毕业论文
关于食用菌工厂化生产污染菌的研究
摘要
从杏鲍菇工厂中患病的杏鲍菇上分离到了2个菌株（指定为S1，S2），接种至种包中，产生了同样的病变。根据革兰氏染色和生化检验结果，初步鉴这两个菌株为假单胞菌属。进一步对其生理生化特性，分析16SrRNA序列，鉴定S1为Pseudomonas putida，S2为Pseudomonas marginais。
关键词：生化检验杏鲍菇16SrRNA基因Pseudomonas putida Pseudomonas marginais
In places of production bacteria were repeatedly isolated. From these lesions two bacterial strains (designated S1, S2) vaccination to the packages, then produce the same kind of illness.Results of Gram stain and biochemical tests preliminarily identified these isolates as Pseudomonas. Physiological and biochemical properties, analysis of the 16SrRNA sequences, identified S1 as Pseudomonas putida. Pseudomonas ,and S2 as Pseudomonas marginais.
Keywords Flammulina velutipes . Pleurotus Eryngii.Pseudomonas putida. Pseudomonas marginais . 16SrRNA gene .
1.引言 (1)
1.1课题研究背景 (1)
1.2课题国外研究状况 ............................................................................. 错误！未定义书签。
1.3常见细菌病害 (2)
1.4课题主要研究内容 (2)
2. 材料与方法 (3)
2.1主要仪器和培养基 (3)
2.1.1主要仪器....................................................................................... 错误！未定义书签。
2.1.2主要培养基................................................................................... 错误！未定义书签。
2.2病原菌的分离纯化............................................................................. 错误！未定义书签。
2.3病原菌的形态观察及染色................................................................. 错误！未定义书签。
2.4病原菌的生理生化性状..................................................................... 错误！未定义书签。
2.4.1葡萄糖氧化发酵作用的测定....................................................... 错误！未定义书签。
2.4.2氧化酶 (4)
2.4.3色素的产生 (4)
2.4.4接触酶 (4)
2.4.5甲基红试验（M.R.试验） (5)
2.4.6乙酰甲基甲醇试验（V.P.试验） (5)
2.4.7产生吲哚试验 (5)
2.4.8水解七叶灵 (6)
2.4.9明胶水解 (6)
2.4.10水解淀粉 (6)
2.4.11反硝化作用 (7)
2.4.12硝酸盐还原试验 (7)
2.4.13碳源的利用 (8)
2.4.14卵磷脂酶测定 (8)
2.4.15精氨酸双水解反应 (8)
2.5运动性的检查..................................................................................... 错误！未定义书签。
2.616S R DNA序列测定与分析............................................................... 错误！未定义书签。
2.6.1 变性 (8)
2.6.2 PCR 扩增 (8)
2.6.3测序 (8)
2.7抑菌剂的筛选 (9)
3．结果与分析 (10)
3.1病原菌的固体培养特征 (10)
3.2病原菌的个体形态特征 (11)
3.316S R DNA序列分析 (13)
3.3.1菌株S1的16S rDNA序列分析 (13)
3.3.2菌株S2的16S rDNA序列分析 (14)
3.4病原菌的生理生化性状 (17)
3.4.1菌株S1的生理生化特征 (17)
3.4.2菌株S2的生理生化特征 (18)
3.5抑菌剂的筛选 (20)
参考文献 (23)
致谢 (24)
1．引言
1.1课题研究背景
杏鲍菇Pleurotus eryngii日名“雪茸”隶属于伞菌目(AgaricaIes)，侧耳科(Pleurotaceae)，侧耳属(Pleurotus)。杏鲍菇以其“香味浓郁似杏仁、味道鲜美如鲍鱼一而得名，子实体硕大粗壮、营养丰富、菌柄洁白、菌肉肥厚、质地脆嫩，既可保鲜加工，又可与鱼、肉等合一烹饪，是近年来中国重点开发的珍稀菇种之一[1]。
近年在杏鲍菇工厂化生产过程中出现了严重的污染菌，有些菇农种植的杏鲍菇其污染率超过了50％以上，杏鲍菇生产因污染菌造成的损失达亿元以上。目前在杏鲍菇栽培过程中, 一些细菌性病害已成为生产中的一大障碍, 严重时几乎全部失败。多年来, 我们研究对造成杏鲍菇病害的细菌对指导食用菌生产具有一定的现实意义, 对提高杏鲍菇栽培的产量、质量和效益发挥了很大作用。
1.2课题国外研究状况
细菌性病害的报道最早是1926年，但病原的确定则在30年代初，https://www.doczj.com/doc/b116576051.html,mbert和Bull 首先鉴定了蘑菇细菌性斑点病的病原菌为托拉斯荧光假单孢杆菌。后来美国、法国、丹麦、英国、德国、荷兰、澳大利亚等国相继报道，并推广用漂白粉水溶液进行防治。由于蘑菇细菌性病害分布广、危害重，1982年在英垦的温室作物研究所召开了细菌性斑点病的国际会议，专门讨论蘑菇细菌性病害问题。此后,有关细菌性斑点病的研究向深度和广度展开。其中英国学者W.C.Wong和T.F.Preece连续发表多篇论文，包括用人工接种方法确定菇蕾表面形成菌落的细荫数量和菇蕾直径大小与症状出现的关系、多种杀菌剂对病原细菌的作用及其对子实体的毒害、次氯酸钠防治细菌性斑点病的有效浓度等。比利时学者M．GOOT等人应用现代生物技术对分离到的20多个菌株进行了比较鉴定后分成7个类型。我国除对蘑菇细菌性病害研究外，还报道了平菇细菌性褐斑病及细菌性腐烂病，金针菇细菌性锈斑病等，防治上通过合理喷水保湿和及时通风等措施可有效控制病害的发生[2]。
1.3常见细菌病害[3]
1.3.1细菌性斑点病, 又叫细菌性褐斑病,主要危害蘑菇和平菇。
发病症状局限于菌盖上, 菌盖初期出现水渍状小斑点, 渐渐变成黄褐色并扩大成小斑, 不规则, 凹陷, 凹陷处呈棕褐色。湿度大时, 凹斑内有粘稠的菌液, 当病斑干后,菌盖往往开裂。
病原该病由托拉斯假单胞杆菌引起。
1.3.2细菌性软腐病主要危害平菇、金针菇、杏鲍菇[4], 极为严重。
发病症状初期在菌盖边缘出现水渍状, 后期遍及整个菌盖乃至菌柄, 子实体渐变褐, 有时菌盖边缘向内翻卷, 整个子实体似水烫伤, 逐渐软腐, 很粘, 湿度大时, 菌盖上可见乳白色菌浓。
病原据鉴定, 细菌性软腐病是由一种萤光假单胞杆菌引起。
1.3.3干腐病主要危害蘑菇。
症状染病菇畸形、褐色, 典型特征是菌盖歪斜, 菇柄基部稍膨大, 但不腐烂, 逐渐萎缩、干枯, 发病严重时, 菌柄全部变褐色。病菇的另一显著特点是菌柄基部, 均带有较多的泥团。
病原该病由一种假单孢杆菌引起。
1.3.4蘑菇细菌性褐斑病。
发病症状发病的菇体先在菌盖表面产生褐色斑块, 随着菇体的生长, 褐斑逐渐扩大, 深入菌盖, 直至整个子实体全部变褐至黑褐, 而萎缩死亡, 最后腐烂。
病原该病原经鉴定为甘蓝黑腐黄单胞杆菌引起。
1.4课题主要研究内容
从杏鲍菇生产厂（昆山正兴食用菌有限公司）中污染的生产包分离纯化，得到纯菌落；查阅资料，做相关的生理生化实验；提取相关基因，测序，比对，鉴定实验菌的种类；查阅相关资料，考察不同的抗生素对实验菌的药性，找出对该实验菌的防治措施。
2. 材料与方法
2.1 主要仪器和培养基
2.1.1主要仪器
超净工作台
光学显微镜
细菌鉴定系统
2.1.2主要培养基
牛肉膏蛋白胨：牛肉膏3g，NaCl 5g，蛋白胨10g，水1000ml, pH 7.2-7.4
2.2 病原菌的分离纯化
取一株病态（表面突起泛黄，有水珠）的杏鲍菇（10 g）置于90 mL无菌生理盐水，振荡20 min，稀释100倍，涂于牛肉膏蛋白胨培养基上。培养24h后，挑去出现的单菌落，采用平板划线分离法，进行病原菌的分离纯化，纯化培养菌株2个，分别记为：S1、S2。
将菌株保存在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上备用，使用时转至牛肉膏蛋白胨培养基上活化。
2.3 病原菌的形态观察及染色
将病原菌在牛肉膏蛋白胨培养基上30℃培养24 h后，观察牛肉膏蛋白胨平板菌落形态、牛肉膏蛋白胨斜面菌苔形态、肉汁冻液体培养基中的生长情况。用革兰氏染色，芽孢染色，用光学显微镜在油镜下观察细菌的形态[5,6]。
2.4 病原菌的生理生化性状
参照文献[5,7,8,9]
2.4.1葡萄糖氧化发酵作用的测定
本试验采用休和利夫森二氏培养基，其配方如下：蛋白胨2g，NaCl 5g，K2HPO4 0.2g，葡萄糖10g，蒸馏水1000ml，1％溴麝香草酚蓝水溶液3ml，pH7.0-7.4
用接种环挑取少量菌种于试管中培养24-48h。与空白管对照比较，如培养基颜色保持原有颜色，则表示该菌不能利用某种糖；如培养基变黄色，则表明该菌能分解某种糖产酸；如如培养基变黄色而且杜氏小管内有气泡，表示该菌能分解糖产酸并产气。
2.4.2氧化酶
直接在菌苔上滴加盐酸二甲基对苯二胺(或盐酸对氨基二甲基苯胺)1％水溶液，不可过湿。在10秒钟内涂抹的菌苔现红色者为阳性，10-50s现红色者为延迟反应，60s以上现红色者不计，按阴性处理。
2.4.3色素的产生
修改金氏(King)等培养基配方如下：
金氏等A培养基金氏等B培养基
蛋白胨2g 2g
K2SO41g ―
甘油1g 1g
MgCl2 0.14g ―
K2HPO4 ―0.15g
MgSO4?7H20 ―0.15g
琼脂2g 2g
蒸馏水100ml 100ml
调PH为7.2，用新鲜菌种按种上述两种培养基上，于28-30℃培养1、2、3、5、7、14d观察。在普通光下检查非荧光色素，在紫外光下检查荧光色素。
2.4.4接触酶
将测定菌按种于适宜的斜面上，适温培养18-24h取一环培养18-24h的菌苗涂于于净的载破片上，然后滴上一滴3-10％的过氧化氢，若有气泡(氧气)，则为接触酶阳性反应，无气泡为阴性反应。
2.4.5甲基红试验（M.R.试验）
培养基：:蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO4 5g，水1000ml，每管分装4-5ml
接种试验菌于以上培养液中，每次二个重复，置适温培养2、4、5d(如为阴性可适当延长培养时间)。肠杆菌科的菌要求在37℃培养4d检查。在培养液中加入一滴甲基红试剂，红色为甲基红试验阳性反应，黄色为阴性反应(因甲基红变色范围4.4红-6.0黄)。
2.4.6乙酰甲基甲醇试验（V.P.试验）
培养基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，K2HPO4 5g，水1000ml，pH7.0-7.4，每管分装4-5ml 接种试验菌于以上培养液中，每次2个重复，置适温培养2d．6d。取培养液和40％NaOH等量相混，加少许肌酸，l0min如培养液出现红色，即为试验阳性反应，有时需要放置更长时间才出现红色反应。可将培养液置48-50℃水浴中处理2h充分摇动，在4h内出现红色者为阳性反应。
2.4.7产生吲哚试验
培养基：蛋白胨10g ，NaCl 5g，水100ml，调pH7.2-7.4，分装试管中把新鲜的菌种接种于上述培养基中，于37℃培养。
培养1、2、4、7d的培养液，沿管壁缓缓加入0.5-1毫升的乙醚至培养液，充分震荡，使乙醚分散于液体中，将培养液静置片刻，待乙醚浮至液面后再加吲哚试剂。如培养液中有吲哚时，吲哚可被提取在乙醚层中。浓缩的吲哚和试剂反应，乙醚层出现玫瑰红色，此反应为阳性，反之为阴性。
2.4.8水解七叶灵
培养基：:在牛肉膏蛋白胨培养基中添加0.1％的七叶灵和0.05％的柠檬酸铁制成平板取新鲜菌种接种后，适温培养3、7、14d观察。产黑褐色色素者为阳性，不产黑褐色素者为阴性。
2.4.9明胶水解
培养基：蛋白胨5g，明胶100-150g，水1000ml，pH 7.2-7.4，分装试管，培养基高度约为4-5厘米
取18-24h的斜面培养物作穿刺接种,并有未接种的空白对照。于20℃温箱中培养，2、7、10、14和30d在20℃以下的室温观察茵的生长情况和明胶是否液化。如菌已生长，明胶表面无凹陷且为稳定的凝块，则为明胶水解阴性。如明胶凝块部分或全部在20℃以下变为可流动的液体，则为明胶水解阳性。如菌已生长，明胶末液化，但明胶表面菌苗下出现凹陷小窝(须与未接种的对照管比较，因培养过久的明胶因水份失散也会凹陷)也是轻度
水解，按阳性记录。若细菌未生长，则或是不在明胶培养基上生长，或是基础培养基不适宜。
2.4.10水解淀粉
培养基：在肉汁陈洋菜培养基中添加0.2％的可溶性淀粉，按倒平板的要求分装
将上列培养基倒成平板，凝固后将培养皿倒置室温自温箱中过夜。取新鲜种菌点种，适温培养。培养2-5d，形成明显菌落后，在平板上滴加碘液。平板呈蓝黑，菌落四周围如不变色或移开菌落后摘加新碘液，菌落下琼脂仍不变色，表示淀粉水解阳性；如变色则为阴性。
2.4.11反硝化作用
培养基：肉汁胨培养液100ml，KNO3 lg，调pH7.2-7.4，分装试管，每管高度约5cm 用肉汁胨斜面菌苔为菌种，接种环接种后用凡士林油封管，同时也要以封油的不含硝酸钾的培养基做对照。培养1～7d，观察含有硝酸钾的培养基中有无气泡，如产生气泡表示有反硝化作用产生氨气，是阳性反应；如不含硝酸钾的对照培养基也产生气泡则只能按可疑或阴性处理，不产生气泡为阴性。
2.4.12硝酸盐还原试验
培养基配方：肉汁胨培养液100ml，KNO3 lg，pH7.0-7.6，每管分装4-5ml
试剂：(1)格里斯氏试剂(2)二苯胺试剂
将测定菌接种于硝酸盐液体培养基中，置适温培养1、3、5d。每株菌做3个重复，另留两管不接种作对照。在两支干净的空试管中倒入少许培养1、3、5d的培养液，再各加一滴A液及B液，在对照管中同样加入A液，B液各一滴。结果观察：当培养液中滴入A、B液后，溶液如变为粉红色、玫瑰色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。如无红色出现，则可加入一、二滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，则表示培养液中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用：如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其它物质，故仍按硝酸盐还原阳性处理。
2.4.13碳源的利用
培养基：(NH4)2SO4 2.0g，NaH2PO4? H2O 0.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4? 7H2O 0.2g，CaCl2? 2H2O 0.1g，蒸馏水1000ml，含碳化合物0.5％，pH 6.5±0.1。
用菌体悬液，每一个测定菌都须接种未加合碳化合物的空白基础培养基作为对照。适温培养2、5、7、14天观察。凡测定菌在合有碳水化合物培养基中的生长情况明显超过空白基础培养基的生长情况者为阳性。否则为阴性。如两种培养基上的生长情况差别不明显，可在同一培养基上连续移种三次。如生长差别仍不明显，则按阴性处理。
2.4.14卵磷脂酶测定
培养基：无菌条件下取卵黄加等量的生理盐水，摇匀后，取10ml上述悬液加入到融化的、约50-55℃的200ml牛肉膏蛋白胨中，混合均匀后倒人培养皿内。制成的卵黄平板过夜后即可使用。
取18-24h的斜面或培养液中的菌体点种在上述平板上。在菌落四周围和下面有不透明的区出现，表示卵磷脂分解生成脂肪，说明有卵磷脂酶。
2.4.15精氨酸双水解反应
培养基：蛋白胨1g，酚红0.01g，牛肉膏5g，L-精氨酸盐10g，K2HP04 0.3g，蒸馏水1000ml，琼脂6g，pH7.0-7.2，分装试管，高度约4-5cm。
用幼龄菌种穿刺接种，并用凡士林油封管，适温培养3、7、14天观察。培养基转为红色者为阳性，应有不含精氨酸空自做对照。
2.5 运动性的检查
半固体琼脂穿刺法。用直引穿刺接种试验菌于半固体培养基内，于适温培养。细菌的运动性可用透过光目测。如生良物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性。如生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩放，其边缘呈云雾状，则表示试验菌株有运动性。对生长快的细菌应培养一天后观察。如第一第不能判定可在第2—3天再观察。如2—3天时仍不能明确判定是否有运动性，可延迟到5—6天再观察一次。因为游动力弱的细菌，在半固体培养基中第1-2天中尚不能从穿刺线游开，故需多培养几天观察。如实验菌在半固体培养基中产气，气泡将穿刺线上的生长物挤乱。此时应注意生长物的扩散情况，不可误将不运动的细菌判为有运动性。如试验菌品好痒细菌．穿刺线上生长物很少，可检
查从培养基表面向下渗入的生长物的情况。
2.6 16S rDNA 序列提取及测序
委托宝生物工程（大连）有限公司测序 2.6.1 变性
在培养基中挑取菌体于50ul TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.D304)中变性后离心取上清作为模板。
反应条件： 80℃，15 min 2.6.2 PCR 扩增
使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit （Code No.D310），进行PCR 扩增目的片段。
反应条件： 94℃ 5 min 1 cycle
??
?
??
min 5.172min 155min 194℃℃℃ 30 cycles 72℃ 5 min 1 cycle 反应体系:
上述1 的变性反应液 1 ul PCR Premix
25 ul Forward primer(20pmol/ul) 0.5ul Reverse primer2(20pmol/ul) 0.5ul 16S-free H2O 23ul Total
50ul
取5 ul 进行3%琼脂糖凝胶电泳
使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0（Code No. D823A ）切胶回收目的片段进行DNA 测序。
2.6.3测序
以Seq Forward、Seq Internal 和Seq Reverse 为引物进行DNA 测序。
2.7 抑菌剂的筛选
2.7.1 细菌鉴定系统试剂卡药敏鉴定
使用细菌鉴定系统中的药敏试剂卡对病害菌进行多种抗生素的抑菌实验。取适量待检菌株置于药敏培养液中，用无菌加样滴管取药敏试验菌液加入药敏试验孔中，每孔加试验菌液150μl。盖上卡片盖板，将卡片置于35℃培养箱中，培养16-24h后，取出卡片，即可人工目测结果。
2.7.2常用抗生素抗性试验
采用滤纸片法，以抑菌圈的大小，测定杀菌效果。本试验采用纸碟法：取0.2ml用平板涂布法将菌混匀密布于生长培养基的平板，同时以无菌镊子取含抗生素的纸片于含菌平板上，置30"℃培养24-48h后，取出观察抑菌圈大小。读取结果，以所测抑菌圈的平均直径(mm)来表示药剂对细菌的抑菌力。(0-5mm)无作用，(6-15mm)弱作用，(>15mm)强抑制作用[14]。
3．结果与分析
3.1污染杏鲍菇样本的性状描述
图1 菌丝包和菇体样本污染图
Fig.1 The sample figure of pollution during mycelial and fruiting bodies growth 从图1可以看出，污染杏鲍菇的样本在菌丝生长阶段，在料袋上出现零星的黄色水珠，黏度不大，这一现象导致菌丝长满袋的时间延长5-7d；且这现象一般出现在袋口附近，缓慢向下蔓延至整个料包的1/4为止。出现这种现象的料包在菌丝长满之后进入出菇环节，经过正常的消毒环节后，会长出子
实体，但随着子实体的增大，菇体会出现大量黄色粘稠状水珠，随着培养时间的延长，被污染的菇体最终会腐烂，而与之接触的健康菇体也会被感染出现相同的症状。
在菌丝生长阶段，若在无菌条件下去除黄色水珠，会大幅度降低后期菇体的污染情况以及推迟出现黄色粘稠液体的时间。因此断定，菌丝生长阶段出现的黄色水珠与后期在子实体上的黄色液体为同一菌株的胞外分泌物。
3.2 污染病原菌的分离
分别挑去菌丝料包上的水珠和污染菇体，进行涂布培养。结果表明，两个样本的培养结果类似，均出现了两种细菌，证实了这一污染现象是由两种微生物引起，分别为CTE 722-B和CTE 722-C；只是两者比例有差异，前者CTE 722-C较多，CTE722-B较少，后者则反之。在培养基培养24h，CTE722-B 为半透明、淡黄色的圆形菌落，表面隆起，边缘略粗糙；CTE722-C为半透明、乳白色的圆形菌落，边缘整齐光滑；CTE722-B的菌落直径较CTE722-C 的大。
图2 涂布培养结果
Fig.2 The result of polluted sample coated culture
病原菌的固体培养特征
2个菌株在牛肉膏蛋白胨平板上生长24h后，观察其形态特征见表3.1
表3.1 菌株S1、S2在4种固体培养基上的培养特征比较
培养基菌株
S1 S2
营养琼脂菌落圆形，半透明，乳白色，表面多皱，
隆起，边缘略粗糙菌落圆形，半透明，乳白色，边缘整齐，光滑发亮
LB琼脂菌落圆形，半透明，杏仁白色，表面光
滑湿润，平坦，边缘平整菌落圆形，半透明，乳白色，表面光滑湿润，平坦，边缘平整
金氏等A培养基无水溶性产生无水溶性产生CTE 722-B
CTE 722-C
金氏等B培养基无非水溶性色素产生无非水溶性色素产生
3.2 病原菌的个体形态特征
通过普通光学显微镜对菌株S1、S2的菌体形态进行观察，结果（见表3.2、图3.1、图3.2、图3.3）
表3.2 菌株S1、S2个体形态的比较
染色方法菌株
S1 S2
革兰氏染色革兰氏阴性，短杆状革兰氏阴性，短杆状，近似球状
芽孢染色无芽孢无芽孢
图3.3 菌株S1的芽孢染色结果
3.3 16S rDNA序列分析
为进一步确定菌株的分类位置，对其16S rDNA序列进行了分析，结果见表下表3.3.1菌株S1的16S rDNA序列分析
表3.3菌株S1的16S rDNA序列
ACGCTGGCGG CAGGCCTAAC ACATGCAAGT CGAGCGGATG AGAAGAGCTT 50 GCTCTTCGAT TCAGCGGCGG ACGGGTGAGT AA TGCCTAGG AATCTGCCTG 100 GTAGTGGGGG ACAACGTTTC GAAAGGAACG CTAA TACCGC ATACGTCCTA 150 CGGGAGAAAG CAGGGGACCT TCGGGCCTTG CGCTATCAGA TGAGCCTAGG 200 TCGGA TTAGC TAGTTGGTGA GGTAATGGCT CACCAAGGCG ACGATCCGTA 250 ACTGGTCTGA GAGGATGATC AGTCACACTG GAACTGAGAC ACGGTCCAGA 300 CTCCTACGGG AGGCAGCAGT GGGGAATATT GGACAA TGGG CGAAAGCCTG 350 ATCCAGCCAT GCCGCGTGTG TGAAGAAGGT CTTCGGA TTG TAAAGCACTT 400 TAAGTTGGGA GGAAGGGCAT TAACCTAA TA CGTTAGTGTT TTGACGTTAC 450 CGACAGAATA AGCACCGGCT AACTCTGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACAG 500 AGGGTGCAAG CGTTAATCGG AA TTACTGGG CGTAAAGCGC GCGTAGGTGG 550 TTTGTTAAGT TGGATGTGAA AGCCCCGGGC TCAACCTGGG AACTGCATCC 600 AAAACTGGCA AGCTAGAGTA CGGTAGAGGG TGGTGGAATT TCCTGTGTAG 650 CGGTGAAATG CGTAGA TA TA GGAAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGACCAC 700 CTGGACTGAT ACTGACACTG AGGTGCGAAA GCGTGGGGAG CAAACAGGAT 750 TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGTCAACTA GCCGTTGGAA 800 TCCTTGAGAT TTTAGTGGCG CAGCTAACGC ATTAAGTTGA CCGCCTGGGG 850 AGTACGGCCG CAAGGTTAAA ACTCAAATGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA 900 GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG 950 CCTTGACATG CAGAGAACTT TCCAGAGATG GA TTGGTGCC TTCGGGAACT 1000 CTGACACAGG TGCTGCA TGG CTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG 1050 GTTAAGTCCC GTAACGAGCG CAACCCTTGT CCTTAGTTAC CAGCACGTTA 1100 TGGTGGGCAC TCTAAGGAGA CTGCCGGTGA CAAACCGGAG GAAGGTGGGG 1150 ATGACGTCAA GTCA TCA TGG CCCTTACGGC CTGGGCTACA CACGTGCTAC 1200 AA TGGTCGGT ACAGAGGGTT GCCAAGCCGC GAGGTGGAGC TAATCTCACA 1250 AAACCGATCG TAGTCCGGA T CGCAGTCTGC AACTCGACTG CGTGAAGTCG 1300 GAATCGCTAG TAATCGCGAA TCAGAA TGTC GCGGTGAATA CGTTCCCGGG 1350 CCTTGTACAC ACCGCCCGTC ACACCA TGGG AGTGGGTTGCA CCAGAAGTAG 1400 CTAGTCTAAC CTTCGGGAGG ACGGTTACCA CGGTGTGATT CA TGACTGGG 1450
结果：根据以上各个结果，得出：S1菌株为假单胞菌属3.3.2菌株S2的16S rDNA序列分析
表3.4 菌株S1的鉴定结果
Accession Description Max
score Total
score
Query
coverage
E
value
Max
ident
HQ218609.1 Uncultured bacterium clone N-167 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
Pseudomonas sp. BSw10041N 16S ribosomal
RNA, partial sequence
2680 2680 100% 0.0 100%
FJ416144.1 >gb|JF345181.1| Pseudomonas sp. PG12 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
2680 2680 100% 0.0 100% EU807744.1 Pseudomonas sp. WMQ-7 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2680 2680 100% 0.0 100%
DQ088809.1 Uncultured bacterium clone MP104-0916-b40
16S ribosomal RNA gene, partial sequence
2680 2680 100% 0.0 100%
DQ366089.1 Uncultured Pseudomonas sp. clone SQ9_Pitesti
16S ribosomal RNA gene, partial sequence
2680 2680 100% 0.0 100% AB109776.1 Pseudomonas putida gene for 16S rRNA, partial
sequence, strain: KF715
2680 2680 100% 0.0 100% AB680572.1 Pseudomonas putida gene for 16S rRNA, partial
sequence, strain: NBRC 14164
2676 2676 100% 0.0 99%
AB240201.1 Pseudomonas sp. OCR2 gene for 16S rRNA,
partial sequence
2676 2676 100% 0.0 99% AF094736.1 Pseudomonas putida strain ATCC 12633 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
2676 2676 100% 0.0 99%
HQ218451.1 Uncultured bacterium clone N-07 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2675 2675 100% 0.0 99% EU341207.1 Uncultured Pseudomonas sp. clone A V_5N-G03
16S ribosomal RNA gene, partial sequence
2675 2675 100% 0.0 99%
AY344806.1 Pseudomonas sp. WSCIII 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2675 2675 100% 0.0 99% AF094745.1 Pseudomonas putida strain ATCC 11172 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
2675 2675 100% 0.0 99%
JN229867.1 Uncultured bacterium clone 1H3C_22 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
2669 2669 100% 0.0 99% HM755541.1 Pseudomonas sp. C-S-NA6 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2669 2669 100% 0.0 99% HQ218605.1 Uncultured bacterium clone N-163 16S
ribosomal RNA gene, partial sequence
2669 2669 100% 0.0 99%
表3.5菌株S2的16S rDNA序列
ACGCTGGCGG CAGGCCTAAC ACATGCAAGT CGAGCGGTAG AGAGAAGCTT 50 GCTTCTCTTG AGAGCGGCGG ACGGGTGAGT AA TGCCTAGG AA TCTGCCTG 100 GTAGTGGGGG ATAACGTTCG GAAACGGACG CTAATACCGC ATACGTCCTA 150 CGGGAGAAAG CAGGGGACCT TCGGGCCTTG CGCTA TCAGA TGAGCCTAGG 200 TCGGATTAGC TAGTTGGTGG GGTAA TGGCT CACCAAGGCG ACGATCCGTA 250 ACTGGTCTGA GAGGATGATC AGTCACACTG GAACTGAGAC ACGGTCCAGA 300 CTCCTACGGG AGGCAGCAGT GGGGAATATT GGACAATGGG CGAAAGCCTG 350 ATCCAGCCAT GCCGCGTGTG TGAAGAAGGT CTTCGGATTG TAAAGCACTT 400 TAAGTTGGGA GGAAGGGTTG TAGATTAA TA CTCTGCAA TT TTGACGTTAC 450 CGACAGAATA AGCACCGGCT AACTCTGTGC CAGCAGCCGC GGTAA TACAG 500 AGGGTGCAAG CGTTAATCGG AA TTACTGGG CGTAAAGCGC GCGTAGGTGG 550 TTTGTTAAGT TGGATGTGAA ATCCCCGGGC TCAACCTGGG AACTGCATTC 600 AAAACTGACT GACTAGAGTA TGGTAGAGGG TGGTGGAATT TCCTGTGTAG 650 CGGTGAAATG CGTAGA TA TA GGAAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGACCAC 700 CTGGACTAAT ACTGACACTG AGGTGCGAAA GCGTGGGGAG CAAACAGGAT 750 TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGTCAACTA GCCGTTGGAA 800 GCCTTGAGCT TTTAGTGGCG CAGCTAACGC ATTAAGTTGA CCGCCTGGGG 850 AGTACGGCCG CAAGGTTAAA ACTCAAATGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA 900 GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG 950 CCTTGACATC CAATGAACTT TCCAGAGATG GA TTGGTGCC TTCGGGAACA 1000 TTGAGACAGG TGCTGCA TGG CTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG 1050 GTTAAGTCCC GTAACGAGCG CAACCCTTGT CCTTAGTTAC CAGCACGTAA 1100 TGGTGGGCAC TCTAAGGAGA CTGCCGGTGA CAAACCGGAG GAAGGTGGGG 1150 ATGACGTCAA GTCA TCA TGG CCCTTACGGC CTGGGCTACA CACGTGCTAC 1200 AA TGGTCGGT ACAGAGGGTT GCCAAGCCGC GAGGTGGAGC TAATCCCATA 1250 AAACCGATCG TAGTCCGGA T CGCAGTCTGC AACTCGACTG CGTGAAGTCG 1300 GAA TCGCTAG TAATCGCGAA TCAGAA TGTC GCGGTGAATA CGTTCCCGGG 1350 CCTTGTACAC ACCGCCCGTC ACACCA TGGG AGTGGGTTGC ACCAGAAGTA 1400 GCTAGTCTAA CCTTCGGGAG GACGGTTACC ACGGTGTGA T TCATGACTGG 1450
G 1500
表3.6 菌株S2的鉴定结果
Accession Description Max
score Total
score
Query
coverage
E
value
Max
ident
AB685670.1 Pseudomonas sp. JCM 5463 gene for 16S
ribosomal RNA, partial sequence
2680 2680 100% 0.0 100%
GQ417869.1 Uncultured Pseudomonas sp. clone F3Boct.13
16S ribosomal RNA gene, partial
sequence>gb|GQ417872.1| Uncultured
Pseudomonas sp. clone F3Boct.16 16S
ribosomal RNA gene, partial
sequence >gb|GQ417892.1| Uncultured
Pseudomonas sp. clone F3Boct.36 16S
ribosomal RNA gene, partial
sequence >gb|GQ417893.1|
Uncultured Pseudomonas sp. clone F3Boct.37
16S ribosomal RNA gene, partial sequence
2680 2680 100% 0.0 100%
GQ417867.1 Uncultured Pseudomonas sp. clone F3Boct.11
16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
2680 2680 100% 0.0 100%
EU681012.1 Pseudomonas sp. W15Feb29 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2680 2680 100% 0.0 100%
EU680983.1 Pseudomonas sp. W15Feb5 16S ribosom al
RNA gene, partial sequence
2680 2680 100% 0.0 100%
EU595584.1 Pseudomonas sp. LC07 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2680 2680 100% 0.0 100% AB334527.1 Pseudomonas sp. MPU 101 gene for 16S
ribosomal RNA, partial sequence
2680 2680 100% 0.0 100%
AM403527.1 Pseudomonas sp. EP25 16S rRNA gene 2680 2680 100% 0.0 100% AM398216.1 Pseudomonas sp. EP07 partial 16S rRNA gene,
strain EP07
2680 2680 100% 0.0 100% DQ490312.1 Pseudomonadaceae bacterium KVD-1700-18
16S ribosomal RNA gene, partial
sequence
2680 2680 100% 0.0 100%
DQ490314.1 Pseudomonadaceae bacterium KVD-1700-23
16S ribosomal RNA gene, partial
sequence >gb|DQ490315.1| Pseudomonadaceae
bacterium KVD-1700-25 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence >gb|DQ490316.1|
Pseudomonadaceae bacterium KVD-1700-26
16S ribosomal RNA gene, partial sequence
2680 2680 100% 0.0 100%
AB685618.1 Pseudomonas sp. JCM 5405 gene for 16S
ribosomal RNA, partial sequence
2676 2676 100% 0.0 99%
FN553609.1 Uncultured sediment bacterium 16S rRNA gene,
2676 2676 100% 0.0 99% clone 285-26
2675 2675 100% 0.0 99% AB680980.1 Pseudomonas fluorescens gene for 16S rRNA,
partial sequence, strain: NBRC 15841
2675 2675 100% 0.0 99% JF766689.1 Pseudomonas sp. BIHB 1312 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
GU198127.1 Pseudomonas fluorescens strain LMG 14677
2675 2675 100% 0.0 99% 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
结果：根据以上各个结果，得出：S1菌株为假单胞菌属
3.4 病原菌的生理生化性状
3.4.1菌株S1的生理生化特征
常规生理生化测试表明，菌株S1氧化利用葡萄糖，不能发酵葡萄糖乙醇产酸，接触酶为阳性，氧化酶为阴性。参照《伯杰氏细菌鉴定手册第八版》和《常见细菌鉴定手册》[7,9]，断定菌株S1为假单胞菌属的细菌。参照上述细菌分类鉴定手册对假单胞菌的鉴定方法，进行了其他生理生化试验，并和Pseudomonas的细菌进行比较，结果见表
表3.7菌株S1生理生化测定结果
实验项目S1 P.putida H262 P.putida biovar A 氧化分解葡萄糖+ + +
氧化酶- + +
接触酶+ + +
乙醇氧化- / -
产生吲哚试验- - -
还原硝酸盐反应+ + +
反硝化作用- - -
明胶液化- / -
淀粉水解-
精氨酸双水解酶+ + +
乙酰甲基甲醇试验（V.P.试验）- - -
甲基红试验（M.R.试验）- - -