西北大学
硕士学位论文
三种原料药溶剂残留量的气相色谱顶空进样分析
姓名：杨京霞
申请学位级别：硕士
专业：中药学
指导教师：孙文基
20080613
气相色谱实验报告 一、实验目的 1、了解气相色谱仪的基本结构及掌握分离分析的基本原理； 2、了解顶空气相色谱法； 3、了解影响分离效果的因素； 4、掌握定性、定量分析与测定的方法。 二、实验原理 气相色谱分离是利用上试样中各组分在色谱柱中的气相和固定相间的分配系数不同，当气化后的试样被载气带入色谱柱进行时，组分就在其中的两相中进行反复多次的分配，由于固定相各个组分的吸附或溶解能力不同，因此各组分在色谱柱中的运行速度就不同。经过一定的柱长后，使彼此分离，顺序离开色谱柱进入检测器。检测器将各组分的浓度或质量的变化转换成一定的电信号，经过放大后在记录仪上记录下来，即可得到各组分的色谱峰。根据保留时间和峰高或峰面积，便可进行定性和定量的分析。 （1）顶空色谱法及其原理介绍 顶空气相色谱是指对液体或固体中的挥发性成分进行气相色谱分析的一种间接测定法，它是在热力学平衡的蒸气相与被分析样品同时存在于一个密闭系统中进行的。这一方法从气相色谱仪角度讲，是一种进样系统，即“顶空进样系统”。其原理如下： 一个容积为V、装有体积为V o浓度为C o的液体样品的密封容器, 在一定温度下达到平衡时，气相体积为Vg，液相体积为Vs，气相样品浓度为Cg，液相中样品浓度为Cs, 则：平衡常数 K=Cs/Cg 相比β=Vg/Vs V=Vs+Vg=V o+Vg 又因为是密封容器，所以 C o V o=CoVs=CsVs+CgVg= KCgVs + CgVg C o=KCg+CgVg/Vs=KCg+βCg=Cg(K+β） Cg=C o/(K+β）＝K’C o 可见，在平衡状态下，气相组成与样品原组成为正比关系，根据这一关系我们可以进行定性和定量分析。 （2）顶空色谱法的优点 顶空色谱进样器可与国内外各种气相色谱仪相连接，它是将液体或固体样品中的挥发性组分直接导入气相色谱仪进行分离和检测的理想进样装置。 它采用气体进样，可专一性收集样品中的易挥发性成分，与液-液萃取和固相萃取相比既可避免在除去溶剂时引起挥发物的损失，又可降低共提物引起的噪音，具有更高灵敏度和分析速度，对分析人员和环境危害小，操作简便，是一种符合“绿色分析化学”要求的分析手段。固相萃取和液相萃取时不可避免地带入共萃取物干扰分析。顶空分析可看成是气相萃
指导原则编号： 【H】G P H7-1化学药物残留溶剂研究的技术指导原则 二OO五年三月
目 录 一、概述 (1) 二、基本内容 (2) (一)残留溶剂研究的基本原则 (2) 1、确定残留溶剂的研究对象 (2) 2、确定残留溶剂时需要考虑的问题 (2) 3、残留溶剂分类及研究原则 (4) (二)研究方法的建立及方法学验证 (6) 1、研究方法的建立 (6) 2、方法学验证 (8) (三)研究结果的分析及质量标准的制定 (9) 1、残留溶剂表示方法 (9) 2、质量标准制定的一般原则及阶段性要求 (10) (四)需要关注的几个问题 (12) 1、附录中无限度规定和未收载的有机溶剂 (12) 2、未知有机挥发物 (12) 3、多种有机溶剂综合影响 (13) 4、中间体的残留溶剂 (13) 5、制剂工艺对制剂残留溶剂的影响 (14) 6、辅料残留溶剂的研究及对制剂的影响 (14) 三、参考文献 (14) 四、附录 (16) 五、著者 (17)
化学药物残留溶剂研究的技术指导原则 一、概述 药物中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中、以及在制剂制备过程中使用或产生而又未能完全去除的有机溶剂。根据国际化学品安全性纲要，以及美国环境保护机构、世界卫生组织等公布的研究结果，很多有机溶剂对环境、人体都有一定的危害，因此，为保障药物的质量和用药安全，以及保护环境，需要对残留溶剂进行研究和控制。 本指导原则是在参考人用药物注册技术要求国际协调会（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH）颁布的残留溶剂研究指导原则,美国药典（the United States Pharmacopoeia，USP）、英国药典(British Pharmacopoeia, BP)、欧洲药典(European Pharmacopoeia，EP)、中国药典(Chinese Pharmacopoeia, ChP)相关内容的基础上，结合我国药物研发的特点，通过分析、研究残留溶剂问题与药物的安全性、有效性及质量可控性之间的内在关系而制定的。本指导原则总结了对残留溶剂问题的一般认识，旨在帮助药物研发者科学合理的进行残留溶剂方面的研究，也为药物评价者提供参考。 考虑到残留溶剂研究涉及的范围比较广泛，本指导原则主要对原料药的残留溶剂问题进行讨论，并以此为基础，探讨和总结药物研究过程中对残留溶剂问题的一般性原则。药物研发者可参考本指导原则对制剂和辅料的残留溶剂问题进行研究。
残留溶剂的鉴定和控制 在本章下描述的测试程序可能适用于以下几种情况： （1）原料药、辅料以及制剂中的大多数未知一类和二类溶剂的鉴定。 （2）原料药、辅料以及制剂中的一类和二类溶剂的限度测试。 （3）对于限度大于1000ppm的二类溶剂以及三类溶剂的定量测试。 一类、二类及三类溶剂在5.4残留溶剂里面都列出来了。 样品配制的三种溶剂以及顶空进样的色谱系统条件都在本章中进行了描述。本章中规定了两个色谱系统，但是系统A是优先推荐的，系统B是用于确证同一性而使用的。样品配制程序的选择主要是根据样品本身的溶解度以及需要控制的溶剂类别来确定的。 下面几种溶剂不适合用顶空进样测定：甲酰胺、2-乙氧基乙醇、2-甲氧基乙醇、乙二醇、N-甲基吡咯烷酮以及环丁砜。其他合适的程序可以用于这些溶剂的测定。 当一种方法被用于定量控制原料药中的残留溶剂，必须进行验证。 测试程序：使用顶空进样气相色谱法进行测量。 样品制备方法1：该方法主要用于易溶于水系统的残留溶剂的测定。 样品溶液（1）将0.200g样品溶于水中，用水稀释至20ml。 样品制备方法2：该方法主要用于难溶于水系统的残留溶剂的测定。 样品溶液（2）将0.200g样品溶于DMF中，用DMF稀释至20ml。 样品制备方法3：该方法主要用于控制N，N-二甲基乙酰胺以及N，N-二甲基甲酰胺的测定。 样品溶液（3）将0.200g样品溶于1,3-二甲基-咪唑啉酮中，用1,3-二甲基-咪咪唑啉酮稀释至20ml。 某些情况下，以上的几种样品配制方法都不适用的时候，所选择的样品配制方法以及顶空条件必须证明是合适的。 溶剂溶液（a）取1.0ml一类溶剂标准品，加9mlDMSO，用水稀释至100ml。取1.0ml至10.0ml水中。 相关溶液包括以下几种：苯：2ppm，四氯化碳：4ppm，1,2-二氯乙烷：5ppm，1,1-二氯乙烷：8ppm，1,1,1-三氯乙烷：10ppm。
方案批准 注：在方案批准部分签字表明签字者同意方案中规定的检测项目检测方法和记录要求。在执行本方案的过程中可能会出现影响严格执行本方案的偏差，对较小的偏差将通过偏差报告的形式来解决，对于关键性偏差，如对方法的调整、对参数或接受标准的调整必须制定出增补方案并按照原方案批准程序得到批准才能进行。所有的偏差报告和增补方案必须在提交验证报告供批准时一同提交。
目录 1.概述 (3) 2.参考资料 (4) 3. 职责 (4) 4. 色谱系统及色谱条件 (4) 5. 器材与试剂 (5) 6. 验证试验 (5) 6.1系统适应性 (5) 6.2专属性 (6) 6.3耐用性 (7) 6.4定量限 (8) 6.5检测限 (8) 6.6线性与围 (8) 6.7准确度 (9) 6.8精密度 (11) 7.再验证周期 (12) 8.偏差及纠正措施 (13) 9.最终审核和批准 (13) 药品残留溶剂顶空分析方法草案 (14)
1.概述 1.1根据ICH对药品中残留溶剂含量的要求及盐酸噻氯匹定生产工艺，必须控制盐酸噻氯匹定生产工艺中使用到的溶剂乙醇、丁酮、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)的残留量。限度分别为：乙醇≤5000ppm、丁酮≤5000ppm、甲苯≤890ppm、DMF≤880ppm。 1.2分析方法草案见附件。 1.3本分析方法属于杂质定量分析，因此需要验证的项目有：系统适应性、专属性、线性、 准确度、检测限、定量限、精密度、耐用性，具体参数及接受标准要求见下表：
2.参考资料 ICH Q3C (R3), November 2005. ICH Q2 (R1), November 2005. <467> Residual Solvents, United States Pharmacopoeia 31, November 2007. <20424> Residual Solvents, European Pharmacopoeia 6.0, June 2007. 3. 职责 4.1色谱系统
安徽建筑大学 现代水分析技术论文 专业：xx级市政工程 学生姓名：xxx 学号：xxx 课题：气相色谱法基本原理及其应用指导教师:xxx xx年xx月xx日
气相色谱法基本原理及其应用 xx （安徽建筑工业学院环境与能源工程学院，合肥，230601） 摘要：气相色谱法是分离混合物中各组分的一种有效的手段，其中气相色谱仪是20世纪50年代末在多数科学家的共同努力下诞生的。本文针对气相色谱法的起源与发展历程、工作原理与特点、在环境水污染物分析领域的应用进行了详细的概述，并列举了饮用水中挥发性有机物的气相色谱检测方法，同时提出了该方法新的发展前景。它的发展已在环境监测、水污染控制领中得到了广泛的应用。 关键词：气相色谱法；发展历程；工作原理；水污染物分析 1.气相色谱法的起源与发展历程 （1）气相色谱法的起源 色谱的发现首先认识到这种分离现象和分离方法大有可为的是俄国的植物学家Tswett。Tswett于1903年在波兰华沙大学研究植物叶子的组成时,将叶绿素的石油醚抽提液倒入装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端，然后用石油醚进行淋洗，结果不同色素按吸附顺序在管内形成一条不同颜色的环带,就像光谱一样。1906年,Tswett在德国植物学杂志上发表的一篇论文中首次把这些彩色环带命名为“色谱图”，玻璃管称为“色谱柱”，碳酸钙称为“固定相”，石油醚称为“流动相”。Tswett开创的方法叫做“液-固色谱法”[1-2],这就是色谱法的起源。 1941年，英国科学家Martin和Synge在研究液-液分配色谱时，预言可以使用气体作流动相，即气-夜色谱法。他们在1941年发表的论文中写到“流动相不一定是液体,也可以是蒸气，如以永久性气体带动挥发性混合物,在色谱柱中通过装有浸透不挥发性溶剂的固体时，可以得到很好的分离”[3]。1950年,Martin和James使用硅藻土助滤剂做载体,硅油为固定相，用气体流动相对脂肪酸进行精细分离,这就是气^液分配色谱的起源。后来，他们在1952年的Biochemical Journal上又连续发表了3篇论文[4-6],叙述了用气相色谱分离低碳数脂肪酸、挥发性胺和吡啶类同系物的方法,这标志着气相色谱法正式进入历史舞台。当时在石油化工的分析中，正当传统的分析方法无能为力时,气相色谱法就像及时雨一样,成为化学分析的得力助手。从此,科学家对气相色谱法的研究逐步展开。 （2）气相色谱法的发展 在历史上,气相色谱法的发展总是和气相色谱仪器的发展密不可分。每一种气相色谱新技术的出现,往往都伴随着气相色谱仪器的改进。因此，了解气相色谱法的发展历史可以从气相色谱仪的发展入手。历史上最早的气相色谱仪1947年由捷克色谱学家Jaroslav Janak发明的。该仪器以C为流动相、杜马测氮管为检测器测定分离开的气体体积。在样品和CA 进入测氮管之前,通过KOH溶液吸收掉CA,按时间记录气体体积的增量。这台仪器虽然简陋,但对当时的气相色谱研究起到了巨大的推动作用。Jaroslav Janak发明的气相色谱仪也有一些明显的不足：它只能测室温下为气体的样品, 样品中的CA不能被测定，而且没有实现自动化。20世纪50年代末,它逐渐被更先进的气相色谱仪所取代。W55年,第一台商品化气相色谱仪诞生,标志着气相色谱仪的发展进入了崭新的时代。 现代气相色谱仪主要由5个系统组成,即气路系统、进样系统、分离系统、温度控制系统与检测记录系统。气路系统与温控系统自气相色谱诞生以来很少有突破性的进展。气路系统主要朝自动化方向发展,20世纪90年代出现了采用电子压力传感器和电子流量控制器，通过计算机实现压力和流量自动控制的电子程序压力流量控制系统,这是气路系统的一大进步[7]。温控系统则基本朝着精细、快速、自动化方向发展。相比之下,进样系统、分离系统与检测记录系统是气相色谱仪的核心组成系统，它们的每一次变革和进步都推动着气相色谱的
残留溶剂的指导原则 1．介绍 本指导原则旨在介绍药物中残留溶剂在保证人体安全条件下的可接受量，指导原则建议使用低毒的溶剂，提出了一些残留溶剂毒理学上的可接受水平。 药物中的残留溶剂在此定义为在原料药或赋形剂的生产中，以及在制剂制备过程中产生或使用的有机挥发性化合物，它们在工艺中不能完全除尽。在合成原料药中选择适当的溶剂可提高产量或决定药物的性质，如结晶型。纯度和溶解度。因此．有时溶剂是合成中非常关键的因素。本指导原则所指的溶剂不是谨慎地用作赋形剂的溶剂，也不是溶剂化物，然而在这些制剂中的溶剂含量也应进行测定，并作出合理的判断。 出于残留溶剂没有疗效，故所有残留溶剂均应尽可能．去，以符合产品规范、GMP或其他基本的质量要求。制剂所含残留溶剂的水平不能高于安全值，已知一些溶剂可导致不接受的毒性（第一类，表1），除非被证明特别合理，在原药、赋形剂及制剂生产中应避免使用。一些溶剂毒性不太大（第二类，表2）应限制使用，以防止病人潜在的不良反应。使用低毒溶剂（第三类，表3）较为理想。附录1中列出了指导原则中的全部溶剂。 表中所列溶剂并非详尽无遗，其他可能使用的溶剂有待日后补充列人。第一、二类溶剂的建议限度或溶剂的分类会随着。新的安全性资料的获得而调整。含有新溶剂的新药制剂、其上市申请的安全性资料应符合本指导原则或原料药指导原则（Q3A新原料药中的杂质）或新药制剂（Q3B新药制剂中的杂质）中所述的杂质控制原则，或者符合上述三者。 2. 指导原则的范围 指导原则范围包括原料药、赋形剂或制剂中所含残留溶剂．因此，当生产或纯化过程中会出现这些溶剂时。应进行残留溶剂的检验。也只有在上述情况下，才有必要作溶剂的检查。虽然生产商可以选择性地测定制剂，但也可以从制剂中各成分的残留溶液水平来累积计算制剂中的残留溶剂。如果计算结果等于或低于本原则的建议水平，该制剂可考虑不检查残留溶剂，但如果计算结果高于建议水平则应进行检测，以确定制剂制备过程中是否降低了有关溶剂的量以达到可接受水平。果制剂生产中用到某种溶剂，也应进行测定。 本指导原则不适用于临床研究阶段的准新原料药、准赋形剂和准制剂。也不适用于已上市的药品。 本指导原则适用于所有剂型和给药途径。短期（如30天或更短）使用或局部使用时，允许存在的残留溶剂水平可以较高。应根据不同的情况评判这些溶剂水平。 有关残留溶剂的背景附加说明见附录2。 3．通则 3.1 根据危害程度对残留溶剂分类 “可耐受的日摄人量”（TDI）是国际化学品安全纲要（IPCS）用于描述毒性化合物接触限度的术语。“可接受的日摄人量”（ADI）是WHO及一些国家和国际卫生组织所用的术语。新术语“允许的日接触量”（PDE）是本指导原则中用于定义药物中可接受的有机溶剂摄人量，以避免与同一物质的ADI混淆。 本原则中残留溶剂的评价以通用名和结构列于附录1，根据它们对人体可能造成的危害分为以下三类； （1）第一类溶剂：应避兔的溶剂 为人体致癌物、疑为人体致癌物或环境危害物。 （2）第二类溶剂。应限制的溶剂 非遗传毒性动物致癌或可能导致其他不可逆毒性测神经毒性或致畸性）的试剂。 可能具其他严重的但可逆毒性的溶剂。
usp[467] 有机挥发性杂质 残留溶剂限度 残留溶剂：不得残留 Ⅰ级已知人体实验致癌物质；强烈疑似人体实验致癌物 质；环境危害物质 残留溶剂：应在限度内 Ⅱ级动物实验非生殖毒性（遗传）；动物实验致癌物质或其它可能的非可逆致病因子；产生毒性如神经毒性或致畸性；其它疑似重大但可逆毒性 残留溶剂：低潜在毒性溶剂 Ⅲ级对人体存在低毒性溶剂；无人体摄入量规定（注：Ⅲ级残留溶剂 PDEs上限为≥ 50mg/天） 表 1 Ⅰ级残留溶剂 溶剂浓度限度（ ppm）不良反应 苯2致癌物四氯化碳4中毒和外周脑组织损害1，2- 二氯乙烷5中毒 1，1- 二氯乙烷8中毒 1，1，1- 三氯乙烷1500环境危害 Ⅱ级残留溶剂 表 2 Ⅱ级残留溶剂 溶剂PDE（mg/天）浓度限度（ ppm） 乙腈 4.1410 氯苯 3.6360 氯仿0.660 环己烷38.83880 1，2- 二氯乙烯18.71870 1，2- 二甲氧乙烷 1.0100 N，N-二甲基乙酰胺10.91090 N，N-二甲基甲酰胺8.8880 1，4- 二氧六环 3.8380 2- 乙氧基乙醇 1.6160 乙二醇 6.2620 甲酰胺 2.2220 己烷 2.9290 甲醇30.03000 2- 甲氧基乙醇0.550 甲基丁基（甲）酮 0.550 2- 己酮 甲基环己烷11.81180
二氯甲烷 6.0600 N-甲基吡咯烷酮 5.3530硝酸甲烷0.550 吡啶 2.0200环丁砜 1.6160四氢呋喃7.2720 1，2，3，4- 四氢化萘 1.0100甲苯8.9890三氯乙烯0.880 二甲苯 *21.72170 *通常含有 60%间- 二甲苯， 14%对 - 二甲苯， 9%邻- 二甲苯和 17%乙苯 Ⅲ级残留溶剂 表 3Ⅲ级残留溶剂 （GMP或其它原料药、赋形剂和药物制剂质量标准规定） 醋酸庚烷 丙酮乙酸异丁酯 苯甲醚乙酸异丙酯 正丁醇乙酸甲酯 2- 丁醇3- 甲基 -1- 丁醇 乙酸丁酯甲基乙基酮 叔丁基甲基醚甲基异丁基酮 异丙基苯2- 甲基 -1- 丙醇 二甲基亚砜戊烷 乙醇1- 戊醇 乙酸乙酯1- 丙醇 乙醚2- 丙醇 甲酸乙酯乙酸丙酯 甲酸 表 4其它残留溶剂 （缺乏足够的毒物学方面的资料） 1， 1- 二乙氧基丙烷甲基异丙基酮 1， 1- 二甲氧基甲烷甲基四氢呋喃 2， 2- 二甲氧基丙烷溶剂己烷 异辛烷三氯醋酸 异丙醚三氟醋酸 除另有规定外，样品中残留的有机挥发性杂质不得超过下表中规定限度：有机挥发性杂质限度（μ g/g ） 氯仿60 1，4- 二氧杂环己烷380 二氯甲烷600 三氯乙烷80
***产品残留溶剂分析方法验证方案 20**年**月
验证方案的起草与审批 方案实施日期：
目录 1.验证目的 (4) 2.方法简介与确认范围 (4) 3.标准品、供试品 (4) 4.风险评估 (4) 5.验证的可接受标准 (5) 6.验证步骤 (6) 6.1系统适应性 (6) 6.2专属性 (6) 6.3定量限与检测限 (7) 6.4线性 (7) 6.5准确度 (8) 6.6精密度 (9) 6.7范围 (9) 6.8耐用性 (9) 6.9样品测定 (10) 7.偏差 (10) 8.风险的接收与评审 (10) 9.再验证 (10) 10.确认结果评审和结论 (10) 11.更改历史 (10) 12. 附录 (10)
1.验证目的 根据法规的要求，分析方法应进行验证，证明采用的方法适合于相应的检测要求。 这个验证方案的目的是为验证提供具体方法参数、可接受标准和研究步骤。 2.方法简介与确认范围 ***产品生产过程中用到有机溶剂乙醇、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、四氢呋喃，为了准确测定溶剂在成品中的残留量，现对该测定方法进行验证，验证包括方法的专属性、检测限与定量限、线性、范围、准确度、精密度及耐用性。 3.标准品、供试品 3.1标准品 3.2供试品 4.风险评估 按照《质量风险管理规程》，质量控制部和质量管理部共同对分析方法进行了风险评
风险评估人： 评估日期： 5.验证的可接受标准
6.验证步骤 6.1系统适应性 精密称取乙醇200mg、丙酮200mg、二氯甲烷24mg、乙酸乙酯200mg、四氢呋喃28.8mg，置于已加入10ml二甲基亚砜的50ml量瓶中，用二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，作为对照溶液储备液；精密移取对照液储备液5ml，置于一100ml量瓶中，用二甲基亚砜稀释至刻度；精密移取5ml，置于20ml顶空瓶中，密封。同法配制6份，连续顶空进样，记录色谱图，相邻组份之间的分离度R均应不小于1.5，各组份峰面积的相对标准偏差(RSD A)均应不大于10%。 6.2专属性 a) 空白：精密移取二甲基亚砜5ml，置于20ml顶空瓶中，密封。顶空进样，记录色谱图，确定二甲基亚砜出峰位置，且溶剂对测定应无干扰。 b) 乙醇定位溶液：取乙醇约10mg，置于50ml量瓶中，用二甲基亚砜溶解并稀释至刻度(含乙醇约200μg/ml)；精密移取5ml，置于20ml顶空瓶中，密封。顶空进样，记录色谱图，确定乙醇出峰位置，并不得有干扰峰，且与二甲基亚砜之间的分离度应不小于1.5。 c) 丙酮定位溶液：取丙酮约10mg，置于50ml量瓶中，用二甲基亚砜溶解并稀释至刻度(含丙酮约200μg/ml)；精密移取5ml，置于20ml顶空瓶中，密封。顶空进样，记录色谱图，确定丙酮出峰位置，并不得有干扰峰，且与二甲基亚砜之间的分离度应不小于1.5。 d) 二氯甲烷定位溶液：取二氯甲烷约12mg，置于50ml量瓶中，用二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，移取1.0ml，置于10ml量瓶中，用二甲基亚砜稀释至刻度(含二氯甲烷约24μg /ml)；精密移取5ml，置于20ml顶空瓶中，密封。顶空进样，记录色谱图，确定二氯甲烷出峰位置，并不得有干扰峰，且与二甲基亚砜之间的分离度应不小于1.5。 e) 乙酸乙酯定位溶液：取乙酸乙酯约10mg，置于50ml量瓶中，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度(含乙酸乙酯约200μg/ml)；精密移取5ml，置于20ml顶空瓶中，密封。顶空进样，记录色谱图，确定乙酸乙酯出峰位置，并不得有干扰峰，且与二甲基亚砜之间的分离度应不小于1.5。 f) 四氢呋喃定位溶液：取四氢呋喃约14.4mg，置于50ml量瓶中，用二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，移取1.0ml，置于10ml量瓶中，用二甲基亚砜稀释至刻度(含四氢呋喃约28.8μg/ml)；精密移取5ml，置于20ml顶空瓶中，密封。顶空进样，记录色谱图，确定四氢呋喃出峰位置，并不得有干扰峰，且与二甲基亚砜之间的分离度应不小于1.5。 i) 对照液：精密称取乙醇200mg、丙酮200mg、二氯甲烷24mg、四氢呋喃28.8mg、
高效液相色谱法(HPLC) 概述： 色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。 二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC技术大发展，而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC的迅速发展。 目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。HPLC已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。 适用范围广： 已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机物可用HPLC分析。HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。 第一课色谱法概述 色谱法是一种重要的分离分析方法，它是利用不同物质在两相中具有不同的分 配系数(或吸附系数、渗透性)，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次反 复分配而实现分离。在色谱技术中，流动相为气体的叫气相色谱，流动相为液体的叫 液相色谱。固定相可以装在柱内，也可以做成薄层。前者叫柱色谱，后者叫薄层色谱。 根据色谱法原理制成的仪器叫色谱仪，目前，主要有气相色谱仪和液相色谱仪。 色谱法的创始人是俄国的植物学家茨维特。1905年，他将从植物色素提取的石油 醚提取液倒人一根装有碳酸钙的玻璃管顶端，然后用石油醚淋洗，结果使不同色素得 到分离，在管内显示出不同的色带，色谱一词也由此得名。这就是最初的色谱法。后 来，用色谱法分析的物质已极少为有色物质，但色谱一词仍沿用至今，在50年代，色 谱法有了很大的发展。1952年，詹姆斯和马丁以气体作为流动相分析了脂肪酸同系物 并提出了塔板理论。1956年范第姆特总结了前人的经验，提出了反映载气流速和柱效 关系的范笨姆特方程，建立了初步的色谱理论。同年，高莱(Golay)发明了毛细管拄， 以后又相继发明了各种检测器，使色谱技术更加完善。50年代末期，出现了气相色谱 和质谱联用的仪器，克服了气相色谱不适于定性的缺点。则年代，由于检测技术的提 高和高压泵的出现，高效液相色谱迅远发展，使得色谱法的应用范围大大扩展。目前 ，由于高效能的色谱往、高灵敏的检测器及微处理机的使用，使得色谱法已成为一种 分析速度快、灵敏度高、应用范围广的分析仪器。 在这里主要介绍气相色谱分析法。同时也适当介绍液相色谱法。气相色谱法的 基本理论和定性定量方法也适用于液相色谱法。其不同之处在液相色谱法中介绍。 第二课气相色谱仪 典型的气相色谱仪具有稳定流量的载气，将汽化的样品由汽化室 带入色谱柱，在色谱柱中不同组分得到分离，并先后从色谱柱中流出， 经过检测器和记录器，这些被分开的组分成为一个一个的色谱峰。色 谱仪通常由下列五个部分组成： 1.载气系统（包括气源和流量的调节与测量元件等） 2.进样系统（包括进样装置和汽化室两部分）
杂质：残留溶剂的指导原则
杂质：残留溶剂的指导原则
1．介绍 本指导原则旨在介绍药物中残留溶剂在保证人体安全条件下的 可接受量，指导原则建议使用低毒的溶剂，提出了一些残留溶剂毒理 学上的可接受水平。 药物中的残留溶剂在此定义为在原料药或赋形剂的生产中，以 及在制剂制备过程中产生或使用的有机挥发性化合物， 它们在工艺中 不能完全除尽。 在合成原料药中选择适当的溶剂可提高产量或决定药 物的性质，如结晶型。纯度和溶解度。因此．有时溶剂是合成中非常 关键的因素。本指导原则所指的溶剂不是谨慎地用作赋形剂的溶剂， 也不是溶剂化物，然而在这些制剂中的溶剂含量也应进行测定，并作 出合理的判断。 出于残留溶剂没有疗效，故所有残留溶剂均应尽可能．去，以 符合产品规范、GMP 或其他基本的质量要求。制剂所含残留溶剂的 水平不能高于安全值，已知一些溶剂可导致不接受的毒性（第一类， 表 1） ，除非被证明特别合理，在原药、赋形剂及制剂生产中应避免 使用。一些溶剂毒性不太大（第二类，表 2）应限制使用，以防止病 人潜在的不良反应。使用低毒溶剂（第三类，表 3）较为理想。附录 1 中列出了指导原则中的全部溶剂。
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杂质：残留溶剂的指导原则
表中所列溶剂并非详尽无遗， 其他可能使用的溶剂有待日后补充 列人。第一、二类溶剂的建议限度或溶剂的分类会随着。新的安全性 资料的获得而调整。含有新溶剂的新药制剂、其上市申请的安全性资 料应符合本指导原则或原料药指导原则（Q3A 新原料药中的杂质） 或新药制剂（Q3B 新药制剂中的杂质）中所述的杂质控制原则，或者 符合上述三者。 2. 指导原则的范围 指导原则范围包括原料药、 赋形剂或制剂中所含残留溶剂． 因此， 当生产或纯化过程中会出现这些溶剂时。应进行残留溶剂的检验。也 只有在上述情况下，才有必要作溶剂的检查。虽然生产商可以选择性 地测定制剂， 但也可以从制剂中各成分的残留溶液水平来累积计算制 剂中的残留溶剂。如果计算结果等于或低于本原则的建议水平，该制 剂可考虑不检查残留溶剂， 但如果计算结果高于建议水平则应进行检 测， 以确定制剂制备过程中是否降低了有关溶剂的量以达到可接受水 平。果制剂生产中用到某种溶剂，也应进行测定。 本指导原则不适用于临床研究阶段的准新原料药、 准赋形剂和准 制剂。也不适用于已上市的药品。 本指导原则适用于所有剂型和给药途径。短期（如 30 天或更短） 使用或局部使用时，允许存在的残留溶剂水平可以较高。应根据不同 的情况评判这些溶剂水平。 有关残留溶剂的背景附加说明见附录 2。
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USP[467]有机挥发性杂质 残留溶剂限度 Ⅰ级需避免的溶剂 已知人体实验致癌物质； 强烈疑似人体实验致癌物质；环境危害物质 Ⅱ级需被限制的溶剂 动物实验非生殖毒性（遗传）；动物实验致癌物质或其它可能的非可逆致病因子；产生毒性如神经毒性或致畸性； 其它疑似重大但可逆毒性 Ⅲ级具有低潜在毒性溶剂 对人体存在低毒性溶剂；无人体摄入量规定（注：Ⅲ级残留溶剂PDEs上限为≥50mg/天） 表1 Ⅰ级残留溶剂 溶剂浓度限度（ppm）不良反应 苯 2 致癌物四氯化碳 4 中毒和外周脑组织损害1，2-二氯乙烷 5 中毒 1，1-二氯乙烷8 中毒 1，1，1-三氯乙烷1500 环境危害 Ⅱ级残留溶剂 表2 Ⅱ级残留溶剂 溶剂PDE（mg/天）浓度限度（ppm） 乙腈Acetonitrile 4.1 410 氯苯Chlorobenzene 3.6 360 氯仿Chloroform0.6 60 环己烷Cyclohexane38.8 3880 1，2-二氯乙烯 1,2-Dichloroethene 18.7 1870 1，2-二甲氧乙烷 1.0 100 N，N-二甲基乙酰胺 N,N-Dimethylacetamide 10.9 1090 N，N-二甲基甲酰胺 N,N-Dimethylformamide 8.8 880 1，4-二氧六环 1,4-Dioxane 3.8 380 2-乙氧基乙醇 1.6 160 乙二醇Ethylene glycol 6.2 620 甲酰胺Formamide 2.2 220
己烷Hexane 2.9 290 甲醇Methanol30.0 3000 2-甲氧基乙醇0.5 50 甲基丁基（甲）酮 0.5 50 2-己酮 甲基环己烷11.8 1180 二氯甲烷 6.0 600 N-甲基吡咯烷酮 5.3 530 硝酸甲烷0.5 50 吡啶 2.0 200 环丁砜 1.6 160 四氢呋喃7.2 720 1，2，3，4-四氢化萘 1.0 100 甲苯8.9 890 三氯乙烯0.8 80 二甲苯* 21.7 2170 *通常含有60%间-二甲苯，14%对-二甲苯，9%邻-二甲苯和17%乙苯 Ⅲ级残留溶剂 表3 Ⅲ级残留溶剂 （GMP或其它原料药、赋形剂和药物制剂质量标准规定） 醋酸Acetic acid 庚烷Heptane 丙酮Acetone 乙酸异丁酯 苯甲醚乙酸异丙酯 正丁醇乙酸甲酯 2-丁醇3-甲基-1-丁醇 乙酸丁酯甲基乙基酮 叔丁基甲基醚甲基异丁基酮 异丙基苯2-甲基-1-丙醇 二甲基亚砜戊烷 乙醇1-戊醇 乙酸乙酯1-丙醇 乙醚2-丙醇 甲酸乙酯乙酸丙酯 甲酸 表4 其它残留溶剂 （缺乏足够的毒物学方面的资料） 1，1-二乙氧基丙烷甲基异丙基酮 1，1-二甲氧基甲烷甲基四氢呋喃 2，2-二甲氧基丙烷溶剂己烷 异辛烷三氯醋酸 异丙醚三氟醋酸除另有规定外，样品中残留的有机挥发性杂质不得超过下表中规定限度：
Identification and control residual solvents (残留溶媒的定性与控制) The test procedures described in this general method may be used: 基本方法中描述的步骤可能用的到： 1）当残留溶媒为不可知时，主要是第一类、第二类残留溶媒在(an active substance,excipient or medicinal product)活性中间体（原料药），赋形剂，医药产品中的定性。 2）第一类、第二类溶媒在(an active substance,excipient or medicinal product)活性中间体（原料药），赋形剂，医药产品中的限度检测。3）当第二类溶媒限度超过1000ppm（0.1%）的定量检测，或者当需要时第三类溶媒的定量检测。 第5.4章列出第一、二、三类残留溶媒 3种溶剂用于样品制备和顶空进样条件选择。 2种色谱体系体系A更合适而体系B常用于定性分析。样品制备过程取决于被检测物的溶解性和一定程度上的残溶的控制。 下列残留溶媒不宜用顶空进样检测： 2-乙氧基乙醇（2-ethoxyethanol）、2-甲氧基乙醇（2-methoxyethanol）、乙二醇(ethylene glycol)、甲基吡咯烷酮（NMP）(N-methylpyrrolidone)、环丁砜(sulfolane) 用其他合适的方法来控制这类残留溶媒。 当一种方法用于定量控制某种物质里的残留溶媒，必须对它进行
验证。 方法、步骤（PROCEDURE） 静态顶空气相色谱法检测（2.2.28） 样品制备1. 用于水溶性的物质里的残留溶媒控制。 样品溶液（1）用水(water R)溶解0.200g被测物并用它稀释到20.0ml。 样品制备2. 用于不容于水的物质里的残留溶媒控制。 样品溶液（2）用DMF溶解0.200g被测物并用它稀释到20.0ml。 样品制备 3 用于当确定或怀疑被测物质里含有N,N-二甲基乙酰胺N,N-二甲基甲酰胺中的一种或两种时的残留溶媒的控制。 样品溶液（3）用DMI溶解0.200g被测物并用它稀释到20.0ml。 有时以上所列样品制备方法不太适合，这时选择溶剂用于制备样品溶液和使用静态顶空，一定要验证它的适用性。 溶媒溶液 溶媒溶液（a）取1.0ml第一类残留溶媒（CRS）加9ml二甲亚砜，并用水(water R)稀释到100.0ml，用水稀释上述溶液 1.0ml到100.0ml。再用水稀释上述溶液1.0ml到100.0ml。 对照溶液限度如下： 苯：2ppm 四氯化碳：4ppm 1,2-二氯乙烷：5ppm
气相色谱仪用途和分析 一、气相色谱仪用途和应用领域主要有以下方面： 石油和石油化工分析：油气田勘探中的化学分析、原油分析、炼厂气分析、模拟蒸馏、油料分析、单质烃分析、含硫/含氮/含氧化合物分析、汽油添加剂分析、脂肪烃分析、芳烃分析。 环境分析：大气污染物分析、水分析、土壤分析、固体废弃物分析。 食品分析：农药残留分析、香精香料分析、添加剂分析、脂肪酸甲酯分析、食品包装材料分析。 药物和临床分析：雌三醇分析、儿茶酚胺代谢产物分析、尿中孕二醇和孕三醇分析、血浆中睾丸激素分析、血液中乙醇/麻醉剂及氨基酸衍生物分析。 农药残留物分析：有机氯农药残留分析、有机磷农药残留分析、杀虫剂残留分析、除草剂残留分析等。 精细化工分析：添加剂分析、催化剂分析、原材料分析、产品质量控制。 聚合物分析：单体分析、添加剂分析、共聚物组成分析、聚合物结构表征/聚合物中的杂质分析、热稳定性研究。 合成工业：方法研究、质量监控、过程分析。 二、分析实例： （一）天然气常量分析： 选用热导检测器，适用于城市燃气用天然气O2、N2、CH4、CO2、C2H6、C3H8、i-C40、n-C40、i-C50、n-C50等组分的常量分析。分析结果符合国标GB10410.2-89。 （二）人工煤气分析： 选用热导检测器、双阀多柱系统，自动或手动进样，适用于人工煤气中H2、O2、N2、CO2、CH4、C2H4、C2H6、C3H6等主要成分的测定。分析结果符合国标GB10410.1-89。 （三）液化石油气分析①： 选用热导检测器、填充柱系统、阀自动或手动切换，并配有反吹系统，适用于炼油厂生产的液化石油气中C2-C4及总C5烃类组成的分析（不包括双烯烃和炔烃）。分析结果符合SH/T10230-92。 液化石油气分析②：
气相色谱法在环境分析中的应用 摘要：气相色谱法是一种很常见的环境分析检测方法，我们也经常将它应用在水、大气、固废等环境检测中。我们以检测非甲烷烃为例来进行探究和学习，（非甲烷烃是一种对人体健康有害的气体）因此我们利用带有双柱双氢火焰离子化检测器的气相色谱仪（岛津GC2014型）和自己所学的知识来对此进行气相色谱检测。并且通过这次检测来了解和复习流动相、检测器、色谱柱以及温度等色谱条件是如何选择以及定性、定量分析方法。 关键词：非甲烷总烃；气相色谱法；定性、定量分析； 1．非甲烷总烃 非甲烷烃(NMHC通常是指除甲烷以外的所有可挥发的碳氢化合物(其中主要是C2～C8，又称非甲烷总烃。主要包括烷烃、烯烃、芳香烃和含氧烃等组分。大气中的非甲烷总烃超过一定浓度，除直接对人体健康有害外，在一定条件下经日光照射还能产生光化学烟雾，对环境和人类造成危害[1]。 监测环境空气和工业废气中的NMHC有许多方法，但目前多数国家采用气相色谱法。由于直接测定NMHC所用仪器价格昂贵，因此我们采用双柱双氢火焰离子化检测器气相色谱法分别测出总烃和甲烷的含量，两者之差为NMHC的含量。在规定的条件下所测得的NMHC是于气相色谱氢火焰离子化检测器有明显响应的除甲烷外碳氢化合物总量，以碳计[2]。 目前我国基本采用气相色谱法测定非甲烷总烃, 按进样的不同有活性炭吸附一热解吸法及针筒采样一手动进样法，采用活性炭吸附一热解吸法[3]易受到活性炭吸附效率的影响，而针筒采样——手动进样法[4]则重复性较差、易熄火。而我们采用气袋采样—气体自动进样器进样分析气体中非甲烷总烃，而这样也最令人满意。此方法操作简单、重复性好、效率高、干扰少，且可用于其他挥发性有机物，如苯系物等的测定。 2．利用气相色谱法检测非甲烷总烃
四、附录 16
1、残留溶剂表示方法 1.1允许日接触量 允许日接触量（permitted daily exposure, PDE）是指某一有机溶剂被允许摄入而不产生毒性的日平均最大剂量，单位为mg/天。某一具体有机溶剂的PDE值是由不产生反应量、体重调整系数、种属之间差异的系数、个体差异、短期接触急性毒性研究的可变系数等推算出的。部分有机溶剂的PDE 值见附录。由于国内目前尚未对此有系统的研究，附录中所列出的数据均是参考ICH残留溶剂研究指导原则中的数据。 1.2浓度限度 在PDE 表示方法的基础上，为了更加便于计算，引入了浓度限度（％）表示方法，其计算公式为浓度限度（％）＝PDE（mg/天）9 /（1000×剂量（g/天））×100％，其中剂量初步定为10g/天。部分有机溶剂的浓度限度见附录。 1.3两种表示方法的比较 以上两种表示方法在残留溶剂研究中均可行，但需要指出的是，PDE值是绝对值，也就是说无论原料药、辅料和制剂，只要能明确各成分的溶剂残留量，以PDE值来计算是很精确的；而对于某一具体制剂来说，由于很难确定处方中各活性成分和各辅料的残留溶剂水平，因此以浓度限度来计算更为简便，只要日摄入总量不超过10g，就无需进一步计算。综合以上情况并考虑目前国内的实际情况，由于大多数药物的日摄入量不会超过10g（包括活性成分和辅料），浓度
限度表示方式是目前更为简便可行的。当然，在某些原料、辅料或制剂的残留溶剂不符合浓度限度时，可根据实际测定的各种残留溶剂量及用法用量计算实际日接触量，并与PDE值比较，如符合限量要求则也属可行。 此外，虽然本指导原则采用浓度限度的表示方式，但由于PDE 值的精确性，药物研发者可采用适当的PDE 值的方式进行残留溶剂研究。
原料药或制剂中有机溶剂的残留量一般要求控制在几个至几千个ppm之间，属于微量或痕量测定，与常量测定有着不同的特点。残留溶剂检查方法的选择对测定结果有着重要的影响，有时采用不同的方法测定同一个样品会得到截然不同的结果。 通过对最近一段申报资料的审评，经常发现在残留溶剂的检查方法尚不合理的情况下，若样品的色谱图中未出现溶剂峰，也未经其它系统验证，研究者就简单地作出样品无该溶剂残留的结论，进而不将其残留定入质量标准，药检所也不再进行复核。针对这种情况，从审评的角度出发，就如何评价残留溶剂检查方法的合理性谈自己的一些认识，与各位业内同仁交流。 有机残留溶剂检查一般采用气相色谱法，评价色谱系统的适用性和方法学验证资料遵循与液相色谱方法评价相同的原则，不再赘述。与液相方法不同的是，气相色谱有多种进样方式，残留溶剂检查常用直接进样法或顶空进样法。针对这两种进样方法不同的特点，评价方法合理性的要点应有所不同。对于直接进样法，应着重评价方法的灵敏度和重复性。目前已普遍用毛细管柱取代填充柱，因为毛细管柱的柱效高，其灵敏度也较填充柱大为提高。但由于毛细管柱直接进样的体积小，一般仅几微升，即使提高供试溶液的浓度，对于测定限量极低的溶剂（如：苯、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等）及对FID检测器响应低的溶剂（如：含氯的溶剂），其检测限一般接近或高于限量，灵敏度难以满足测定的需要。测定此类溶剂最好采用顶空进样法，对含卤素的溶剂可改用电子捕获检测器（ECD）。进样量小也易造成进样重复性差，采用内标法较外标法的结果更为准确。 顶空进样法是将大量样品中的残留溶剂富集在顶空瓶上层的气体中，对绝大多数有机溶剂而言，灵敏度较直接进样法大为提高，但顶空进样系统中存在气液两相的平衡问题，对结果准确性的影响因素增多。评价方法是否合理，应着重关注以下三个方面：1）顶空条件：顶空瓶的平衡温度和时间是最重要的参数，根据溶解样品的溶剂和待测溶剂的不同性质，达到气液平衡所需的温度和时间可能不同，应有试验数据作为选择的依据，但在申报资料中一般都未提及。判断顶空条件是否适用，一般的规律是：顶空瓶的平衡温度应低于溶解样品所用溶剂的沸点10℃以下，能满足检测灵敏度即可；对于沸点过高的溶剂，如DMF、DMSO、聚乙二醇等，用顶空进样测定的灵敏度不如直接进样，不适宜采用顶空法；顶空瓶的平衡时间一般应为30至60分钟，才能保证气液两相达到稳态平衡。 2）供试品和对照品是否平行：由于供试品和对照品的液体部分状态不完全一致而造成的基质效应会直接影响到结果的准确性。采用标准加入法可以消除基质效应，但目前在国内的申报资料中较少见到，其原因可能是方法较为繁琐，且需要消耗大量的样品，对新药研发初期样品量较少的情况或一些贵重的药品不太适用。如果申报资料中提供了回收率数据，就容易判断基质效应的大小，但由于目前对此没有强制要求，大多数资料都未对回收率进行研究。因此在评价方法时，至少应要求对照品和供试品采用相同的溶剂溶解，且液体部分的体积应完全一致。 3）重复性：由于顶空进样法存在气液平衡和气体进样的问题，粗放度较大，中国药典2005年版的要求是：内标法连续五次进样的相对标准偏差小于5％，外标法的相对标准偏差小于10％；欧洲药典则要求相对标准偏差小于15％，因此重复性应密切关注。 此外，无论是直接进样或顶空进样，都应尽量使供试液中的样品完全溶解，否则当残留溶剂被包裹在样品晶格中时就不能被检测出来，可能造成结果与实际情况完全不符。对溶解性差的样品，可采用不挥发性酸或碱的溶液、高沸点的有机溶剂、混合溶剂等来溶解样品，即使样品在加热的条件下可能被破坏，只要待测的残留溶剂不被破坏（如：测定酯类溶剂不