激光扫描共聚焦显微镜技术简介
李鹏云曾晓荣
（泸州医学院心肌电生理学研究室，四川泸州
６４６０００）
中图分类号Ｒ３１８．５１
文献标识码Ａ
文章编号１０００－２６６９（２００６）５－０４６９－０２
作者简介：李鹏云（１９７６－），女，研究实习员，硕士。
激光扫描共聚焦显微镜（ＬＳＣＭ）是随着光学、视频、计算机等技术的迅速发展而诞生的一种高科技产品。它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，成为形态学﹑
分子细胞生物学﹑神经科学﹑药理学﹑遗传学等领域新一代强有力的研究工具。不仅可对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的“光学切片”；进行单标记或双标记细胞及组织标本的荧光定性定量分析；还可用于活细胞生理信号，离子含量的实时动态分析监测，粘附细胞的分选，细胞激光显微外科和光陷阱技术等。此外在应用荧光光漂白恢复（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｃｏｖｅｒｙａｆｔｅｒｐｈｏｔｏ－
ｂｌｅａｃｈｉｎｇ－ＦＲＡＰ），光漂白中的荧光丢失（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｌｏｓｓｉｎｐｈｏｔｏｂｌｅａｃｈｉｎｇ－ＦＬＩＰ）研究蛋白分子的运动以及荧光共振能
量转移技术（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＲｅｓｏｎａｎｃｅＥｎｅｒｇｙＴｒａｎｓｆｅｒ－ＦＲＥＴ）研究蛋白质分子之间的相互作用方面具有独特的优势［１￣２］。
１ＬＳＣＭ的基本组成及原理
ＬＳＣＭ的组成除光学显微镜部分之外主要由激光发射
器、扫描装置、光检测器、计算机系统（包括数据采集，处理，转换，应用软件）、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统组成。
ＬＳＣＭ利用放置在光源后的照明针孔（ｓｏｕｒｃｅａｐｅｒｔｕｒｅ）和
放置在检测器前的探测针孔（ｄｅｔｅｃｔｏｒａｐｅｒｔｕｒｅ）实现点照明和点探测。激光扫描束经照明针孔形成点光源，经分光镜（Ｂｅａｍ
Ｓｐｌｉｔｔｅｒ）反射后，通过物镜在样品聚焦。对标本内焦平面上的
每一点进行扫描，标本上的被照射点所发射的荧光沿同一光路进入物镜，穿过分光镜后在探测针孔处成像，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。然后经探测针孔后的光电倍增管（ＰＭＴ）或冷电感耦合器件（ｃＣＣＤ）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。共聚焦是指光路（激发和发射）在两个位置上聚焦。在共聚焦扫描装置中，照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，激发光聚焦在标本上而发射光聚焦在针孔上。
另外，还可通过计算机控制显微镜载物台上的微量步进马达使显微镜上下步进移动，从而实现对细胞或组织切片进行类似ＣＴ断层扫描的无损伤连续光学切片，然后经过计算机的三维重构，能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结构（见附图）。
附图ＬＳＣＭ工作原理示意图（引自ＬＳＣＭ（ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ２）培训教材）
２ＬＳＣＭ与普通显微镜的区别２．１光源
普通显微镜采用的自然光或灯光是一种场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰。ＬＳＣＭ以激光为光源，激光具有单色性强﹑
方向性好﹑高亮度﹑相干性好等优点，可以避免普通显微镜的缺点。一般常用的气体激光器如氩（Ａｒ）﹑氪（Ｋｒ）﹑氦（Ｈｅ）﹑氖（Ｎｅ）。
２．２空间分辨率
普通显微镜摄影是场摄影，同时包含了焦点和非焦点的影像，必然受到物镜分辨率和切片厚度的制约。而ＬＳＣＭ对标本上的每个点都是在焦点上的摄影，其在Ｘ－Ｙ轴上的最佳空间分辨率可达０．２￣０．２５μｍ，较普通显微镜要高出４０％［３］；在Ｚ轴上的最佳空间分辨率可达０．５￣０．６μｍ［４］。
２．３瞬时分辨率［５］
ＬＳＣＭ较普通显微镜的另一大优点是可以实时动态观察
活体组织标本。ＬＳＣＭ的荧光检测器可以毫秒级或微秒级的速度检测荧光，即其时间分辨率极高，能对细胞内的分子进行功能性动态观察；检测灵敏性极强；还可对荧光进行精确定量分析。
泸州医学院学报
２００６年
第２９卷第５期ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｕｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＶｏｌ．２９Ｎｏ．５
２００６４６９
泸州医学院学报２００６年第２９卷第５期ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｕｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅＶｏｌ．２９Ｎｏ．５２００６
２．４图像处理
ＬＳＣＭ的图像是以电信号的形式记录下来的，可以采用各种模拟的和数字的电子技术进行图像处理。另外，ＬＳＣＭ图像分析软件系统功能强大，可对图像进行三维重建分析，获得时空上大量多样信息，而普通显微镜则是望尘莫及的。
３ＬＳＣＭ使用的技术要点
３．１样品准备
样品的最大厚度大约１￣２ｍｍ（１０×／０．４物镜），它取决于物镜的数值孔径（ＮＡ）、物镜的工作距离、激光的穿透力以及样品的透明度。一般要求是单层贴壁细胞，可以是经荧光探针标记（单标、双标、三标）固定的或活的组织；固定的或活的贴壁培养细胞（Ｃｏｎｆｏｃａｌ专用小培养皿，盖玻片）；用盖玻片封片的经甩片或滴片后的悬浮细胞。对于非贴壁细胞的粘贴，一般常用的粘贴剂有多聚赖氨酸﹑伴刀豆球蛋白﹑ｃｅｌｌ－ｔａｋ﹑ｖｅｃｔａｂｏｎｄ﹑琼脂凝胶等。选择粘贴剂的标准是：不影响实验目的，对标本无损害［１］。
３．２样品的荧光标记
３．２．１荧光探针的选择
实验标本须经过荧光染色后才能进行ＬＳＣＭ的观察与分析。目前分子探针公司（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）就提供了１８００多种荧光探针，因此正确选择适宜的荧光探针对于样品的制备至关重要。一般情况下应当根据研究目的、研究方法、所用机器类型选择合适的荧光探针种类和商品形式。如需要进行两种以上的荧光标记时，应当注意这两种荧光探针的性质：如激发波长是否可以分开，颜色是否相同，对环境温度﹑ｐＨ等的敏感性等。此外，激光光源﹑荧光探针的量子产率﹑光漂白﹑光毒性以及标记物的性状（活细胞﹑死细胞﹑细胞器等）均需加以考虑。
３．２．２荧光探针的负载
染色过程的一般原则是在保证一定信噪比的前提下，尽量降低所用荧光染料的浓度，消除其对待测离子的缓冲作用。根据荧光染料的不同，一般可采用孵育﹑显微注射﹑转基因或经膜片钳微电极尖端导入细胞等方法进行负载。
影响胞内染料浓度及分布的因素，一方面由细胞所决定：如细胞膜表面积﹑使染料去酯化的酯酶在胞内的含量及分布等，它们是影响染色的主要因素。另一方面与具体的实验条件有关：如孵育时间﹑孵育温度﹑孵育混合物的搅拌程度﹑初始的染料浓度及细胞浓度等［６］。因此，对于不同的样品，荧光探针的负载条件应当在参考文献的基础上不断进行探索。
３．３ＬＳＣＭ的使用
在成像前，首先要明确想要达到的预期目标，这样可以节省时间同时提高成功率。根据标本选择的荧光探针的激发波长选择激光器的类型；根据荧光探针的发射波长选择相应的滤片。然后选择合适的软件，设置相关的参数进行实验。由于ＬＳＣＭ是一种高度精密的仪器，其激光发射器﹑光检测器以及扫描装置均很精细，因此操作者必须受过专门培训方能独立使用。
我院的ＬＳＣＭ（ＬｅｉｃａＴＣＳＳＰ２－ＲＳ）是目前国内唯一一台速度最快的激光扫描共聚焦显微成像系统。它拥有高灵敏度，高信噪比的激光扫描器，与徕卡倒置光学显微镜（ＤＭＩＲＥ２）相连接；三只激光器［红色（ＨｅＮｅ６３３ｎｍ／１０ｍＷ），绿色（ＨｅＮｅ５４３ｎｍ／１．２ｍＷ）和蓝色（Ａｒ４５８ｎｍ／５ｍＷ；４７６ｎｍ／５ｍＷ；４８８ｎｍ／２０ｍＷ；５１４ｎｍ／２０ｍＷ）］紫外４０５ｎｍ／５０ｍｗ以及６通道ＡＯＴＦ声光调制器；配备的物镜包括干镜（１０×，２０×ＡＰＯ，４０×ＡＰＯ）；油镜／甘油镜（６３×ＡＰＯ）和油镜（１００×ＡＰＯ）。
可进行特定兴趣区域扫描，多种扫描方式及系列扫描：扫
描面积为２２毫米，扫描分辨率达１０２４×１０２４，线性扫描速率８０００线／秒；另外具有４００￣８５０ｎｍ超宽带的光谱响应范围。同时超宽的ＳＣＳＩ数据接口可加速数据的处理速率。同时该系统提供的全在线帮助界面方便应用。
近年来随着双光子ＬＳＣＭ，多光子多焦点ＬＳＣＭ等新型
的共聚焦激光显微镜的出现，其独特的成像方式及精确的计算机测量定位系统，使其在生物学尤其是细胞生物学领域的应用越来越广泛。当然，ＬＳＣＭ也存在一些不足，比如激光管有使用寿命的限制；检测过程中需要使用荧光染料，增加了检测成本；激光存在荧光漂白作用及细胞毒性，应在使用过程中加以关注。
参考文献
１．李楠．激光扫描共聚焦显微镜概述．见：李楠，尹岭，苏振１．伦，主编．激光扫描共聚焦显微镜术［Ｍ］．北京：人民军医出１．版社，１９９７；１￣１１
２．ＰａｄｄｏｃｋＳＷ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅａｎｄｐｒａｃｔｉｃｅｓｏｆｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｃｏｎｆ－１．ｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ［Ｊ］．ＭｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０００；１６（２）：１２７
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６．ＨａｕｇｌａｎｄＲＰ．Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆｆｌｕｏｒｓｅｃｅｎｔｐｒｏｂｅｓａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈ１．ｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｍ］．Ｔｈｅ９ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ．ＳＡ：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＩｎｃ，２００２；７７１￣７８０
（２００６－０４－２７收稿）
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