青岛中港全浸初期不锈钢表面生物膜的细菌
多样性分析
陈永伟1,2栾鑫1,2 段继周2 池振明1
(1. 中国海洋大学海洋生命学院青岛266003, 2. 中国科学院海洋研究所青岛266071)
提要为了研究全浸15天不锈钢表面生物膜的形成情况, 首先采用SEM及荧光显微镜进行观察, 显示全浸15天不锈钢表面已有大量微生物及其腐蚀产物附着, 表明其表面生物膜已经形成; 进一步通过EDS对不锈钢表面进行元素分析, 发现实海全浸15天的316L不锈钢表面出现了大量的组成生物体的C、P等基本元素, 并且还出现了不锈钢基体中所不存在而存在于生物膜及其代谢产物中O等元素, 进一步证明了不锈钢表面生物膜的形成。采用16S rRNA基因结合PCR-RFLP技术分析手段对实海全浸15天的316L不锈钢表面生物膜细菌群落的多样性进行了研究, 发现316L不锈钢表面附着细菌的OTU数为24, 分别属于变形菌门和拟杆菌门, 其中α-变形菌的OTU数是18, 占总克隆数的72.3%, 为绝对优势种群。
关键词生物膜; 316L不锈钢; 细菌多样性; PCR-RFLP; 生物腐蚀
中图分类号:
316L不锈钢具有极强的耐腐蚀性和良好的机械加工性, 常被应用在海洋设施中的关键部件。在海水中不锈钢会形成一层由微生物及其代谢产物所组成的生物膜, 该生物膜包含多种腐蚀微生物, 如铁氧化菌, 硫酸盐还原菌和锰氧化菌等(Newman et al., 1986;Xu et al., 2008)，从而会对不锈钢产生微生物腐蚀, 结果也导致了巨大的经济损失(Beech et al., 1999)。
有大量研究发现316L不锈钢在淡水和天然海水中都有开路电位正向移动现象发生
1
1*项目来源：中国科学院重要方向性项目（No. KZCX2-EW-205）；国家自然科学基金(40976046)。陈永伟,硕士研究生, E-mail：today521328@https://www.doczj.com/doc/c56777463.html,
通讯作者：段继周, 硕士生导师, 研究员, E-mail：duanjz@https://www.doczj.com/doc/c56777463.html,
收稿日期：, 收修改稿日期：
(Motoda et al., 1990; Dickinson et al., 1996), 但是在灭菌海水以及某些已培养出的单一株菌或两株菌的混合菌液中却出现开路电位负向移动的现象(Xu et al,2007; Xu et al,2008)。目前比较普遍的观点是, 上述开路电位变正现象是由微生物在不锈钢表面的生长繁殖造成的, 但具体是哪种微生物, 其机理是什么尚不清楚。因此, 研究天然海水中的316L不锈钢表面的微生物菌落结构具有重要意义, 这对进一步研究微生物腐蚀机理和寻找具有腐蚀性能的微生物提供参考依据。
有研究表明, 在一般情况下, 生物膜的形成与发展会在14-20天内达到成熟阶段(黄宗国, 2008)。Jones等(2007)对暴露于天然海水中的316L不锈钢表面所形成生物膜的细菌群落结构进行了研究, 表明主要的细菌群体在2-20天内的相对丰度基本没有发生变化。国内有关学者对引水系统中的不锈钢表面生物膜进行了研究, 结果表明, 不锈钢表面细菌种类明显多于PVC材料, 不锈钢的腐蚀导致不锈钢表面粗糙度增加, 有利于生物膜的再生。因此, 他们认为导致这种现象发生的原因之一是不锈钢腐蚀造成的。(Lin et al,2012)。然而, 国内缺乏对海水中316L不锈钢表面生物膜的细菌多样性方面的研究。为了了解青岛近海316L不锈钢表面微生物膜的细菌群落组成, 本实验选择夏季在青岛海域实海全浸316L不锈钢来分析研究其表面的生物膜中的细菌多样性。
1材料和方法
1.1挂片与取样
本实验所选用的材料为购自山东信阳晟鑫科技有限公司的316L不锈钢, 首先, 按照国标金属材料在表面海水中常规暴露腐蚀试验方法(GB5776-1986)进行处理, 然后用SiC水相砂将试样逐级打磨至2000#, 然后放入无水乙醇中超声10 min, 最后放入干燥器内, 备用。将处理好的试样实海全浸于青岛中港实验场（东经119°58’,北纬35°52’）内。取样时将不锈钢片放入灭菌的50mL离心管中, 然后放入冰盒中带回实验室-20°C保存备用。
1.2生物膜表面观察与分析
1.2.1扫面电子显微镜观察(SEM)
为了观察不锈钢表面附着微生物随时间的变化规律, 分别在第1天、3天、5天、7天、10天和15天取回不锈钢片, 先用灭菌磷酸盐缓冲液(PBS) 溶液冲洗掉不锈钢表面吸附的悬浊液, 然后用5%戊二醛(用灭菌PBS稀释)固定2h。后用50%, 75%, 90%和100%的乙醇梯度脱水各30min, 真空临界点干燥, 喷金后放置到扫描电镜(KYKY-2800扫描电子显微镜, 北京中科科仪技术发展有限责任公司)上进行观察。加速电压为20kV。
为了观察不锈钢全浸15天以后的腐蚀形貌变化, 分别用扫描电镜观察不锈钢片第0天的初始形貌和15天后去除表面腐蚀产物后的表面形貌。腐蚀产物的去除方法参考国标金属和合金的腐蚀腐蚀试样上腐蚀产物的清除(GB/T 16545一1996)。
1.2.2 X射线能谱分析(EDS)
对SEM观察后的第15天的不锈钢片不做任何处理, 直接进行EDS分析, 来研究不锈钢表面组成元素的变化。
1.2.3荧光显微镜观察
4＇,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）溶液是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，其穿过生物膜后与双链DNA结合，在紫外线(365nm)照射下会显示蓝色荧光，因此，可以用DAPI溶液对全浸15天的不锈钢进行染色以观察其表面细菌附着情况。将15天取回的不锈钢片先用灭菌PBS溶液冲洗掉其表面, 后用0.01mg/mL的DAPI染色30分钟, 然后荧光观察其表面附着微生物的数量。
1.3 PCR-RFLP技术表面附着微生物多样性分析
1.3.1 总DNA的提取以及16S rRNA基因的扩增:
利用PowerSoil DNA Isolation Kit(Mobio, USA)试剂盒来提取锈层中微生物的总DNA, 从-20°C冰箱中取出全浸15天的不锈钢片,用数片灭菌纱布擦拭其表面后，将擦拭后的纱布放入试剂盒中的Power Bread Tubes中, 然后按试剂盒说明进行DNA提取。以总DNA为模板, 采用细菌16S rRNA基因保守引物Bac8F: 5′-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3′和Bac1492R: 5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增。50μL反应体系为: DNA模版
2μL, 正反引物(2mM)各5μL, 10xBuffer 5μL, dNTP(2.5mM)4μL, dH2O补充至50μL。反应条件为:94°C预变性5 min; 94°C变性30s, 55°C退火30 s, 72°C延伸90 s, 进行30个循环; 最后72°C延伸10 min。
1.3.2 16S rRNA基因文库构建及测序
利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(华舜W5211,上海)纯化回收PCR产物, 将纯化的16S rRNA 基因连接到载体pMD19-T(Takara, 大连)上, 转化到感受态细胞E. coli DH5α中, 涂布在含有x-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB培养基上, 于37°C培养约12h, 选择具有氨苄抗性的白色转化子96株进行划线培养。然后用水煮法快速提取细胞中的基因组DNA, 采用T载体通用引物RV-M: 5′-GAGCGGA TAACAA TTTCACACAGG-3′和M13-D: 5′-AGGGTTTTCCCAGTCACGACG-3′(Dang et al)进行PCR验证。再先后用Msp I (NEB R0106, 北京)与Hha I(NEB R0139, 北京)限制性内切酶进行酶切。根据酶切所得的RFLP带型对克隆子进行初步划分, 相同带型归为同一个RFLP带型, 每个带型挑选出一株代表性菌株送测序(上海鼎安生物技术有限公司)。
1.3.3系统进化分析
测得的序列用DOTUR软件进行处理, 相似性在97%以上的被归为同一个操作分类单元(OTU)。将所得结果分别与NCBI GenBank数据库进行比对, 确定最相似的核酸序列, 用Clustal X软件比齐, 然后用MEGA4.0程序通过邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树。1.3.4 统计学分析
以覆盖率C来评价所构建的16S rRNA基因文库对环境微生物多样性的体现, 公式为: C=[1－(n/N)]×100%, 其中n指文库中只包含一个克隆的OTU 数, N指文库的克隆总数。并计算其香浓-威纳（Shannon-Wiener）指数（H）、辛普森（Simpson）指数(D)和均匀度（J）等多样性指数(栾鑫等,2013)。
2 实验结果与分析
2.1 不锈钢表面观察分析结果
2.1.1扫描电镜观察
经过扫面电镜的观察，得到全浸海水1天, 3天, 5天, 7天, 10天, 15天的SEM照片(图1), 结果显示: 不锈钢片在海水中浸泡1天后就发现其表面出现细菌附着及圆形腐蚀产物生成; 在第三天表面的微生物明显增多, 且有絮状腐蚀产物形成; 在第五天附着的微生物和絮状腐蚀产物继续增多, 但第七天和第五天比较变化不太明显; 到了第十五天腐蚀产物厚度进一步增加形成块状突起。
图1实海全浸1天、3天、5天、7天、10天和15天的不锈钢挂片SEM观察结果, 放大倍数均为2500倍Fig.1 SEM micrograph of representative morphologies of the 316L stainless steel immersed in the sea for
1d,3d,5d,7d,10d and 15 d.
2.1.2 荧光显微镜分析结果
为了观察实海全浸15天的316L不锈钢表面微生物附着情况, 我们对其进行了荧光显微镜观察, 结果如图3所示, 在不锈钢的表面发现有大量的蓝点(图2a), 部分位置蓝点极度聚集形成一片蓝色光区(图2b)。
图2 实海全浸15天的不锈钢钢片表面附着微生物的荧光照片
Fig.2 Fluorescence microscopy of 316L stainless steel immersed in the sea for 15 days
图a、图b分别为不锈钢表面生物膜放大200、400倍荧光照片
2.1.3 X射线能谱分析结果
为了进一步分析不锈钢表面形成的生物膜, 分别对全浸海水之前和全浸海水之后的316L不锈钢片进行了X射线能谱分析(EDS), 结果如图3所示。将全浸海水前、后EDS结果进行对比, 结果如表1所示。结果发现, 构成生物体的基本元素C、O元素含量明显增高，并且发现了不锈钢中不存在的P元素。另外，在生物膜中未发现不锈钢中存在的Mn元素和Mo元素。
图谱1 图谱2
图3全浸海水前,后的316L不锈钢的局部能谱分析图谱
Fig.3 EDS analysis of local area of 316L stainless steel before and after seawater immersion
图谱1为全浸海水前不锈钢能谱图,图谱2为全浸海水后不锈钢能谱图
表1 316L 不锈钢基体与表面生物膜成分EDS 分析结果
Tab.1 Result of EDS analysis of 316L stainless steel with biofilm
C
Atomic %
P Atomic % Cr Atomic % Fe Atomic % Ni Atomic % O Atomic % Si Atomic % Mn Atomic % Mo Atomic % 全浸海水前 9.88
— 16.25 60.01 10.11 2.30 1.02 0.76 1.11 全浸海水后
21.50 3.37 1.95 6.52 0.75 50.53 — — — 2.2细菌多样性分析结果
从筛选的96个克隆子中获得的RFLP 带型为47个, 经测序所得序列经3% cut off 后得到的OTU 数为24, 其样品覆盖率C 为88.2%, 香浓-威纳指数H 为3.81, 辛普森指数D 为0.90, 均匀度J 为0.83，三个多样性指数都比较高，说明不锈钢表面具有丰富的细菌多样性。进一步分析细菌16S rRNA 基因文库的Rarefaction 稀释度曲线（图4）也表明当克隆数在渐近于93时, 稀释度曲线逐渐接近平台期, 说明本研究建立的16S rRNA 基因文库基本能够反映全浸不锈钢中细菌的群落结构。
各门克隆数占总克隆数的比例, 如图5所示。在不锈钢表面占据绝对优势的是α-变形菌, 占到总克隆数的72.3%, 其中占据到绝对优势的单株菌是序列HSY .CS.25所代表的红细菌科的一种暂时不可分离菌, 占到整个基因文库的20.4%。同时在不锈钢表面还有2.1%的γ-变形菌, 18.1%的ε-变形菌以及7.4%的拟杆菌。在整个文库中所占比例超过10%的菌种还包括: Thalassobacter ，Loktanella maricol 以及序列HSY.CS.1和38所代表的暂时不可分离菌, 其中
图4 细菌16S rRNA 克隆文库稀释度曲线分析
Fig.4 Rarefaction curves of the bacteria 16S rRNA clones libraries
5
10
15
2025
30
161116212631364146515661667176818691
O T U 数 克隆数
前三者所占比例为10.8%, HSY .CS.38所占比例为14.0%。根据所得的24个OTU, 构建不锈钢表面附着微生物的系统发育进化树(图6)。分析发现α-变形菌(Alphaproteobacteria) 占到18个OTU 数, γ-变形菌(Gammaproteobacteria)占到了1个, 拟杆菌门(Bacteroidetes)占到了2个, ε-变形菌(Epsilonproteobacteria)占3个。
图5 316L 不锈钢表面附着微生物中各分支菌占总菌数的例
Fig.5 Composition of clone library for 316L stainless steel
经过比对, α-变形菌中已知序列有7个, 分别为Thalassobius gelatinovorus , Pseudoruegeria aquimaris , Thalassobacter , Phaeobacter arcticus , Litoreibacter janthinus , Loktanella maricola , Hoeflea alexandrii 。其中前6者属于红杆菌目(Rhodobacterale)且均属于红杆菌科(Rhodobacteraceae)。仅有的一种γ-变形菌为Thiomicrospira crunogena 。ε-变形菌中已知序列仅一种为S ulfurospirillum arcachonense 。拟杆菌已知序列有两种, 均属于黄杆菌科(Flavobacteriaceae), 分别为Polaribacter , Dokdonia donghaensis 。
3. 讨论
3.1 不锈钢表面生物膜的形成
SEM 分析结果表明, 随着时间的变化, 全浸于海水中的不锈钢片表面细菌数量逐渐增加, 并且腐蚀产物越来越厚, 与第1天相比, 全浸15天以后, 不锈钢表面细菌大量聚集在一起, 并且有大量的腐蚀产物分布在细菌聚集区周围。另外, 不锈钢全浸15天以后, 经DAPI
72.30% 2.10%
18.10%
7.40%
α-变形菌门 γ-变形菌门 ε-变形菌门 拟杆菌门
染色, 在荧光显微镜下出现了大量蓝点(图2a), 说明不锈钢表面有大量细菌附着, 片状蓝色区域(图2b)的形成, 是由于大量细菌聚集在一处造成的。EDS分析结果发现构成生物体的基本元素C元素和O元素含量明显增加, 同时还有不锈钢基体中不存在的P元素存在, 进一步说明在不锈钢表面存在大量微生物及其代谢产物。因此, 通过以上分析我们发现, 经过15天实海全浸实验, 316L不锈钢表面已经形成了较为丰富的由微生物及其代谢产物组成的生物膜。另外根据不锈钢SEM照片观察, 我们发现在不锈钢表面存在着各种不同形状的细菌, 因此我们对316L不锈钢表面生物膜进行了进一步的细菌多样性分析。
3.2 细菌多样性分析
根据结果，我们发现, 不锈钢表面具有丰富的细菌多样性, 其中α-变形菌门中的红杆菌目为优势菌群。Thalassobius gelatinovorus是一种需氧的能动棒状菌, 具有氧化酶和过氧化酶活性(Muramatsu et al,2007)。Phaeobacter arcticus是生长在2-9% 浓度NaCl条件下的一种需氧的能动杆状菌, 具有过氧化氢酶和细胞色素酶活性(Zhang et al,2008)。Loktanella maricola 是一种附着在不锈钢表面的需要低浓度NaCl才能生长的非能动杆状菌(Yoon et al,2007)。Litoreibacter janthinus和Pseudoruegeria aquimaris都是能在8%NaCl浓度下生长的异养非能动性杆状需氧菌(Yoon et al,2007;Lyudmila et al,2011)。
在实海全浸初期不锈钢316L表面还附着着一种重要的可以加速腐蚀的细菌Sulfurospirillum arcachonense, 这是一种微需氧的具有能动性的硫酸盐还原菌, 是一种典型的金属腐蚀菌, 在无氧条件下可以利用醋酸盐生成氢和甲酸, 具有氧化酶, 过氧化酶和脲酶活性, 可以以元素硫作为电子受体, 生成H2S(Finster et al,1997)。Thiomicrospira是不锈钢表面存在的一种化能自养细菌, 它是一种能动的杆状菌, 能降解含硫化合物, 如硫化物, 硫代硫酸盐以及元素硫, 作为能量来源。它可以利用不锈钢中的硫元素, 加速不锈钢的腐蚀(Wirsen et al,1998)
Dokdonia sp.是广泛存在于海洋中的一种没有能动性的微嗜盐的需氧异养菌, 属于黄杆菌科, 它会附着在各种基质的表面进行生长(Laura et al,2007)。Hoeflea alexandrii也是存在于
不锈钢表面的一种好氧非共生菌, 可以依靠单极鞭毛运动到达附着基质表面, 具有过氧化酶活性, 不能利用硝酸盐, 但可以消耗生物膜内其他微生物代谢产生的硝酸, 生成吲哚, 可以起到延缓不锈钢腐蚀的作用(Luc?a et al,2006)。
通过对已知细菌的分析发现, 不锈钢表面的细菌几乎都是革兰氏阴性菌, 其中60%以上的细菌具有能动性。我们对全浸海水15天不锈钢表面细菌的种类研究发现, 不锈钢表面附着有大量的好氧细菌, 其中包括一种抑制腐蚀的Hoeflea alexandrii菌, 这些细菌及其代谢产物的出现初步形成了一层生物膜, 从而改变了界面的电化学性质, 起到抑制腐蚀的作用; 然而随着生物膜厚度的增加, 氧气的传递受到阻碍, 因此到达不锈钢介质表面的氧气减少, 结果导致了厌氧细菌, 如Sulfurospirillum arcachonense的出现, 这些厌氧菌是重要的腐蚀性细菌, 从而会加速不锈钢的腐蚀, 这可能是开路电位发生正移的一个重要原因。不锈钢在天然海水中的耐腐蚀性先变大后变小, 这与刘彬等(2012)研究结果相符。
4. 结论
全浸15天的316L不锈钢表面形成了丰富的由细菌及其代谢产物组成的生物膜, 并且根据SEM照片对附着细菌的形状进行初步观察, 可以发现316L不锈钢表面附着的细菌种类较多。全浸15天的316L不锈钢表面生物膜具有丰富的细菌多样性, 优势菌群为红杆菌目, 并且还发现了一株对钢铁有腐蚀作用的硫酸盐还原菌存在。
图7 不锈钢表面细菌系统发育分析
Fig.7 Phylogenetic tree of bacteria on the surface of stainless steel
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Diversity of Bacterial Community of Biofilm on Stainless Steel Surface in Middle
Port Area of Qingdao
CHEN Yong-Wei1,2 LUAN Xin1,2 DUAN Ji-Zhou2 CHI Zhen-Ming1
(1.College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China; 2. Institute of
Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)
Abstract The formation of biofilms on 316L stainless steel after 15d immersion in seawater, which is composed of microbial community and its metabolites, was found by SEM and Fluorescence microscope. EDS analysis showed that the stainless steel surface had a large number of C, P, and other basic elements of organisms, and also found that there had been some new elements, Such as oxygen, which is further evidence of the formation of biofilms. The 16S rRNA gene clone library technique and PCR-RFLP analysis were applied to give a comprehensive view of the diversities and compositions of the
biofilms. The results showed that the number of bacteria OTUs on 316L stainless steel is 24, belonging to Proteobacteria and Bacteroidetes, respectively. Among them, α- Proteobacteria bacteria OTU number is 18, accounting for 72.3% of the total number of clones, as absolute dominant population.
Key words biofilm; 316L stainless steel; bacterial diversity; PCR-RFLP; microbiologically influenced corrosion
306 中国医学文摘耳鼻咽喉科学 NEWS AND REVIEWS/November 2009, Vol.24, No.6 专题论坛 抗生素的合理应用 EATURE 1 生物膜的概念 细菌生物膜是指在多聚糖、蛋白质和核酸等组成的基质内相互粘连粘附于物体表面的细菌群体[1]。生物膜可以由一种或几种细菌混合生长而成。乳酸乳球菌与萤光假单胞菌混合形成的生物膜就是一个典型的例子。乳酸乳球菌自身不易形成生物膜，但可以提供给萤光假单胞菌乳酸作为养料，而萤光假单胞菌帮助乳酸乳球菌固定在物体表面，并且消耗氧气为乳酸乳球菌这一厌氧菌提供更合适的生长环境[2]。 生物膜的生命周期分为附着、生长和分离3部分。附着阶段，物体表面的血清蛋白和其他物质作为连接物介导细菌的附着；生长阶段，细菌通过分裂并在物体表面定植，生成聚合物基质，使得生物膜形成三维结构，并形成隧道，这些隧道帮助营养物质的交换以及废物的排出，并调节生物膜内的pH 值。生物膜中的细菌对氧气和营养的需要有所减少，废物通过其内的管道得以排出。生物膜内细菌间的紧密接触为携带耐药基因的质粒的交换和对密度感应分子的交流提供了良好环境。生物膜内的细菌间更利于质粒、酶和其他分子的交换，通过化学信号进行交流。生物膜的形成需要细菌间的化学信号进行协调。使得细菌能感知到周围细菌的存在并对环境变化作出相应的反应。这一过程称为密度感应（quorum-sensing ）。虽然不同细菌的生物膜有其特异性，但均具有一些普遍的结构特征。生物膜中细菌形成的微菌落间具有间隙空位（interstitial voids ），液体可在这些间隙中流动，使得营养物质、气体和抗菌药物得以扩散。生物膜的结构随着外部和内部的改变而持续变化。 2 生物膜与临床 99%的细菌以生物膜的形式生活，美国疾病控制与预防中心估计至少65%的人类细菌感染与生物膜有关[3]。生物膜已经被证实与慢性中耳炎、中耳胆脂瘤、慢性腺样体炎[1]等疾病相关。Pawlowski 等[4]于2005年在耳蜗植入体上发现了细菌生物膜。Cryer 等[5]于2004年发现一些慢性鼻窦炎手术治疗后症状仍持续 细菌生物膜研究进展 郑波 [关键词] 生物膜（Bio ?lms ）；抗药性，细菌（Drug Resistance ，Bacterial ） 郑波 北京大学第一医院临床药理研究所，北京 100034 广东人，副教授，副主任医师，主要从事细菌耐药机制和抗菌药物合理应用的研究工作。Email ：doctorzhengbo@https://www.doczj.com/doc/c56777463.html, 的患者鼻窦中存在生物膜，这些患者主要为铜绿假单胞菌感染。Ramadan 等[6]于2005年对5位慢性鼻窦炎患者进行黏膜活检，对标本进行扫面电镜检查均发现有生物膜的存在。此外，生物膜已被证实与下列感染有关：慢性前列腺炎、导管相关感染、人工关节感染、牙周病、心内膜炎以及囊性纤维化患者的假单胞菌肺炎等。 3 生物膜与抗菌药物耐药 生物膜内细菌对抗菌药物的敏感性较游离状态时显著降低，最低可降低1000倍。其原因包括生物膜的结构阻止了药物的传输或生物膜中的细菌的生理学改变等。以前一直认为生物膜介导的对抗菌药物耐药的原因是抗菌药物难以渗透入生物膜。但一些研究否认了这一假设。研究显示喹诺酮类可以很快的渗透到铜绿假单胞菌和肺炎克雷白杆菌生物膜的深部[7，8]，四环素可很快的渗透到大肠埃希菌生物膜内，万古霉素可以很快渗透到表皮葡萄球菌生物膜内。目前唯一得到证实的是氨基糖苷类药物，由于生物膜中的基质带负电荷，而氨基糖苷类带有正电荷，因此氨基糖苷类药物难以渗透到生物膜的深部[9]。 生物膜对β内酰胺类耐药性增加的机制之一是细菌产生的β内酰胺酶在生物膜表面基质内聚集，可达到很高的浓度，能迅速的将渗透进生物膜内的β内酰胺类抗生素水解掉，有效保护深部细菌不被β-内酰胺类抗菌药物灭活[10]。有研究证实氨苄西林会被肺炎克雷白杆菌生物膜表层中聚集的β内酰胺酶快速水解。 生物膜造成的缺氧环境也增加了对抗菌药物耐药性。一项在囊性纤维化患者生成的铜绿假单胞菌生物膜的研究显示氧气仅能渗透到生物膜的25%深度。铜绿假单胞菌在厌氧条件下比在有氧条件下对抗菌药物的敏感性明显降低[11]。 由于很多抗菌药物对繁殖期细菌杀伤作用更强大，如青霉素类、头孢菌素类和碳氢霉烯类等。在生物膜深部的细菌受氧气、营养物质缺乏的影响及可能存在的密度感应系统的调控，使得细菌的生长、繁殖速度下降，影响抗菌药物对其作用。因此在抗菌药物作用下，生物膜中相对敏感的细菌会被杀死，但耐药菌会持
第7卷第5期1998年10月 环境科学进展 ADVANCESINENVIRONMENTALSCIENCE Vol.7,No.5 Oct.,1999生物膜的研究进展Ξ 王文军1、2 王文华1 黄亚冰1 张学林2 (1中国科学院生态环境研究中心环境水化学国家重点实验室,北京100085) (2中国科学院长春地理研究所,长春130021) 摘 要 本文综述了近年来生物膜研究成果,包括生物膜的发育形成、形态结构、组成、物理-化学特征、抗性等;生物膜在污水处理方面的作用和微生物组织腐蚀性的负效应。 关键词:生物膜 特征 作用 生物膜在天然水环境中和工程处理过程中起着重要的作用[1-3]。在天然水环境中,绝大部分矿物颗粒表面覆盖着有机外壳[4],这些有机外壳由腐殖酸物质和生物膜组成,它们将强烈地改变矿物颗粒的吸附行为,这种表面吸附作用在河水污染物的迁移过程中起着决定性作用。在工业应用中,生物膜的作用表现在废水处理,以及酸性矿物排泄物的生物修复等方面,例如在水和废水处理系统中,生物膜反应器比悬浮生长反应器具有更大的优势,能提高生物量在反应器中的滞留程度,促进对污染物降解效率。生物膜的破坏性作用表现在清洁水系统中,以及微生物诱导的腐蚀等方面[5,6]。随着对生物膜在自然环境(如水、土、生物环境)中和工业应用方面的重要性的不断认识,在过去的二十多年,人们对生物膜的兴趣极大地增加[7]。美国、德国、日本、英国、法国等国家对生物膜进行了大量的研究[1-31],取得了一些初步的研究成果。 一、生物膜的形成及影响因素 生物膜形成于自然环境和人工环境中。在自然环境条件下,生物膜存在于几乎所有暴露于水中的固体表面上,代表了一类微生物群体,其中有各种寄居者如固着细菌、原生动物、真菌和藻类[4-9]。这些微生物细胞及非生物物质镶嵌在微生物分泌的有机聚合物基质(Matrix)中,聚合物基质由细菌胞外聚合物质和腐殖质等其它有机物质组成。即生物膜代表了一种稳定的由微生物细胞组成的复杂混合物的微生态系统,细胞镶嵌在胞外聚合物的基质中,并且附着到固体表面。生物膜发育形成的条件和时间序列大致为[9]: (1)存在着清洁的可用于聚居的固体表面;(2)一种有机分子膜快速形成;(3)聚结的细胞 Ξ1国家自然科学基金资助项目:29777027 2中国科学院武汉水生所淡水生态与生物技术国家重点实验室开放基金资助
Polymicrobial infections in mice. Bacterial cultures were grown overnight and then subcultured the following day into fresh media appropriate for each bacterium.Three milliliters of each culture was pelleted and washed three times with phosphate-buffered saline (PBS) to remove residual medium and toxins. Bacterial suspensions were diluted in PBS to give a final concentration of 2×106 to 3×107 CFU/ml (as determined by serial dilutions and plating of the PBS suspensions of bacteria). The polymicrobial infections for the young and aged diabetic mice were separated into eight experimental groups, as shown in Table2. One hundred-microliter samples of each bacterial suspension (2×105 to 3×106 CFU), singly or in combination, were injected subcutaneously into the inner thighs of the mice, as previously described (7). Each experimental group (Table2) was comprised of 24 mice. At 1, 8, and 22 days postinjection, eight mice from each experimental group were euthanized by cervical dislocation following the induction of deep anesthesia with 100% CO2 gas. Six mice were used for the determination of the number of CFU in the injection area; the remaining two mice were used to assess the pathology of the injection site. Blood from all mice was removed from the caudal vena cava and/or directly from the heart and placed in blood vials containing EDTA. These samples were sent to a reference labo-ratory (Ani Lytics, Inc., Gaithersburg, MD) for determining complete blood cell counts. From six of the mice, the tissue surrounding the area at the site of injection was excised and the spleens were removed. Each sample was homogenized using a tissue homogenizer and resuspended in a final volume of 1 ml of PBS. Appropriate dilutions were plated on a selective medium specific for growth of each of the three organisms used. E. coli-containing samples were plated on eosinmethylene blue agar (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) and incubated aerobically at 37°C overnight. B. fragilis-containing samples were plated on Bacteroides bile esculin agar (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) and incubated anaerobically at 37°C for approximately 2 days. C. perfringens-containing samples were plated on either tryptose-sulfate cycloserine agar base (EM Science, Gibbstown, NJ) or Shahidi Ferguson Perfringens agar base (Becton Dickinson, Sparks,MD) and incubated anaerobically at 44°C for 8 to 12 h. The remaining two mice were necropsied, and the area of injection and spleens were examined for pathological changes in the infection. Five-micron-thick sections of the abscess area were stained with hematoxylin and eosin and mounted on microscope slides. Experim ental protocols involving mice were examined and approved by the Virginia Tech Institutional Animal Care and Use Committee.
细菌生物膜的耐药性机制的研究近况 随着抗生素的广泛应用,细菌对抗生素产生的耐药现象日益加重, 给临床抗感染治疗带来了极大的挑战。近年来细菌对抗生素的耐药现象日益严重, 随着对生物膜研究的深入,发现细菌对抗生素的耐药性不仅与耐药菌株的大量产生有关,亦与致病菌在体内形成生物膜有关。近些年来,对细菌生物膜的基础研究和临床研究成为国内外细菌耐药研究热点,本文在前人的研究基础上,对生物膜的耐药机制作综述,为了更好指导临床治疗方案。 细菌生物膜(Bacterial Biofilm ,BF) 是细菌在生长过程中为适应生存环境而不可逆的粘附于非生物或生物表面形成的一种与浮游细胞(plank tonic cell)相对应的生长方式,由细菌和自身分泌的胞外基质组成。BF的耐药机制不同于浮游菌，有效浓度的抗菌药物能迅速杀死浮游生长的细菌和BF表面的细菌，但对BF深处的细菌却难以有效杀灭。当细菌以BF形式存在时耐药性明显增强(10一1000 倍),抗生素应用不能有效清除BF,还可诱导耐药性产生。BF通过多种机制参与耐药形成, 不同机制间还存在协同作用[1]。 1 抗菌药物渗透障碍 BF中的细菌合成的胞外基质及水不溶性胞外多糖等物质构成的细菌生物膜独特三维结构,是BF 细菌的保护装置,成为抗菌药物向BF 和BF 细菌菌体内渗透的天然屏障。BF的物理性阻碍作用,降低了菌体内抗菌药物的浓度,从而表现出耐药性。改变金黄色葡萄球菌胞外多糖中特定季铵盐疏水键长度,增加其疏水,该菌株的耐药性亦增高;若去除疏水基质,则对多数抗菌药物敏感。此外,胞外多糖所带的负电荷,可与带正电荷的抗菌药物结合,而阻止药物的进一步渗透。氟化喹啉虽易穿透生物膜,但也不能完全清除细菌生物膜内的细菌。这一现象表明,BF 阻止抗菌药物渗透,只是其耐药机制的一个方面[2]。 2 特殊的微环境药物活性调节与生物膜中细胞的生长速度密切相关，抗生素对快速生长细胞更有杀伤力。生物膜中的营养成分、代谢产物浓度、渗透压和氧浓度等，自外向内呈梯度下降。这种特殊微环境和营养条件，使其中的细菌生长速度较游离菌和浮游菌明显缓慢。深层的细菌很难获得养分和氧气，代谢产物难以排出而堆积，因此，这些生物膜菌代谢活性很低，甚至处于休眠状态，菌体较小，不进行频繁的细胞分裂，对各种理化刺激、应激反应及药物均不敏感。Schauder等[3]发现当使用抗生素治疗时，生长快速的外层或表层细菌最敏感，首先被杀死；生长缓慢者敏感性下降，大部分被杀死；而生长停滞者则不敏感，待抗生素治疗停止后，残存细菌利用死亡细菌作为营养源迅速繁殖形成新的生物膜，这使感染反复发作，难以控制。 3 BF特殊的生物膜表型生物膜细菌与浮游菌相比,出现了生物膜环境所特有的基因表达模式,即对生长表面的粘附触发了部分细菌亚群基因表达的变化, 使其生物学行为也随之改变, 这称为生物膜表型。生物膜特有的表型能够激活其耐药机制。目前从mRNA 水平和蛋白水平寻找生物膜状态和浮游状态下基因表达的差别,是生物膜研究的一个热点。白色念珠菌拥有的编码外排泵的MDR 基因和耐药性相关基因——CDR 基因家族, 在生物膜中表达均有增强, 可能引起细胞膜上外排泵数目增多或活性增强, 导致生物膜中的菌株出现耐药性。而人工敲除细菌中的这些耐药性基因, 所培养的浮游菌株耐药性下降, 生物膜菌株耐药性却没有明显下降,表明耐药性并不是单一的耐药性基因所控制的
国内外感染伤口细菌生物膜处理方式的研究进展 细菌生物膜是感染伤口迁延不愈，手术及局部给药治疗效果不佳的主要原因之一。目前临床上普遍使用的处理伤口细菌生物膜的方法有局部机械清创法、负压疗法、局部药物等，虽具有一定的治疗效果，但细菌生物膜仍是目前临床治疗慢性感染的棘手问题。近年来，国内外学者提出了一些新的治疗方法及理念，如光动力学治疗、低能量光疗、乙酸及抗菌肽等的使用，本文综述了国内外感染伤口细菌生物膜处理的研究进展，以期为目前生物膜的临床治疗与护理带来启发。 Abstract：Bacterial biofilm is one of the main reasons for the unhealing of infection wound，the poor effect of operation and local administration.At present，the methods of treating bacterial biofilm in clinic are local mechanical debridement，negative pressure therapy，local medicine and so on. Although it has certain therapeutic effect，bacterial biofilm is still a thorny problem in clinical treatment of chronic infection.In recent years，scholars at home and abroad have put forward some new treatment methods and ideas，such as photodynamic therapy，low-energy phototherapy，acetic acid and antimicrobial peptides，etc.This article reviews the research progress of bacterial biofilm treatment in infected wounds at home and abroad in order to bring inspiration to the clinical treatment and nursing of biofilm. Key words：Bacterial biofilm；Infected wound；Photodynamic therapy；Low energy phototherapy；Antimicrobial peptide 傷口细菌生物膜（bacterial biofilm）因其独特的组织结构，对抗生素以及其它一些抗菌物质有着极强的耐药性[1]。美国疾控中心数据表明，65%～80%的伤口感染都与细菌生物膜有关[2]。而细菌生物膜也成为了感染伤口迁延不愈，手术及局部给药治疗效果不佳的主要原因之一。目前临床上普遍用来处理伤口细菌生物膜的方法包括局部机械清创法，破坏菌膜、生物工程替代疗法、负压疗法、局部药物等治疗方法，以上方法虽均具有一定的治疗效果，但细菌生物膜仍是目前临床治疗慢性感染的棘手问题。近年来，国内外医学专家通过对细菌生物膜产生的机制和其对伤口愈合的不利影响，以及如何消除伤口生物膜的方法进行了研究，并提出了一些新的治疗方法及理念，这些会对目前生物膜的临床治疗与护理带来启发，现综述如下。 1细菌生物膜产生的机制及特性 细菌生物膜是微生物有组织生长的聚集体，指细菌不可逆的附着于一个惰性或活性的实体表面，进而繁殖、分化，并分泌一些多糖（EPS）基质，将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物。单个生物膜可由一种或多种不同的微生物组成，包括细菌，还包括真菌、病毒、蛋白质、细胞外DNA等多种成分[3]。 生物膜的形成是一个动态[4]的过程，主要分以下3个阶段：微生物附着于创面，EPS的分泌和菌落的形成，以及菌落细胞的成熟与传播。当生物膜内环境
·综述·支原体生物膜研究进展 叶晓敏，陆春 (中山大学附属第三医院皮肤科，广东广州510630) ［摘要］近几年，支原体生物膜研究逐渐受到研究人员的关注。多种支原体都被证实具有生物膜形成 能力，生物膜形成后支原体耐药性增加，研究生物膜对于防治临床支原体感染有着重大意义。本文从 目前报道的几种支原体生物膜的形成及结构、生物膜形成的影响因素、生物膜形成对支原体药物敏感 性的影响及可能机制等几个方面综述了目前对支原体生物膜的研究进展。 ［关键词］支原体;生物膜 ［中图分类号］R759［文献标识码］A［文章编号］1674－8468(2011)01－0060－04 生物膜(Biofilm，BF)是微生物在生长过程中附着于物体表面而形成的由微生物的细胞及其分泌的聚合物等所组成的膜样多细胞复合体［1］。生物膜的存在可以增强病原微生物对宿主免疫攻击及抗菌药物的抵抗力。目前对大量支原体的研究已发现很多支原体都具有形成生物膜的能力。生物膜形成后增强了支原体对环境压力如热、干燥、缺氧、高渗透压等［2-3］及对抗菌药物的抵抗力［4］。本文从支原体生物膜的形成及结构、生物膜形成的影响因素、生物膜形成对支原体药物敏感性的影响及可能机制等几个方面对目前支原体生物膜的研究进展作一综述。 1支原体生物膜的鉴定及其形成和结构 生物膜是微生物细胞不断粘附、聚集，并包裹在自身生成的胞外基质中形成的多聚复合物，体积上15%由细胞组成，85%由胞外基质组成。目前生物膜的培养多以玻片、细胞爬片、滤膜为载体，可在液体中或固体培养基表面培养，依靠扫描电镜或共聚焦显微镜观察，通常认为观察到多层复合结构即为生物膜结构［5-6］。 生物膜的形成是一个动态过程，先后包括5个步骤［7］:可逆性粘附、不可逆性粘附、早期形成阶段、成熟及消散阶段。虽然很多研究认为支原体培养24小时生物膜即已形成，并以此期生物膜为对象研究其对抗菌素等的抵抗力。但Laura McAuliff等［2］在研究了牛支原体生物膜时有不同的发现。作者利用共聚交显微镜结合SYTO9/PI 荧光探针对牛支原体生物膜形成的动态过程进行观测，发现形成的24及48小时大部分细胞是活的，而通过共聚交显微镜的观察及三维重构发现牛支原体生物膜在最初的24小时仅有一层细胞粘附，48小时才发展成一个非匀质的框架结构，有近20um高，还有通道样结构，此时的生物膜才趋于成熟，同时研究发现培养24小时的牛支原体生物膜对达氟沙星，恩氟沙星，土霉素与游离状态的细胞同样敏感，证明牛支原体培养24小时尚未形成成熟生物膜。可见不同微生物生物膜成熟的时间是存在差异的，在对生物膜特性进行研究之前因先确定其成熟时间点。 支原体生物膜形态与其他微生物相似，可呈网络样、蜂窝状、柱状、蘑菇样、塔样，其间可见水通道，同一种微生物可形成不同结构的生物膜。如肺炎支原体的生物膜最初可形成蜂窝状的区域，在此基础上向外生长成蘑菇状或塔状，塔的直接从小的10um到大于50um，并在塔结构内可见到通道。随着生物膜生长时间的延长，蜂窝状结构中的空洞减少而塔的直径增加，生物膜的形成逐渐趋于成熟［8］。生物膜在不断成熟、丰厚的过程中对内层细胞保护作用不断增强，但由于其深部的细胞营养物质及氧份缺乏也会抑制其生长，正如Laura McAuliff的研究发现培养72小时的生物膜中近70%的细胞都死亡了，活的细胞主要位于生物膜中心。 2影响支原体生物膜形成的因素 生物膜的形成过程中粘附是第一步也是最关键的一步，某些胞外多糖及蛋白质物质是介导粘附的重要基质。如大肠杆菌的表多糖［9］，铜绿假单胞菌的藻酸盐［10］等都可促进生物膜的形成。有关支原体的研究也发现支原体的生物膜形成也与某些多糖及蛋白质物质有关。 2．1多糖与生物膜形成 野生型的肺炎支原体可形成一种胞外多糖，即表多糖(exopolysaccharide，EPS)-Ⅰ，它是由当量克分子的葡萄糖
生物膜 介绍：本文介绍了什么是生物膜以及它们在阻碍伤口愈合过程中所起到的重要作用。此外，还探讨了可能的干预方法，旨在清除或减少生物膜，并预防其在伤口再次形成。 什么是生物膜： 生物膜是一种微生物群落复合体，由细菌和真菌组成。微生物能合成并分泌一种保护性基质，通过它将生物膜牢固的附着在活体或非活体表面。 生物膜是一种动态的异种群落复合体，处于不断变化的状态，它们可能由单一种群细菌或真菌组成，大多数情况下，由多种群组成，比如包含多种多样的菌群。基本上，可将生物膜描述成细菌隐藏在一层厚厚的黏滑的保护层中，保护层由糖类和蛋白质组成。生物膜保护层可保护微生物免受来自外界的危害。 生物膜与伤口有什么联系？ 一直以来都认为生物膜可在医疗器械表面形成，例如导尿管、气管插管、鼓膜通气管、骨科与胸部植入物、角膜接触镜、子宫内避孕器（IUDs）以及缝合线。它们是导致潜在的细菌感染和慢性炎症的主要原因，如牙周炎、囊性纤维化、慢性痤疮以及骨髓炎。 生物膜还常见于伤口，并在某种程度上会延迟伤口愈合进程。通过电子显微镜对慢性伤口与急性伤口的活组织检查发现，60%的慢性伤口含有生物膜结构，而急性伤口只有6%含有生物膜结构。据报道，生物膜是导致多种慢性炎症性疾病的主要因素，那么极有可能几乎所有的慢性伤口上至少有部分创面含有生物膜菌群。 生物膜是如何形成的？ 阶段一：可逆的表面粘附 微生物通常被认为处于孤立的自由漂浮状态（如浮游型）。然而，在自然条件下，大部分微生物倾向于粘附在物体表面上，并最终形成生物膜。最初的粘附是可逆的。 阶段二：永久性表面粘附 随着细菌的繁殖，它们粘附的更加牢固（定植），发生变异，改变基因表达模式以提高生存能力。这通常是一种被称为细菌群感效应（Quorum sensing）的细菌通讯的结果。 阶段三：黏滑保护性基质/生物膜 一旦牢固地附着在表面上，细菌开始分泌一种包围基质，即细胞外聚合物（EPS）。 这是一种保护性基质或称为“黏质物”。这样，小菌落形成最初的生物膜。 EPS的准确成分因所含的不同微生物而异，但通常由多糖、蛋白质、糖脂和细菌DNA 所组成。一般认为存活的或死去的细菌释放的细菌DNA是构成生物膜细胞外聚合物（EPS）基质的重要组成部分。细菌分泌出各种蛋白质和酶帮助生物膜牢固的粘附在伤口创面上。
Hans Journal of Medicinal Chemistry 药物化学, 2018, 6(3), 78-84 Published Online August 2018 in Hans. https://www.doczj.com/doc/c56777463.html,/journal/hjmce https://https://www.doczj.com/doc/c56777463.html,/10.12677/hjmce.2018.63011 Advances on Research of Mycobacterium tuberculosis Biofilms Menglan Gan, Renfeng Wang, Zaichang Yang* School of Pharmacy, Guizhou University, Guiyang Guizhou Received: Aug. 1st, 2018; accepted: Aug. 15th, 2018; published: Aug. 22nd, 2018 Abstract Biofilms refer to a microbial community that is surrounded by a self-generated extracellular po-lymer and attached to the cell surface, but the physiology and genetics definition of the M. tuber-culosis biofilm have not yet been described. Because of its unique physiological state, M. tuberculo-sis biofilms limit the therapeutic effect of anti-tuberculosis drugs, prolong the cycle of tuberculosis treatment, and seriously endanger human health. This article reviewed the formation mechanism, structural composition and related functions and quantitative methods of M. tuberculosis biofilms, and discussed the research ideas of using M. tuberculosis biofilms as novel anti-tuberculosis drugs to shorten the treatment of tuberculosis and provide a new direction for improving the therapeu-tic effect of tuberculosis. Keywords Mycobacterium tuberculosis, Biofilms, Tolerance 结核分枝杆菌生物膜研究进展 甘梦兰，王仁凤，杨再昌* 贵州大学药学院，贵州贵阳 收稿日期：2018年8月1日；录用日期：2018年8月15日；发布日期：2018年8月22日 摘要 生物膜是指被自我产生的细胞外聚合物包裹，并附着在细胞表面的微生物群落，但结核分枝杆菌生物膜*通讯作者。
96孔微量板定量检测细菌生物膜的方法步骤(protocol) 摘要：96孔微量板定量检测法（polystyrene microtiter plate assay）检测细菌生物膜有着许多优势。一方面，在对大批样品快速操作时能保持试验的一致性。另一方面，微量板定量检测法不仅能对细菌形成生物膜定性，而且还能定量计算细菌形成生物被的能力，因此96孔微量板法被广泛应用于定量检测细菌生物被膜的方法。 关键词：生物膜 , 菌膜 相对于其它细菌生物膜体外培养方法而言，微孔板法有着当然的批处理优势，尤其是在对大批样品快速操作时还能保持试验的一致性，使得96孔板，乃至384孔板检测法大量应用于细菌生物膜的研究。微量板定量检测法（polystyrene microtiter plate assay）不仅能定性细菌能否形成生物膜，而且和不同染色方法结合，还能定量计算细菌形成生物被的能力，这对实验室生物被膜研究工作是非常有利的，因此96孔微量板定量检测法是目前实验室广泛应用的定量检测细菌生物被膜的方法。 主要试剂和仪器： 聚苯乙烯96孔板、PBS缓冲液、甲醇、1%结晶紫溶液、33%冰乙酸溶液、酶标仪或分光光度计。 实验步骤： (1) 在96孔聚苯乙烯微孔培养板中每孔加入100μl培养液，接种10μl过夜培养菌液，37°C静置孵育36h； (2)将培养液吸出，每孔加入200μl无菌PBS缓冲液清洗板孔3次；
(3) 每孔加入100μl甲醇固定15min，然后吸出培养孔中的甲醇，自然风干； (4) 每孔加入100μl 1%结晶紫溶液，室温下染色5min； (5) 吸出培养孔中的结晶紫染色液后，用流水把多余的染料冲洗干净； (6) 把培养板倒置在滤纸上除去残余的水，并在37°C烘箱中烘干或室温凉干； (7) 完全干燥后，每孔加入100μl 33%冰乙酸溶液，在37°C培养箱中作用30min以溶解结晶紫； (8) 590nm条件下，用酶标仪测定培养孔中溶液的OD值； (9) 每次试验每种菌株做3个孔的重复，试验数值取3次平均值（D值）； (10) 以未接种菌的培养液作为阴性对照，阴性值的2倍作为界限值(Dc)。 结果判定： 基于D值，菌株可分为3类： （1）强生物被膜形成株（D＞2×Dc）； （2）弱生物被膜形成株（Dc＜D≤2×Dc）； （3）无生物被膜形成株（D≤Dc）。
收稿日期：２００８－０４－２９ 基金项目：江苏省农科院院基金（６２１０７３０） 作者简介：杨敬辉（１９７３－），男，云南丽江人，助理研究员，从事植物病害生物防治工作。 河北农业科学，２００８，１２（９）：１－３ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｂｅｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ 责任编辑李布青 在自然环境中生存的细菌结合于固体、液体介质表面或与别的微生物细胞密切接触，以多细胞形式聚集在一起称作生物膜［１］。细菌粘附于寄主表面，彼此间由１个结构复杂的基质包裹，基质通常由不同的胞外多聚物，包括多聚糖、蛋白和ＤＮＡ等组成。生物膜的构型排列很复杂，有些是表面平坦无特征的膜，有些则是由多层细胞聚集形成形状各异的膜，如塔型和彩带型等。 生长于生物膜内的细菌所表现的细胞生理学，与其 分散生长于组织内时所表现的生理学不同［２］。在生物膜 内，细菌能对营养、代谢排泄物的浓度和细菌群体密度作出反应，调节新陈代谢，并能与邻近细胞相接触，参与细胞之间的交流。细菌形成生物膜后增强了对抗生素的忍耐力。生物膜所具有的有益和有害的活性，使其在工业、医药和设施农业上具有重要意义。 虽然许多关于微生物生物膜形成的基础研究大多集中在无生命物质的表面，但很明显在寄主植物与细菌互作过程中，细菌可在生物体表面上形成生物膜。粘附于植物表面的多细胞聚集体被描述为微菌落、聚集体或细 胞簇［３］ 。综述了有关生物膜结构、形成和微生物与陆生 植物结合所形成生物膜特性等方面的研究进展。 １细菌生物膜形成的影响因子 １．１复杂而动态的植物表面环境影响生物膜的形成 陆地环境中蕴藏着丰富而多样的微生物群落，这些 微生物群落能参与资源库的竞争和修整。在复杂而竞争的环境中，植物提供微生物赖以生存的环境。细菌定殖于植物的叶面、根、种子和内部脉管系统，这些类型的组织有特殊的化学和物理特性，这些特性影响了微生物的定殖机会和挑战能力。 陆生环境中水的可利用程度及其饱和水平是多样的，植物与细菌的互作大多经历不同水平的水合作用。此外还依赖于定殖位点、气侯条件和适宜的土壤组成等。植物的叶表面相对干燥，但能被雨水和露水淋湿。植物根围和土壤中种子表面含水量则更依赖于土壤中水的饱和度。水的限制作用能极大的影响生物膜的结构。 因此，特定环境和特定组织内水的饱和水平将极大 的影响生物膜的形成［３］ 。而在每个大的组织类型中又有 不同的微环境，如：植物根的不同部位表现出不同的小生境，生长活跃的根组织在土壤中的分泌率较高，而处 于生长点的根冠细胞则不断脱落［４］ 。不同场所释放的营 养和渗出物质能在很大程度上影响生物膜的产生。植物叶面组织经常含有一腊质层，其在叶片上表面和下表面分布不同。韧皮部和木质部导管在脉管系统中是不同的组织类型，在叶、茎干和根中的韧皮部及木质部组织，其流动性组成，体系结构和空间排列上均不相同。细菌能适应各种小环境，因此，生物膜的形成反映了其定殖场所的自然状态。 １．２细菌在植物表面主动和被动的沉积作用对生物膜形成的影响 微生物沉积作用的被动机制在整个陆生环境中较为常见，如风、雨的飞溅和根围的水流。而趋化性和运动 性是细菌形成生物膜的主动性机制［５］。不同假单胞菌的 植物相关细菌生物膜研究进展 杨敬辉１，文平兰２，陈宏州１，朱桂梅１，潘以楼１ （１．镇江农科所，江苏句容２１２４００；２．句容市农技推广中心，江苏句容２１２４００） 摘要：介绍了不同类型的植物相关细菌生物膜，综述了有关生物膜结构、形成和微生物与陆生植物结合所形成生物膜的特性等方面的研究进展，阐述了植物表面环境、细菌在植物表面主动和被动的沉积作用等对生物膜形成的影响。关键词：微生物；生物膜；群体感应中图分类号：Ｑ９２５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８－１６３１（２００８）０９－０００１－０３ ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒｅｓｓｏｎＢｉｏｆｉｌｍＦｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＰｌａｎｔ!ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＢａｃｔｅｒｉａ ＹＡＮＧＪｉｎｇ!ｈｕｉ１，ＷＥＮＰｉｎｇ!ｌａｎ２，ＣＨＥＮＨｏｎｇ!ｚｈｏｕ１，ＺＨＵＧｕｉ!ｍｅｉ１，ＰＡＮＹｉ!ｌｏｕ１（１．ＺｈｅｎｊｉａｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ，Ｊｕｒｏｎｇ２１２４００，Ｃｈｉｎａ；２．ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＥｘｔｅｎｓｉｏｎＣｅｎｔｅｒｏｆＪｕｒｏｎｇ Ｃｉｔｙ，Ｊｕｒｏｎｇ２１２４００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｅｖｅｒａｌｔｙｐｅｓｏｆｐｌａｎｔ!ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａｂｉｏ－ｆｉｌｍｓｗｅｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｏｒ－ｍａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｏｆｂｉｏｆｉｌｍｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ．Ｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇｏｆｔｈｅｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｏｆｐｌａｎｔｓｕｒｆａｃｅａｎｄｔｈｅａｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔ!ａｓ－ｓｏｃｉａｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｗｉｔｈｈｏｓｔｔｉｓｓｕｅｓｕｒｆａｃｅｓｄｕｒｉｎｇｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｓｙｍｂｉｏｓｉｓｏｎｔｈｅｂｉｏｆｉｌｍｆｏｒｍａｔｉｏｎｗｅｒｅｅｌａｂｏ－ｒａｔｅｄ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ；Ｂｉｏｆｉｌｍ；Ｑｕｏｒｕｍ!ｓｅｎｓｉｎｇ
细菌生物膜与导管伴生感染相关性的研 究 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】NFDEA目的：探讨细菌生物膜在置入导管伴生感染中的作用。方法：对置入性导管于撤除导管时行导管内细菌检查及分离培养，用结晶紫和阿利新蓝染色法对细菌生物膜进行定位及定量检测，分析导管细菌生物膜形成与导管伴生感染的关系。结果：患者置入性导管细菌生物膜阳性率为61.29% (38/62) ，染色技术可用于观察导管内细菌生物膜形成情况。结论：细菌生物膜形成是置入导管伴生感染的重要致病因素，染色技术简便快速，可作为临床快速诊断的方法。 【关键词】NFDEA生物膜;导管;伴生感染 AbstractNFDEAObjective：To investigate the effect of bacterial biofilm on associated infection of insertion catheter. Methods：The bacteria in insertion catheter were isolated and cultured after removing catheter. The method of staining with Crystal Violet and Alcian Blue was used to localization and quantitation detection of
bacterial biofilm. Then the relationship of bacterial biofilm with associated infection of catheter was analyzed. Results：The positive ratio of bacterial biofilm in insertion catheter was 61.29% (38/62). The staining method can be used to observe the formation condition of bacterial biofilm in insertion catheter. Conclusion：The formation of bacterial biofilm was important pathogenic factor in associated infection of insertion catheter. The staining technique was convenient and fast that can be used in clinical fast diagnosis. Key wordsNFDEAbiofilm; catheter; associated infection 现代医学技术的发展，多种侵入性的医疗器械、生物医学材料广泛应用，如传统的导尿管、子宫节育环、中心静脉导管、新型的人工心脏瓣膜、各种支架、角膜接触镜等，这些器械和材料的应用，在解决了原有医疗问题的同时，许多引发了伴生感染(associated infection)[1]，此种现象在有置入性导管者表现尤为突出有研究发现，细菌容易粘附于塑料输液管内表面，形成细菌生物膜(biofilm)，难以冲洗清除[2]。为了解细菌生物膜与置入性导管伴生感染相关性，我们对医院实施置入性导管进行检查或治疗的患者撤出导管时进行细菌检查、分离培养及生物膜形成的研究，现将结果报道如下。 1 材料与方法 1.1 材料 2009年7月至2010年6月，采集来自沈阳市多家医院病房患者包括导尿管、呼吸机导管及手术的引流管等标本，共62例(临检已
泉州师范学院 学年论文 论文题目：生物膜法在污水处理中的研究进展指导老师：黄初龙 学院：资源与环境科学学院 专业班级：09级环境工程与管理 学号：090905001 姓名：刘姣
生物膜法在污水处理中的研究进展 摘要：生物膜法在污水处理工艺中是与活性污泥法并行的一种好氧型生物污水处理方法，广泛的应用于工业废水和城市污水处理的二级处理中，也是污水处理的关键环节。与活性污泥法相比，生物膜法具有一些特有优势，比如无需污泥回流，运行管理容易，无污泥膨胀问题，易于微生物生存，运行稳定等。文中简单介绍了生物膜法对磷、氮及一些重金属去除的研究进展。 关键词：生物膜法；污水处理；活性污泥法 Abstract：Biofilm and activated sludge is a parallel-ty pe aerobic biological treatment methods，in the sewage treatment process．They widely used in the secondary treatment of industrial wastewater and urban sewage treatment，and these methods are the key link in sewage treatment．Compared with the activated sludge process，biofilm has some unique advantages．For example，no sludge return，easy operation and management，no sludge expansion，ease of microbial survival，run stable，etc．The paper describes simply biofilm research on the removal of phosphorus，nitrogen and some heavy metals． Key words：B iofilm treatment；sewage treatment；activated sludge 引言 近年来，伴随着经济的快速发展，我国在追求GDP增长的同时也带来一系列的环境问题，其中淡水资源紧缺迫使城镇生活污水处理技术显得尤其重要。然而随着人们生活水平的提高，城镇生活污水中的氮、磷含量增加，有机成分复杂，传统的生物污水处理技术已无法紧随步伐，处理效果不佳，为此，在新型填料的不断开发和完善基础上，生物膜法处理工艺借其处理效率高、剩余污泥产泥量少、运行管理方便等特点得到快速发，在污水处理中有广阔的应用前景。生物膜可认为是由一种或是多种微生物群体组成的，并附着在一种载体表面上进行生长发育[1—2]。 1 生物膜法概述 1.1生物膜法的净水机理 生物膜法和活性污泥法一样都是利用微生物来去除废水中各种有机物的处