微生物的快速检测与
鉴定
微生物的快速检测与鉴定
微生物论文
学院：食品科学与工程学院
班级：生工091
学生：彭彩连
学号：42号
【关键词】微生物快速检测
随着人们生活水平不断提高，各种安全问题越来越受到人们的重视，微生物的污染问题也相应地备受关注。在食品和环境等各个方面都有微生物污染的可能，一旦污染，微生物将大量繁殖而导致食源性疾病或环境污染甚至医院内感染。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏，导致感染的致病菌的种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大。传统的检验方法，主要包括形态检查和生化方法，其准确性、灵敏性均较高，但涉及的实验较多、操作烦琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重，而且要有大量人员参与［1，2］。所以，迫切需要准确、省时、省力和省成本的快速检验方法。本文对微生物快速检测方法的进展情况及实际应用进行综述，以利于预防食源性疾病及公共卫生突发事件的发生。
1 即用型纸片法
3M公司的perrifilmTMPlate系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数［3］。由RCP Scientific Inc 公司开发上市的Regdigel系列，除上述项目外还有检测乳杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的产品［4］，这两个系列的产品与传统检测方法之间的相关性非常好。如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面，操作简便、快速、省料，特异性和敏感性与发酵法符合率高，已经被列为国标方法。使用时应正确掌握操作技术和判断标准，从而达到理想的检测效果［5］。美国3M公司生产的PF(Petrifilm)试纸还加入了染色剂、显色剂，增强了菌落的目视效果，而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。霉菌快速检验纸片，应用于食品检验中的霉菌具有操作简便，仅需36℃培养，不需要低温设备；快速，仅需2 d就可观察结果，比现在的国家标准检验方法缩短3～5 d，大大提高了工作效率。纸片法与国标法在霉菌检出率上差异无统计学意义，且菌落典型，易判定。纸片荧光法利用细菌产生某些代谢酶或代谢产物的特点而建立的一种酶—底物反应法。只需检测时纸片可高压灭菌处理，4℃保存，简化了实验准备、操作和判断［6］。但由于它们价格昂贵，限制了在基层单位的实际应用。
2 生物化学技术
2.1 PCR技术 PCR技术采用体外酶促反应合成特异性DNA片段，再通过扩增产物来识别细菌。由于PCR灵敏度高，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌，即可通过PCR进行筛选，节约了大量时间，但PCR技术也存在一些缺点：食物成分、增菌培养基成分和其他微生物DNA对Taq酶具有抑制作用，可能导致检验结果假阴性；操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳
性结果，扩增过程中有一定的装配误差，会对结果产生影响。由于以上原因，PCR技术对操作者的自身素质要求很高，对于基层单位而言难以做到。短时间内也不会有经济效益和社会效益，因此影响了这项技术在基层的应用。
2.2 基因探针技术基因探针技术利用具有同源性序列的核酸单链在适当条件下互补形成稳定的DNA RNA或DNA DNA链的原理，采用高度特异性基因片段制备基因探针来识别细菌。基因探针的优点是减少了基因片段长度多态性所需要分析的条带数。如法国生物一梅里埃公司的GEN PROBE基因探针检测系统，对于分离到的单个菌落，30 min完成微生物的确证试验［7］，基因探针的缺点是不能鉴定目标菌以外的其他菌。
3 选择、鉴定用培养基法
在培养基中加入特异性的生化反应底物、抗体、荧光反应底物、酶反应底物等，可使目标培养物的选择、分离、鉴定一次性完成。如生物一梅里埃公司的BP+RPF(兔血浆+纤维蛋白原)培养基，可在24 h内鉴定金黄色葡萄球菌［8］。Merk公司的chro mocult Coliform Agar培养基上，大肠杆菌为墨绿色至紫色菌落，沙门菌为淡绿色至蓝绿色菌落。柠檬酸杆菌和克雷伯杆菌为橙红色至红色菌落，其他肠道菌为无色菌落［9］。这个方法对操作者要求不高，短期培训合格后即可上岗，从而取得一定的经济效益和社会效益，应用前景十分广泛。
4 免疫学技术
免疫学技术通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌。免疫方法的优点是样品在进行选择性增菌后，不需分离，即可采用免疫技术进行筛选。由于免疫法有较高灵敏度，样品经增菌后可在较短的时间内达到检出度，抗原和抗体的结合反应可在很短时间内完成［10］。此技术对操作者要求也不高，是目前为止基层单位应用时间最长最为广泛的一项快速检测技术。如采用免疫磁珠法可有效地收集、浓缩神奈川现象阳性的副溶血性弧菌，可显著提高环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率［11］。胶体金免疫层析法能快速、灵敏检测金黄色葡萄球菌［12］，应用胶体金免疫层析法检测乙型肝炎表面抗原，可大大提高工作效率［13］。ATP生物发光法是近年发展较快的一种用于食品生产加工设备洁净度检测的快速检测方法。利用ATP生物发光分析技术和体细胞清除技术，测量细菌ATP和体细胞ATP，细菌ATP 的量与细菌数成正比，用ATP生物发光分析技术检测肉类食品细菌污染状况或食品器具的现场卫生学检测，都能够达到快速适时的目标［14，15］。微型自动荧光酶标分析法(mini VIDAS)是利用酶联荧光免疫分析技术，通过抗原-抗体特异反应，分离出目标菌，由特殊仪器根据荧光的强弱自动判断样品的阳性或阴性。VIDAS法检测冻肉中沙门菌具有很高的灵敏度和特异性，用于进出口冻肉的检测，可大大缩短检验时间，加快通关速度［16］，检测冻肉中李斯特氏菌亦如此［17］。
5 细菌直接计数法
主要包括流式细胞仪(flow cytometry，FCM)和固相细胞计数(solid phase cytometry，SPC)法。FCM通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。光散射信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的强度则代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，由此可通过仪器检测散射光信号和荧光信号来估计微生物的大小、形状和数量。流式细胞计数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和定量鉴定［18］。目前已经建立了细菌总数［19］、致病性沙门菌、大肠埃希氏菌［20］等的FCM检验方法。固相细胞计数可以在单个细胞水平对细菌进行快速检测［21］。滤过样品后，存留的微生物在滤膜上进行荧光标记，采用激光扫描设备自动计数。每个荧光点可直观地由通过计算机驱动的流动台连接到ChemScan上的落射荧光显微镜来检测，尤其对于生长缓慢的微生物检测用时短，使该方法明显优于传统平板计数法［22］。此方法要求配备特殊的仪器，财政投入较大，因此基层单位目前暂时无法应用
6 全自动微生物分析系统(AMS)
AMS是一种由传统生化反应及微生物检测技术与现代计算机技术相结合，运用概率最大近似值模型法进行自动微生物检测的技术，可鉴定由环境、原料及产品中分离的微生物。AMS仅需4～18 h即可报告结果，以常规法鉴定细菌，只能得到是或不是某种菌，要想知到是哪种菌还要做大量、烦琐的生化试验，而AMS则可以直接报告是什么菌［23］。法国生物梅里埃集团公司出品的Vitek AMS自动微生物检测系统属当今世界上最为先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。Vitek对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础，不同种类的Vitek试卡(检测卡)含有多种的生化反应孔，可达30种，可鉴定405种细菌［24］。用AMS明显缩短肠道菌生化鉴定的时间，如鉴定沙门菌属只需4 h，鉴定志贺氏菌属只需6 h，鉴定霍乱弧菌等致病性弧菌亦只需4～13 h ［22］183-186。这套系统对基层单位而言具有极强的应用价值，但他昂贵的价格让人望而生畏。
总之，随着现代科技的发展，可以预料在不远的将来，传统的微生物检测技术将逐渐被各种新型简便的微生物快速诊断技术所取代。近年来兴起的基因探针技术及全自动微生物检测系统，将从根本上改变微生物的检测方法，具有非常广阔的应用前景。
微生物常规鉴定技术
一、形态结构和培养特性观察
１、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、
排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。
２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。
１）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。（图３－８）
图３－８细菌的培养特征
1.点状
2.圆形
3.丝状
4.不规则形
5.假根状
6.纺锤状
7.扁平
8.隆起
9.凸起 10.垫状 11.脐状 12.边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝状 17.卷发状 18.丝线状 19.刺毛状 20.串珠状 21.疏展状 22.树根状 23.假根状 24.丝状 25.串珠状 26.乳头状 27.绒毛状 28.树根状 29.量杯状30.萝卜状 31.漏斗状 32.囊状 33.层状 34.絮状 35.环状 36.蹼状 37.膜状
２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
二、生理生化试验
微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。
微生物检验中常用的生化反应有：
１、糖酵解试验
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。
试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。
本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
千里马招标网https://www.doczj.com/doc/c714182995.html, 政府采购谈判 文件 采购编号：SZWK-XC-T-号 采购项目：全自动微生物鉴定及药敏分析系统采购单位：苏州市相城区第三人民医院 项目类别：医疗设备 苏州市卫康招投标咨询服务有限公司 二〇一八年八月
谈判邀请函 ： 受苏州市相城区第三人民医院的委托，苏州市卫康招投标咨询服务有限公司对其所需采购的全自动微生物鉴定及药敏分析系统在国内组织竞争性谈判采购。欢迎符合采购文件资格要求的供应商前来报名参加谈判。 一、采购编号：SZWK-XC-T-号 二、采购内容及数量：全自动微生物鉴定及药敏分析系统一套 三、采购预算：.元整 四、参加谈判的供应商资格要求： A、供应商的一般资格要求 、具有独立承担民事责任的能力； 、具有良好的商业信誉和健全的财务会计制度； 、具有履行合同所必需的设备和专业技术能力； 、有依法缴纳税收和社会保障资金的良好记录； 、参加招标活动前三年内，在经营活动中没有重大违法记录； 、法律、行政法规规定的其他条件。 B、供应商的特殊资格要求 、具有医疗器械生产（经营）企业许可证； 、具有所投产品的合法代理资格。 五、参加谈判报名及领取谈判采购文件时间：自公告发布之日起至月日每日：～：，：～：（节假日除外）； 参加谈判报名及领取谈判采购文件地点：苏州市干将西路号号楼四楼苏州市卫康招投标咨询服务有限公司； 领取谈判文件时请提供以下材料并加盖公章（复印件需提供原件现场核查）： 、企业法人营业执照副本复印件（三证合一）； 、法人授权委托书（报名经办人必须为投标单位正式员工，提供社保缴纳证明及劳动合同等材料）； 、医疗器械生产（经营）企业许可证复印件； 、所投产品的合法代理资格证明材料。 六、谈判时间、地点： 、递交谈判响应文件的时间：年月日：~：（北京时间） 地点：苏州市相城区庆元路号相城区市民服务中心三楼会议室 、递交谈判响应文件的截止时间：年月日：：（北京时间）
什么是食品微生物检验 吴崇食质12级1班学号：20122629 微生物是个体难以用肉眼观察的一切微小生物之统称。微生物包括细菌、病毒、真菌、和少数藻类等。（但有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”，但是它的生存必须依赖于活细胞。根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等，按照细胞机构分类分为原核微生物和真核微生物。 微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50%是由病毒引起。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。 微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的，它们可用来生产如奶酪，面包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必须通过显微镜放大约1000 倍才能看到。比如中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。想像一下一滴牛奶，每毫升腐败的牛奶中约有5千万个细菌，或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50亿。也就是一滴牛奶中可能含有50 亿个细菌。 微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广
微生物常规鉴定技术 一、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染5min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 （13）实验完毕后的处理： ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦 去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将 镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干
A B C D 高鹃 新版GMP 与快速微生物检测鉴定技术新版GMP 与 快速微生物检测鉴定技术 3.快速鉴定技术 4.法规与药典要求 第一部分引言无菌药品生产要求的大幅度提高 新版GMP 无菌药品附录 以上各级别空气悬浮粒子的标准规定如下表： 洁净度级别 悬浮粒子最大允许数静态 ≥0.5μm ≥5.0μm A 级(1) 352020B 级352029C 级3520002900D 级 3520000 29000 洁净级别 浮游菌cfu/m 3 沉降菌（φ90mm ）cfu /4小时 表面微生物 接触cfu /碟（φ55m m ） 5指手套cfu /手套A 级<1<1<1<1B 级10555C 级1005025 － D 级 200 100 50－ 洁净区微生物监测的动态标准 工业工程技术要求隔离装置隔离器Rabs RTP 公用工程 水系统空调系统氮气压缩 空气真空传送系统动态环境监测系统粒子监测沉降菌浮游菌
动态环境监测带来的新课题 １、大量数据的管理和分析 ２、面对细菌培养阳性结果发生争执 是生产管理方面的问题？ 是QC 的OOS ？３、细菌培养阳性结果的后续处理明确what where who how 革兰氏染色无法判定 无菌药品生产要求的大幅度提高 未污染 ？ 无菌药品生产要求的大幅度提高 无菌药品附录： 产品的无菌或其它质量特性绝不能只依赖 于任何形式的最终处理或成品检验（包括无菌检查）。 微生物检测技术的飞跃发展 快速检测技术（不需进行培养PAT ）快速鉴定技术（属种株）为无菌药品生产和质量管理提供了先进技术手段及时发现污染，追溯污染源 案例： 爱吃桔子的员工 一直难以去除的革兰氏阳性短棒状菌燃烧麦秸杆与无菌药品生产车间
全自动微生物鉴定/药敏系统VITEK 2 COMPACT 30 1、设备的主要用途、功能及特点 该系统为完整的全自动细菌鉴定和药敏分析系统,细菌鉴定采用生化反应数码鉴定原理。可以以最少的实验人员及最短的准备和处理时间，提供最准确的测定结果。数据库应涵盖革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、芽胞菌、酵母菌、奈瑟氏菌及嗜血杆菌、厌氧菌；必需有生物反恐菌的鉴定能力（鼠疫杆菌、霍乱弧菌、吐拉菌等） 2、技术参数及指标 ①系统组成：电脑主机为国际知名品牌原装PC；另有比浊仪、充填系统、读数 孵育系统、数据处理系统、废弃物收集系统、打印机等； ②检测原理：采用生化反应数码鉴定原理，结合终点法、阈值法、特别是动态 分析法的检测原理，24小时连续自动检测，并时时出报告； ③充填处理量：每批可同时填充10个试剂卡。 ④充填方式:：利用真空原理进行试剂卡的填充。 ⑤菌液用量：3ml。 ⑥试卡密封方式：自动热切割掉试剂卡上的菌液传送小管，进行密封。 ⑦鉴定速度：每15分钟对同一卡片进行1次光学检测。细菌5小时内鉴定率达95%， 一般3-5小时，酵母菌≤18小时，芽孢菌≤14小时。 ⑧鉴定准确率：90% 的试验将报告单一的鉴定结果。 ⑨鉴定范围：鉴定细菌种类齐全，含概革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、芽孢 菌、奈瑟氏菌嗜血菌弯曲菌、厌氧菌，要求≥550种菌。 ⑩药敏功能：平均药敏检测时间7小时，专家规则同时符合美国CLSI、德国DIN、法国AFNOR标准。 ?自动化程序：自动接种、全封闭实验板、自动培养及判读、打印结果、自动收集废弃物。 ?试卡设计：试卡上有64微孔，内含有鉴定或药敏所用的生化或抗生素干燥底物； 实验过程中除需要从厂家购买鉴定卡和药敏卡之外无其他专用附加试剂和耗材，可
第一章微生物检验常规鉴定技术 课堂教学计划（1学时） 第一章微生物检验基本知识 包括显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。 接种、分离纯化和培养技术
一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C 左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至
食品微生物检验的内容及检测技术 食品安全检验过程的主要内容 食品微生物的检验。食物在生产过程中以及放置过程中会受到环境中微生物的损坏或影响，在部分研究中，将食品中细菌数量对食品的损坏程度作为食品安全检测的首 要内容。在食品微生物的检验过程中，我们主要对人体有害微生物进行检验，其中在食品安全检验过程中，因为食品中有多种微生物共存现象，所以在检验前，微生物检验员要把不同的菌体进行分离，这样才能更加清楚的了解各种微生物的数量及菌体的分布情况，包括生产型食品微生物，如醋酸杆菌，酵母菌等和使食物变质的微生物，如霉菌、细菌等和食源性病原微生物如溶血性大肠杆菌，肉毒杆菌等。对食品原辅料微生物的控制和产成品微生物的检验是保证食品安 全的重要途径。 针对食品致病菌的相关检验。不同的致病菌会对人们的身体健康有不同程度的危害，像我们在生活中经常吃到的大米，有些不法商家将发霉的大米加工后再次放入市场进行二次销售，虽然经加工后，在外表上和普通大米没啥两样，但这种大米中含有黄曲霉这一致病菌，据可靠信息表明，黄曲霉的危害性十分巨大，如果人们长时间吃这样的大米，出
现癌症的风险要比常人高出很多倍，由此可见，食品中致病菌的检验是保证我们能吃到放心食品十分关键的微生物检 测技术，所以我们在致病菌的检验上对不同种类的致病菌进行定量严格检验。如乳制品和肉制品的致病菌主要是黄曲霉菌和大肠杆菌，而蛋制品中则容易出现染沙门菌、大肠菌群、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，罐头食品容易出现肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌。 食品微生物检验中的主要特点 对食品检测要求相对较高。在食品微生物的一系列检验中，由于食品中涉及的微生物种类较多，因此加大了食品微生物检验的难度。国家标准或行业标准对不同食品中微生物的含量特别是致病菌的含量有明确的要求。在食品的运输过程中，食品致病菌以及其他微生物对相应的食品有一定的污染，随着微生物种类的增多，检测人员需要对食品受致病菌影响的程度、食品保质期以及其他相关的标准进行测量，难度会随着微生物种类的增多而复杂。所以在微生物检验上我们对每一阶段的食品安全检测都要重视，在各个微生物的测量上，相关的检测技术要求就有所提高。 食品微生物检验效率。随着食品市场的商品流通提高，人们对食品需求不断增加，而食品安全问题却在日益严重，为了保障人们在能够及时满足食品种类和数量要求的同时，进一步促进食品安全的保障措施落实，必须加强食品安
设备名称：全自动微生物鉴定及药敏分析系统 一、具体用途：对食品，环境中的微生物进行快速，全自动的鉴定及药物敏感性测试。 二、技术参数与性能要求： 1. 系统可同时处理》30个标本，系统具有扩容功能，至少可以两台联机； 2. 分析组件可对环境中和食品中的细菌进行全自动鉴定，种类包括革兰阴性菌、革兰阳性 球菌、革兰氏阳性杆菌、酵母样真菌、假丝酵母类真菌、苛养菌、厌氧菌及棒状杆菌等的 鉴定； 3. ★分析组件可对芽孢杆菌进行全自动鉴定； 4. ★大于500种可鉴定细菌，鉴定结果通过美国FDA认证，细菌鉴定采用GB推荐生化鉴定 显色法，药敏检测采用比浊法，并且鉴定方法原理可在GB4789中查询（提供具体细菌库）； 5. ^分析组件可自动进行革兰阴性菌、革兰阳性菌、酵母样真菌、肺炎链球菌等药敏试验， 以上所有药敏试验均得到美国FDA批准用于临床应用（提供FDA证明资料）； 6. ★在对标本的鉴定及药敏试验过程中，无需添加任何额外附加试剂； 7. 快速全自动对细菌进行鉴定和药敏试验，采用实时检测系统，系统每隔15分钟对试剂卡 进行一次扫描读数，一旦确认结果，可马上出报告； & ★细菌最快鉴定时间V 4个小时，平均鉴定时间不超过5小时； 9?最快药敏实验时间5小时，平均药敏实验时间不大于6小时； 10. ★系统可同时进行鉴定和药敏实验，并且可同时上机的鉴定试剂卡种类不少于4种，可 同时上机的药敏试剂卡的种类不少于6种； 11. ★系统自动填充悬浮液至试剂卡，自动密封拭卡，并自动将拭卡装载于设备内置读数系 统/孵育系统，测试结束时可自动丢弃拭卡，操作都在仪器内部自动进行，不需要额外设 备； 12. 卡片填充菌液后为封闭式卡片，不会造成污染； 13. ★鉴定卡和药敏卡必须独立包装； 14. 鉴定卡应至少提供3种不同试剂的SFDA注册证； 15. 药敏卡应至少提供5种不同试剂的SFDA注册证； 16. 测试完成后，经分析软件分析后得出结果并可自动打印报告，并保存结果； 17. 具备中文报告软件系统； 18?双向联网软件，可传输报告结果；
微生物自动化鉴定系统的工作原理 微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了快速发展。数码分类技术集数学、计算机、信息及自动化分析为一体，采用商品化和标准化的配 套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板，可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药 敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。 一、微生物数码鉴定法 早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作 提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和 形成独特的不同细菌鉴定系统。如、、、和等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。 ( 一)数码鉴定法基本原理 数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索 本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并 比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。随着电脑技术的进步，这一过程已变得非常容易。 1．简要介绍计算步骤： (1)出现频率（概率）的计算：将记录成阳性或阴性结果转换成出现频率：①对阳性特征，则除以100即得。②对阴性特征，除以1
00的商被1减去即可。③说明：对“0”和“100”，因这2个数太超量，为了使结果不出现过小或过大，而用相似值0.01或0 .99值代替。 (2)在每一个分类单位中，将所有测定项目的出现频率相乘，得出总出现频率。 (3)在每个分类菌群中的所有菌的总出现频率相加，除以一个分类单位的总出现频率，乘100，即得鉴定%（） (4)在每个菌群中，再按值大小顺序重新排列。将未知菌单次总发生频率除以最典型反应模式单次总发生频率，得到模式频率T 值，代表个体与总体的近似值。T值越接近1，个体与总体越接近，鉴定价值越大。按大小排序，将相邻两项的之比为R， 代表着首选条目与次选条目的差距，差距越大，价值越大。如果≥80，参考T及R值可作出鉴定。 2．在编码检索本中检索数据谱得出的结果有以下几种形式（以鉴定系统为例）。 (1)有此数码谱:①有一个或几个菌名条目及相应的鉴定值（和T值）。②对鉴定结果好坏的评价，最佳……等。 ③用小括号列出关键的生化结果及阳性百分率。④有时，鉴定结果不佳或有多条菌名条目,需进一步补充试验项目才能得出良好的鉴定结 果。⑤指出某些注意要点，需用“推测性鉴定”，并将此菌送至参考实验室；需用“血清学鉴定”，作进一步的证实等。 (2)无此数码谱：可能有以下原因：①此生化谱太不典型。②不能接受，鉴定值低(＜80.0)。③可疑。需进一步确认是否 纯培养，重新鉴定，可与供应商技术服务部联系。 3. 结果解释
（生物科技行业）微生物常 规鉴定技术
微生物常规鉴定技术 壹、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同壹种的细菌在壹定条件下，培养特征却有壹定稳定性。，以此能够对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的壹项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性仍是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如
青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。 革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）俩大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这俩类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤： （1）涂片：涂片方法和简单染色涂片相同。 （2）晾干：和简单染色法相同。 （3）固定，和简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。
微生物检测手段及注意事项
微生物检测手段及注意事项 微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文对生长量测定法、微生物计数法、生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常用的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其他生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，通常情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长通常指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和他们的生长抑制紧密相关。所以有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，所以测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而
测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，可以从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 1. 微生物计量法 1.1 体积测量法 又称测菌丝浓度法，通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10 mL）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5 min）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法 可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10~20%。在离心法中，将一定体积待测培养液倒入离心管中，设定一定的离心时间和转速，进行离心，并用清水离心洗涤1~5次，进行干燥。干燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘干，或采用红外线烘干，也可在80 ℃或40 ℃下真空干燥，干燥后称重。如用过滤法，丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤，过滤后用少量水洗涤，在40 ℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐，通常获取的微生物产品为菌体时，常采用这种方法，如活性干酵母（Activity Dry Yeast, ADY）,一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。
BD PHOENIX 100 型全自动微生物分析仪仪器标准操作规程 一、概况和工作原理 1、概况是快速全自动细菌鉴定/药敏系统，能对于临床大多数的革兰氏需氧和苛养厌氧菌；大多数革兰氏阴性的需氧和苛养厌氧菌能进行快速鉴定和药敏实验。它一次能同时做100份鉴定和药敏。 2、细菌鉴定原理BDPHOENIX100的鉴定部分由51个孔组成，采用传统生化、酶一底物生化呈色反应和BD专利的荧光增强法相结合的原理。由一系列改良的发酵，氧化，降解，水解等反应的产物与各类指示剂（酸碱指示剂、酶联指示剂、荧光指示剂）反应，最后被实时仪器检测。 3、药敏试验原理BDPHOENIX100的药敏试验部分由85孔组成，其中84孔包被有抗生素，1孔为生长对照。试验采用微量肉汤二倍稀释法，采用传统比浊法及BD专利呈色反应（指示剂随细菌生长过程中的氧化还原反应而变色的反应）结合的双重检测。 4、BDPHOENIX100的专家系统能对以下的耐药机制进行监测：产ESBL 的肠杆菌科、万古霉素耐药（VRE）的肠球菌、高度的氨基糖肽类抗生素耐药（HLAR）的肠球菌、甲氧西林耐药（MRS）的葡萄球菌、产?-内酰氨酶（BL）的葡萄球菌。 二、基本结构 1、菌液配置CrystalSpec比浊仪、鉴定管4.5ml（2～25oC）、药敏管8ml（2～25oC）、药敏指示剂（2～8oC、启封后14 天内保持稳定）、鉴定或鉴定加药敏板。 2、孵箱由计算机控制下的孵箱，孵育箱内置可旋转的直立圆柱体，一次可置100份标本鉴定和药敏。 3、工作站由标本扫描装置、标本基本信息输入的键盘、液晶屏幕、快捷键组成。 三、操作步骤 1. 加样 1.1 将鉴定和药敏板放在加样盘上。注：手持板条时，不要触及板条的正面；鉴定/药敏板启封后应在2小时内使用。 1.2 标注实验室编号。注：标记不要影响到ID/AST检测孔的判读；请勿使用带有荧光的标记笔。 1.3 将肉汤试管放在加样盘上；鉴定管放在左边；药敏管放在右边。 1.4 用鉴定管配制0.5麦氏单位菌悬液。注：配好的菌液必须在60分钟内加样完成；请勿使用金属接种环加样。
VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用 近年来，微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化，并力求简便、快速、准确。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。 近年来，微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化，并力求简便、快速、准确。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。VITEK已被许多国家定为细菌最终鉴定设备，并获美国药品食品管理局（FDA）认可。该系统有高度的特异性、敏感性和重复性，还具有操作简便、检测速度快的特点，绝大多数细菌的鉴定在2～18 h内可得出结果。现将该系统的工作原理、主要结构、功能并结合我们使用后的一些体会介绍如下。 1工作原理 VITEK对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础，不同种类的VITEK试卡（检测卡）含有多种的生化反应孔，可达30种。将手工分离的待检菌的纯菌落制成符合一定浊度要求的菌悬液，经充填机将菌悬液注入试卡内，封口后放入读数器/恒温培养箱，根据试卡各生化反应孔中的生长变化情况，由读数器按光学扫描原理，定时测定各生化介质中指示剂的显色(或浊度反应，然后把读出信息输入电脑储存并进行分析，再和预定的阈值进行比较，判定反应，再通过数值编码技术与数据库中反应文件进行比较，最后鉴定报告将在显示器上自动显示)并在打印机上自动打印。 2VITEK系统的结构组成 2.1检测卡 目前VITEK系统的检测卡有14种，微生物常用的有7种，即：革兰氏阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰氏阴性菌卡（GNI+）、非发酵菌卡（NFC）、酵母菌卡（YBC）、厌氧菌卡（ANI）、芽胞杆菌卡（BAC）、奈瑟氏菌嗜血杆菌卡（NHI），以及药敏检测卡等。每张检测卡对应接种1份标本，检测卡为一次性消耗品。 2.2充填机将待测菌的菌悬液注入试卡内。 2.3读数器/恒温箱可在培养过程中定时读出细菌在试卡内培养基中的生长变化值。 2.4电脑主机/显示器/键盘/打印机用于储存和分析资料、系统的操作和结果分析鉴定，实验结果的自动显示报告和打印。 2.5电源稳压器和UPS在外围断电的情况下提供电脑主机约10 min持续电源。 3VITEK系统的功能
Biolog微生物鉴定步骤 一检测原理 Biolog微生物鉴定系统测试的是微生物在鉴定板中利用或氧化化和物的能力。测试会产生特征性的紫色孔模式，组成代谢指纹。所有必需的营养物质和生化试剂都预先加进96孔板中，四唑紫是一种氧化还原染料，指示碳源的利用情况。.鉴定步骤非常简单，纯化分离到的菌株经扩大培养，再制成接种液加到鉴定板中。在培养过程中，一些孔中的化学物质能被氧化并将显色物质成紫色，对照孔（A-1）和阴性孔仍然为无色。鉴定板在相应的培养条件下培养4-6小时或16-24小时即可形成代谢模式。系统软件自动和数据库对比，如果能找到合适的匹配，就可以得出一个鉴定结果。 二所需器材和消耗品： 培养基、接种液、巯基乙酸钠、长棉签、接种棒、储液槽、八道移液器、移液器头、浊度仪、浊度标准品、控温培养箱和相应的鉴定板。其中接种液自行配制，接种棒、储液槽可选用国产品牌代替。 三鉴定步骤：
第一步： 在用户自己的培养基上纯化菌株，如果菌株为冻干或冷冻样品，需要传代培养2-3代，让菌株恢复活力。 对纯化好的菌株做革兰氏染色，确定菌株是革兰氏阴性还是阳性。观察菌落外部形态或用显微镜观察菌株形态，确定是酵母还是丝状真菌，是球菌还是杆菌。 如果是革兰氏阴性菌，还需要最终确认是肠道菌、非肠道菌或苛生菌。方法是，氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/A w，则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)，氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A，则该菌株为肠道菌(GN-ENT)。如果菌株①需要在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养，②在BUG+B培养基上生长非
常差，形成针尖大小的菌落，那么可以认为这些菌是苛生菌(GN-FAS)。大多数苛生菌都是从哺乳动物的呼吸道里分离出来的，如Actinobacillus, Alysiella, Brucella, Capnocytophaga, CDC Group DF-3, CDC Group EF-4, Eikenella, Haemophilus, Kingella, Moraxella, Neisseria, Simonsiella, Suttonella,和Taylorella。 如果是革兰氏阳性菌，用革兰氏染色可以很容易的区分球菌和杆菌，推荐再做一个过氧化氢酶实验，最终确定是球菌还是杆菌。通过革兰氏染色或观察菌落形态可以区分出芽孢杆菌。 微生物的扩大培养应该用Biolog推荐的培养基和培养条件，以便使微生物达到最佳的代谢活性，进而准确的和数据库中的代谢模式匹配。 微生物应该是新鲜的，确保其处于指数增长期，因为一些菌株在达到稳定期时会失去生存能力或代谢活性，推荐的培养周期为4-24个小时。 如果扩大培养的量不足以配制相应的浊度，可以培养多个平板，培养时间可以延长到48个小时。 第二步： 首先确定浊度仪没开启电源的时候，指针应指在0%，如果没有，用螺丝刀调整。开启电源，取未开盖的装有接种液的试管，擦干净管壁，放入浊度仪，指针应指在100%，如果没有，旋动右方旋钮。然后用浊度标准管检验，读数在±2%都是正常的。要使用哪管接种液，就用相应的试管做100%校正，不要在浊度仪的光路中旋转试管。 在鉴定革兰氏阴性肠道菌和苛生菌的时候，在接种液里应该加准确三滴巯基乙酸钠。巯基乙酸钠的作用是抑制芽孢形成，并且可以部分或完全的抑制A-1或其它孔由于微生物利用自身分泌的聚多糖荚膜而出现的紫色。一些非肠道菌液需要添加巯基乙酸钠。 按照下列步骤制备均匀的菌悬液：用接种液将棉签稍微浸湿，用棉签在菌落上面轻轻的滚动可以将菌落取到接种液中，从而不会将培养基或其它营养物质带入接种液。先取单菌落，不够再取生长紧密的菌落。在试管内壁接种液液面的上方，旋转挤压棉签可以将菌落团分散。然后上下移动棉签，将分散的菌落和接种液充分混合形成均一，无菌团的菌悬液。如果菌悬液有菌团，可以让菌团沉到管底。 调整浊度直至达到允许的范围，增加接种液或添加菌落可以降低或升高菌悬液的密度。 将菌悬液接种到鉴定板上，不要超过20分钟。如果长时间部接种到鉴定板上，一些菌会失去代谢活性。 第三步： 将鉴定板编上相应的号码。把菌悬液倒入储液槽，不要全部倒入，因为试管底部可能有未分散的菌团。按照不同的鉴定板所需的加样量进行移液器的程序选择，将移液器头安放到移液器上，必要时可以用手加固，以免
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微生物鉴定指导原则
本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定， 以及药物 原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中检出微生物的鉴定提供指 导。当微生物的鉴定结果有争议时，以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey， s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。 微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其 进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药 品微生物检验中的重要环节， 药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确 规定，如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” （通则 1106）中选择培养 基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法” （通则 1101） 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净实验 室微生物监测和控制指导原则（通则 9203）建议对洁净室和其他受控环境分离 到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。此外，在 药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终 产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数 非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中， 对所检出微生物的常规 特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革 兰染色或其它染色法，某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧 化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌药品产品的控制菌 检查应达到种的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装） 失败时，对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。 一、微生物的鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行 初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到 的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与 方法和数据库的局限性息息相关， 未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准 微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没 有此模式菌株，就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中，用户
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全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK 2操作规程 1、目的 规范操作程序，正确使用仪器，保证检测工作顺利进行，更好地维护保养仪器。 2、适用范围 适用于全自动微生物鉴定及药敏分析系统VITEK 2的使用操作。 3、程序 3.1开机： 1 先开稳压电源，然后开UPS、打印机、终端、读数器，最后开电脑。 2 等待屏幕出现，输入用户名及密码，双击VITEK 2-compact软件进入主菜单。 3 点击Enter图标，进入试卡编辑菜单。 4 点击试卡图标，选中BAR CORD。 5 扫描试卡；载卡架信息：可以用条码扫描器输入，也可自下拉菜单选择。 6 输入实验号和菌株号保存。 3.2测试标本 1 标本的稀释：选取经纯培养18～24小时后，大小为3mm左右的待测菌落2～3个，置于装有3 mL 0.45 %生理盐水的试管中进行稀释，用标准比浊计测菌液浓度（如浊度高加生理盐水，浊度低加菌落）。最后的菌液浓度必须达到测试卡所要求相应标准度。将试管放到样品架上。 2 卡片标记：从冰箱中取出测试卡，放置2～3分钟，使温度与室温相同。 3 卡片充样：将测试卡放在载卡架上，输样管浸入装有待测菌液的标准管中。将载卡架放入仪器的填充仓，按START FILL触点开关，约70秒左右，填充完毕。 4 填充完毕后，待蓝色指示灯闪烁，将载卡架取出，在十分钟之内取出并放入
装载仓。 5 仪器自动扫描条码，审核所有输入的卡片信息是否正确，确认无误后自动进行封口和上卡。操作完成后，待蓝色指示灯闪烁时才能打开装载仓门取出卡架。 3.3关机程序： 1 先将读数器状态窗口关闭，待系统接受，退出主菜单。 2 按下仪器上功能键，选择Maintainance键。 3 点击Shutdown键，关仪器。 4 依次关闭仪器电源、UPS、稳压电源。 5关机次序：先关电脑，再其他附件。
全自动微生物快速检测质谱仪 一设备名称：微生物快速质谱鉴定仪 二主要技术规格及系统概述： 1. 微生物快速鉴定仪主要由质谱仪主机和微生物数据库、计算机工作站、软件等组成。主要用微生物快速鉴定和分型。 2．技术规格与要求： 2.1 分子量范围:1-500KDa 2.2．灵敏度：大于250 fmol BSA（m/z66,000），信噪比50：1 2.3．质量准确度：蛋白混合物：< 200 ppm 2.4．激光器： 2.4.1 气态激光器 *2.4.2最大频率≥50Hz，且激光频率在其范围内任意连续可调。 2.4.3．激光照射次数≥60,000,000 shots 2.5．离子源及清洗方式：独立的自动清洗离子源装置，可软件控制，方便日常维护，确保仪器长期稳定运行。 2.6．检测器：检测器具有长寿命、宽的动态范围、高分辨和高质量精度。 2.7．真空泵：采用无油真空泵，运行噪音低保证科室工作环境安静，后期免维护，节约成本。 2.8．离子源：离子源电离处为无网格设计，提高仪器检测灵敏度。离子源具备红外激光自动清洗功能，无需泄真空，方便日常维护，确保仪器长期稳定运行。 2.9．稳定性：校准标准品为蛋白质混合物且校正能保持24小时 2.10. 自诊断系统：提供自动化的自诊断程序。
2.11. 远程监控：提供安全的ISDN点对点连接，实现远程服务。 2.12．软件： 2.12.1 基于Windows操作系统的仪器控制、数据采集、数据处理及分析的全套最新软件。 2.12.2 常规细菌，酵母菌，分枝杆菌、丝状真菌鉴定分析软件。 2.12.3 需要包含IVD和科研操作软件，科研库与临床库采用相同的建库原理和算法，以便确保自建库的可靠性。 3. 微生物数据库 *3.1 微生物数据库含标准配置的细菌、酵母菌数据库，同时配置分枝杆菌、丝状真菌菌库科研库。 3.2 数据库含有大于5600种以上微生物菌株的信息。每一张MSP（数据库内数据）都是平均20-24的平行实验图谱所得统计结果，保持更新。 *3.3 数据库中包括了不少于380个属、总计≥1046个菌种的特征指纹图谱。3.4 允许用户轻松自建微生物数据库，完成数据库的扩充和自定义，且数据库可共享。 4.配置要求 4.1. 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪/一套，台式机以节约科室空间 4.2．计算机工作站/一套，激光打印机/一台，UPS电源/一台。 *4.3．不少于3块可重复使用靶板，以便降低检测成本。 4.4．仪器控制软件； 4.5．其它所必需的附件、专用工具和消耗品 4.6. LIS对接联网。