中国组织工程研究与临床康复
第 15 卷 第 6 期 2011–02–05 出版
February 5, 2011 Vol.15, No.6
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research
大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定*★
李晓峰，赵劲民，苏 伟，范 锲，罗世兴，马爱国
Primary culture and identification of rat osteoblasts
Li Xiao-feng, Zhao Jin-min, Su Wei, Fan Qie, Luo Shi-xing, Ma Ai-guo
Abstract
Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Li Xiao-feng★, Master, Attending physician, Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China xiaofengli74@ https://www.doczj.com/doc/bb14951948.html, Correspondence to: Zhao Jin-min, Doctor, Professor, Department of Traumatic Orthopaedics and Hand Surgery, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China zhaojinmin@https://www.doczj.com/doc/bb14951948.html, Supported by: the Key Scientific Research Program of Medical Health of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 200636* Received: 2010-07-23 Accepted: 2010-11-20
BACKGROUND: Tissue engineering requires a lot of seed cells. Osteoblasts have become an important seed cells in bone tissue engineering. However, there are the difficulties to derive osteoblasts and the different purity of osteoblasts was obtained. OBJECTIVE: To establish the methods of isolated culture and purification of neonatal rat calvarial osteoblasts, and to observe the biological characteristics of the osteoblasts from the skull. METHODS: Osteoblasts of Sprague-Dawley neonatal rats were primarily cultured and proliferated by the second enzyme digestion. Osteoblasts were purified by differential attachment method. Osteoblast proliferation and osteogenic activity were identified by morphology, alkaline phosphatase detection, Alizarin red staining and calcium nodules Von kossa staining, ultrastructure and cell proliferation curve. RESULTS AND CONCLUSION: Primarily cultured calvarial osteoblasts could proliferate by the secondary source of enzyme digestion. The amplification cells showed representative morphological and biological characteristics of osteoblasts. Alkaline phosphatase, Alizarin red staining and calcium nodules Von kossa staining presented positive results. Ultrastructural features appeared as high-differentiated active osteoblasts. Cell proliferation curves showed active cells. Results indicated that calvarial osteoblast of Sprague-Dawley rat has good proliferation and osteogenic activity and can be continuously passaged, with high purity, cell biological characteristics of stability. Calvarial osteoblast is suitable for experiment in vitro. Li XF, Zhao JM, Su W, Fan Q, Luo SX, Ma AG. Primary culture and identification of rat osteoblasts.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(6):990-994. [https://www.doczj.com/doc/bb14951948.html, https://www.doczj.com/doc/bb14951948.html,]
摘要
背景：组织工程需要大量的种子细胞，成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难，获得的 成骨细胞的纯度不一。 目的：建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法，观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。 方法：采用二次酶消化法对 SD 大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养，扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、 细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节 Von kossa 法染色、超微结构以及细胞增殖曲线，确定其增殖与成骨活性。 结果与结论：二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖，传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活 性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节 Von kossa 法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞，细胞增 殖曲线显示细胞生长活跃。提示，新生 SD 大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性，能连续传代增殖，纯度高， 细胞生物学特征稳定，适用于做体外实验研究。 关键词：成骨细胞；组织工程；原代培养；鉴定；形态学 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.06.010 李晓峰，赵劲民，苏伟，范锲，罗世兴，马爱国. 大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定[J].中国组织工程研究与临床康复，2011， 15(6):990-994. [https://www.doczj.com/doc/bb14951948.html, https://www.doczj.com/doc/bb14951948.html,]
用二次酶消化法，应用碱性磷酸酶、钙化结节 0 引言 组织工程是研究、开发用于修复、维护、 促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态 的生物替代物的一门新兴学科。组织工程需要 大量的种子细胞，成骨细胞已成为骨组织工程 构建的重要种子细胞之一。随着组织工程学的 发展，成骨细胞的体外培养已成为骨组织工程 体外构建研究的基础。因成骨细胞包绕在致密 组织中，致使取材困难，虽然用组织块法、酶 消化法、骨膜组织块法、骨髓组织块法以及薄 层骨片经 EDTA 处理并经胶原酶消化均可分离 培养出成骨细胞,但是获得的成骨细胞的纯度不 一 。 实验采用新生乳鼠颅盖骨做试验材料， 采
[1]
染色、电镜超微结构观察鉴定成骨细胞，以生 长曲线进行成骨细胞增殖能力鉴定。期望建立 一种简单、快速、成活率高和纯度高的原代培 养方法，以获得大量成骨细胞，为骨组织工程 提供足够的种子细胞提供理论依据和实践经 验。 1 材料和方法 设计：细胞形态学与生物学特性实验。 时间及地点：于2009-07/2010-01在广西 医科大学基础医学院中心实验室完成。 材料：取新生24 h内SD大鼠乳鼠20只，不 计体质量、不分雌雄，由广西医科大学动物实
P.O. Box 1200, Shenyang 110004 https://www.doczj.com/doc/bb14951948.html,
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李晓峰，等. 大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定
https://www.doczj.com/doc/bb14951948.html, 广西医科大学第 一附属医院创伤 骨科手外科， 广西 壮族自治区南宁 市 530021 李晓峰★，男， 1974 年生，吉林 省德惠县人，汉 族，2005 年福建 医科大学毕业， 硕 士，主治医师，主 要从事创伤外科 手外科、 组织工程 方面的研究。 xiaofengli74@ https://www.doczj.com/doc/bb14951948.html, 通讯作者:赵劲 民，博士，教授， 广西医科大学第 一附属医院创伤 骨科手外科， 广西 壮族自治区南宁 市 530021 zhaojinmin@ https://www.doczj.com/doc/bb14951948.html,
中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:1673-8225 (2011)06-00990-05 收稿日期： 2010-07-23 修回日期： 2010-11-20 (20100723013/D·Q)
验中心提供，许可证号：SCXK(桂)2009-0002。 实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国 科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物 的指导性意见》标准 。
实验用试剂与仪器：
试剂及仪器 H-DMEM 培养基、胎牛血清 胰蛋白酶、青霉素、链霉素、 Ⅱ型胶原酶 H-500 型透射电子显微镜 JSW-T300 扫描电镜 SW-CJ 型生物洁净工作台 CO2 培养箱 倒置相差显微镜 HITACHI JEOL 苏净集团安泰公司 Shellab Olympus 来源 Gibco Sigma
[2]
核固红复染细胞核， 自然干燥后中性树胶封固。 阳性细胞可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸 酶活性部位。 钙化结节染色(茜素红法)： 细胞接种方法同 上，弃培养基，培养板用PBS冲洗2次，体积分 数95%乙醇固定30 min， 蒸馏水冲洗3次， 0.1% 茜素红[茜素红-Tris-Hcl(pH 8.3)]染色，37 ℃， 30 min，蒸馏水冲洗。低倍镜视野(×40)下进行 矿化结节观察。 Von Kossa’s矿化结节染色法： 细胞接种方 法同上，弃培养基，培养板用 PBS 冲洗2 次， 40 g/L多聚甲醛固定标本，5%硫代硫酸钠孵育 30 min，蒸馏水冲洗，然后用1%硝酸银溶液紫 外线下染色30 min，蒸馏水冲洗掉浮于细胞表 面 的 黑 色物质 ， 继 续用 5% 硫 代 硫 酸钠 染 色 2 min，1%中性红复染10 min，蒸馏水漂洗后 观察。 成骨细胞扫描电镜表面形态观察： 培养24 h 后取出预先置培养板内的圆盖玻片(直径 9 mm)，用PBS冲洗3次，加入3%戊二醛固定 2 h； 用PBS冲洗3次， 45 min/次。 加入1%锇酸， 固定2 h。体积分数为50%，70%，80%，90%， 95% 的乙醇逐级脱水，各 15 min ；体积分数 100% 乙醇脱水 2 次 (15 min/ 次 ) 。醋酸异戊酯 15 min。CO2临界点干燥，黏附于载物台上真 空镀膜仪镀金，扫描电镜观察并摄片。 成骨细胞透射电镜超微结构观察：消化收 集细胞， 1 000 r/min离心5 min弃上清； 前固定： 加入预冷的固定液3%戊二醛固定2 h。漂洗： 弃戊二醛，将细胞团块挑出，包入擦镜纸内， 装入小瓶中，加入PBS过夜。去除液体，PBS 漂洗，重复3次(每隔15 min 1次)。后固定：清 洗后，加入1%锇酸固定3 h。漂洗：弃去锇酸， 加入0.1 mol/L的PBS漂洗，步骤同上。乙醇逐 级脱水，丙酮浸透。包埋，修块，切片，醋酸 铀-柠檬酸铅双染，透射电镜观察并摄片。 生长曲线测定： 将生长状态良好的SD乳鼠 成骨细胞传至96孔培养板， 接种密度5×103/孔， 将培养板移入CO2孵箱中，在37 ℃、体积分数 5% CO2及饱和湿度条件下培养。 每孔加入MTT 溶液(5 g/L)20 μL，37℃孵箱中继续孵育4 h， 终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加 入150 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分 溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上 测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴， 光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。 主要观察指标： 主要观察成骨细胞的形态、
方法：
成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠
的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组 织。用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培 养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎 块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入 孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液， 加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消 化90 min，1 000 r/min离心10 min，使细胞沉 淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除 骨碎片。所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血 清、 100 U/mL 青霉素， 100 mg/L 链霉素的 DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多 个25 cm 培养瓶。 于37 ℃， 含体积分数5%CO2 培养箱培养。48 h后换液，以后隔日换液1次。
成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过
2
程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度 长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。 将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞 悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。
成骨细胞鉴定：
活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置 相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍 照。 Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整 细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板 中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。待细 胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇 固定10 min，Giemsa染液染2 min，蒸馏水冲 洗，显微镜下观察拍照。 碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞 接种方法同上， 体积分数95%乙醇固定30 min， 按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。
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李晓峰，等. 大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定
成骨细胞特征性染色、超微结构及生长曲线。 统计学分析：由第一作者采用SPSS 13.0统计软件 进行处理，计量数据以求均数加标准差检验方法。软件 来源为美国SPSS公司。 2 结果 2.1 大鼠成骨细胞原代培养和传代培养的活细胞观察
现，细胞膜及胞浆内颗粒染色呈蓝黑色颗粒，块状深染 颗粒，见图3。
成骨细胞细胞植入 24 h 后细胞充分铺展，形态多样， 呈三角形、梭形、多角形等不规则形。细胞伸展，有长 短不一的突起，可见胞核。胞质丰富，有时可见 2 个细 胞核，呈集落样生长趋势，集落中心细胞排列紧密甚至 重叠。随着细胞增殖，可呈复层生长，见图 1。 2.4 茜素红染色 ( 钙化结节染色 ) 细胞汇合时均呈多 层重叠生长，细胞局部堆集成灶状，形成钙结节，茜素 红染色钙结节染成橘红色，见图4。
Figure 3 Blue-black particle could be found in cytoplasm and envelope of the second passage of osteoblasts (Alkaline phosphatase staining,×100) 图 3 成骨细胞第 2 代显示包膜、胞浆中有蓝黑色颗粒(碱性 磷酸酶染色，×100)
a: After 2 d of culture, osteoblasts showed polygonal shape with long synapse (Arrow: nucleoli, ×100)
Arrow: calcium nodules could be stained in orange particles or massive precipitate
Figure 4
The second passage of osteoblasts (Alizarin red staining, ×40) 图 4 成骨细胞第 2 代(茜素红染色，×40)
b: After 6 d of culture (Arrow: osteoblasts formed nodules, ×40)
Figure 1 Osteoblasts of passage 2 图 1 第 2 代成骨细胞
2.5
Von Kossa’s 矿化结节染色法
成骨细胞进行
VonKossa 染色，看到了大量钙化结节形成，细胞聚集， 结节中央呈黑色，周边呈褐色，向周围颜色逐渐变淡， 见图 5。
2.2 Giemsa染色结果 成骨细胞多呈三角形或梭形， 胞浆丰富，染成紫蓝色，细胞核染成深蓝色，呈圆形或 卵圆形，位于细胞中央，有一两个核仁，核仁明显。见 图2。
Arrow: cell aggregation
Figure 5
The second passage of osteoblasts (Von Kossa staining, ×40) 图 5 第 2 代成骨细胞(Von Kossa 染色，×40)
Figure 2
After 2 d of culture, the second passage of osteoblasts (Giemsa staining, ×100) 图 2 成骨细胞第 2 代培养第 2 天(Giemsa 染色，×100)
2.6
成骨细胞扫描电镜表面形态观察
细胞呈多角
形，细胞立体感较好，表面有较多粗短的针状突起，与 2.3
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碱性磷酸酶活性检测
可见大量染色阳性细胞出
周围细胞突起连接成。见图6。
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基质或类骨质[2]。成骨细胞是活跃的成熟骨细胞，其能 合成有机基质并调节矿化过程，负责骨基质的合成、分 泌和矿化不断地进行着骨重建。成骨细胞的增殖先于成 骨细胞分化，而细胞增殖为进一步的再生成功起到了关 键作用[3]。同时，骨细胞不断地接收来自周围的细胞和 组织的信号，例如，通过激素和生长因子，来调节其增 殖，活性和存活[4-5]。
Figure 6 Observation of osteoblasts using scanning electron microscope (×2 000) 图 6 成骨细胞扫描电镜观察(×2 000)
成骨细胞的增殖率和生物活性控制着骨的形成，加 速成骨细胞的增长是有效修复骨缺损的关键因素。 Marinucci等[6]发现胶原能刺激成骨细胞的DNA合成。 一旦 成骨细胞生长活跃， 它们开始产生碱性磷酸酶， 并释放入 类骨质生成矿物质沉积。 碱性磷酸酶， 在碱性条件下水解 有机磷化合物的酯键，在骨骼钙化中起重要作用[7]。碱性 磷酸酶通常被作为成骨细胞活性最为广泛认可的生物 标志物[8-10]。已有证据表明，轻度减少碱性磷酸酶的表 达及其活性，将足以影响矿化形成过程[11-12]。原代培养 的成骨细胞矿物质沉积很快，在大约15 h完成[13]。有研 究表明细胞外基质具有高代谢活性，而非静态支架[14]。 选择最有成骨潜力的细胞是骨组织工程应用的一 个战略[15]。Hofstter等[16]已证明培养的成骨细胞，即使 是分化成熟的成骨细胞仍有多分化潜能，能转化为骨组
2.7
成骨细胞透射电镜超微结构观察
可见成骨细胞
内线粒体丰富，内质网扩张呈囊状，出现较多的基质小 泡、髓样体和空泡状结构，见图7。
Figure 7
Transmission electron microscope of osteoblasts (×2 800) 图 7 成骨细胞透射电镜观察(×2 800)
织、软骨组织和纤维组织。 然而，成骨细胞来源有限，需要通过体外扩增技术 的方法增加成骨细胞数量[17]。 成骨细胞培养是骨组织工 程及骨代谢形成机制研究的基础。自Peck等[18]于1964 年首次体外培养成骨细胞获得成功至今，对于成骨细胞 体外培养技术的研究日益深入，体外培养技术也日趋成 熟。培养标本的来源也较广泛，涉及骨、骨膜、骨髓及 骨外组织等 [19-20] 。虽然大鼠颅盖骨成骨细胞的体外培 养、纯化和鉴定技术已经成熟。但采用组织块培养法一 次获得的细胞量较少。胰蛋白酶的活性较强，消化时间
2.8
成骨细胞的生长曲线
接种第一、二天为细胞潜
伏适应期，第3~7天生长曲线基本为线性曲线，表明这 段时间是细胞的对数生长期，细胞数生长旺盛。第7天 后曲线变得平缓，细胞增殖明显减慢，进入平台期，见 图8。
0.55 0.50 A 490 nm 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Culture time (d)
过长会对细胞膜造成损害，但时间过短则不利于细胞从 骨质中分离出来[21]。胰酶可消化蛋白质、脂质等，胶原 酶只消化骨细胞周围的基质[22]。 应用消化能力较弱的胶 原酶，提高了细胞的成活率，可在短期内获得大量功能 良好的细胞。 实验采用新生24 h以内SD大鼠颅骨为组织来源的 成骨细胞培养，其来源广泛、经济，取材方便；采用二 次酶消化法，首先用胰酶对整块颅骨预消化，一方面可 以减少胰酶对成骨细胞的损伤，另一方面能使成纤维细 胞、破骨细胞、骨生成细胞首先脱落；剪碎后再用胶原 酶消化,这样能使更多的成骨细胞游离出来。传代时， 采 用差速贴壁法进一步纯化成骨细胞。使最终获得的成骨
Figure 8 图8
Growth curve of skull-derived osteoblasts of neonatal Sprague-Dawley rats SD 新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的生长曲线
3
讨论 骨是由矿化有机基质和骨细胞组成。骨发生开始于
细胞纯度高，活性好。
倒置显微镜下观察：成骨细胞植入24 h后细胞充分铺
展，形态多样，呈三角形、梭形、多角形等不规则形。 细胞形态膨大， 伸展出长短不一的突起， 胞核清晰可见。
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成骨细胞生成和Ⅰ型胶原分泌，构成了约90%的有机骨
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李晓峰，等. 大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定
传代后四五天进入指数生长期。细胞形态于其他学者 报道一致 [23]。成骨细胞生长曲线显示：成骨细胞 1~3 d 为延滞期， 4~8 d进入对数生长期，第 8天以后进入平 台期。 成骨细胞碱性磷酸酶活性检测可见大量细胞出现 阳性反应，说明培养的成骨细胞具有碱性磷酸酶活性。 矿化能力是成骨细胞的又一重要生物学特征
[24]
[15] [16] [17] [18]
。 茜素红
钙化结节染色法和Von Kossa’ s矿化结节染色法均为阳 性结节染色，证实所培养成骨细胞所形成的结节为钙化 结节。 成骨细胞扫描电镜观察细胞呈多角形，细胞立体感 较好，表面有较多粗短的针状突起；与周围细胞突起连 接成[25]。 透射电镜观察超微结构观察显示成骨细胞保持 典型成骨细胞超微结构特点，细胞器发达，含有大量内 质网，线粒体致密，内质网扩张呈囊状，出现较多的基 质小泡、髓样体和空泡状结构，显示为代谢活跃成骨细 胞。 本实验结果表明，二次酶消化法能够在更短时间内 获得大量的高纯度的成骨样细胞，细胞生物学特征稳 定，适用于做体外实验研究模型。 4 参考文献
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来自本文课题的更多信息-基金资助：广西医疗卫生重点科研项目(桂卫重
200636)：组织工程种子细胞的实验研究
[2]
作者贡献：设计为第一、三作者，实施为第一、四、五、
六作者，由第二作者进行评估，资料收集为第三作者，第一 作者成文，第二作者审校，第一、二作者对文章负责。
[3] [4] [5] [6]
致谢：感谢广西医科大学动物实验中心提供实验动物。
感谢陆永光博士对本研究提出的意见及支持。
利益冲突： 本课题不涉及厂家及相关雇主或其他经济组
织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理批准： 实验过程中对动物的处置符合中华人民共和
国科学技术部 2006 年颁布的《关于善待实验动物的指导性 意见》标准。
[7] [8]
本文创新性：
提供证据：检索 CNKI， PubMed 数据库，检索时间 2010-06 和检索关键词设定为：组织工程；成骨细胞；原 代培养；鉴定；形态学。 创新点说明： 随着组织工程学的发展， 成骨细胞的体外 培养已成为骨组织工程体外构建研究的基础。 因成骨细胞取 材困难， 获得的成骨细胞的纯度不一限制了成骨细胞的研究 与应用。实验通过成骨细胞的碱性磷酸酶、钙化结节染色、 电镜超微结构及绘制生长曲线的方式观察了成骨细胞的形 态学及生长过程中的形态学变化， 对体外培养大鼠成骨细胞 进行了较为全面的分析。
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P.O. Box 1200, Shenyang
110004
https://www.doczj.com/doc/bb14951948.html,
利用组织块可以成功地培养得到原代培养的人皮肤真皮成纤维细胞。培养中应该注意以下事项： ①一般皮肤主要取白手术过程中切除的部分组织，方法似外科取断层皮片手术操作，但组织一般2—3cm 即可，注意取材时不要用碘酒消毒．此外，不要切取太厚，要尽量去除皮下组织，如果皮下脂肪太厚会影响组织块的贴壁，不易于日后细胞的游出． ②尽量去除表皮，如有表皮未被完全剔除，则可能造成表皮细胞竞争生长，最为常见的为角质形成细胞的污染，它可以和成纤维细胞共同生长．虽说在今后的传代培养时可通过细胞纯化方法适当去除，但这种混和生长状态会对后续实验产生影响．所以，一旦发现细胞污染，应立即停止实验，重新培养． ③在剪切组织块时要注意保持组织块湿润，可向其表面滴加几滴培养液，要始终保持其成湿润状态，这一点要特别注意而且十分重要．剪切时要掌握好时间，尽量在短时间内完成． ④组织块在最初贴壁时不是很牢固，所以开始加液不应太多，以刚刚浸没组织块为易，特别要注意，在最初几天时要减少移动培养瓶次数，避免过多晃动而造成组织块脱壁，最好在开始3 d内不换液．⑤文献报告成纤维细胞培养多在CO 培养箱内进行，培养箱内环境为CO 浓度50 ml／L，湿度95％，培养瓶为开放式．因其湿度，温度及氧气与人体内实际情况较为接近，所以适合成纤维细胞的成长．但开放式培养的同时也增加了细胞培养污染的机率，所以，可以根据
自己实验室的条件选用合适的培养方法，如半开放式和充气后密闭瓶口，其效果也十分理想．但同时要密切观察培养液的pH变化，以保持适宜的酸碱度． ⑥细胞培养失败的最常见原因是污染，其中以微生物污染最常见，污染一旦明确，多数将无法救治，应尽快弃之，以防止污染扩大，影响其他细胞．因此，应在各个阶段严格遵守无菌操作原则，把好每一关口，尽可能禁止其他污染的物品进入操作环节，以避免造成时间、人力、物力的浪费．
山东财政学院 2009—2010学年第 1 学期期末考试《应用随机过程》试卷(A ) （考试时间为120分钟） 参考答案及评分标准 考试方式： 闭卷 开课学院 统计与数理学院 使用年级 07级 出题教师 张辉 一． 判断题（每小题2分，共10分，正确划√，错误划ⅹ） 1. 严平稳过程一定是宽平稳过程。（ⅹ ） 2. 非周期的正常返态是遍历态。（√ ） 3. 若马氏链的一步转移概率阵有零元，则可断定该马氏链不是遍历的。（ⅹ ） 4. 有限马尔科夫链没有零常返态。（√ ） 5．若状态i 有周期d, 则对任意1≥n , 一定有：0)(?nd ii p 。（ⅹ ） 二． 填空题（每小题5分，共10分） 1. 在保险公司的索赔模型中，设索赔要求以平均每月两次的速率的泊松过程到达保险公司，若每次赔付金额是均值为10000元的正态分布，一年中保险公司的平均赔付金额是＿＿240000元＿＿＿。 2．若一个矩阵是随机阵，则其元素满足的条件是：（1）任意元素非负（2）每行元素之和为1。 三． 简答题（每小题5分，共10分） 1． 简述马氏链的遍历性。 答：设) (n ij p 是齐次马氏链{}1,≥n X n 的n 步转移概率，，如果对任意 I j i ∈,存在不依赖于i 的极限0)(?=j n ij p p ，则称齐次马氏链{}1,≥n X n 具有遍历性。 2． 非齐次泊松过程与齐次泊松过程有何不同？
答：非齐次泊松过程与齐次泊松过程的不同在于：强度λ不再是常数，而是与t 有关，也就是说，不再具有平稳增量性。它反映了其变化与时间相关的过程。如设备的故障率与使用年限有关，放射物质的衰变速度与衰败时间有关，等等。 四． 计算、证明题（共70分） 1. 请写出C —K 方程，并证明之. （10分） 解： 2. 写出复合泊松过程的定义并推算其均值公式. （15分） 解：若{}0),(≥t t N 是一个泊松过程，是Λ,2,1,=i Y i 一族独立同分布的随机变量，并且与{}0),(≥t t X 也是独立的， )(t X =∑=t N i i Y 1，那么{}0),(≥t t X 复合泊松过程
实验-小鼠成纤维细胞的原代培养 一.实验目的 1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养中的取材、消化及无菌操作等基本实验技术和操作过程。 2 ?熟悉在倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况的方法。 3?了解细胞原代培养与传代培养的原理和方法。 二.实验原理 自17世纪下半叶Robert Hooke提出"细胞”概念直至20世纪中叶，细胞培养(CeIl CUltUre )才逐渐发展起来。现代生命科学以及相关领域的研究前提是细胞的维持和增殖，因此，细胞培养不仅是细胞生物学的密不可分的组成部分，而且已经成为生物化学、生物物 理学、遗传学、免疫学、肿瘤学、生理学、分子生物学和神经科学、甚至临床医学的重要内容。细胞培养也是细胞生物学延伸至相关学科的一条主要途径。 如今，细胞培养已经成为生命科学和医学研究最常用的基础技术之一。 细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下，使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。细胞培养的直接目的是维持或扩增细胞数量。依据取材于动物组织或培养细胞，细胞培养分为原代培养和传 代培养。 1 .原代培养(Primary CUItUre )是从供体取得组织或细胞后在体外进行首次培养直至成功地进行首次传代之前的培养。但实际上通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。原代培养是建立细胞系的第一步，其最基本的方法有两种：组织块培养法和消化 培养法。 组织块培养法是指直接从机体取下组织和器官，通过组织块直接长出单层细胞，该培养法是最常用的原代培养方法，其将刚刚离体的、生长活力旺盛的组织剪成小块接种在培养瓶 中作为实验材料，一天后细胞可从贴壁的组织块四周游出并生长。组织块培养法操作过程简 便、易行，培养的细胞较易存活，适用于一些来源有限、数量较少的组织的原代培养。 消化培养法利用酶或机械方法将组织分散成单个细胞后，在不加任何粘附剂的情况下，直接移植在培养瓶壁上，加入培养基立即进行培养的方法。该方法主要使用生物化学手段将 较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接 松散、相互分离，细胞失去与间质的连接，活细胞从组织中释放出来形成含单细胞或细胞团的悬液，分散的细胞易与外界进行新陈代谢互动，在短时间内即可贴壁生长成片。胰蛋白酶
鸡胚成纤维细胞培养 1、准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、 75%酒精擦拭手至肘部。 2、布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3、选胚：取9-10日龄鸡胚，（注：鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低）用新 洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。 4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。 5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 6、剪切：用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。 7、处理组织：将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的 胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml（组织消化液以及胰酶的配置见微生物指导）结扎瓶口或塞以胶塞。 8、消化：将其置入37℃水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器 消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10－15分钟。一般约12分钟。视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短。见组织松软即可。一般不可消化时间太长否则容易导致细胞活力不足。 9、分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织 已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液少许。（制法见微生物试验实习指导），用力震摇，或用吸管吹打。 使细胞分散，脱落。然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清（可以不离心吸掉上清），加入适量含有血清的培养液。 10、计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培 养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。分装在细胞培养瓶中。视细胞多少而定加入培养基。 培养基为0.5％的含5％犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液. 11、将其置入co2细胞培养箱中，37度。瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易 生霉菌，每次换液时需要换新塞。培养24小时进行观察。一般在24－48小时可形成单层细胞。 传代 1. 倾倒培养瓶内旧培养液。 2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。 3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。 4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。 5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。 6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。
成纤维型细胞：在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维细胞。本型细胞由形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3 厘米个 长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。 培养细胞的纯化 【我是小米2】培养细胞的纯化： 1、自然纯化 即利用某一种类细胞的增殖优势，而排挤其他细胞生长，靠自然的增值潜力最后留下生长优势细胞，去除其他细胞。有些恶性肿瘤细胞可以通过此方法，自然纯化建立细胞系。 2、人工纯化 （1）酶消化法 在消化培养细胞时，常是成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，特别是在原代培养和培养早期这种差别尤为明显，因而可以利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。 （2）机械划除法 原代培养成功后，上皮细胞和成纤维细胞所数都同时出现，混杂生长。这种混杂生长常常分区成片，每种细胞都以小片或区域性分布的方式生长在瓶壁上。因此可以采用机械的方法去除不需要的细胞。 （3）反复贴壁法 成纤维细胞与上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部分细胞常能在短时间内大约 10－30min完成附着过程，而上皮细胞大部分在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞。 （4）克隆法 采用细胞克隆法将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，选择出所需要的克隆。 （5）培养及限定方法 某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则无法生长，可以利用这种技术来纯化细胞。
（6）流式分选 brdu 【sxtyzyq2】除了Brdu能用于抑制成纤维细胞的生长，便宜易买到的 【snany】阿糖孢苷效果不是特别理想 【cl1202】我在SD大鼠胃粘膜壁细胞原代培养的文献中看到的：成纤维细胞大量生长是壁细胞分离培养失败的常见原因。培养基中加入血清会刺激成纤维细胞而抑制壁细胞生长，对壁细胞可能还有一定的毒性作用。为了减少成纤维细胞的生长，先加入含有胎牛血清（100ml/L）的培养液，时差贴壁30-45分钟，除去成纤维细胞，然后再换用无血清的培养液进行培养。不知道你有没有用？试试吧。 【sxtyzyq2】买sigma公司的brdu然后把它配成终浓度为1 mmol/l然后1ml 培养液中加入5微升就可抑制成纤维细胞 【gfeng8078】我是养心肌原代，也需要抑制成纤维细胞，请问各位大侠，5-brdu 用多大的浓度？ 【cheerfulness】养心肌原代最初24h培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的brdu 【gfeng8078】你是怎么样达到0.1mmol/L的浓度呀，由于有培养液的存在，加了Brdu进去，自然就稀释了？我想把Brdu溶解于DMEM中然后一起抽滤，可是有报道说这对Brdu的药效有影响 【jiangbin1230】请问用组织块贴壁法能培养出肠的成纤维细胞吗？我试过很多次了，一个皿就只有零散的一二十个成纤维细胞，都是柱状上皮细胞，是否由于正常组织太少不能培养出啊？能帮帮忙吗？ 【sdf771214】请问成纤维细胞的帖壁时间一般是多少?我养的是内皮细胞,如何时差帖壁啊? 【victoh】不同来源的成纤维细胞在不同培养支撑介质上的贴壁时间应该是不一样的，此外也还受到其他一些因素的影响，至于上皮细胞，其本身种类就更加复杂了 上皮细胞 【warmbull】我现在正在做的培养，但发现有几瓶细胞可能是被成纤维细胞（长梭形、透明细胞）污染了，后来成纤维细胞抑制了色素上皮细胞的生长。现在又出现了这种情况，请问各位大侠，有什么办法可以除去杂细胞？还有，我养的色素上皮细胞生长增殖很缓慢，有的甚至慢慢萎缩，会是什么原因呢？
细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员： 一、实验原理
细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法： 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次，自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20－30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。 取材注意事项： 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物：9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤
成纤维细胞 科技名词定义 中文名称：成纤维细胞 英文名称：fibroblast 定义： 普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。分泌前胶原、纤连蛋白和胶 原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；总论（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 疏松结缔组织中的成纤维细胞 成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的 间充质细胞(mesenchymalcell) 分化而来。成纤维细胞较大，轮廓清楚， 多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁
大而明显。根据不同功能活动状态，可将细胞划分成成纤维细胞和纤维细胞，成纤维细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成 和分泌活动，在一定条件下，它可以实现跟纤维细胞的互相转化。成纤维 细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分 重要的作用。 目录 细胞的功能活动状态划分 来源 特征 创伤修复 分离培养 原代培养 展望 展开 编辑本段 细胞的功能活动状态划分
根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌 活动；纤维细胞（fibrocyte）功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核 小着色深，核仁不明显，细胞质少。此二型细胞可互相转化。[1] 编辑本段 来源 成纤维细胞：数目最多，胞体大，为多突的纺锤形或星形的扁平 细胞，细胞核呈规则的卵圆形，细胞轮廓不清。 成纤维细胞摄取所需的氨基酸，如脯氨酸和赖氨酸等，在粗面内质网的核蛋白体上合成前α多肽链（proalphapolypeptidechain ），多肽链输送到高尔基复合体后，组成前胶原分子（procollagen ）。前 胶原分子由分泌囊泡带到细胞表面，然后通过胞吐作用释放到细胞 外。在前胶原肽酶催化下，将每一前α多肽链的尾段除去，成为原胶 原分子（tropocollagen ）。许多原胶原分子成行平行排列，结合成具 有周期性横纹的胶原原纤维。由胶原原纤维互相结合形成胶原纤维。 编辑本段 特征 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细 胞(mesenchymalcell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维 细胞(fibrocyte)的
一、鸡胚成纤维细胞的体外培养 鸡胚成纤维细胞在病毒学研究中十分常用。孵化8－12d的鸡胚可用作培养的材料来源。 （一）实验材料 1. 鸡胚：孵化10d的受精蛋数个。孵化方法是将受精蛋放到38.5℃孵卵箱或恒温箱中，静置。每日翻动1—2次，以防止鸡胚粘连到蛋壳上影响发育。箱内湿度(40～70％)可通过在箱底放一盛水盘来维持。鸡胚的孵化期为2ld。孵化前，如遇蛋壳表面污物较多，可用刀片等器具刮除，不要用湿布擦拭，更不能用酒精棉球消毒或者用水洗蛋。孵育前可将受精蛋保存在10℃左右，保存期一般不超过10d。也有人将受精蛋保存在4℃冰箱中。 2. 消化液：含0.25％胰蛋白酶、青霉素100 1U／ml、链霉素100 μg/ml混合消化液。用Hanks 液或HEPES液配制。 3. 培养液：DMEM培养液，添加10％－20％的胎牛血清（FCS）、青霉素100 IU/ml、链霉素100 μg/mL。 4. 其它培养用品：手术器械、平皿、三角瓶或15ml血清瓶、离心管、100目不锈钢筛网、培养瓶或培养板、振荡水浴箱、离心机等。 （二）操作步骤 1)取孵化10d的鸡胚，分别用碘酒与酒精棉球擦拭消毒，晾干。用一已消毒金属器具将受 精蛋大头端击破，用镊子小心夹去破碎蛋壳，然后撕去气室外面的膜，暴露出尿囊绒膜及附着的血管。开口大小以受精蛋内容物不溢出为宜，但不宜太小。用镊子轻轻夹住鸡胚的颈部，小心取出鸡胚，放于无菌培养皿中，除去头部、四肢、内脏和皮肤。 2)胚体用Hanks液或生理盐水清洗3次，切成1－2 mm3的小块，然后转移到容积适中的 三角瓶或15ml血清瓶内。 3)加入适量消化液，一般每10个鸡胚加20 m1消化液，用胶塞密封瓶口。 4)在振荡水浴箱上37℃慢速搅拌5－10 min。加入少量血清钝化胰蛋白酶。然后通过100 目不锈钢筛网，制备细胞悬液，将细胞悬液转移到离心管中。 5)离心（800 rpm，10 min），弃上清液，将细胞沉淀用培养液洗2次。 6)加入培养液，用吸管吹打制成细胞悬液。用血球计数板计数细胞。 7)以0.2～1X06个细胞/ml的密度接种细胞。于37℃、5％CO2培养箱中培养。每2－3d换 液1次。待细胞汇合成片后，可行传代培养。 （三）结果 在倒置显微镜下观察，用8～12d龄鸡胚培养的细胞主要为具有长突起的梭形、星形或三角形的成纤维细胞。用I型和Ⅲ型胶原的抗体作免疫细胞化学分析，培养物以呈阳性反应的成纤维细胞为主。 （四）讨论 鸡胚成纤维细胞在普通培养液中具有生长优势，一般不需特殊处理，经几次传代后就可逐渐排除其它细胞，得到较纯的成纤维细胞。体外培养的胚胎细胞的形态与所取鸡胚的胚龄有关。若用体节前期的胚胎，培养的细胞不是典型的长的或星形的成纤维细胞，而为宽扁的细胞，这可能与胚胎细胞的分化状态有关。
应用随机过程试题及答案 一．概念简答题（每题5 分，共40 分） 1. 写出卡尔曼滤波的算法公式 2. 写出ARMA（p,q）模型的定义 3. 简述Poisson 过程的随机分流定理 4. 简述Markov 链与Markov 性质的概念 5. 简述Markov 状态分解定理 6．简述HMM 要解决的三个主要问题得分B 卷（共9 页）第2 页7. 什么是随机过程，随机序列？8．什么是时齐的独立增量过程？二．综合题（每题10 分，共60 分） 1 ．一维对称流动随机过程n Y , 0 1 0, , n n k k Y Y X ? ? ? ? 1 ( 1) ( 1) , 2 k k k X p x p x ? ? ? ? ? 具有的概率分布为且1 2 , , ... X X 是相互独立的。试求1 Y 与2 Y 的概率分布及其联合概率分布。 2. 已知随机变量Y 的密度函数为其他而且，在给定Y=y 条件下，随机变量X 的条件密度函数为? ? 其他试求随机变量X 和Y 的联合分布密度函数( , ) f x y . 得分B 卷（共9 页）第3 页 3. 设二维随机变量( , ) X Y 的概率密度为( ,其他试求p{x<3y} 4．设随机过程( ) c o s 2 , ( , ) , X t X t t ? ? ? ? ? ? X 是标准正态分布的随机变量。试求数学期望( ) t E X ，方差( ) t D X ，相关函数1 2 ( , ) X R t t ，协方差1 2 ( , ) X C t t 。B 卷（共9 页）第4 页5 ．设马尔科夫链的状态空间为I={0,1}, 一步转移概率矩阵为
乳鼠心肌成纤维细胞分离与培养 一、实验动物 1~3日龄C57小鼠乳鼠10只。 二、试剂及配制 高糖DMEM(gibco)、Ⅰ型胶原酶（MP）、0.25%胰蛋白酶(solarbo公司), 胎牛血清（gibco 160000-044）、青霉素-链霉素混合液（solarbo）。 培养液:DMEM培养基：FBS：双抗100：10：1（45ml：5ml：0.5ml） 酶消化液:将胰蛋白酶用PBS缓冲液(pH7.2 ～7.4)稀释,配成0.1%胰蛋白酶消化液;将Ⅰ 型胶原酶溶于PBS缓冲液(pH7.2～7.4) 中,配成0.1%的胶原酶消化液。0.1%胰蛋白酶及 01%Ⅰ型胶原酶以2∶1混合, 现配现用。 三、实验仪器 超净工作台、CO2培养箱、光学倒置显微镜、离心机?? 四、组织消化和分离细胞 1、将乳鼠于75%乙醇缸中浸泡5ｓ, 转移至超净台。 用大头针将其固定在无菌的泡沫板上, 用聚维酮碘消毒胸、腹部皮肤。 2、取2把弯镊子撕开皮肤, 充分撕拉开, 再用乙醇棉签消毒。用眼科虹膜剪在剑 突处正中线 稍偏左向上开胸后用剪子压住胸骨右缘, 使心脏自然跳出, 用弯镊子勾住心脏根部 , 取 出心脏, 置于盛预冷PBS液的培养皿中。 3、将鼠心脏全部取出后 , 剪去心房、剔除心脏上结缔组织、脂肪及血管, 预冷ＰＢＳ液清 洗3次, 去除血污。 4、将心脏剪成约1mm×1mm×1mm的组织块, 刮入加有搅拌子的锥形瓶中, 酶消化液冲洗剪 刀及培养皿, 转移至锥形瓶中。 5、加入孵育过的酶消化液为心肌组织的5倍,37 ℃水浴, 打开磁力搅拌器 ,60r/min 搅拌 10min, 吸管轻轻吹打组织块 1min分散细胞, 自然沉降2min后遗弃上清液。 6、再次加入消化酶液8～15ml消化8min。 五、培养细胞 1、吸取上清液入离心管, 加入预冷培养液2ml, 吹打均匀后,1200r/min离心4min, 弃上清, 细胞沉淀加预冷的培养液吹打后成细胞悬液用封口膜封口放于冰中备用。
Ist. Nazionale Neurologico Carlo Besta Laboratory Procedures for Human Cell Culture August 2004 _______________________________________________________________ PRIMARY FIBROBLAST CULTURE FROM HUMAN SKIN BIOPSY This protocol describes the steps for obtaining a primary fibroblast cell line from human skin biopsies. Fibroblasts are derived directly from excised skin as explants; enzyme digestion by collagenase may help obtain cells in a shorter time. This protocol describes the different steps for obtaining a primary cell line from a skin biopsy. Equipment and materials ?Laminar flow hood ?CO2 incubator ?Inverted microscope ?Sterile surgical Instruments for microdissection ?BME fibroblast medium +2 or Mg+2 ?PBS 10x without Ca ?Collagenase type II (4mg/ml) ?Petri dishes 100 mm ?Pasteur pipettes 2 ?Culture flask, 25 cm ?15 ml sterile plastic tube BME Fibroblast medium BME 80 ml Foetal bovine serum 20 ml Penicillin-streptomycin solution 100x 1 ml Filter and store at +4°C, up to 1 month. The skin biopsy sample should be shaped as a diamond and about 5-10 mm in diameter. Collect the tissue sample in sterile BME fibroblast medium. Procedure 1 1.Rapidly wash the skin biopsy in PBS in a Petri dish, cut into small fragments and transfer these to a flask. https://www.doczj.com/doc/bb14951948.html,ing a sterile Pasteur pipette with flame-rounded tip, distribute the small tissue fragments over the bottom surface of the culture flask. 3.Pass the flask rapidly and carefully through the Bunsen flame in order to evaporate the medium so that the minced tissue pieces adhere to the plastic surface, but so as not to heat-damage the minced tissue. Take care not to cook the tissue! 4.Carefully add BME medium for fibroblast growth, firmly close the lid of the flask and place in CO2 incubator. 5.The next day, slightly unscrew the lid of the flask so that the tissue can “breathe.” 6.Replace the culture medium after two days and, from this point on, replace it three times a week.
辽宁农业职业技术学院毕业论文 系别：生物技术系 专业名称：兽药生产与营销 论文题目：鸡胚成纤维细胞传代 学生姓名：郐永琳 指导教师：裴春生 评阅人： 成绩： 二O一O年六月二十日
评阅人评语： 评阅人签字： 年月日
目录 摘要 (1) 关键词 (1) 前言 (1) 1材料 (1) 1.1仪器 (1) 1.2种蛋 (1) 1.3犊牛血清 (1) 1.4溶液 (1) 2方法 (2) 2.1鸡胚的选择与孵化 (2) 2.2鸡胚原代细胞制备 (2) 2.3细胞传代 (4) 3结果与分析 (4) 4讨论 (4) 4.1温度 (4) 4.2P H (5) 4.3气体 (5) 4.4细胞接种量 (5) 4.5无菌条件 (5) 5结论 (5) 参考文献 (6) 致谢 (6)
鸡胚成纤维细胞传代 摘要：采用10日龄SPF鸡胚，进行消化，制备原代细胞，当细胞长成良好单层时，按1:2比例进行细胞传代，找出鸡胚细胞传代方法和情况。其结果是：按本实验室方法进行鸡胚传代，传至20代以上细胞形态没有发成变化，细胞生长良好。细胞数量大大增加。为病毒的研究和疫苗生产提供条件。 关键词：鸡胚；传代；生长特性 前言 细胞培养的方法是将机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。细胞在培养瓶长成致密单成后，已基本饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须传代（再培养）。也是将细胞保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种操作的必经过程，在这个过程中可以掌握其操作过程又能观察到细胞的生长情况。 1 材料 1.1 仪器 培养箱、培养瓶、玻璃漏斗、吸管、移液管、纱布、水浴锅、手术剪、镊子、培养皿、烧杯、瓶塞、培养盘、蛋托、超净工作台、显微镜、三角烧杯、95%酒精、75%酒精棉、碘酒棉、废液缸等。 1.2 种蛋 SPF种蛋，由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。 1.3 犊牛血清 多用胎牛或犊牛血清。由颈动脉无菌放血。采血前先向瓶内加些等渗盐溶液湿润瓶避，采血后置室温或37℃温箱内待血液完全凝固后，有灭菌玻棒将血块自瓶壁分离。随后再置室温或4℃冰箱内一天，即可吸取血清，如有少量红细胞可离心沉淀除去。经滤过除菌分装，置-20℃冻存，使用前56℃水浴中灭活30min。 1.4 溶液 1.4.1 Hank，s液NaCl16g、Na2HPO40.304g、KCl 0.8g、KH2PO40.12g、MgSO40.4g、C6H12O6 2g、CaCl20.28g、酚红2mL、水解乳蛋白10g、加蒸馏水至2000mL高压灭菌116℃30min。 1.4.2 酚红苯酚红1g、NaOH0.12g加蒸馏水至200mL。
细胞生物学实验 原代培养 一、实验目的 1.理解细胞原代培养原理 2.了解细胞原代培养的一般方法与步骤 3.了解细胞原代培养的应用 4.独立进行细胞原代培养操作 5. 熟悉无菌操作技术 二、实验原理 细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。 原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞 刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生 物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养: 组织直接从机体获取后, 通过组织块长出单层细胞, 或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养, 在首次传代前的培养可认为是原代培养。 原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA处理，使之分散成单个细胞，加入适量培养基 置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖
的过程。 三、实验步骤 鸡胚成纤维细胞的原代培养 （1）入无菌室之前首先穿实验服，佩戴一次性手套、帽子。要用肥皂洗手, 用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。 （2）关闭已照射超净台台面20 分钟左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气。打开照明灯。 （3）超净台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，并擦拭超净台台面。 （4）准备好所需试剂及仪器，摆放在超净台中。 （5）按照1%的比例向含10%FCS勺DMEM培养基中加入双抗（本次试验的培养基约为80ml，故加入800卩I的双抗） （6）取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中，用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后，用镊子在鸡蛋气室位置（大头处）敲一个小口，然后用镊子小心去除气室部分的蛋壳。 （7）换用洁净的无菌镊子揭开膜，再用洁净的无菌弯头镊子取出鸡胚至灭菌的培养皿中，并用D-hanks 液冲洗鸡胚，重复三次。 （8）用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢及内脏，用D-hanks 液充分洗涤躯干部分三次。 9）将洗涤过的躯干移至干净的培养皿，吸去多余的液体，然后用眼科剪将躯干充分剪碎，剪碎速度要快。
鸡胚成纤维细胞的制作及培养 鸡胚成纤维细胞培养 1、准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、 75%酒精擦拭手至肘部。 2、布局:点燃酒精灯，安装吸管帽。 3、选胚:取9-10日龄鸡胚，(注:鸡胚日龄越小，形成细胞活力越好，但产量较低)用新 洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酒、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。 4、用另一套镊子将壳膜打开将鸡胚夹起去头、爪、眼，放灭菌生理盐水中。 5、把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污;如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 6、剪切:用眼科剪把组织切成1~2毫米大小的块，以便于消化。 7、处理组织:将已剪碎的组织碎片倒入一个带玻璃珠的灭菌三角瓶中，其中加入0.25%的 胰酶，10个胚约7ml，或加组织消化液，一个胚1ml(组织消化液以及胰酶的配置见微 生物指导)结扎瓶口或塞以胶塞。 8、消化:将其置入37?水浴箱中或用恒温水浴，消化中应不停摇动，如用电磁恒温搅拌器 消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。消化10,15分钟。一般约12
分钟。视鸡胚日龄大小而定。越小消化时间越短。见组织松软即可。一般不可消化时间 太长否则容易导致细胞活力不足。 9、分离:在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织 已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，加入0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水 解乳蛋白Hank，s液少许。(制法见微生物试验实习指导)，用力震摇，或用吸管吹打。 使细胞分散，脱落。然后用纱布过滤或随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的 组织块。低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟，吸出上清(可以不离心吸掉上清)， 加入适量含有血清的培养液。 10、计数:用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培 养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄， 说明液体变酸，可用NaHCO调整。分装在细胞培养瓶中。视细胞多少而定加入培养基。3 培养基为0.5,的含5,犊牛血清双抗的的水解乳蛋白Hank，s液. 11、将其置入co2细胞培养箱中，37度。瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。培养24小时进行观察。一般在24,48小时可形成单
习题 1. 设随机过程{(,),}X t t ω-∞<<+∞只有两条样本函数 12(,)2cos ,(,)2cos ,X t t X t t x ωω==--∞<<+∞ 且1221 (),()33P P ωω==，分别求： （1）一维分布函数(0,)F x 和(,)4F x π ； （2）二维分布函数(0,;,)4F x y π ； （3）均值函数()X m t ； （4）协方差函数(,)X C s t . 2. 利用抛掷一枚硬币一次的随机试验，定义随机过程 1 2 cos ()2t X t πωω?=??出现正面出现反面 且“出现正面”与“出现反面”的概率相等，各为1 2 ，求 1）画出{()}X t 的样本函数 2）{()}X t 的一维概率分布，1 (;)2F x 和(1;)F x 3）{()}X t 的二维概率分布121 (,1;,)2 F x x 3. 通过连续重复抛掷一枚硬币确定随机过程{()}X t cos ()2 t t X t t π?=? ?在时刻抛掷硬币出现正面 在时刻抛掷硬币出现反面 求：（1）1(,),(1,)2F x F x ； （2）121 (,1;,)2 F x x 4. 考虑正弦波过程{(),0}X t t ≥，()cos X t t ξω=，其中ω为正常数，~(0,1)U ξ. （1）分别求3,,,424t ππππωωωω = 时()X t 的概率密度(,)f t x . （2）求均值函数()m t ，方差函数()D t ，相关函数(,)R s t ，协方差函数(,)C s t . 5. 给定随机过程： ()X t t ξη=+ ()t -∞<<+∞ 其中r. v. (,)ξη的协方差矩阵为1334C ?? = ??? ， 求随机过程{(),}X t t -∞<<+∞的协方差函数. 6. 考虑随机游动{(),0,1,2,}Y n n =
成纤维细胞的培养 1前言 成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。 成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。 2材料和方法 2.1材料 玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管 塑料器材：细胞培养板 橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管 滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜 2.2试剂的配制 水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、 2.3方法 2.3.1试剂配制 （1）细胞分散液：无钙胰蛋白酶加4倍无菌蒸馏水 （2) 组织冲洗液：无血清MEM （3）细胞生长液：含10％FCS MEM 2.3.2实验分配：每人1枚鸡胚，每人制备1瓶100mL培养瓶细胞。 2.3.3细胞制备过程 碘酊消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，用无血清MEM 冲洗3次，将鸡胚置于无菌平皿内，去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个平皿内，用无血清MEM冲洗3次，剪碎胚体，静止片刻，吸净上清，加入5－10倍无钙胰蛋白酶，并吸入于无菌青霉素小瓶内，用橡皮膏封严瓶口，37 ℃消化至细胞呈毛球样，吸净消化液，加入细胞生长液，将细胞置于细胞培养瓶中，并用大口吸管吹打细胞使之充分分散，分装2个细胞培养瓶内。 4、换液或接毒 细胞于37℃培养过夜，次日换细胞维持液，或单层接种病毒，每日观察CPE。
人皮肤成纤维细胞库的构建 试剂: 胶原酶(Sigma)，优质胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Sigma)，中性蛋白酶(Sigma)，DMEM培养基(Sigma)，二甲基亚砜(Merck)。 配液 :成纤维细胞培养基配制:DMEM10g，NaHCO3 3．7g，HEPES 2．4g，优质胎牛血清100ml，青霉素100 000U，链霉素100 000U，超纯水加至1 000ml，用1N NaOH 调pH值至7-2～7．4，0．22pan孑L滤膜过滤除菌，9Om】／瓶分装，一2O℃贮存备用。D—Hanks 平衡盐液：NaC1 8．0g，KC1 0．4g，Na2HPO4·12H：0 134．4mg，KH~PO4 0．06g，NaHCO3 0．35g，酚红O．O2g，青霉素100000U，链霉素100000U，超纯水加至1 o0Ornl，用1N NaOH调pH值至7．2-7A，0．22tun孔滤膜过滤除菌，90ml／瓶分装，一2O℃贮存备用。 方法:乙醇棉球将标本用力擦拭3遍；标本移至培养皿中，用D—Hanks平衡盐液反复用力彻底冲洗标本5遍，直至标本发白，轻度发胀；在培养皿中修剪皮下筋膜组织及多余的皮下脂肪，将标本剪成0．3cmx2．0em大小的皮条，置于培养皿中，加0．25％胰蛋白酶浸没组织，4℃冰箱中消化14~16h，以用眼科镊能轻轻揭下表皮为度；消化后的标本置于超净工作台上。吸出胰蛋白酶，用DMEM漂洗2遍，中止胰蛋白酶消化作用；用眼科镊轻轻揭下表皮，置于另一培养皿中(用于培养角质形成细胞)，真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮成分剪成糊状(组织大小约为0．1cmx0．1cmx0．1cm)，加入0．2％胶原酶浸没组织，37℃孵箱中消化1~4h，以将组织基本上消化散开，看不到组织块为度；加D-Hanks平衡盐液1 500#min离心5min，5遍，以洗去胶原酶，沉淀即为成纤维细胞，弃上清，加DMEM制成细胞混悬液，接种至50ml培养瓶中，置37℃、5％CO：、湿度95％的CO 孵箱中培养131。24h后更换培养基，以后更换培养液1次／3d，大约7~9d左右长满后传代。 成纤维细胞的传代:倒掉培养瓶内旧培养液，向培养瓶内加入0．25％的胰蛋白酶2ml。轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后倒掉消化液后再加入2ml新的消化液，轻轻摇动后再倒掉大部分消化液，仅留少许进行消化。消化约2—5min后把培养瓶放置显微镜下观察，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入DMEM 2ml终止消化，用吸管反复吹打瓶壁细胞，吹打过程要顺序进行，细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。按1：3传代至新的培养瓶中，置37℃、5％CO 、湿度95％的CO2孵箱中培养，约3~5d左右可再次传代。 成纤维细胞的冻存与复苏:用0．25％的胰蛋白酶2ml消化、分散接近长满单层的成纤维细胞，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入DMEM 6ml终止消化，轻轻吹打细胞。以使细胞游离，1 500r／min离心5min，去除胰蛋白酶及旧的培养液，将细胞重悬于配制好的含有10％无菌二甲基亚砜DMEM冻存液中，然后分装入无菌塑料冻存管中，每支冻存管加液1~2ml，封闭冻存管，标明细胞的名称、代数及冻存日期，先将冻存管置于4℃冰箱中保存2h，一20℃冰柜中保存2h，一80℃超低温冰柜中保存2h，即可迅速投入一196~C长期保存。复苏时，将冻存管从液氮中取出，迅速置于37℃水浴中复温，加入8ml培养液，混合后1 O00r／min离心5min，倾去上清液，再加入10rnl培养混悬，重复低速离心5rain，以除去二甲基亚砜，用新鲜培养液重悬细胞，用培养液适当稀释，使细胞接种密度为1xllY／ml，接种培养瓶，置37℃、5％C0 、湿度95％的CO 培养箱内培养，待细胞贴壁后更换培养液。最后，将成纤维细胞在倒置显微镜下直接观察其细胞形态，并摄相。 换液注意事项： 贴壁细胞换液的时候是从培养瓶的非细胞附着面加PBS（避免影响细胞贴壁），然后轻轻晃动瓶子，从非细胞附着面倒出PBS （也可以吸出来，以免弄湿瓶口），洗的次数以镜下视野比较干净为准（只要你加pbs不是太少，一般2次左右就洗干净了），一般不需要吹打，尤其是在你刚传了代或者细胞贴壁能力不是很好的情况下 细胞的换液 (1) 从培养箱中取出培养瓶，观察细胞。 内容有：①培养瓶中培养液的PH值。 ②培养瓶中液体是否澄清。 ③倒置显微镜下细胞的生长状态。 (2) 翻转培养瓶，使贴有细胞的一面瓶壁向上，并使培养瓶口斜向上倾斜约45°，开瓶盖，用酒精灯的外焰烧瓶口消毒。玻璃瓶瓶口先有雾气生成，等瓶口再次透亮即可。一次性使用的培养瓶只需将瓶口过火即可。 (3) 长滴管吸取培养液，放入废液缸中。 (4) 新吸管吸5ml培养液加入细胞瓶。 (5) 关瓶盖。瓶盖拧紧后向回拧半圈，以利于CO2进入。 完成实验记录。