Ⅱ实验内容
实验一蛋白质的沉淀与凝固
蛋白质溶液是一稳定的亲水性溶胶液，其稳定的因素有二：一是蛋白质胶粒上的电荷使之相互排斥，不易凝集成团；二是胶粒表面的水化膜，它使胶粒与水融洽相依，又在胶粒之间起了隔离作用。如果上述两种稳定蛋白质溶液的因素被破坏，蛋白质将于溶液中沉淀析出。
促使蛋白质沉淀的因素很多，大致可分为两类：
第一类是可逆的沉淀反应。这时蛋白质的空间构象未受到很大改变，除去沉淀因素后，可以重新溶解，例如盐析和低温乙醇沉淀蛋白。
第二类是不可逆的沉淀反应，重金属盐类或生物碱试剂沉淀蛋白后，由于蛋白质结构发生重大改变，所以不再溶于水中。不可逆的蛋白质沉淀多表示蛋白质已经变性。变性的蛋白质在等电点附近加热时，蛋白质分子间相互盘绕而变成坚实的凝块。
一、蛋白质的盐析
[原理]
高浓度的盐离子可与蛋白质胶粒争夺水化膜，同时盐又是强电解质，可抑制蛋白质的解离。因而用高浓度的中性盐，使蛋白质带电量减少，水化膜破坏而从溶液中沉淀出来。盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白变性，故常用于分离各种天然蛋白质。
由于蛋白质的组成及性质不同，所以盐析时所需中性盐的浓度也不相同。例如半饱和的硫酸铵沉出球蛋白，饱和的硫酸铵则沉出清蛋白。
[操作]
1.取一试管，加入3ml 5%蛋白质溶液及3ml饱和硫酸铵溶液，摇匀静止数分钟后观察现象。
2.将试管内容物过滤，加硫酸铵粉末于滤液中，使达饱和状态，摇匀后观察现象。（注意固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。）
3.取上项浑浊液1ml，加水2ml，观察是否复容。
二. 乙醇沉淀蛋白质
[原理]
乙醇是脱水剂，可与蛋白质争夺水化膜；此外，加入乙醇可使水的介电常数变小，蛋白质解离度降低，带电量减少。故加入乙醇能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。
用此法在低温下操作可使沉出的蛋白质保持其理化特性及其生物学活性，但室温中乙醇与蛋白质接触较久后，可使之变性，形成不可逆的沉淀。
[操作]
1.取试管4支，标出1、2、3、4号码，按下表操作
试剂 1 2 3 4
5%蛋白质溶液（ml） 1 1 1 -
1%乙酸（滴）- 1-2 - -
95%乙醇（ml）- - - 2
2.将3管及4管置冰水中，放置5分钟，然后将第4管的冰乙醇倒入第3管中（此步最好在冰水中进行），混匀，同时向第1及第2管中各加入未冰浴的乙醇2ml混匀，观察各管的沉淀情况并立即向第1、2及3管中各加入蒸馏水10ml，混匀，比较各管变化并解释之。
三. 重金属盐沉淀蛋白
[原理]
在溶液的PH值大于蛋白质的等电点时，带负电荷的蛋白质与重金属离子（Ca2+、Hg2+、Ag1+、Pb2+等）结合成盐而沉淀。
[操作]
取试管4支，按下表操作。
试剂（滴） 1 2 3 4
5%蛋白质溶液 5 5 5 5
1%乙酸- - 10 10
10g/L硫酸铜 3 - 3 -
30g/L硝酸银- 3 - 3
混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。
四. 生物碱试剂沉淀蛋白
[原理]
能沉淀生物碱（或植物碱）或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。
在溶液的PH值小于蛋白质的等电点时，带正电荷的蛋白质与生物碱试剂的负离子结合成盐而沉淀。
[操作]
取试管3支，按下表操作。
试剂 1 2 3
5%蛋白质溶液（ml） 1 1 1
1%乙酸（滴）10 10 10
苦味酸溶液（滴）数滴- -
鞣酸溶液（滴）- 数滴-
三氯乙酸溶液（滴）- - 数滴混合均匀，比较各管浑浊程度并解释之。
五. 蛋白质的加热凝固
[原理]
蛋白质在其等电点附近加热，即发生变性凝固，在加热过程中，随着蛋白质变性作用的深化，使已变性的蛋白质分子间凝聚成凝胶状的蛋白块。但应注意，当蛋白质溶液远离等电点而带有很多同种电荷时，加热虽可使其变性，但因同种电荷的排斥作用并不发生凝固现象。
[操作]
取试管4支，按下表操作
试剂 1 2 3 4
5%蛋白质溶液（ml） 2 2 2 2
1%乙酸（滴）- 1-2 - -
10%乙酸（ml）- - 0.5 -
100g/LNaOH（ml）- - - 0.5 混匀后各管分别加热，观察有否沉淀析出及沉淀析出的多少、快慢并解释之。。另外在第2管加热蛋白沉出后再加入5ml蒸馏水，观察是否复溶，为什麽？
[试剂]
1．5%蛋白溶液：取出鸡蛋清用蒸馏水稀释5倍，搅匀后用纱布过滤。
2．饱和硫酸铵溶液。
3．硫酸铵结晶粉末。
4．95%乙醇。
5．1%乙酸和10%乙酸。
6．30g/L硝酸银溶液。
7．10g/L硫酸铜溶液。
8．100g/L氢氧化钠溶液。
9．苦味酸饱和溶液及鞣酸饱和溶液。
10．100g/L三氯乙酸溶液。
（李素婷）
实验三微量凯氏定氮法
[原理]
蛋白质样品与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳和水，而氮转变为氨，氨与硫酸结合生成硫酸铵，再与纳氏试剂显色，与标准液比较，可求其含氮量。如测血清蛋白，可将总氮量减去非蛋白氮量，再乘以6.25即得蛋白质量。
[操作]
1．取血清或血浆0.2ml，以0.9%NaCl溶液稀释至10ml（稀释50倍）
2．取消化管1支，加入稀释血清0.5ml，50%硫酸0.5ml, 玻璃珠1枚，在电炉上消化。
3．当出现白雾并充满消化管时，消化管口加玻盖，再继续消化3分钟左右，冷却，
加3%H
2O
2
1~2滴，再消化至出现白雾，加盖，继续消化至无色透明，完全冷却后加蒸馏
水至17.5ml，再加纳氏试剂至25ml，混匀，与标准管比色。
4．标准管制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，以蒸馏水作空白调零，500nm波长比色。
5．标准曲线制备：取硫酸铵标准液（应用液）制备标准曲线，取5支干净试管操作如下
试剂（ml） 1 2 3 4 5
标准硫酸铵应用液- 0.8 1.2 1.6 2.0
18N H
2SO
4
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
蒸馏水 3.4 2.6 2.2 1.8 1.4 混匀，各管加奈氏试剂1.5 ml, 以第1管为空白，用500nm波长比色得各管光密度值，以浓度为横坐标，测得各管光密度为纵坐标，作一标准曲线。
6．测得测定管的光密度值，于标准曲线上查出含氮量。
[计算]
蛋白质g %=含氮量?6.25?100
[试剂]
1．50%硫酸
2. 18N硫酸溶液：取比重1.84的分析纯浓硫酸50毫升慢慢加到50毫升蒸馏水中。
3. 3%H
2O 2
4. 0.9%NaCl
5. 奈氏试剂：
奈氏试剂贮存液：于500毫升锥形瓶内加入碘化钾150克，碘110克及蒸馏水100毫升和纯汞150克，振摇到碘色将变时（约15分钟），混合液发生高热，将锥型瓶放入冷水内继续振摇至棕红色的碘转变成带绿色的碘化钾汞溶液时为止。将上清液倾入2000毫升的量筒中，用蒸馏水洗涤瓶内壁及瓶内沉淀物数次，将洗液一并倾入量筒中，加蒸馏水至2000毫升。
奈氏试剂应用液：取10%氢氧化钠溶液700毫升，加入奈氏贮存液150毫升，摇匀，用蒸馏水稀释到1000毫升。如浑浊，可静止过夜，取上请液备用。
6．硫酸胺标准贮存液：（1毫升=1毫克氮）
取分析纯硫酸铵置烤箱中110o C，干燥半小时，取出置干燥器内待其冷却，准确称取干燥的硫酸铵4.716克，置1000毫升量瓶中，加蒸馏水300毫升使之溶解，加纯浓
硫酸1毫升，再加蒸馏水至刻度。(NH
4)
2
SO
4
分子量132.06；其氮占28。
故：132.06﹕28=4.716﹕X
X=1
即4.716克硫酸铵中含氮1克
7．硫酸铵标准应用液：
取硫酸铵标准贮存液1.0毫升，于100毫升容量瓶中，加纯硫酸0.1毫升，以蒸馏水稀释至刻度，于带磨口玻璃瓶中保存。
（周晓慧）
实验四双缩尿法测定蛋白质含量
[原理]
凡含有两个以上肽键的化合物在碱性溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色的复合物，这一反应称为双缩尿反应。蛋白质含有肽键，因而一切蛋白质均可与双缩尿试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，经与同样处理的标准蛋白溶液相比，即可求出样品中的蛋白质含量。
[操作]
1.标准曲线的制备
取6支试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液
试剂 1 2 3 4 5 6 标准蛋白溶液（10mg/ml）0.0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 生理盐水（ml） 1.0 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 双缩脲试剂(ml) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白浓度(mg/ml) 0.0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 混匀后，于37℃水浴中保温15分钟，在520nm波长下比色，以第一管调零，测得各管的光密度。以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2.样品测定
取待测蛋白样品0.1ml，加生理盐水 0.9ml，再加双缩脲试剂4.0ml，于37℃水浴中保温15分钟，测其光密度，查标准曲线即可得出样品中的蛋白质含量。
[试剂]
1．10g/L标准蛋白溶液：准确称取经凯式定氮法校正的结晶牛血清蛋白或人血清蛋白10g，用生理盐水配成浓度为10mg /ml。
2．双缩尿试剂：称取CuSO
4?5H
2
O 2.5g、蒸馏水100ml加热助溶。另取酒石酸钾钠
10g、碘化钾5g，溶于500毫升蒸馏水中，再加200 g/L NaOH 300ml混合，然后将硫酸铜溶液倾入，加蒸馏水至1000 ml。
3.生理盐水
（周晓慧）
实验五改良酚试剂法测定蛋白质含量
[原理]
蛋白质中所含酪氨酸和色氨酸等残基能在碱性条件下与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比。
利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。
[操作]
（一）制作标准曲线
1．取试管6支分别编号，按下表加入试剂：
试剂（ml） 1 2 3 4 5 6
标准蛋白溶液（1mg/ml）0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
生理盐水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
试剂A 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 混匀后置于50?C水浴10分钟，冷却后各管加入试剂B 0.1ml，室温放置10分钟，各管加入试剂C 3ml，立即混匀，置37?C水浴箱恒温10分钟。冷却后以1号管为空白，在分光光度计上以波长650nm比色，读取光密度值。
2.以各标准样品蛋白质浓度为横坐标，各管光密度值为纵坐标作标准曲线。
（二）样品测定
取试管2支，按下表加入试剂
试剂（ml）测定管空白管
稀释的待测样品 1.0 -
生理盐水- 1.0
试剂A 0.9 0.9 混匀后在50?C水浴箱中保温10分钟，取出冷却后，两管各加试剂B 0.1ml，室温放置10分钟，再各加试剂C 3ml，立即混匀，置37?C水浴箱保温10分钟，冷却后在分光光度计上以波长650nm比色读取光密度值。
[结果与计算]
根据测定管光密度值查标准曲线，由标准曲线计算样品蛋白质含量。
[注意事项]
1.测定蛋白质的浓度应在0.015～0.110mg/ml范围。
2.各管加酚试剂必须快速，并立即摇匀，不应出现混浊。
[试剂]
1.标准蛋白溶液：称量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙种球蛋白10mg，用生理盐水配制成1mg/ml的标准蛋白溶液。
2．试剂A：2g酒石酸钾钠及100g Na
2CO
3
溶于500ml 1mol/L NaOH中，用蒸馏水稀
至1000ml。
3．试剂B：2g酒石酸钾钠及1g CuSO
4?5H
2
O分别溶解于少量水中，混合后加蒸馏水
至90ml，再加10ml 1mol/L NaOH即成。
4．试剂C：
（1）市售的酚试剂，用1mol/L NaOH滴定相当于2.5 mol/L HCl，按1﹕10稀释即可。
（2）称取Na
2WO
4
?2H
2
O 100g及Na
2
MoO
4
?2H
2
O 25g溶于700ml蒸馏水中，加入85% H
3
PO
4
50ml，浓HCl 100ml混匀后，置圆底烧瓶中回流10小时，加入硫酸锂（Li
2SO
4
?H
2
O）150g、
蒸馏水50ml及浓溴水数滴，继续煮沸15分钟去溴，冷却后稀释至1000ml，过滤，溶液应为金黄色，置棕色瓶中保存，使用时稀释至1mol/L。
（周晓慧）
实验六紫外分光光度法测定蛋白质含量
[原理]
蛋白质在280nm处的特征性吸收峰，是由于其中所含有的芳香族氨基酸：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸所引起的，其光密度和蛋白质的浓度呈线性关系，可用于蛋白质的定量。对于同样浓度的不同蛋白质，如果酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸含量不同，其光密度值也不同，选用标准蛋白质时必须注意。若样品中含有其它具有紫外吸收的杂质，如核酸、核苷酸等，可产生较大的误差，故应作适当的校正。
蛋白质样品中含有核酸时，混杂的核酸在280nm处也有吸收，对此法有一定的影响。
因此，一般情况下在测定A
280的同时，测定A
260
，计算A
280
/A
260
的比值。如果A
280
/A
260
≥1.5，
可忽略不计核酸的影响，A
280/A
260
<1.5时，需按下列公式计算蛋白质的浓度：
蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A
280-0.76A
260
[操作]
1．标准曲线的制备：
取试管8支按下表加入试剂
试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 7 8
标准蛋白液（1mg/ml）0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 4.000
0.9%NaCl溶液 4.000 3.500 3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 0.000
蛋白浓度(mg/ml) 0.000 0.125 0.250 0.375 0.500 0.625 0.750 1.000 混匀，选波长280nm，用1cm石英比色杯，第一管为空白，分别测定各管溶液光密度值。以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2．样品测定：将待测的蛋白样品用0.9%NaCl溶液稀释，使其浓度在蛋白标准曲线范围之内，混匀后按上述方法测定光密度值，查标准曲线，得出样品的蛋白浓度。
[试剂]
1.标准蛋白液：准确称取结晶牛血清白蛋白（精确0.001）用0.9% NaCl溶液配置成1mg/ml的溶液（需用凯氏定氮法校正）。
2. 0.9% NaCl溶液。
（周晓慧）
实验七凝胶过滤层析分离血红蛋白与硫酸铜
[原理]
血红蛋白（分子量64500）与铜溶液混合物，通过葡聚糖凝胶G-25层析柱，以蒸馏水为洗脱剂，进行分离大分子的血红蛋白和小分子的硫酸铜。
[操作]
1．凝胶的准备：葡聚糖凝胶G-25 1g，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，于沸水浴中煮沸2小时（或在室温放置6小时），待冷却至室温时装柱。
2．装柱：在层析管底部填少许玻璃棉，关闭玻管的出口。然后自顶部缓缓加入葡聚糖凝胶G-25悬液。
待底部凝胶沉积1～2cm时，打开出口。当凝胶上升至距柱顶3cm时即可。
3．样品的制备：
（1）血红蛋白的制备：取草酸钾抗凝血2ml于离心管中，3000转/分离心5 分钟，弃去上清液，再用生理盐水洗血细胞两次。将血细胞用5倍体积蒸馏水稀释。
（2）铜溶液的制备：将硫酸铜3.73g溶解于10ml热蒸馏水中，冷却后稀释到15ml。
另取柠檬酸钠17.3g及碳酸钠（Na
2CO
3
·H
2
O）10g，加水60ml，加热使之溶解，冷却后
稀释到85ml。之后把硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中。
（3）取血红蛋白稀释液、铜溶液按2：3体积混合，作为样品。
4．加样：
（1）将层析柱出口打开，使床表面的蒸馏水流出，直到床面正好露出，再关闭出口。
（2）用小滴管将样品（约0.8ml）沿柱内壁缓缓地加于床面上，然后打开流出口，使样品进入床内，直到床面重新露出。
（3）用上述方法加入约2ml蒸馏水。当将近流干时，反复加入多量蒸馏水，进行洗脱，直至红蓝两条带分开为止。
[试剂]
1．葡聚糖凝胶G-25。
2．草酸钾。
3．生理盐水。
4．硫酸铜。
5．柠檬酸钠。
6．碳酸钠。
（王鲁华）
实验八凝胶过滤层析分离血红蛋白与鱼精蛋白[原理]
本试验使用交联葡聚糖凝胶（Sephadex G-50）将血红蛋白（红色，分子量为64500）与二硝基氟苯-鱼精蛋白，从混合液中分开。由于它们的分子量及颜色的不同，可以观察到血红蛋白洗脱较快，而鱼精蛋白洗脱较慢。
[操作]
1．凝胶的制备
称取Sephadex G-50 1g，置于锥形瓶中，加蒸馏水30ml，于沸水浴中煮沸1小时（此为加热法溶胀，如在室温溶胀，需浸泡3小时），取出冷却至室温后再行装柱。
2．装柱
取直径0.8～1.5cm，长度17～20cm的层析管，在底部填砂芯或少许玻璃棉，装上带有螺旋夹和细玻管的橡皮管，垂直置于铁架上，柱中先加入少量水，充满细玻璃管，并残留部分水于层析管下部，以排除层析柱底部及细玻管内的气泡。然后关闭玻管的出口，边轻轻搅拌以蒸馏水稀释的葡聚糖凝胶悬浮液，边将其自层析管顶部缓缓加入，待底部凝胶沉积1～2cm时，再打开出口，一面继续加凝胶，待凝胶上升至距玻管顶3cm 左右即可停止，最后以蒸馏水平衡凝胶柱。加入凝胶时速度应均匀，并使凝胶均匀下沉，以免层析床分层，同时防止柱内有气泡。如层析床凝胶表面不平整，可在凝胶表面用细玻棒轻轻搅动，再让凝胶自然沉降，使表面平整。
3．样品的制备
（1）血红蛋白（Hb）溶液的制备：取草酸钾抗凝血2ml于离心管中，以2500r/min 离心5分钟，弃去上层血浆，用0.9％NaCl 5ml洗血细胞，重复三次，每次要把血球搅起，以3500r/min离心5分钟后尽量弃去上清液。加蒸馏水5ml，充分混匀，放冰箱过夜使沉淀的血球充分溶血，备用。
溶液1.5ml中（2）DNP-鱼精蛋白的制备：称取鱼精蛋白0.15g，溶于10％NaHCO
3
（此时该蛋白质溶液pH应在8.5～9.0左右）。另取二硝基氟苯0.15g，溶于微热的95％乙醇3ml中，待其充分溶解后，立即倾入上述蛋白质溶液中。将此管置于沸水浴中，煮沸5分钟，冷却后加2倍体积的95％乙醇，可见黄色的DNP-鱼精蛋白沉淀。离心5分钟，弃去上清液，沉淀用95％乙醇洗2次，所得沉淀用1ml蒸馏水溶解，即为DNP-鱼精蛋白溶液，备用。
（3）取血红蛋白稀释液0.1ml，加DNP-鱼精蛋白溶液0.2ml，充分混匀，此混合液即为样品溶液。
4．加样
加样时先将层析管出口打开，使床表面蒸馏水流出，直到床面正好露出，用下口较大的滴管，将上述样品（约0.3ml）缓缓沿层析柱内壁小心地加于床表面，注意尽量不使床面搅动，然后打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出，重复上法加1～2倍于样品体积的蒸馏水，这样可使样品的稀释最小，而样品又完全进入床内。当少量蒸馏水将近流干时，加入蒸馏水使其充满层析柱上面空间，开始洗脱。
5．洗脱与收集
反复加入蒸馏水洗脱，调节出口处螺旋夹，使洗脱速度在0.5～1.0ml／分左右（约10～15滴／分）洗脱时可观察到黄、红两条区带逐渐分开，当红色的血红蛋白区带到达玻管下端时，用带刻度的离心管收集流出液，直至红色液全部流出为止，待测。再换以另一离心管，收集黄色的DNP-鱼精蛋白洗脱液，直至黄色液全部洗出为止，此液可回收重新使用。
[结果与计算]
取一试管吸取前述血红蛋白液0.1ml，加蒸馏水至5ml作为标准管（上柱前液），取收集的血红蛋白液加蒸馏水至5ml。以蒸馏水为对照，测得标准管及收集管液体在540nm 波长处的光密度值，按下列公式计算血红蛋白的回收率。
血红蛋白回收率（％）＝洗脱收集液光密度值／上柱前液光密度值×100％
[试剂]
1．Sephadex G-50
2．草酸钾抗凝血液
3．0.9％NaCl
4．鱼精蛋白
5．10％NaHCO
3
6．2，4-二硝基氟苯
7．95％乙醇
（王鲁华）
实验九血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
[原理]
血浆中的各种蛋白质，它们的等电点都在pH7.0以下，如将它们置于pH8.6的缓冲液中电泳时，它们都解离成负离子，向正极移动。在同一pH溶液中，由于各种蛋白质所带电荷的数量不同以及分子大小不同，因此它们在电场中的移动速度也有差别，利用这种性质可以把各种蛋白质分开。
醋酸纤维薄膜作为电泳支持物具有电渗小、分离速度快，区带清晰、操作简便等优
点。醋酸纤维薄膜电泳可将血清蛋白分为白蛋白及α
1-球蛋白、α
2
-球蛋白、β-球蛋白
γ-球蛋白等5条区带。固定染色之后，不仅可看到清晰的色带，并可将各带染料溶于碱溶液中进行定量测定，从而计算出血清中各种蛋白质的构成比。
[操作]
1．准备与点样：
（1）将薄膜切成2×8cm的小条，在薄膜无光泽面距—端1.5cm处用铅笔画一横线，表示点样位置。
（2）将薄膜无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液中(缓冲液盛于培养皿中)。
（3）将充分渗透(指膜上没有白色斑痕)的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条两端各贴于两块玻片上使点样线驾空。
(4)吸取少量血清滴于普通玻璃板上，用X光片或加样器的钢口蘸取样品，平直印于膜上，待血清全部渗入膜内，移开点样器。
2．电泳：将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面(即点样面)向下，点样端置于阴极。槽架上四层纱布怍桥垫，膜条与纱布需贴紧，待平衡5分钟后通电，调节电压至90V，或电流为0.4～0.6mA/cm宽，通电1小时左右关闭电源。
3．染色：通电完毕后用镊子将薄膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染5分钟取出，首先用自来水冲洗一下，然后立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景变白为止。用滤纸吸干薄膜。
4．定量：
（1）取试管6支，编好号码，分别加入0.4mol/L氢氧化钠4ml。
（2）剪开薄膜上各条蛋白色带，另于空白部位剪—平均六小的薄牵，分别浸入上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。
（3）约半小时后，用分光光度计进行比色，在650nm波长下读取各管的光密度，用空白薄膜条洗出液为空白对照。
[计算 ]
光密度总和T=A+α
1+α
2
+β+γ
各部分蛋白质的构成比为：
白蛋白=A/T；α
1球蛋白=α
1
/T
：
依次类推。
[临床意义]
1．正常值：白蛋白为0.54～0.61；α
1球蛋白为0．04～0.06；α
2
球蛋白为0．07～
0.09；β球蛋白为0.10～0.13；γ球蛋白为0.17～0.22
2．肝硬化时，白蛋白显著降低，γ球蛋白升高2～3倍。肾病综合征时，白蛋白降低，α
2、
β球蛋白升高。
[试剂]
1.巴比妥缓冲液（pH8.6）：巴比妥钠1
2.76g、巴比妥1.66g、蒸馏水加热溶解后再加水至1000ml（离子强度0.06）。
2，氨基黑10B染色液：氨基黑10B 0.5g、甲醇50 ml、冰醋酸10 ml、蒸馏水40 ml。 3．漂洗液：95%乙醇45 ml、冰醋酸5 ml、蒸馏水50 ml。
4．0.4mol/L NaOH。
（王文勇）
实验十一血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定
[原理]
为了研究蛋白质的性质、结构及功能，首先要从大分子体系中分离纯化这种蛋白质，并且须保持天然蛋白质原有的结构与生物学活性（即不变性）是比较复杂的，蛋白质分离主要是利用各种蛋白质性质的不同，尤其是蛋白质在不同酸、碱环境中的性质和电学性质的差异。分离蛋白质常用的方法有：盐析、层析、超离心、超过滤等，根据目的要求不同，可分别采用这些方法或几种方法配合使用。
本实验以分离纯化血清γ-球蛋白为例，介绍一种蛋白质的分离纯化方法。过程包括：盐析、离心分离、凝胶层析、离子交换层析纯化、浓缩和电泳鉴定等几个步骤。（一）盐析法粗提蛋白质
血清中含有清蛋白和球蛋白（α- β- γ- 、球蛋白），由于它们所带电荷不同，分子量不同，在高浓度盐溶液中溶解度不同，因此，可利用它们在中性盐溶液中（常用硫酸铵、硫酸钠等）溶解度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。由于各种蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度不一，调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀析出，达到分离目的。
本实验采用在血清中加入50%饱和度的硫酸铵，使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解于溶液中，经离心分离获得沉淀部分，即为含有γ-球蛋白的粗制品。
（二）凝胶过滤层析法脱盐
用盐析法分离而得到的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须首先去除。常用的方法有透析法、凝胶过滤层析法等。凝胶过滤层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技术。凝胶有多种，葡聚糖凝胶（Sephadex）是常用的一种人工合成的凝胶，脱盐用sephadexG-25层析柱，它的骨架是α-1，6-糖苷键联接成的直链葡聚糖，由环氧氯丙烷作交联剂制成的多孔网状结构的多聚物。结果大分子物质（蛋白质）直径大，不能进入凝胶颗粒的网孔中，垂直向下移动，速度快。而小分子物质（无机盐）可扩散入凝胶颗粒网孔中，流经的路程长、速度慢，从而使混合物中各组分按分子大小不同的顺序流出，蛋白质先流出，无机盐后流出，得到除去盐的蛋白质溶液
（三）离子交换层析纯化蛋白质
纯化蛋白质的方法很多，如各种层析方法：离子交换层析、凝胶层析、吸附层析及亲和层析等；各种电泳方法：可选用制备区带电泳、等电聚焦电泳及蛋白质结晶等。
本实验采用DEAE-纤维素［二乙基氨乙基，-CH
2-CH
2
-N+H（CH
2
-CH
3
）
2
］离子交换层
析法进一步纯化 -球蛋白。蛋白质是两性电解质，本实验所调整的溶液pH为6.5，此时溶液中的清蛋白pI 4.7、α-球蛋白pI 5.06、β-球蛋白pI 5.12皆带负电荷，而r-球蛋白pI 7.3带正电荷。DEAE-纤维素是一种阴离子交换树脂，本身带有正电荷，可与溶液中带负电荷的离子结合，如α-球蛋白、β-球蛋白等。而带正电荷的r-球蛋白则不能结合在树脂上，因而在洗脱的溶液中只留有r-球蛋白，以达到纯化的目的。
（四）浓缩
干燥的葡聚糖凝胶颗粒内部有孔隙容积。当把干燥的葡聚糖凝胶颗粒投入稀的高分子溶液中时水分和低分子量物质就会进入凝胶颗粒内部的孔隙直到充满为止，而高分子物质则排阻于凝胶颗粒之外，因此，经十几分钟后通过离心或过滤就可分离出膨胀的凝胶颗粒，得到浓缩了的高分子溶液。
利用葡聚糖凝胶G-25型干胶吸水膨胀，而不吸入蛋白质的特性，在已纯化的γ-球蛋白溶液中加入适量葡聚糖凝胶G-25型干胶。离心约5分钟（3000转/分）。上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液。
（五）电泳法鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）
利用醋酸纤维素薄膜作为电泳支持物，将未分离纯化的原血清样品点样于膜上进行
电泳时，可将血清蛋白分为清蛋白、α
1、α
2
、β及γ-球蛋白等5条区带，而用分离
纯化后的γ-球蛋白溶液点样电泳，在γ-球蛋白相应位置仅呈现1条区带（电泳迁移率相同），将区带洗脱，或直接扫描，可计算出各种蛋白质的百分含量。
[操作]
（一）盐析粗提：
取正常人血清2.0ml于小试管中，边摇边缓慢加入饱和硫酸铵溶液2.0ml，使之成为半饱和溶液。混匀后室温放置10分钟，3000转/分，离心10分钟，弃去含有清蛋白的上清液。于沉淀中加蒸馏水1.0ml，振摇使之溶解，此液即为粗提的球蛋白溶液。（二）脱盐：
1.凝胶处理：（老师准备），称取葡聚糖凝胶G-25型6.0g于小烧杯中，加100ml蒸馏水，置沸水浴1小时，并以玻璃棒轻轻搅动以使气泡逸出。冷却置室温，待凝胶大部下沉后，弃去含有细微悬浮凝胶颗粒的上清液。加蒸馏水约100ml轻轻搅动片刻，再弃去含有细微颗粒的上清液。加0.02mol/L pH 6.5醋酸铵溶液100ml。轻搅拌片刻，待大部分凝胶下沉后，弃去含有细微颗粒的上清液，再加醋酸铵溶液100ml重复处理一次，最后加入醋酸铵溶液20ml，此即为已溶胀备用的凝胶溶液。
2.装柱：取一层析管（1.5?20cm 或25ml碱式滴定管），垂直夹于铁架台上，关闭玻管出口，先加入醋酸铵溶液约10ml,,打开出口让硫酸铵溶液充满下部容器然后排出，以排除空气。关闭出口，自玻管顶部缓慢加入溶胀后的葡聚糖凝胶混悬液，边加边搅拌，保持凝胶均匀连续地沉降，当混悬液达玻管顶部时，打开出口，以螺旋夹控制流速10-20滴/分，继续加混悬液，待凝胶面上升至距玻管顶口3cm左右时即可停止，柱床面留一层液体。
3.平衡：用螺旋夹控制流速8-10滴/分，用醋酸铵溶液（ pH6.5）流洗平衡几分钟后，即可使用。凝胶管柱上端平衡液始终不少于1cm高度，不得出现干胶和断层，并应保持凝胶面平整。
4.上样：即样品上柱，待层析液（醋酸铵溶液 pH 6.5）上端的液面刚好下降至凝胶表面时（切勿进入空气）将凝胶层析管下端的螺旋夹拧紧，这时将盐析所得的球蛋白溶液用滴管小心加入层析柱内，打开螺旋夹，用试管收集流出的液体，当球蛋白溶液恰好完全进入凝胶柱上端面内时，立即用2ml醋酸铵溶液小心冲洗管壁上的蛋白质，然后再重复冲洗一次。
5.洗脱：反复加入多量醋酸铵溶液进行洗脱，洗脱速度为10滴/分，每当试管内收集到1ml(约15滴)液体时，应取1滴置磁反应板上加入200g/L磺基水杨酸试剂检验有无蛋白质流出，如有则呈白色混浊。每收集1ml换一试管，并不断检查蛋白质，直到反应呈阴性为止。再分别从每个试管各取出1滴蛋白液置磁反应板上加入50g/L醋酸钡，
沉淀为止，将含蛋白质而无硫酸铵的溶液合并，此即为已脱直至检查出现白色的BaSO
4
盐的球蛋白溶液，待进一步纯化。
6．凝胶的再生与保存：葡聚糖凝胶可柱内再生，故凝胶层析柱可重复使用，每次用完后以醋酸铵溶液进行充分洗涤，留待再用。为防止凝胶霉变，可用含0.02%叠氮化钠的醋酸铵溶液进行流洗后再放置。长时间不用，宜将凝胶从柱内倒出，以湿态保存，只要在其中加适当的抑菌剂如0.02%叠氮化钠置4o C冰箱内，可放置几个月至一年，不需要干燥。如凝胶柱有轻微污染，则可用0.2mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl的混合液处理。（三）纯化
1．DEAE-纤维素处理：称取DEAE-纤维素3.0g，加0.5mol/L盐酸溶液45ml，搅拌后放置30分钟，加蒸馏水250ml，搅匀，待纤维素大部分下沉后，弃去含有细微颗粒的上层液体，如此反复2-3次，用蒸馏水洗至流出液pH4.0，再加0.5mol/L氢氧化钠溶液45ml，搅拌后放置30分钟，弃取上层液体，再用蒸馏水洗至pH7.0，弃上层液体后加醋酸铵溶液约200ml,用1mol/L的醋酸调至pH6.5（约5ml），留待装柱。
2．装柱：与葡聚糖凝胶层析装柱法相同。
3.平衡：用pH6.5醋酸铵溶液、平衡的方法、时间同葡聚糖凝胶层析。
4.上样：将脱盐收集的球蛋白溶液上柱，方法过程与脱盐法相同。
5.洗脱：用pH
6.5醋酸铵溶液反复加入多量进行洗脱，流速20-30滴/分，方法与上述脱盐法相同，同样用200g/L磺基水杨酸检查有无蛋白流出。此次收集的即为纯化的γ-球蛋白溶液，留待浓缩及鉴定。
Ac溶液流洗几遍， 6.DEAE-纤维素的再生与保存：先用1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH
4
再用0.02mol/L醋酸铵溶液（pH6.5）洗涤平衡后可重复使用。
（四）浓缩
将纯化后的γ-球蛋白溶液量其体积，每毫升加葡聚糖凝胶G-25干胶颗粒0.25g，吸收水分，摇动2-3分钟，离心5分钟（3000转/分），上清液即为浓缩的γ-球蛋白溶液，用吸管吸至另一个小试管中，留待电泳鉴定。
（五）电泳法鉴定
1．准备：在2 8cm醋酸纤维薄膜无光泽面距一端1.5cm处用铅笔轻划一条线，表示点样的位置。
2.浸泡醋酸纤维薄膜：将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上，使膜条自然浸湿下沉，浸泡一般要大于2小时，最好过夜，充分浸透至膜上没有白色斑痕。
3．点样：将充分浸透的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，吸取少量血清滴于玻片上，用X光片或加样器的钢口蘸取血清，平直印在点样线上，待血清完全浸入薄膜后移开。另点样一条膜条，吸取少量已纯化的γ-球蛋白溶液滴于玻片上，其它操作同上述血清点样。注意点样位置与血清薄膜一致，以便比较迁移率。
4．电泳：将点样膜条置于电泳槽上，使点样面向下，点样端置于阴极，槽架上用四层滤纸或两层纱布作桥架，膜条与滤纸需贴紧，平衡约5分钟后接通电源，调节电压100-110V，稳定电流为0.4-0.6mA/cm宽膜条，通电50-60分钟后关闭电源停止电泳。 5．染色：用镊子将电泳后的膜条取出，浸于盛有氨基黑10B 的染色液中，染色5分钟取出，先用蒸馏水冲一下，立即按顺序浸入不同杯的漂洗液中漂洗4-5次，直至薄膜背景漂净为止，用滤纸吸干薄膜。对照观察血清薄膜与γ-球蛋白薄膜两者的电泳区带分析结果。
血清γ-球蛋白分离、纯化及鉴定操作流程
实验五：血液凝固及其影响因素 实验人： 同组人： 【实验目的】 1．学习血液凝固的基本过程 2．了解加速或延缓血液凝固的一些因素 【实验原理】 血液凝固是一个酶的有限水解激活过程，在此过程中有多种凝血因子参与。根据凝血过程起动时激活因子来源不同，可将血液凝固分为内源性激活途径和外源性激活途径。内源性激活途径是指参与血液凝固的所有凝血因子在血浆中，外源性激活途径是指受损的组织中的组织因子进入血管后，与血管内的凝血因子共同作用而启动的激活过程。 【实验材料和用具】 家兔 清洁小试管7个、小烧杯2个、竹签、秒表、试管架、哺乳动物手术器械一套、兔手术台、动脉夹、塑料动脉插管、线、棉花、水浴槽、冰盒 液状石蜡、肝素、草酸钾1~2mg、脑匀浆液0.1ml、生理盐水 【实验过程】 1、动物麻醉及颈部手术（此部由助教老师操作） 取一只动物，称重。按1g/kg体重的剂量将乌拉坦（氨基甲酸乙酯）由耳缘静脉缓慢注入，观察动物肌张力、呼吸与角膜反射的变化。动物麻醉后背位固定于兔手术台上。 剪去颈部手术野的毛，沿颈正中线在喉头上一指至锁骨上一指的地方作一5～7cm的皮肤切口。分离皮下组织及肌肉。 2、颈总动脉插管（此部由助教老师操作） 在气管两侧辨别并分离颈总动脉，颈总动脉下方穿两条线备用。在左侧颈总动脉的近心端夹一动脉夹，在动脉夹远心端距动脉夹约3cm处结扎。用小剪刀在结扎线的近侧（结扎线与动脉夹之间）沿向心方向剪一小斜口（约占管径的一半），向心脏方向插入动脉插管，由备用的线结扎固定。取血时将动脉夹松开即可。 3、血液凝固的加速和延缓观察 1.打开兔颈总动脉夹，血液从动脉插管流出，弃去第一份1mL动脉血后，向每个试管中注入1mL兔动 脉血，并摇匀。 2.自血液流出动脉插管开始计时。除第1管外，其他各管每隔15秒钟将试管倾斜一次，观察液面是否 倾斜即血液是否流动，直到试管内血液不再流动为止，记录凝血时间。 3.当第2管已经凝固时，再倾斜第1管看血液是否凝固，若尚未凝固则按上述方法每隔15秒钟倾斜一 次，直到血液凝固为止，记录凝血时间，即为该兔血的凝固时间。 4.以第2管为对照，各管观察其他各管中血液凝固时间。 5.向第9管中滴加2％氯化钙2滴，观察血液是否凝固。 6.取出第5管中的玻棒，用水洗净，观察附着在玻棒上的纤维蛋白。 注意事项：
血液凝固及其影响因素 【摘要】目的：学习血液凝固的基本过程。了解加速或延缓血液凝固的因素。 方法：①去家兔血液与两个烧杯中，其中一个进行搅拌，观察血液凝固时间。 ②取家兔血液分别装于八个装有不同物质的试管中，（其中1号，4号不加物质），观察血液凝固时间； 结果：实验中静置的烧杯发生了凝血现象，搅拌的烧杯不发生凝血现象；血液接触面的粗糙程度，温度，等因素对血液凝固有不同的影响，草酸钾，肝素等抗凝剂是血液不发生凝固现象。 结论：血液凝固受接触面，温度，Ca2+等理化因素的影响，可将血液凝固分为内源性凝血和外源性凝血。 【关键词】：血液凝固内源性凝血外源性凝血 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1实验动物：家兔（由浙江中医药大学动物实验中心提供）。 1.1.2 实验器械：清洁小试管8个、小烧杯2个、竹签、秒表、试管架、哺乳动物手术器械一套、兔手术台、动脉夹、塑料动脉插管、线、棉花、水浴槽、冰盒1.1.3 实验药品和试剂：石蜡油、肝素1ml、草酸钾1ml、肺组织浸液0.1ml、生理盐水 1.2方法 1.2.1、动物麻醉及颈部手术 取一只家兔，称重。按5ml/kg体重的剂量将乌拉坦（氨基甲酸乙酯）由耳缘静脉缓慢注入，观察动物肌张力、呼吸与眼角膜反射的变化。动物麻醉后背位固定于兔手术台上。 剪去颈部手术野的毛，沿颈正中线在喉头上一指至锁骨上一指的地方作一5～7cm 的皮肤切口。分离皮下组织及肌肉。 1.2.2、颈总动脉插管 在气管两侧辨别并分离颈总动脉，颈总动脉下方穿两条线备用。在左侧颈总动脉的近心端夹一动脉夹，在动脉夹远心端距动脉夹约3cm处结扎。用小剪刀在结扎线的近侧（结扎线与动脉夹之间）沿向心方向剪一小斜口（约占管径的一半），向心脏方向插入动脉插管，由备用的线结扎固定。取血时将动脉夹松开即可。
影响血液凝固的因素 一、实验目的 1.熟悉家兔耳动，耳缘静脉，颈总静脉，心脏采血方法； 2.观察纤维蛋白原在血液凝固过程中的作用； 3.观察并比较内源性凝血和外源性凝血过程； 4.观察不同因素对血液凝固的影响，观察水蛭素和阿司匹林对血液凝固的影响。 二、实验原理 血液凝固是由凝血因子按一定顺序相继激活而生成的凝血酶最终使纤维蛋白原变为纤维蛋白的过程。因此，凝血过程可分为凝血酶原酶复合物的形成、凝血酶的激活和纤维蛋白的生成三个基本步骤。在此过程中有多种凝血因子参与，根据凝血过程中的第X因子所依赖的凝血因子来源不同，可将血液凝固分为内源性凝血途径和外源性凝血途径。 内源性凝血途径是指参与血液凝固的所有凝血因子在血浆中，外源性凝血途径是指受损的组织中的组织因子进入血管后，与血管内的凝血因子共同作用而启动的凝血过程。第X凝血因子一旦激活，最终使纤维蛋白原转变成纤维蛋白，形成血凝块。 本次实验通过多次操作，探究不同因素，不同物质对于凝血过程的作用。 三、实验结果 1.实验观察纤维蛋白原在凝血过程中的作用 在1，2号烧杯中加入颈总动脉血，用竹签搅拌2号烧杯约30s，用生理盐水洗去竹签上的血液，在竹签上可看到白色纤维蛋白细丝。放置60min，可观察到1号烧杯血液凝固呈深红色，二号烧杯血液未凝固，呈鲜红色。 2.影响血液凝固的因素 取2ml耳中央动脉血；4000rmp/min，离心10min制备贫血小板血浆，吸取上清液备用； 1000rmp/min，离心10min制备富血小板血浆，此时仅红细胞白细胞下沉，血小板仍然悬浮，吸取上清液备用 贫血小板血浆中加入兔脑悬液是为了增加组织因子，贫血小板是经离心后去除大部分血小板可阻断内源性凝血过程，加入的脑悬液内含有大量组织因子。可以准确反映纤维蛋白原降解为纤维蛋白的时间 如下表加入试剂于1，2，3号试管，观察三个试管的血浆凝固时间，实验结果如下
P13三、5 、常用蛋白质沉淀方法有哪些？列举沉淀应用的实例 蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀(precipitation)，变性蛋白质一般易于沉淀，但也可不变性而使蛋白质沉淀，在一定条件下，变性的蛋白质也可不发生沉淀。 常用蛋白质沉淀的方法有： (一)盐析(Salting Out) 在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等。例如用半饱和的硫酸铵来沉淀出血清中的球蛋白，饱和硫酸铵可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出来，盐析沉淀的蛋白质，经透析除盐，仍保证蛋白质的活性。 (二)重金属盐沉淀蛋白质 蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，但若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。如临床上利用蛋白质能与重金属盐结合的这种性质，抢救误服重金属盐中毒的病人，给病人口服大量蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。 (三)生物碱试剂以及某些酸类沉淀蛋白质 蛋白质又可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸)结合成不溶性的盐沉淀。如临床血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。 (四)有机溶剂沉淀蛋白质 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。
蛋白质沉淀反应实验集团企业公司编码：（LL3698-KKI1269-TM2483-LUI12689-ITT289-
蛋白质的沉淀反应 一、目的和要求 1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 2、掌握几种沉淀蛋白质的方法 3、了解蛋白质变性与沉淀的关系 二、沉淀反应 （一）原理 在水溶液中，蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用，所以成为稳定的胶体颗粒。但这种稳定的状态是有条件的。在某些理化因素的作用下，蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性，则会以固态形式从溶液中析出，这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型： 1、可逆沉淀反应 沉淀反应发生后，蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显着变化。在沉淀因素去除后，又可恢复其亲水性，这种沉淀反应就是可逆沉淀反应，也叫做不变性沉淀反应。属于这类沉淀反应的有盐析作用、等电点沉淀以及在低温下短时间的有机溶剂沉淀法等。 2、不可逆沉淀反应 蛋白质在沉淀的同时，其空间结构发生大的改变，许多副键发生断裂，即使除去沉淀因素，蛋白质也不会恢复其亲水性，并丧失生物活性，这种沉
淀反应就是不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、强烈震荡、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。 （二）盐析 1、材料与试剂 （1）10%的卵清蛋白溶液（要求新鲜配制）、浓蛋白溶液（2）饱和硫酸铵溶液（3）固体硫酸铵（4）滤纸、玻棒 2、操作方法 （1）取试管一支，加入浓蛋白溶液2ml，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置10分钟将出现沉淀。此沉淀物为球蛋白。 （2）取上清液于另一支试管。 （3）向上清液液中加入硫酸铵粉末，边加边用玻棒搅拌，直至粉末不再溶解为止。静置数分钟后，沉淀析出的是清蛋白。 （4）向两支试管中分别加水，观察其沉淀是否溶解。 （三）重金属盐沉淀 重金属离子如Pb2+、Cu2+、Hg2+、Ag2+等可与蛋白质分子上的羟基结合生成不溶性金属盐而沉淀： 重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；临床上用蛋白质解除重金属盐引起的食物中毒。 1、材料与试剂 （1）10%的卵清蛋白溶液（2）0.1mol/L氢氧化钠溶液 （3）3%硝酸银溶液（4）0.1%硫酸铜溶液（6）试管3支
（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分
蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫Kb分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为%%的蛋白质浓度比较适中。 2．离子强度和类型
一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱，下面为几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。 3．PH值 一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。 4．温度 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。 二．硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=左右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫酸铵饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出，停止透析。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但手续烦琐，需不断测量饱和度，故多用于结晶，其它情况少见。 使用固体硫酸铵时：1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0℃或室温两种，加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（饱和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。 第二节有机溶剂沉淀法 有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相
实验3.1 血液凝固及其影响因素 一、实验目的 1.了解血液凝固的基本过程。 2.测定加速及延缓血液凝固的各种物理和化学因素。 二、实验原理 血液流出血管后会很快凝固，血液凝固是指血液由流动的液体变为不能流动的凝胶状台地过程，其实质是血液中的可溶性纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白的过程；纤维蛋白交织成网，把血细胞及血液的其他成分网罗在内，从而形成血凝块。血液凝固的过程可分为三个阶段：第一阶段是凝血酶原激活物的形成，第二阶段是凝血酶的形成，第三阶段是纤维蛋白的生成。三个阶段的实质是由凝血因子按一定的顺序相继激活而生成的凝血酶最终使可溶性纤维蛋白原变成不溶性的纤维蛋白。 凝血系统包括内源性和外源性两套凝血系统。内源性凝血途径是指参与凝血的因子全部来自血液，通常因血液与带负电荷的衣物表面接触而被启动。外源性凝血途径是由来自血液之外的组织因子与血液接触而启动的凝血过程。内源性与外源性凝血系统的区别是：外源性凝血系统所需的凝血因子的种类及凝血步骤较少，因此血液凝固的时间短，而内源性凝血系统的血液凝固时间长。 本试验在暴露血管的条件下直接从动物动脉取血，观察记录不同实验条件下血液凝固的时间，通过加入外源性的组织因子来观察外源性凝血系统的作用，比较内源性与外源性凝血系统血液凝固过程的不同，并进一步比较影响血液凝固的各种物理及化学作用。 三、实验用品 家兔，哺乳动物手术器械一套，小试管11支，带橡皮条的玻璃棒，小烧杯两只，试管架，秒表13个，0.1%的肝素，2%草酸钾，7%枸缘酸钠，8%的Cacl2溶液，细玻璃粉，石蜡油，冰块。 四、实验方法和步骤 1、备好11支干洁试管和2只小烧杯。 2、麻醉家兔，进行动脉插管。 取一只家兔，从一侧耳缘静脉缓慢注入25%氨基甲酸乙酯（4ml/kg体重），待其麻醉后，背位固定于手术台上，距喉头1~2cm起，之胸骨上端1~2cm止，做一5~7厘米长的正中皮肤切口，钝性分离皮下组织和肌肉，实施气管插管。然后，暴露一侧颈总动脉，于近心端加
实验三蛋白质的颜色反应和沉淀反应 一、目的： 1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应及其机理。 二、原理： (一)蛋白质的颜色反应原理 蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。 (二)蛋白质的沉淀反应原理 蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。 蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。 三、仪器、试剂和材料 1. 卵清蛋白液：将鸡蛋白用蒸馏水稀释20～40倍，2～3层纱布过滤，滤液冷藏备用。 2. 饱和硫酸铵溶液：称硫酸铵850g 加于1000mL 蒸馏水中，在70～80℃下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。 3. 1%醋酸铅溶液 4. 1%硫酸铜溶液 5. 0.1%茚三酮溶液：0.1g 茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。 6. 浓硝酸：比重1.42。 7.试管及试管架、吸管、量筒、布氏漏斗。
实验蛋白质的沉淀反应与颜色反应 一、实验目的 掌握鉴定蛋白质的原理和方法。熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步熟悉蛋白质的有关反应。 二、实验原理 蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。 三、实验仪器 1、吸管 2、滴管 3、试管 4、电炉 5、pH试纸 6、水浴锅 7、移液管 四、实验试剂 1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。 2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。
3、Millon’s试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸（水浴加温助溶）溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。此试剂可长期保存。 4、尿素晶体 5、1%CuSO 4：1g CuSO 4 晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml 6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml 7、浓硝酸 8、0.1%茚三酮溶液：0.1g茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml. 9、冰醋酸 10、浓硫酸 11、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。 12、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。 13、95%乙醇。 14、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml 15、氯化钠晶体 16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml 17、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。 18、1%醋酸溶液。 五、实验步骤 蛋白质的颜色反应 （一）米伦（Millon’s）反应
血液凝固的影响因素实验报告 篇一：影响血液凝固的因素实验报告书写 影响血液凝固的因素 （一）实验目的：通过本实验来了解血液凝固的基本过程及了解影响血液凝固的一些因素。 （二）实验对象：家兔 （三）实验步骤：（略） （四）实验结果： 1、观察纤维蛋白原在凝血过程中的作用：实验中可见到静置杯内血液发生凝固。搅拌杯内血液不凝固，但在毛刷上见到红色的血凝块，经水冲洗后毛刷上缠绕有白色丝状物。 2、观察影响血凝的一些理化因素：如下表9-1所示。 表9-3影响血凝的一些理化因素实验条件 1.加少许棉花 2. 用石蜡油均匀涂试管内壁 3.放置37℃水浴 4.放置冰水水浴
5.加肝素10个单位 6.加草酸钾2mg （表9-3文字说明：略） 3、观察内源性及外源性凝血过程：如下表9-2所示 表9-2内源性和外源性凝血过程的观察 试剂 1、富血小板血浆 2、少血小板血浆 3、生理盐水 4、羊肺悬液 5、0.025mol/L CaCl2 血液凝固时间 （表9-2文字说明：略） （五）讨论： 血液凝固是指血液由流动的液体状态变为不流动的冻胶状态血液凝固过程大致分为三个主要阶段：①凝血酶原激活物形成；②凝血酶原激活成凝血酶，③纤维蛋白原转变为
纤维蛋白。在凝血酶原激活物的形成过程中分有两种不同的途径：内源性凝血途径和外源性凝血途径。内源性凝血途径是由凝血因子Ⅻ启动的，参与血凝的全部凝血因子都在血浆内。凝血因子Ⅻ可被各种带负电荷的物质等所激活，如血管内膜暴露的胶原纤维、玻璃、陶器等。外源性凝血途径是由存在于血管外组织中的凝血因子Ⅲ所启动的，其余参与的凝血因子也在血管内。凝血因子Ⅲ在脑、肺、胎盘组织含量很丰富。 不管是内源性凝血途径或外源性凝血途径，他们最后的是使血纤维蛋白的形成而使血液发生凝固。在观察纤维蛋白原在凝血过程中作用的实验中，由于参与凝血的全部凝血因子都在血浆中，因此其凝血过程是属于内源性凝血。由于玻璃和毛刷表面都带有负电荷，后者可激活凝血因子Ⅻ，启动内源性凝血过程。凝血到最后阶段时，在凝血酶的作用下，把纤维蛋白原水解成血纤维蛋白；形成的纤维蛋白不断地交叉成网状结构，把血液中的所有血细胞网凝血时间 50’’ 8’15’’ 2’15’’ 6’45’’不凝不凝试管1 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 2’15’’试管2 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 3’45’’试管3 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 45’’ 罗于其中，从而使血液发生凝固。静置杯中的血液，由于发生了上述的血液凝固过程，所形成的纤维蛋白没有被破
沉淀蛋白质的常用方法（TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤） 2010-08-18 15:19 TCA-DOC For precipitation of very low protein concentration 1) To one volume of protein solution, add 1/100 vol. of 2% DOC (Na deoxy cholate, detergent). 2) Vortex and let sit for 30min at 4oC. 3) Add 1/10 of Trichloroacetic acid (TCA) 100% vortex and let sit ON at 4oC (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!). 4) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). [OPTION: Wash pellet twice repellet samples 5min at full speed between washes]. 5) Dry samples under vaccum (speed vac) or dry air. For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Normal TCA To eliminate TCA soluble interferences and protein concentration 1) To a sample of protein solution add Trichloroacetic acid (TCA) 100% to get 13% final concentration. Mix and keep 5min –20oC and then 15min 4oC; or longer time at 4oC without the –20oC step for lower protein concentration. Suggestion: leave ON if the protein concentration is very low. (preparation of 100% TCA: 454ml H2O/kg TCA. Maintain in dark bottle at 4oC.Be careful, use gloves!!!). 2) Spin 15min 4oC in microfuge at maximum speed (15000g). Carefully discharge supernatant and retain the pellet: dry tube by inversion on tissue paper (pellet may be difficult to see). 3) For PAGE-SDS, resuspend samples in a minimal volume of sample buffer. (The presence of some TCA can give a yellow colour as a consequence of the acidification of the sample buffer ; titrate with 1N NaOH or 1M TrisHCl pH8.5 to obtain the normal blue sample buffer colour.) Acetone Precipitation To eliminate acetone soluble interferences and protein concentration
盐析法沉淀蛋白质的原理 1 中性盐沉淀（盐析法） 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是： ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 ②操作简单、安全。 ③对许多生物活性物质具有稳定作用。 ⑴中性盐沉淀蛋白质的基本原理 蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
⑵中性盐的选择 常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。 2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵 盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯 度提高了四倍。 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的 作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的 （NH4）2SO4保存可达数年之久。 4) 价格便宜，废液不污染环境。 ⑶盐析的操作方法 最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。
蛋白质纯化方法 蛋白质浓缩有多种方法，有盐析，超滤，离子交换，有机溶剂沉淀等方法。 有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。由此法析出的沉淀一般比盐析容易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离的效果，在有机溶剂中添加中性盐的浓度为0.05mol/L左右，中性盐过多不仅耗费有机溶剂，可能导致沉淀不好。沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能得到可重复的结果。医学教育`网搜集整理有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂易除去；缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。例如酒精消毒灭菌就是如此，但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。
蛋白质浓缩技术是免疫学中常用的手段，现介绍几种常用的浓缩技术。 （一）透析袋浓缩法 利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋（无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成30％－40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。 （二）冷冻干燥浓缩法 这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如NaOH、CaCl2和硅胶等）。密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷冻干燥。 （三）吹干浓缩法 将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度不能过高，最好不要超过15℃。 （四）超滤膜浓缩法 此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅拌之下过滤；另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压抽气，而使袋内液体渗出。 （五）凝胶浓缩法 选用孔径较小的凝胶，如SephadexG25或G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶粒子吸水后，通过离心除去。 （六）浓缩胶浓缩法 浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物，具有很强的吸水性能。每克干胶可吸水120ml～150ml。它能吸收低分子量的物质，如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐等，适宜浓缩10 000分子量以上的生物大分子物质。浓缩后，蛋白质的回收率可达80％～90％。比浓缩胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注意，浓缩溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离子交换，影响浓缩物质的回收率。 选择材料及预处理 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。
血液凝固和影响血液凝固的因素 浙江中医药大学14级临床医学本部三班张伊娜 【摘要】目的：通过测定某些条件下的血液凝固时间，探究各种因素对血液凝固的影响及机制。方法：取家兔新鲜血液分别置于室温、低温、涂石蜡于试管壁的试管，加棉花、NaCl、肝素、草酸钾、肺组织浸液，用竹签搅拌处理，观察记录其凝血时间并与不做任何处理的血液凝固时间进行对比，分析凝血时间的变化。结果：经棉花、肺组织浸液处理的血凝时间较室温短，经NaCl、涂石蜡于试管壁处理的血凝时间较室温长，经肝素、草酸钾、低温处理的血液不凝，经竹签搅拌的血液不凝且竹签上缠有乳白色丝状物。结论：增加粗糙面、组织因子促进血液凝固；稀释血液、涂石蜡于试管壁可延长凝血时间；肝素、草酸钾、低温抑制血液凝固。纤维蛋白是血液凝固所必需的。 【关键词】血液凝固；凝血因子；肝素；纤维蛋白 1实验材料和方法 1.1实验材料 1.1.1实验动物 家兔。 1.1.2实验材料和器械 棉花，石蜡油，碎冰块，氯化钠，肝素，草酸钾，肺组织浸液，氨基甲酸乙酯；试管（8支），小烧杯（2支），竹签，兔手术台，手术器械，注射器，动脉夹，动脉插管，恒温水浴槽，秒表（本实验用手
机秒表功能）。 1.2实验方法 1.2.1家兔称重后，按5mL/kg体重剂量给家兔耳缘静脉注射200g/L 的氨基甲酸乙酯使之麻醉，将兔仰卧并固定于兔手术台上。 1.2.2切开颈部皮肤、肌肉后，使两侧颈总动脉暴露，用玻璃分针分离一侧颈总动脉，头端用线结扎，向心端夹上动脉夹。用眼科剪在近结扎线处的血管壁剪一“V”形小口，向心方向插入动脉插管，用线结扎固定。以备取血之用。 1.2.3取8支试管，并编号。按下表实验条件准备完毕(其中4号试管1~4组加0.5mLNaCl,而5~8组加2mL NaCl) 图示：促凝与抗凝试验 1.2.4放开动脉夹，先放一管血后再1~8号管每管加入血液1mL（约
實驗3 蛋白質的沉澱與變性反應 目的 (1)瞭解蛋白質的沉澱反應、變性作用和凝固作用的原理及它們的相互關係。 (2)學習鹽析和透析等生物化學的操作技術。 原理 在水溶液中，蛋白質分子的表面，由於形成水化層和雙電層而成為穩定 的膠體顆粒，所以蛋白質溶液和其他親水膠體溶液相類似。但是，蛋白質膠 體顆粒的穩定性是有條件的，相對的。在一定的物理化學因素影響下，蛋白 質顆粒失去電荷，脫水，甚至變性，則以固態形式從溶液中析出，這個過程 稱為蛋白質的沉澱反應。這種反應可分為以下兩種類型: 一、可逆澱汲反應 在發生沉澱反應時，蛋白質雖已沉澱析出，但它的分子內部結構並未發 生顯著變化，基本上保持原有的性質，沉澱因素除去後，能再溶於原來的溶 劑中。這種作用稱為可逆沉澱反應，又叫作不變性沉澱反應。屬於這一類的 反應有鹽析作用; 在低溫下，乙醇、丙酮對蛋白質的短時間作用以及利用等 電點的沉澱等。 二、不可逆沉澱反應
在發生沉澱反應時，蛋白質分子內部結構、空間構象遭到破壞，失去原來的天然性質，這時蛋白質已發生變性。這種變性蛋白質的沉澱不能再溶解於原來溶劑中的作用叫作不可逆沉澱反應。重金屬鹽、植物鹼試劑、過酸、過鹼、加熱、震盪、超聲波，有機溶劑等都能使蛋白質發生不可逆沉澱反應。試劑和器材 一、試劑 1．蛋白質溶液 取5m1雞蛋蛋白蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌均勻後用4-8層紗布過濾，新鮮配製。 2．蛋白質氯化鈉溶液 取20ml蛋清，加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液100ml，充分攪勻 後，以紗布濾去不溶物(加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白)。 硫酸銨粉末，飽和硫酸銨溶液，3%硝酸銀，0.5% 醋酸鉛，10% 三氯醋酸，濃鹽酸，濃硫酸，濃硝酸，5% 磺基水楊酸(sulfosalicyclic acid)，0.1% 硫酸銅，飽和硫酸銅溶液，0.1% 醋酸，10% 醋酸，飽和氯化鈉溶液，10% 氫氧化鈉溶液。 二、器材 試管，試管架，小玻璃漏斗，濾紙，玻璃紙，玻璃棒，500ml 燒杯，10 ml量筒。
蛋白质沉淀法 在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂： 1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 第一节盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋
白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。 2．离子强度和类型 一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱，下面为几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。 3．PH值 一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。但必须注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。 4．温度 在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4℃进行。 二．硫酸铵的使用 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫酸铵饱和