对发酵剂的质量有重要作用，可 根据生产发酵乳制品的品种, 选择适当的菌种, 并对菌种发育 的最适温度、耐热性、产酸能力及是否产生粘性物质等特性, 进 行综合性选择, 还要考虑到菌种间的共生性，使之在生长繁殖 中相互得益。生产酸奶一般采用冻干菌种,主要为保加利亚乳杆 菌和嗜热乳链球菌混合发酵剂，嗜热链球菌产酸，保加利亚乳 杆菌产酸、产香。 6.接种接种之前，将发酵剂进行充分搅拌,使菌体从凝乳块中 游离分散出来；同时采用无菌操作方式接种，防止微生物的污
发酵剂活力的则定 (1)酸度测定法：向灭菌脱脂乳中加3%发酵剂，在适宜温度下（42℃）培养3.5小时，滴定其酸度。以乳酸酸度值来表示结果。 称取 10 g（精确到 0.001 g）已混匀的试样，置于 150 mL 锥形瓶中，加20 mL 新煮沸冷却至室温的水，混匀，用氢氧化钠标准溶液电位滴定至 pH 8.3 为终点；或于溶解混匀后的试样中加入2.0 mL 酚酞指示液，混匀后用氢氧化钠标准溶液滴定至微红色，并在 30 s 内不褪色，记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数，代入下面公式中进行计算。 试样中的酸度数值以（o T）表示，按下式计算： c×V ×100 X = ——————————×0.009 m×0.1 式中： X——试样的酸度，单位为度（o T）； c——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； V——滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，单位为毫升（mL）； m——试样的质量，单位为克（g）； 0.1——酸度理论定义氢氧化钠的摩尔浓度，单位为摩尔每升（mol/L）。 0.009---相当于乳酸（90%）的量 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。 附：酚酞指示液：称取 0.5 g 酚酞溶于 75 mL 体积分数为 95 %的乙醇中，并加入 20 mL 水，然后滴加氢氧化钠溶液（8.1）至微粉色，再加入水定容至 100 mL。 并非活力越强发酵剂质量越好，应控制在0.65～1.15范围，其中0.8～0.95最佳，发酵剂活力与最佳接种量的关系可参考如下参数： 活力大于0.9时，接种量2.0-2.5% 活力在0.8-0.9时，接种量3.0-3.5% 活力在0.7-0.8时，接种量3.5-4.0% 活力在0.6-0.7时，接种量5.0% 活力小于0.6的发酵剂不适于在酸奶生产中使用。 (2)刃天青还原法： 将1毫升发酵剂加入9毫升灭菌脱脂乳中，并加0.005%刃天青溶液1毫长，36.7℃保温30分钟后开始检查，其后每5分钟观察一次结果，淡粉红色为终点。活力好的发酵剂应在35分钟内还原丸天青。50~60分钟还原的发酵剂不宜使用，对照的不含发酵剂空白灭菌脱脂乳的还原时间不应少于4小时。
黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。生长适温37℃，最低相对湿度为88%，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。 黑曲霉是发酵常用的菌种。食品工业上用作发酵菌种，如用于食醋生产制曲、麸曲法白酒生产制曲、柠檬酸发酵等，主要是利用此黑曲霉分泌产生淀粉酶、糖化酶、柠檬酸、葡萄糖酸、五倍子酸等的功能；在生物肥料工业上，黑曲霉具有裂解大分子有机物和难溶无机物，便于作物吸收利用，改善土壤结构，增强土壤肥力，提高作物产量的效果。黑曲霉产生的孢子很多，很适合于用沙土管法进行保存。 沙土管保藏法。取河沙用水浸泡洗涤数次，过60目筛除去粗粒，再用10%盐酸浸泡2～4小时，除去其中有机物质，再用水冲洗至流水的pH达到中性，烘干备用。同时取贫脊土或菜园土用水浸泡，使呈中性，沉淀后弃去上清液，烘干碾细，用100目筛子过筛，将
处理好的沙与土以（2～4）:1混匀，用磁铁吸出其中的铁质，然后分装小试管或安瓿内，每管装量0.5～2克，塞棉塞，用纸包扎灭菌（1.5公斤/平方厘米，1小时），再干热灭菌（160℃，2～3小时）1～2次，进行无菌检验，合格后使用。将已形成孢子的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3～5毫升，刮菌苔，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土为止。将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内，接上真空泵抽气数小时，至沙土干燥为止。真空干燥操作需在孢子接入后48小时内完成，以免孢子发芽。制备好的沙土管用石蜡封口，在低温下可保藏2～10年。 但是沙土管保存使用起来不是很方便，而且只是适用于长期的保存，容易导致大量的孢子特性下降，用之前需要进行分离纯化。 还有以下保藏方法可以应用： 1、斜面保藏方法，可以取部分孢子重新分离，然后传斜面待斜面张满孢子后在4度冰箱进行保存可以保存1－2个月没有问题，我们做过相关的试验。而且可以随时使用，进行活化或者直接接种，非常方便。 2、深冷管保存，可以用无菌水配成20％甘油加入到斜面中刮下孢子进行保存。或者用专用的GSH（甘油
黑曲霉发酵生产柠檬酸 （中北）生物技术18083108 陈园园 摘要：黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。大多数曲霉菌如泡盛曲霉、米曲霉、温氏曲霉、绿色木霉和黑曲霉都具有产柠檬酸的能力，而黑曲霉的产酸能力更强。黑曲霉从土壤中分离培养，土壤来源有要求。黑曲霉和黑根霉菌种用于发酵产柠檬酸，了解产物发酵生产的机理，柠檬酸发酵的发酵条件，掌握发酵过程步骤，了解产物提取的几种方法，学习利用沉淀法提取柠檬酸的原理，掌握沉淀法提取柠檬酸的方法是本次实验的目的要求。 关键词：黑曲霉、黑根霉、柠檬酸 实验材料和试剂： 样品：新鲜土壤样品（来源于食堂垃圾堆处） 培养基：查氏培养基、马铃薯培养基 无菌水：带有玻璃珠装有20mL无菌水三角瓶 试剂：400U/mL庆大霉素液、10％苯酚、酚酞指示剂、碳酸钙、0.1M NaOH 、0.1M H2SO4 实验器材： 无菌培养皿、培养箱、无菌吸管、无菌离心管、电子天平、记号笔、玻璃涂棒、酒精灯、火柴、圆底烧瓶、抽滤瓶、玻璃棒、抽滤设备、冰箱 实验步骤 一．黑曲霉、黑根霉菌种的分离和培养 1.黑曲霉的分离培养 ①土壤样品的采集 用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样10～25g，装入事先准备好灭菌容器内扎好。编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件。一般样品取回后应马上分离，以免微生物死亡。 ②制平板： 在融化好的查氏培养基中加入链霉素0.2mL/瓶 制3块PDA培养基、3块查氏培养基平板。 ③制备土壤稀释液： 1. 称取土壤2g，放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，同时加入3滴10％苯酚溶液，振荡5min，即为稀释10－1的土壤悬液。 2. 另取无菌离心管2支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4，再加入0.9mL无菌水。取10－1的土壤稀释液，吸取0.1mL加入第一只离心管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。同法依次连续稀释至10－3、10－4土壤稀释液。 无菌操作法分别吸取10－2、10－3 、10－4土壤稀释液0.1mL，分别加在已制好的3块查氏平板培养基上。 ④涂板 用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，静置于桌面5min。 2.黑根霉的分离培养 马铃薯培养基2块 1号马铃薯培养基用接种环无菌操作从酒酿样品中挑取1环在上面进行划线分离， 2号马铃薯培养基取安琪菌剂0.1g加入10mL带玻璃珠的无菌水三角瓶进行稀释溶解，
酸奶发酵详细过程公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
酸奶的发酵过程 酸奶:一般指酸牛奶,它是以新鲜的牛奶为原料，经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加有益菌（发酵剂），经发酵后，再冷却灌装的一种牛奶制品。目前市场上酸奶制品多以凝固型、搅拌型和添加各种果汁果酱等辅料的果味型为多。酸奶不但保留了牛奶的所有优点，而且某些方面经加工过程还扬长避短，成为更加适合于人类的营养保健品。 酸奶发酵的工艺流程:酸奶生产的工艺流程和关键控制点. 工艺操作及各步要点 : 1.原料乳质量要求原料乳色泽应呈乳白或略带微黄; 组织状 态应呈均匀的胶态流体, 无沉淀、无凝块、无肉眼可见杂质和其他异物; 对于滋气味的要求是应具有新鲜牛乳固有的香气, 无其他异味.理化指标:脂肪≥%，蛋白质≥%，干物质≥%，酸 度16~18 度原料奶的体细胞数应小于4×107个/mL。不得使
用有抗生素、有效氯以及清洗剂等残留的生鲜乳。不得使用患 有乳房炎的牛的牛乳。 2.标准化处理 ⑴乳脂均质化的最佳浓度约为%, 对这样浓度的乳脂进行均质 化后会对发酵乳的风味产生积极的影响。 ⑵国内奶的总固体含量为%,为了提高酸奶的粘稠度, 可以采用添加乳粉、浓缩物、乳清粉等方式。 3.均质均质是酸奶生产的重要程序, 目的在于: ( 1) 促进 乳中成分均匀, 提高酸奶的粘稠性和稳定性; ( 2) 使乳中的 脂肪球破碎、变小, 与酪蛋白膜结合, 提高脂肪球的密度, 降 低脂肪球聚集的趋势, 使其均匀地悬浮在液体中. 4.杀菌酸奶的杀菌一般采取90~95℃、5min, 其目的是:( 1) 杀灭乳中的大部分微生物或全部致病菌; ( 2) 除去原料乳中 的氧从而降低氧化还原电位, 助长乳酸菌的发育; ( 3) 改善 酸乳硬度和组织状态; ( 4) 防止乳清析出。 5.菌种的选择菌种的选择对发酵剂的质量有重要作用, 可根 据生产发酵乳制品的品种, 选择适当的菌种, 并对菌种发育的 最适温度、耐热性、产酸能力及是否产生粘性物质等特性, 进 行综合性选择, 还要考虑到菌种间的共生性,使之在生长繁殖 中相互得益。生产酸奶一般采用冻干菌种，主要为保加利亚乳 杆菌和嗜热乳链球菌混合发酵剂，嗜热链球菌产酸，保加利亚 乳杆菌产酸、产香。