第一章皮肤 一、皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成。 二、皮肤腺有皮脂腺、汗腺和乳腺。 1、皮脂腺分布在毛囊周围。口角部、肛门、包皮和乳头周围有特化的皮脂腺。 2、汗腺，大鼠的汗腺只局限于足垫的皮肤。 3、乳腺 数量大鼠的乳腺共有6对，胸部3对，腹部1对，鼠蹊部2对。个别的大鼠有5对或者7对。 大小和形态随大鼠的年龄和性周期有明显的变化。 部位包埋在皮下组织中，由结缔组织隔与胸壁和腹壁松松地相连。 第二章骨 一.脊柱大鼠的脊柱由57 —61块脊椎骨组成，包括颈椎7、胸椎13、腰椎& 荐锥 4、尾锥27 —31块。锥式C7T13L6S4Cy27—31。骨性标志为第二胸椎，其棘突最高，超过其它脊椎骨。 1、颈椎和其它哺乳动物一样，恒为7块，全无肋骨相连，横突上具有横突孔，供锥动脉通过。 2、胸椎13块，椎骨的长度由前向后逐渐增加（由2毫米增加到4毫米），锥管的直径平均为3.3毫米，较颈部的锥管为狭窄。 3、腰椎6块，每块锥体的长度比较一致，约 6 —7毫米。锥管直径由前面的 4 毫米向后逐渐缩小至2毫米。 二、胸骨 共分为6节，最前一节为胸骨柄，第二到第五节称为胸骨体，最后一节为剑突，棒状的剑突后面接一盘状的剑状软骨。胸骨柄长约10毫米。 第三章肌肉系统（省略） 第四章消化系统 消化系统包括消化管及附属消化器官。消化管可分为口腔、食管、胃、小肠和大肠等部。附属消化器官有齿、舌、唾液腺、肝和胰。 第一节消化管
、口腔1、舌全长约30毫米，不具有正中系带，但是有两条侧系带。 一、食管 分为颈、胸、腹三部。成年大鼠食管的颈-胸段长度约75毫米，腹段通过膈的食管裂孔在膈后的长度约15毫米，食管外径约2毫米。 位置：食管主要是沿气管背侧走行，仅在颈部稍偏左侧。 一、胃 位置：横位于腹腔的左前部，其壁面几乎完全为肝的左叶所覆盖。 大小：胃重为体重的0.5% ,属单室胃。 形态：胃小弯朝向背前方，食管在其中部入胃。胃大弯朝向腹后方，其边缘 有双层的口袋状大网膜。贲门部外观呈半透明状，内壁有粘液腺。 三、小肠 1、十二指肠 长度：长约100毫米。 位置：从幽门发出向右后行，再折向前终于右侧。可分为降支（向右后行）、横支（水平部）、升支（向前行），它们构成一个不完全的环，包围着部分胰腺。 颜色：淡红色。 2、空肠 长度：为小肠的最长部分，大约有700—1000毫米。 位置形态：盘旋在腹腔的右方腹侧部。 3、回肠 长度：较短，约有40毫米。 位置形态：以三角形的系膜回盲褶与盲肠的末端相连，向盲肠的开口与结肠的起始部紧密相接。 二、大肠 1、盲肠 长度：是介于小肠与盲肠之间的一个大的盲囊。长约60毫米，直径约10毫米。位置：通常位于腹腔的左后部。盲肠呈锥体形，分为基部、体部和尖端。 2、结肠 长度：长约100毫米。
图Ⅷ-31左心房与左心室The left atrium and left ventricle 11左心房left atrium 12左心室left ventricle 13肺动脉右支right branch of pulmonary artery 14肺静脉pulmonary vein 15前腔静脉precavalvein 16肺动脉左支left branch of pulmonary art 7tery 17后腔静脉postcaval vein 18心中静脉 middle cardiac vein 19头臂动脉brachiocephalic artery 20主动脉弓aortic arch 21乳头肌papillary muscles 22左颈总动脉left common carotid artery 23左锁骨下动脉left subclavian artery 24右前腔静脉right precaval vein 25心外膜extracardium
图Ⅷ-56前肢内侧面The anterior limb. Medial aspect
图Ⅷ-57后肢内侧面(1)The posterior limb. Medial aspect（1） 1腋神经axillary nerve 2桡神经radial nerve 3头静脉cephalic vein 4正中神经median nerve 5正中动脉median artery 6肌支muscular branch 7尺神经ulnar nerve 8臂动脉brachial artery 9胸长神经long thoracic nerve 10胸外侧动脉external thoracic artery I1颈总动脉common carotid artery 12主动脉弓aorta arch 13左心耳left auricle 14右心耳right auricle 15食管esophagus 16胸主动脉thoracic aorta 17腹壁浅动脉superficial epigastric artery 18腹壁浅静脉superficial epigastric vein 19隐动脉saphenous artery 20隐大静脉great saphenous vein
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２００９年５月第６卷第１３期 图１腹主动脉灌注图２修肝及套管 圈３肝脏血管系统吻合完成 当延长供肝的冷缺血时间并不明显增加术后死亡率及并发症的发生。而术中过多地牵动供肝则会明显影响供肝的质量嗍。手术分离时尽可能去除血管壁周围的筋膜、结缔组织等。防止再通后造成套管腔狭窄及血栓形成。 ３．２供肝灌注 先松开门静脉夹，再松开肝下下腔静脉夹，均缓慢松开。灌洗压力过大容易引起供肝的细胞器肿胀、细胞坏死和淋巴细胞浸润，导致细胞内钙超载和能量代谢障碍．从而影响移植肝的质量。本研究采用的是经腹主动脉的灌注法。以１￣２ＩｌｉＯｎ的速度灌注腹主动脉，灌注液体经过肝动脉和门静脉系统回流入肝脏，从而保证肝脏得到充分、缓慢而均匀的灌注，提高供肝的质量。 ３．３袖套管放置 套管必须保证硬度适中、内壁光滑。由于不重建肝动脉，而胆道血供多由肝动脉供应．故供肝胆总管不应保留过长．有利于减少胆道并发症。在脾静脉水平安放门静脉袖套较为方便。在左肾静脉水平剪断ⅣＣ。有利于袖套的翻转。 ３．４受体手术 笔者在进腹时习惯取中上腹横切口，而此过程中笔者建议结扎左右腹壁下静脉，首先该血管相对较粗大，出血会影响术野，其次该血管的出血量相对于只有１２一１３“血容量的大鼠来讲会是术后出血性休克死亡的重要原因。受体术前１５ｒｎｉｎ常规给予阿托品对于预防术后肺炎、肺不张有较好的效果ｆＩｑ。供肝恢复血供后对于肝门部的处理，使用血供较好的大网膜覆盖，既有加压防止出血、使胆漏和胆道感染局限化的作用，同时可以适当供给胆道血供，可以预防胆道并发症的发生【ｌｌｌ。受体阻断门静脉后，经门静脉注入羟乙基淀粉 ?论著? 注射液可将肝内残存的血液及时推人体循环。起到“自身输血”的作用。在ＳＶＣ的吻合过程中，缝线不宜过紧。防止血管狭窄。供肝门静脉及ＩＶＣ“套管法”吻合前，必须排出阻断夹后方的一段积血。以防止血栓栓塞。Ｐａｅｈｅｃｏ等旧研究表明，随门静脉淤血时间的延长。再灌注后闲肠道内菌群移位而使内毒素骤升。如此可激活肝脏Ｋｕｐｆｆｅｒ细胞，产生大量的ＴＮＦ—Ｏｔ及一系列的级联反应。从而对供肝及受者的肺脏产生损伤１７．Ｌａ－ｌ川。同时．ＩＶＣ阻断时间的延长会导致血钾浓度显著升高。在供肝恢复血供的过程中．应缓慢放开无创血管夹，而且应按顺序先放开门静脉。后放开肝上上腔静脉，尽量使心脏逐渐适应血容量的增加。 ４结论 重复是技巧之母．所以大量的练习是提高手术技巧的关键。认真、耐心、仔细的手术是成功的关键。对于供肝的提早冷缺血处理及对供肝植入后的细心操作。使得手术成功的机会大大增加。 【参考文献】 【１】ＫａｍａｄａＮ，ＣａＭｅＢＹ．ＡｓｕｒｇｉｃａｌｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｗｉｔｈｆｉｖｅｈｕｎｄｒｅｄｔｈｉｒＩｙｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓｉｎｔｈｅｒａｔ【Ｊ】．Ｓｕｒｇｅｒｙ，１９８３，９３（Ｐｔｌ）：６４－６９． 【２】宇汝胜，汪泳，钱海鑫．大鼠原位肝移植模型的手术操作技巧探讨阴．肝胆胰外科杂志．２００８．２０（１）：７－９． 【３】权毅，付华。徐亮．大鼠原位肝移植模型的建立和术式改进阴．中国现代医学杂志．２００６．１６（２）：２２６－２２９． 【４】ＷａｎＣＤ，ＣｈｅｎｇＲ，ＷａｎｇＨＢ。ｅｌａ１．１ｒａｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｅｔａｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅｓｉｎａｒａｔｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｍｏｄｅｌ陬ＨｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙＰａｎｃｒｅａｔＤｉｓＩｎｔ，２００８，７（１）：２９—３３． 【５】汪根树。陈规划，朱晓峰．大鼠小体积原位肝移植模型的建立田．中国实验诊断学，２００６，（１０）：儿１９－１１２２． 【６】贾凯，徐钧．二袖套法大鼠原位肝移植术的改进们．山西医科大学学报，２００６，３７（４）：３５６－３５８． 【７】ＴｉａｎＹ，ＪｏｅｈｕｍＷ，Ｇ∞晒ｅｖＰ，ｅｔａ１．Ｋｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＴＮＦ－Ｍｐｈａｓｉｇｎａｌｉｎｇｍｅｄｉａｔｅｓｉｎｊｕｒｙｉｎｔｈｅａｒｔｅｒｉａｌｉｚｅｄｓｍａｌｌ—ｆ打一ｓｉ∞ｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅＩｎｏｕｏｅ叽ＰｌｏｃＮａｉｌＡｃａｄＳｃｉ．２００６，１０３（１２）：４５９８－舢奶． 【８】ＵｍｔａＫＮａｎｙｅｎＢ，Ｂｍｕｈ＆ｅｔａ１．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄｓｕｒｖｉｖａｌｉｎｒａｔｌｉｖｅｒｔｒａｒｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｌｌｅｘｔｅｎｄｅｄｃｏｌｄｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ：ｒｏｌｅ０ｆｐｏｒｔａｌｖｅｉｎｃｌａｍｐｉｎｇｔｉｍｅＩＪ］．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９８，２８（２）：３６６－３７３． 【９】邵堂雷，蔡伟耀，张明钧，等．影响肝移植鼠近期存活的术中因素分析叨．上海第－－ｇｇ科大学学报，２００１，２１（３）：２２３—２２５． 【１０】彭勇，龚建平，刘长安，等．大鼠原位肝移植模型制作过程中麻醉方法的选择【Ｊ】．中华普通外科杂志，２００３，１２０）：６７３－－６７６． 【１ｌ】常顺伍，郑树森，梁廷波，等．大鼠原位肝移植术中胆道重建方法的改进【Ｊ】．中华器官移植杂志２００７，（１）：１３—１６． 【１２】ＰａｅｈｅｅｏＥＧ，ＧｏｒａｅａＭＣ，ＲｏｄｒｉｇｕｅｓＧ凡ｅｔａ１．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｌｉｖｅｒｉａｅｈａｅｍｉｅｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｉｎｃｉｒｒｈｏｔｉｃｒａｔｓｓｕｂｍｉｔｔｅｄｔｏｈｅｐａｔｉｃｉｓｅｈａｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ【Ｊ】．ＡｅｔａＣｉｒＢｒａｓ，２００６，２１：２４－２８． 【１３】ＯｌｌｕｏｇｌｕＥ，ＫｅｒｅｍＭ，ＰａｓａｏｇｌｕＨ，ｅｔａ１．Ｄｅｌａｙｅｄｅｎｅｒｇｙｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ０ｆｉｓｃｈｅｍｉｃｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇｏｎｈｅｐａｔｉｃｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙｉｎｒａｔｓ仞．ＥｕｒＳｕｒｇＢｅｓ，２００６，３８：１１４－１２１． 【１４］Ｋａｓｈｔｉ气Ｍｅｈｒａｂｉ气ＰａｈｌａｖａｎＩＳ，ｅｔａ１．Ａｒｅｖｉｅｗｏｆｖａｒｉｏｕｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅ呲忉．ＴｒａｎｓｐｌａｎｔＰｒｏｅｔ２００５，３７：１８５－１８８． （收稿日期：２００９－０２—１７） ＣＨＩＮＡＭＥＤＩＣＡＬ ＨＥＲＡＬＤ中目医琦导囊３５ 万方数据
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone
图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect
图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect
1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process
实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更
为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。
实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对
应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，
大鼠的生物学特性和解剖学特点 1．大鼠性哺乳钢，啮齿目，鼠科，大鼠属动物。 2．繁殖快。大鼠2月龄时性成熟，性周期4天左右，妊娠期20（19～22），哺乳期21天，每天产仔平均8只，为全年、多发情性动物。 3．喜啃咬、夜间活动、肉食，白天喜欢挤在一起休息，晚上活动大，吃食多，因此白天除实验必须抓取外，一般不要抓弄它。食性广泛，喜吃各种煮熟的动物肉。对光照较敏感。 4．性情较凶猛、抗病力强。大鼠门齿较长，激恕、袭击抓捕时易咬手，尤其是哺乳期的母鼠更凶些，常会主动咬工作人员喂饲时伸入鼠笼的手。对外环境适应性强，成年鼠很少患病。一般情况下侵袭性不强，可在一笼内大批饲养，也不会咬人。 5．无胆囊：大鼠、鸽、鹿、马、驴、象等动物没有胆囊，它们的总胆肝管括约肌的阻力很少，肝分泌的胆汁通过总胆管进入十二指肠，受十二指肠端括约肌的控制。 6．不能呕吐：因此药理实验时应予注意。 7．垂体一肾上腺系统功能发达，应激反应灵敏。行为表现多样，情绪敏感。 8．视觉、嗅觉较灵敏，做条件反射等实验反应良好，但对许多药物易产生耐药性。 9．大鼠血压和血管阻力对药物反应敏感，但对强心甙的作用较猫敏感性低671倍。10．肝脏再生能力强，切除60～70%的肝叶仍有再生能力。 11．对营养、维生素、氨基酸缺乏敏感，可发生典型的缺乏症状。体内可以合成维生素Ｃ。 12．对炎症反应灵敏。它的眼角膜无血管。 13．生长发育期长，长骨长期有骨骺线存在，不骨化。 14．成年雌鼠在动情周期不同阶段，阴道粘膜可发生典型变化，采用阴道涂片法（Yaginal Smear Test）来观察性周期中阴道上皮细胞的变化，可推知性周期各个时期中卵巢、子宫状态与垂体激素的变动。 15．大鼠（包括小鼠）心电图中没有S-T段，甚至有的导联也不见T波，如有T波也是与S波紧挨着，或在R波降支上即开始，以致看不到等电线的S-T段。但心电图其他成分稳定，重复性好。豚鼠以上较大的动物均有明显的S-T段，在选择动物品种时应以注意。 16．大鼠垂体较脆弱地附着在漏斗下部，不需要很大的吸力就可以除去而不破坏鞍膈和脑膜，适宜于制作去垂体模型。大鼠也很适于作肾上腺和卵巢等内分泌腺切除手术。 17．大鼠肠道较短，盲肠较大，但盲肠功能不发达。不耐饥饿，肠内能合成维生素C。双子宫。胸部和鼠蹊部各有三对乳头。胰腺十分分散，位于胃和十二指肠弯曲处。染色体为21对，寿命3～4年。 18．大鼠的体温39（38.5～39.5）℃，心跳频率475（370～580）次/分，呼吸频率85.5(66～114)次/分，通气量7.3(5-10.1)ml/分，潮气量0.86(0.6～1.25)ml，耗氧量2000mm3/g体重，麻醉时收缩压116（88～138）mmHg红细胞总数8.9(7.2～9.6)百万mm3,血红蛋白14.8(12～17.5)g/100ml血，白细胞总数：5000～15000/mm3,血小板10～30万/mm3，血容量占体重的7.4%，红细胞比重1.090,总蛋白7.2(6.9～7.6)g%。
实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利
实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入： 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. （可选）定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。 注：实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。
【摘要】目的研究大鼠辅助性原位肝移植模型的手术技巧及术后并发症的预防。方法30只SD大鼠作供体。30只SD大鼠为受体。通过“袖套法”施行大鼠辅助性原位肝移植。结果24h存活率76％(19/25)；周存活率56％(14/25)。结论熟练的显徽外科技术是模型成功与否的关键。 【关键词】肝脏；移植；大鼠 Parital auxiliary orthotopic liver transplantation in rats LONG Guang-hui, XIAO Ping, XIE Yong, et al. Department of Hepatobiliary Surgery，Peking University Shenzhen Hospital，Guangdong，518036 [Abstract］Objective To investigate the method and technique of parital auxiliary orthotopic liver transplantation in rats. Methods 30 cases of parital auxiliary orthotopic liver transplantation in SD rats were performed using cuf-tecnique and microsurgery method. The successful rate, operation time and complications were observed. Results The general successful rate was 90%, the survival rate of post-operation 24-hour and one week was 76％(19/25)and 56％(14/25)respectively. Conclusion Meticulous and skilled microsurgical technique is the key to successful operation. [Key words］liver; transplantation; rat 近年来，辅助性原位肝移植因其手术创伤相对较小、供体来源比较容易获取以及术后不必长期服用免疫抑制剂等优点已经越来越多地受到临床医生的重视[1]。但是，该该移植方法目前也有其一定的局限。其中又以供肝与移植肝功能竞争导致移植肝萎缩最为明显[2]。因此，建立动物辅助性原位肝移植模型了解供肝与移植肝功能竞争的机理是解决这一难题的重要研究手段。70年代大鼠原位肝移植模型获得成功后[3,4]。原位肝移植的动物模型已经逐渐成熟并被实验研究广泛采用。但是，辅助性原位肝移植的动物模型尚不多见。本实
大鼠肝脏移植模型制作 大鼠原位肝移植是研究器官保存、肝脏缺血再灌注损伤、免疫抑制剂、移植排斥反应以及免疫耐受机理等方面常用的动物模型。最初由Lee在1973年报道，经过许多学者的改进，其手术基本稳定，根据肝上下腔静脉吻合方式，大鼠原位肝移植可分为“二袖套法”和“三袖套法”，下面简单的将大鼠肝脏移植的模型制作介绍一下。 一、手术器械 显微外科手术器械包，手术显微镜1台，自制S拉钩（用橡皮筋一端带弯成S形大头针）4个，眼科剪1把，其它外科器械若干及纱布、棉球、棉片和橡皮条等。 二、供、受者大鼠的选择 根据不同的研究目的选择不同的动物品系，在同种移植模型中，一般采用两种纯系健康大鼠，如Lewis大鼠，Brown Norway 大鼠（BN），DA大鼠等，国内应用Wistar，SD大鼠也比较多。如果是异种移植可以选用豚鼠－大鼠，仓鼠－大鼠等不同品系的动物。 三、术前准备 供、受者术前禁食14h，自由饮水，采用乙醚吸入麻醉麻醉的方法，提高手术的安全性，受者术前肌肉注射阿托品0.03mg，防治分泌物阻塞呼吸道。 四、供者手术 麻醉成功后，经阴茎背静脉注射50U/ml肝素稀释液3.0ml，使供者全身肝素化。十字切口入腹，经腹主动脉穿刺灌洗供肝；灌洗前，剪开膈肌，阻断腹主动脉，离断胸腔段肝上下腔静脉，灌洗至流出液澄清为止，约需灌洗液20～30ml。游离肝下下腔静脉，分离结扎离断右肾静脉和右肾上腺静脉，自肠系膜上静脉置管，缓慢注入20ml含肝素的林格氏液，于右肾静脉下方离断肝下下腔静脉，剪开胆总管前壁，近肝端插入外径1.0mm，长4.0mm 的聚乙烯管约2.0mm（可用硬膜外导管制成），结扎固定后远肝端离断之，分离结扎离断肝固有动脉；游离门静脉，结扎离断其分支幽门静脉、脾静脉，于脾静脉下方离断门静脉，锐性分离肝周韧带，结扎左膈下静脉，绕肝上下腔静脉环切膈肌及其腱膜，保留2.0mm
大鼠系统解剖简述 第一章皮肤 一、皮肤由表皮、真皮和皮下组织构成。 二、皮肤腺有皮脂腺、汗腺和乳腺。 1、皮脂腺分布在毛囊周围。口角部、肛门、包皮和乳头周围有特化的皮脂腺。 ２、汗腺,大鼠的汗腺只局限于足垫的皮肤。 3、乳腺 数量大鼠的乳腺共有6对，胸部3对，腹部1对,鼠蹊部2对。个别的大鼠有5对或者7对. 大小和形态随大鼠的年龄和性周期有明显的变化。 部位包埋在皮下组织中,由结缔组织隔与胸壁和腹壁松松地相连。 第二章骨 一。脊柱大鼠的脊柱由57-６1块脊椎骨组成,包括颈椎7、胸椎1３、腰椎6、荐锥４、尾锥2７—３1块。锥式C7T13L6Ｓ4Cy27－31.骨性标志为第二胸椎，其棘突最高，超过其它脊椎骨。 1、颈椎和其它哺乳动物一样，恒为7块,全无
肋骨相连,横突上具有横突孔，供锥动脉通过。 2、胸椎１3块，椎骨的长度由前向后逐渐增加 （由2毫米增加到4毫米）,锥管的直径平均为 3。3毫米，较颈部的锥管为狭窄。 ３、腰椎 6块,每块锥体的长度比较一致,约6-7 毫米。锥管直径由前面的４毫米向后逐渐缩小至2 毫米。 二、胸骨 共分为6节,最前一节为胸骨柄，第二到第五 节称为胸骨体,最后一节为剑突，棒状的剑突后面 接一盘状的剑状软骨。胸骨柄长约10毫米。 第三章肌肉系统(省略) 第四章消化系统 消化系统包括消化管及附属消化器官。消化管可 分为口腔、食管、胃、小肠和大肠等部。附属消 化器官有齿、舌、唾液腺、肝和胰。 第一节消化管 一、口腔 1、舌全长约3０毫米，不具有正中系带，但是有两条侧系带。 一、食管 分为颈、胸、腹三部。成年大鼠食管的颈-胸段
长度约75毫米，腹段通过膈的食管裂孔在膈后的长度约15毫米,食管外径约2毫米. 位置：食管主要是沿气管背侧走行，仅在颈部稍偏左侧。 一、胃 位置: 横位于腹腔的左前部，其壁面几乎完全为肝的左叶所覆盖。 大小：胃重为体重的０.5％，属单室胃。 形态：胃小弯朝向背前方，食管在其中部入胃.胃大弯朝向腹后方，其边缘有双层的口袋状大网膜.贲门部外观呈半透明状，内壁有粘液腺. 三、小肠 1、十二指肠 长度：长约100毫米. 位置：从幽门发出向右后行，再折向前终于右侧.可分为降支（向右后行）、横支(水平部）、升支（向前行)，它们构成一个不完全的环，包围着部分胰腺。 颜色：淡红色。 2、空肠 长度：为小肠的最长部分，大约有７0０－1000毫米。
实时荧光定量PCR全方位解析 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧
荧光定量PCR实验指南（一） 一、基本步骤： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 2、引物、探针的设计； 3、引物探针的合成； 4、反应体系的配制； 5、反应条件的设定； 6、反应体系和条件的优化； 7、荧光曲线和数据分析； 8、标准品的制备； 二、技术关键： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 从https://www.doczj.com/doc/ba18242496.html,/网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq 软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定
比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。 2、引物和探针设计 2.1引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 序列选取应在基因的保守区段； 扩增片段长度根据技术的不同有所分别： sybr green I技术对片段长度没有特殊要求； Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp； 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对； 避免引物自身形成环状发卡结构； 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
大鼠原位肝移植步骤及详细说明 动物案例 供体：Lewis大鼠、DA大鼠； 受体：BN大鼠 造模方法 二袖套一吻合法(门静脉和肝下下腔静脉行袖套法,肝上下腔静脉行吻合法) 供肝的获取 腹采用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3ml/100g)，十字切口入腹，离断肝脏镰状韧带，将小肠移出腹腔外，以生理盐水纱布覆盖。游离胃小弯背腹侧的尾状叶盘状乳头突，近肝侧结扎并离断左膈下静脉，结扎并切断左肝至食管高位血管支，结扎右肾上腺静脉丛，并切断右肾动静脉。游离肝下下腔静脉至左肾静脉上缘，游离肝外胆管并行胆管内插管，经门静脉主干向肝脏内灌注含肝素50U 的4℃生理盐水10ml，行肝脏冷灌注。当肝脏变白时，在靠近左肾静脉入口处剪断肝下下腔静脉，形成灌注液流出道，在膈肌上方横断肝上、下腔静脉，将供肝取出，置于4℃生理盐水内。 血管袖套制备 在4℃生理盐水中将门静脉与肝下下腔静脉壁外翻，分别套在外径2.10mm和2.76mm的聚乙烯管上，用5-0丝线环扎固定，完成袖套制备。
具体步骤 大鼠麻醉后，上腹部直切口入腹，分步游离受体肝脏，游离完毕后将受体肝脏取出。将供肝自生理盐水保存液中取出置于受体原位，冰生理盐水纱布覆盖肝脏表面，以预置的7-0无损伤线吻合肝上、下腔静脉，吻合时，受体侧连同膈肌环一并缝合，先缝合后壁，从左侧开始，将缝线从血管外缝入腔内，在腔内连续缝合。针距控制在1mm，至右侧角时，将缝线穿出血管壁，在血管腔外与右侧角缝线打结。以同一缝线从右侧角连续缝合血管前壁，接近左侧角时，向肝上、下腔静脉内注入4℃生理盐水，驱出血管腔内的空气，至左侧角时，与原缝线打结。以弯血管夹在吻合口近肝侧钳夹肝上、下腔静脉，更换下小儿Satinsky心耳钳，检查吻合口是否出血。吻合成功后，经门静脉向供肝内灌注4℃生理盐水10ml，排除肝内的肝素盐水，夹闭肝下下腔静脉，将供肝门静脉套管插入受体门静脉内，开放门静脉及肝上、下腔静脉阻端夹，结束无肝期。肝下下腔静脉的吻合方法与门静脉相同，最后将供体胆管插入受体胆管插管内，按层缝合腹壁。 造模周期 约1h一对 模型成功率 95%以上