硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定
摘要本实验以小麦为实验材料，对小麦进行预处理，提取酶液进行硝酸还原酶与谷氨酰胺合成酶活性的测定，说明小麦对氮素的利用途径。
关键词小麦硝酸还原酶谷氨酰胺合成酶酶活性
引言
硝酸还原酶(NR)是植物代谢中十分重要的一种酶,它主要是在硝酸亚硝化过程中起催化作用。同时, 它对其他代谢如光合作用、碳代谢和能量代谢都有重要影响[1]。就植物的生长和发育而言 ,氮素的同化是个十分重要的生理过程。其中 ,无机氮必须同化为谷氨酰胺和谷氨酸等有机氮才能被植物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶 (GS) 是高等植物氮代谢中十分重要的酶 ,它和谷氨酸合成酶联合作用 ,催化氨的同化 ,使其转变成 Gln 和 Glu ,在小麦植物体内含氮有机物的生物合成中作为 N 的供体[2]。
1、实验材料与方法
1.1实验材料与试剂
小麦、亚硝酸钠、磷酸氢二钠、对氨基苯磺酸、浓盐酸、萘基乙烯胺、硝酸钾、三氯乙酸、反应液、终止液、显色液、亚硝态氮标准溶液、三羟甲基氨基甲烷、硫酸镁、二硫苏糖醇、蔗糖、浓盐酸、谷氨酸钠盐、半胱氨酸、乙二醇双（氨乙基醚）四乙酸（EGTA）、盐酸羟胺、氯化铁、三氯乙酸、三磷酸腺苷（ATP）。
1.2实验原理
1.2.1硝酸还原酶活性的测定
硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-
萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。此红色偶氮化合物在540nm下有最大吸收峰，可用分光光度计测定。故硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示，而亚硝态氮的量可有标准曲线查的。
1.2.2谷氨酰胺合成酶活性的测定
谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它能催化植物体内在硝酸还原过程中产生的氨与谷氨酸形成谷氨酰胺，实现氨的同化，在生物体内，谷氨酰胺既是氨的贮存形式（消除氨毒），又可用于谷氨酸的合成，在进一步合成其他氨基酸。但在该实验设计反应体系中，谷氨酰胺与盐酸羟胺等物质发生反应，生成γ-谷氨酰基异羟肟酸。此物质在酸性条件下可与Fe3+形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。因此，谷氨酰胺合成酶的活性可用产生的γ-谷氨酰基异羟肟酸与Fe3+形成的络合物的量来表示，一般间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位为：A?mg-3(protein) ?h-1。
1.3实验步骤
1.3.1硝酸还原酶活性的测定
1.3.1.1标准曲线制作
取7支试管，按下表顺序依次添加试剂。摇匀后在30℃下水浴20min，然后在540nm下比色。以亚硝态氮含量与对应吸光值建立回归方程。
符号 1 2 3 4 5 6 7
试剂
（ml ）亚硝酸钠
标准液
蒸馏水
1% 磷胺
0.02%α-
萘胺
酶管含亚
硝态氮
（ug）
0.0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0
4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
0.0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
1.3.1.2硝酸还原酶活性测定
植株预处理、取样、酶活性反应：先往对照瓶中加入1ml终止液，然后往3个瓶中均加入9ml反应液；混匀后立即放入真空干燥箱中，抽真空15min（期间停顿几次通入空气，再抽真空，使叶片完全沉入瓶底）；之后将各瓶在30℃、黑暗条件下静置反应30min；反应时间到，立即往两个测定瓶中加入1ml 终止液；将各瓶摇匀，再静置3min。最后进行显色反应，根据标线求得亚硝态氮含量。计算硝酸还原酶活性。
1.3.2谷氨酰胺合成酶活性的测定
1.3.
2.1酶液的提取
称取植物叶片1.0g，置于预冷研钵中，加3ml酶液提取液，置冰浴上研成匀浆，转移于寓心管中，在4℃下、15.000转离子20min，上清液即为酶液。
1.3.
2.2谷氨酰胺合成酶活性测定
取3支试管，分别加入0.7ml酶液和0.7mlATP溶液：然后往其中1支加入1.6ml反应混合液A（作为对照管），另外2支各加入1.6ml反应混合液B（作为反应管），混匀后，将3支试管均置于37℃水浴下反应30min；反应结束
后，3支试管均立即加入1ml显色液，摇匀，静置片刻后，取上清液在540nm 处测定吸光值（用酶液提取液调零），根据吸光值计算酶活性。
1.3.
2.3酶液中可溶性蛋白含量测定（采用紫外吸收法）
取酶液0.3ml，用蒸馏水定容至100ml，分别在260nm和280nm下测定吸光值（用蒸馏水调零），根据公式计算酶液中可溶性蛋白含量。
2、实验结果与分析
2.1硝酸还原酶活性的测定
2.1.1标准曲线的测定以及硝酸还原酶活性的测定
图1 标准曲线
2.1.2样品活性的测定
通过实验得出对照管，测试管1，测试管2的吸光值（表1）。
表1硝酸还原酶的吸光值
1 2 3 平均值
对照管0.005 0.015 0.009 0.0097 测试管1 0.039 0.016 0.029 0.028 测试管2 0.031 0.035 0.036 0.034
通过以上的数值代入标准曲线中可以得出硝酸还原酶含量，即硝酸还原酶的活性（表2）。
表2 不同管内亚硝态的量
编号亚硝态氮的量 P≤0.5
对照管0.318 a
测试管1 0.629 b
测试管2 0.764 c 通过以上的数据统计，可以得出亚硝态氮的量，即为硝酸还原酶的活性，从实验的结果来看，实验管和对照关差异显著，实验前测试管用硝酸钾处理，小麦中硝酸还原酶明显增多，硝酸还原酶的活性明显增强。
2.2谷氨酰胺合成酶活性测定
以γ-谷氨酰基异羟肟酸与Fe3+形成的络合物在540nm波长下的吸光值（表3）。
表3 540nm波长下的吸光值
1 2 3 平均值
对照管0.558 0.596 0.620 0.591 测试管1 0.806 1.002 1.018 0.942 测试管2 1.328 1.096 1.115 1.179 可溶性蛋白利用紫外吸收法测定，通过测定在不同波长下溶液的吸光值，然后利用公式进行计算，根据公式可以算出（表4）：可溶性蛋白的含量
=1.55A
280-0.76A
260
表4 可溶性蛋白的含量
编号可溶性蛋白的含量 P≤0.5
对照管0.053 a
测试管1 0.089 b
测试管2 0.101 c
由表3和表4得到的数据可以代入以下公式，计算得出谷氨酰胺合成酶的活力（表5）：通过测定谷氨酰胺合成酶在540nm吸光值和粗蛋白质的含量，通过公式就可以计算出谷氨酰胺合成酶活性，计算公式常用的是：GS=A/
（P*V*T）在上面的公式中：A为540nm波长下的吸光值；P为可溶性蛋白的含量；V为反应体系中加入的酶量；t为反应时间（h）。
表5 谷氨酰胺合成酶的活力
编号谷氨酰胺合成酶的活力 P≤0.5
对照管0.319 a
测试管1 0.322 b
测试管2 0.337 c
通过试验结果表明，三个实验试管中谷氨酰胺合成酶的活力之间差异性不显著，说明了植株体内的谷氨酸含量不是很高，很可能与实验前的处理时间长短有关系。
3、讨论
硝酸还原酶(NR)是陆生植物氮代谢的关键酶之一, 它将进入植物体内的
NO
3-还原为 NO-
2
, 进而在亚硝酸还原酶的作用下还原为氨进入氮的同化。因此,
NR 活性直接影响植物对土壤中硝态氮的利用能力。生产中, 硝酸还原酶活性可作为农作物氮肥形态选择的重要依据, 也被认为是作物氮高效的育种选种指标之一[3,4]。GS 在氮同化过程中起着十分重要的作用 , GS 也是分子生物学研究基因专一性表达和时空表达调控的好模式 ,所以成为人们研究的热点之一 ; 同时它的表达既受环境因素 ,如 CO2 、光、 NaCl 浓度等的影响 ,又受到发育因子的影响 ,因此 ,也是植物逆境生理研究的重要内容之一[5]。在硝酸还原酶活性测定中，抽真空后不能见光是因为酶对反应条件很敏感，可能在光照的条件下就失活，另外，硝酸会见光分解。实验前充分光照是使小麦的酶活性达到
最大值。空白对照的目的在于有一个在同样条件下结果的对比。谷氨酰胺与盐酸羟胺等物质发生反应，生成γ-谷氨酰基异羟肟酸。此物质在酸性条件下可与Fe3+形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰。在试验中测得可溶性蛋白的含量，利用公式即可算出谷氨酰胺合成酶的活力。随着氮代谢相关基因研究的进一步深入，与植物氮素营养反应相关的基因更为明确，利用基因表达差异进行植物氮营养的早期检测，将为更加准确、及时地进行肥料运作提供科学依据。
参考文献
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植物体内硝酸还原酶活力的测定 P56—59 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键美，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：NO3—＋NADH＋H+ →NO2—＋NAD++H2O产生的亚硝酸盐与对—氨基苯磺酸（或对—氨基苯磺酰胺）及α—萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度计法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即ug·g—1·h—1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性好。 一、离体法 仪器与用具： 冷冻离心机；分光光度计；天平；冰箱；恒温水浴锅；研钵；剪刀；离心管；具塞试管（10ml）；移液管（5、2、1ml）；洗耳球。 试剂： 亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g溶于去离子水定容至1000ml，然后再吸收5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug/ml的标准溶液； 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml； 1%（W/V）溶液：1.0g对氨基苯磺酸溶于100ml 3mol/L HCl中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/L HCl）； 0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶中； 0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液中； 0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12H2O ，0.0570g K2HPO4·3H2O加去离子水溶解后定容至1000ml； 提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸，0.0372g EDTA溶于100ml 0.025mol/L PH8.7的磷酸缓冲液中； 2mg/ml NADH溶液：2mg NADH溶于1ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液（临用前配置）。 方法： 1. 标准曲线制作
实验9 硝酸还原酶活性的测定 一、目的 学会植物组织中硝酸还原酶活性的测定方法。 二、材料用具及仪器药品 木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、洗耳球 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）、0.2mol/L KNO3）；磺胺试剂、a-苯胺试剂，NaNO2 标准溶液： a—萘胺试剂配制：0.2克a—萘胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。 磺胺试剂配制：取1克磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml. NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解，定量至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水定量至1000ml，该溶液每ml含有NaNO25ug，用时稀释之。 磷酸缓冲液： 贮备液A：0.2mol/L NaH2PO4溶液（27.8g NaH2PO4·H2O配成1000ml）。 贮备液B：0.2 mol/L Na2HPO4溶液（53.65g Na2HPO4·7H2O或Na2HPO4·12H2O 配成1000ml）取A液16ml+B液84ml，用水稀释至200ml 三、原理 硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于NO—3还原于NO—2 NO—3+NADH+NO—2+NAD++H2O 产生的NO-2可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2的含量的高低，即表明酶活性的大小。 NO-2含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺sulfanil—amide）比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO2。 四、方法步骤 1．将新鲜叶片（蓖麻、烟草、木茨叶等）水洗，用吸水纸吸干水分，然后用1cm的钻孔器钻取的圆片，在天平上称取等量的叶圆片两份，每份0.5克，（或每份取50个叶圆片），分别置于含有下列溶液的三角瓶中，（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml。（2）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，叶圆片即沉于溶液中，（如果没有真空瓶，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器内,，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使之真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使叶圆片中的空气抽去，并沉于溶液中），将三角瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml，以测定NO-2含量。 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可在反应溶液中加入30μmol/L 的 3—磷酸甘油醛或1.6——二磷酸果糖，能显著增加NO-2的产生。 2．NO-2含量的测定 保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，先加入磺胺试剂2ml，后加入一
实验三预习报告硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定一、硝酸还原酶的测定[原理]: 硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及α-萘胺(或萘基乙烯胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以-1-1ug.g.h为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 [试剂] 1(亚硝酸钠标准溶液:准确称取分析纯NaNO0.9857g溶于去离子水后定容至1 2-1000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml的标准液; 2(0.1molpH7.5的磷酸缓冲液:NaHPO.12HO30.0905g与NaHPO.2HO 242242 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml; -13(1%(W/V)溶液:1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.LHCL中(25ml浓-1盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.LHCL); (0.02%(W/V)萘基乙烯胺溶液:0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，4 贮于棕色瓶中; -1-15(0.1mol.LKNO溶液:2.5275g KNO溶于250Ml 0.1mol.LPh7.5的磷酸缓冲33 液中; -16(0.025mol.LPh 8.7 的磷酸缓冲液:8.864 0g NaHPO12HO，0.0570g 24.2
食品添加剂硝酸盐亚硝酸盐的毒性和人体健康的危害 毒理与功能评价所陈新霞奚清丽王民生 常见的硝酸盐(nitrate)为硝酸钠，为白色细小结晶状粉末，稍带淡灰色或淡黄色，无臭，味略苦咸，易潮解和溶于水，其水溶液为中性，高热时分解为亚硝酸钠。硝酸盐广泛用作于食品加工业中的发色剂和防腐剂。 亚硝酸盐(nitrite)俗称“硝盐”，外观及滋味都与食盐相似，人们通常称为“工业用盐”。亚硝酸盐主要指亚硝酸钠，它是一种白色或淡黄色结晶状颗粒或粉末，无臭，味咸稍带苦味，易潮解，易溶于水，难溶于乙醇和乙酸，其水溶液的pH为9，能缓慢吸收空气中的氧而转变为硝酸钠。亚硝酸盐主要用于生产各种染料和某些有机合成、金属表面的热处理，也常在肉类制品中允许作为发色剂限量使用。 硝酸盐和亚硝酸盐广泛分布于自然环境，主要来源是含氮肥料的大量使用。食品、燃料、炼油等工厂排入环境和水体中的大量含氮废弃物和氮氧化物，经过生物、化学转换后均形成硝酸盐，而造成地表水和地下水的硝酸盐污染，在硝酸盐还原菌的作用下，硝酸盐还原成亚硝酸盐。无机、有机含氮肥料和农药的大量使用，导致土壤中硝酸盐富集化，菜根从土壤中获取养分的同时，也摄入了大量硝酸盐，一些蔬菜如卷心菜、花椰菜、胡萝卜、芹菜、菠菜等通常含有很高的硝酸盐（1000 ～3000mg／kg），一般成年人每天摄入的硝酸盐约100mg 。蔬菜中的硝酸盐，在腌制过程中极易被还原成亚硝酸盐。在食品加工中，硝酸盐和亚硝酸盐常作为肉制品的发色剂添加于食品原料中，以增加腌肉制品的色泽和抑制微生物的繁殖及毒素的产生，来延长保质期和提高腌肉的风味。 人体主要通过饮食摄入过多的硝酸盐与亚硝酸盐，这两种物质在我国A级绿色食品中不得使用。1994年联合国粮农组织和WHO规定了硝酸盐和亚硝酸盐的每日容许摄入量（ADI 值）分别为5mg／kg和0.2mg／kg。我国食品安全国家标准食品添加剂使用标准（GB2760-2011）规定，在肉制品中硝酸盐(硝酸钠，硝酸钾)的最大使用量不得超过500mg ／kg，亚硝酸盐的最大使用量不得超过150mg／kg。在肉制品中亚硝酸盐的最终残留量不得超过30mg／kg，肉罐头中不得超过50mg／kg。婴儿对硝酸盐和亚硝酸盐敏感，因此，欧共体建议亚硝酸盐不得用于婴儿食品，硝酸盐应限制使用。 硝酸盐与亚硝酸盐主要从消化道进入人体。含有大量硝酸盐的饮水、粮食、鱼、肉制品、蔬菜、渍酸菜、隔夜炒菜等食用后，在口腔可被唾液中硝酸盐还原酶还原成亚硝酸盐进入人体。 唾液腺可以浓缩富集硝酸盐并分泌到口腔中，唾液中的硝酸盐水平是血液中的20倍。Xia等比较了Sjogren综合征、腮腺良性肥大患者和健康成人的腮腺液、混合唾液、血液和尿液中硝酸盐、亚硝酸盐含量后发现，Sjogren综合征患者混合唾液中硝酸盐、亚硝酸盐的总量均明显低于健康对照组和腮腺良性肥大组，而Sjogren综合征患者尿液中硝酸盐、亚硝酸盐的总量均明显高于健康对照组。Xia等还通过建立小型猪腮腺破坏萎缩的动物模型来进行硝酸盐负荷实验研究，结果发现当双侧腮腺破坏后混合唾液中硝酸盐、亚硝酸盐含量明显降低，给予硝酸盐负荷后腮腺破坏组混合唾液中硝酸盐、亚硝酸盐升高的幅度明显低于对照组，而尿液中的硝酸盐含量却明显高于对照组。说明腮腺是机体硝酸盐代谢的重要器官,而机体维持高浓度的唾液硝酸盐含量可能与口腔抗菌作用有关。 唾液中的硝酸盐随吞咽运动进入胃中,在正常情况下在胃和十二指肠重吸收入血，经血循环回到唾液腺，再次分泌到唾液中，经历了从十二指肠→唾液腺→口腔→十二指肠的循环过程，这种循环使硝酸盐不断地在口腔被还原成亚硝酸盐，人体内80%亚硝酸盐都是从这个循环得到的。在病理情况下，如一些疾病导致胃酸过低时，胃液中的一些硝酸盐还原菌活性增强，也可使硝酸盐还原为亚硝酸盐。Hunault的研究表明硝酸盐在胃肠道高吸收，而在
一、实验目的和要求 掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。 二、实验内容和原理 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸 盐： 产生的NO2-可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定NO2-含量的增加，即表示该酶活性的大小。 NO2-含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰胺）反应产生重氮，再与α–萘胺（或萘基乙烯二胺）偶联形成紫红色的偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定，利用标准曲线确定溶液中NO2-含量。 三、主要仪器设备 1、实验仪器分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。 2、实验试剂0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液 3、实验材料在15-25℃蒸馏水培养一周的大麦苗两组，一组加KNO3，一组加NH4Cl，在白天置光照下处理。 四、操作方法和实验步骤 1、剪取新鲜的叶片两组，一组是处理苗0.51g，另一组是对照苗0.50g，叶片各剪为0.5~1cm的碎片，压实。 2、两组中各加入15ml的酶促反应液。 3、真空抽取10min，充分交换细胞内外液。 4、加盖在30℃的保温箱中保温20min。 5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。 6、比色：在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 7、空白管：4mlH2O +磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml 室温放置15min同样在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 五、实验数据记录和处理 称重：处理苗0.51g；对照苗0.50g OD值：处理苗0.513A；对照苗0.050A NO2- 含量标准曲线：Y=257.29X-4.8262（X=OD值；Y=NO2含量（nmol）） 有标准曲线得出NO2-的含量：处理苗：C NO2-=127.16nmol 对照苗：C NO2-=8.038nmlo 硝酸还原酶活力(nmol NO2-·g-1·h-1)= 根据OD值从标准曲线上查得的NO2（nmol）×3 ×15/4/m 硝酸还原酶活力：处理苗=2805 nmol NO2-·g-1·h-1对照苗=180.855 nmol NO2-·g-1·h-1 六、实验结果与分析
货号: QS1807 规格：50管/24样谷胺酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： GS（EC6.3.1.2）主要存在于植物中，是生物体内氨同化的关键酶之一，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺，不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性，而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运输形式。 测定原理： GS在ATP和Mg2+存在下，催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成红色的络合物；该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：30mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：粉剂×2瓶，-20℃保存。用时每瓶加入5mL蒸馏水充分溶解备用，用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂四：10mL×1瓶，4℃避光保存。 样本测定的准备： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页
硝酸还原酶的测定方法 硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮简单易行，在一般条件下都能做到。红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。仪器药品721型分光光度计真空泵（或注射器）保温箱天平真空干燥器钻孔器三角烧瓶移液管烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml 蒸馏水器中。磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水器稀释至100ml。α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水器中，稀释至100ml。NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水器溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。操作步骤 1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测 3. ．绘制标准曲线与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水俗中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线。实验作业1．试比较不同植物的酶活性。2．试比较取样前植物处于照光或黑暗条件下酶活性的不同。参考文献1．陈薇、张德颐：1980。植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化，植物生理学通讯，1980(4)：45—49。2．周树、郑相穆：1985。硝酸还原酶体内分析方法的探讨，植物生理学通讯，1985(1)：47—49。3．Hageman,R.H.and D.P. ．Hucklesby:1971.Methods in Enzymology,23A:491—503. 4．Radin.J.W.:1973.Plant Physiology,51:332—336. 5．Snell,F.D.and C.T.Snell:1949.Colorimetric Methods of Analysis,Vol.II,802—807 （华东师范大学张志良）参考资料：硝酸还原酶活性的测定一、材料用具及仪器药品木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、
硝酸还原酶的测定 一、实验目的和要求 掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。 二、实验内容和原理 硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐: --产生的NO可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定NO含量的增加，即表示该酶活22 性的大小。 装 -NO含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸(或对–氨基苯磺酰2 订 胺)反应产生重氮，再与α–萘胺(或萘基乙烯二胺)偶联形成紫红色的偶氮化合物。生成的红色偶氮 线化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定，利用标准曲线确定溶液中NO2-含量。三、主要仪器设备 1、实验仪器分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。 2、实验试剂 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液 3、实验材料在15-25? 蒸馏水培养一周的大麦苗两组，一组加KNO3，一组加NH4Cl，在白天置光照下处理。 四、操作方法和实验步骤
、剪取新鲜的叶片两组，一组是处理苗0.51g，另一组是对照苗0.50g，叶片各剪为0.5~1cm的碎片，压1 实。 2、两组中各加入15ml的酶促反应液。 3、真空抽取10min，充分交换细胞内外液。 4、加盖在30?的保温箱中保温20min。 5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。 6、比色:在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 7、空白管:4mlH2O +磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml ,室温放置15min同样在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 五、实验数据记录和处理 称重: 处理苗0.51g;对照苗0.50g OD值:处理苗0.513A;对照苗0.050A - NO含量标准曲线:Y=257.29X- 4.8262(X=OD值;Y=NO2含量(nmol)) 2---有标准曲线得出NO的含量:处理苗:C NO=127.16nmol 对照苗:C NO=8.038nmlo 222--1-1硝酸还原酶活力(nmol NO?g?h)= 根据OD值从标准曲线上查得的NO2(nmol)× 3 × 15/4/m2 -1-1-1-1 --硝酸还原酶活力:处理苗=2805 nmol NO?g?h 对照苗=180.855 nmol NO?g?h22 六、实验结果与分析 1、实验结果分析:实验表明用硝酸钾处理的苗比用氯化铵处理的苗硝酸还原酶活力更强～而且根据测出 的亚硝酸的含量～处理苗是对照苗的10倍左右～远比旁边几组的高～因为可能是因为在取材的时候～取了粘有培养液的根部～但并没有用蒸馏水洗去吸附在上面的硝酸根、亚硝酸根～或者根部的硝酸还原酶活性更多,猜测,。 2、诱导时如用NaNO3 替代KNO3结果会如何，为什么,
货号：MS1801 规格：100管/96样谷氨酸合成酶（Glutamate synthase，GOGAT）试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： GOGAT广泛分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同构成GS/GOGAT循环，参与氨同化的调控。 测定原理： GOGAT催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸；同时NADH氧化生成NAD+，340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体20mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存； 粗酶液提取： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、样本测定 （1）在试剂二中加入9mL试剂一充分溶解混匀，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用（配好后3h内用完）； （2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL试剂二，混匀，立即记录340nm 处20s时的吸光值A1和 5min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。 GOGAT活性计算： a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 GOGAT（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。 第1页，共2页
首都师范大学生命科学学院实验报告 实验题目硝酸还原酶活性的测定 一、实验原理 硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于 NO 使之还原为 NO 。 NO -+ NADH + H + — NO 2- + NAD + + H 2O 产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。 NO 含量的测定----磺胺法 NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。 —、实验用品 1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗 2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤 1. 分别配制反应液于小烧杯中 (1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml (2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2- 的获得 (1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。 (2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气， 内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。 3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。 4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。 5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓 度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。 课程名称植物生理实验 实验时间2010331 成绩 姓名唐倪文 班级_3 学号 1090800032 NaNO 浓度为横坐标。具
实验27 植物体内GS 谷氨酰胺合成酶活力的测定 【原理】 谷氨酰胺合成酶（GS ）是植物体内氨同化的关键酶之一，在A TP 和Mg 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol ·mg ﹣1protein ·h ﹣1。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1。 【仪器与用具】 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml 、1ml ）。 【试剂】 提取缓冲液： 0.05mol/L Tris-HCl ，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT ，0.4mol/L 蔗糖。称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g ，0.1245g MgSO 4·7H 2O ，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml ； 反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）： 内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2mmol/L EGTA ，称取 3.0590g Tris ，4.9795 gMgSO 4·7H 2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA ，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml ； 反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）： 反应混合液A 的成分再加入80mol/L 盐酸羟胺，pH7.4； 显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3和0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2O ，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml ； 40mmol/L A TP 溶液：0.1210g A TP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。 【方法】 1.粗酶液提取 称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min ，上清液即为粗酶液。 2.反应 1.6ml 反应混合液B ，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml A TP 溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml ，摇匀并放置片刻后，于5,000g 下离心10min ，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。 3.粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml ，用水定容至100ml ，取2ml 用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（见实验28）。 4.原始数据记载 5.结果计算： GS 活力(A ·mg ﹣1 protein ·h ﹣1)＝t V P A ?? 式中 A —540nm 处的吸光值； P —粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml ）； V —反应体系中加入的粗酶液体积（ml ）； T —反应时间（h ）。
硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒使用说明 可见分光光度法50管/24样产品简介： NR（EC1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。 NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ+NADH+H＋→NO2ˉ+NAD＋+H2O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体20mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂五：标准储备液1mL，-20℃保存。 诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL 蒸馏水，充分混匀。
0.1umol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取0.1ml试剂五加9.9mL 蒸馏水，充分混匀。 操作步骤： 一、样品测定的前处理： 1、取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30min，取出样本，滤纸吸干。（根据需要进行诱导处理） 2、称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴研磨，4000g，4℃离心10min，取上清冰上放置待测。 二、NR测定操作： 1，分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 2，样本测定（在EP管中加入下列试剂） 试剂名称（μL）测定管对照管标准管空白管 样本100100 0.1μmol/mL NaNO2100 双蒸水500100 试剂一375375375 试剂二125125125 混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃(其他物种）水浴30min 试剂三250250250250 试剂四250250250250 混匀，显色20min，4000g常温离心10min，取上清，540nm下比色。
实验三、硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的测定 一、硝酸还原酶的测定 [原理]： 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以ug.g-1.h-1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。 [试剂] 1．亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO20.9857g溶于去离子水后定容至1 000ml，然后再吸取5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug.ml-1的标准液；2．0.1molpH7.5的磷酸缓冲液：Na2HPO4.12H2O30.0905g与NaH2PO4.2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1 000ml； 3．1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于100ml 3 mol.L-1HCL中（25ml浓盐酸加水定容至100ml 即为 3 mol.L-1HCL）； 4．0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g萘基乙烯胺溶于100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中； 5．0.1mol.L-1KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250Ml 0.1mol.L-1Ph7.5的磷酸缓冲液中； 6．0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液：8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于1 000ml去离子水中； 7．30%三氯乙酸溶液：30g三氯乙酸。水溶后定容至100ml。 [方法]； 摇匀后在25度下保温30min，然后在540nm下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。 2.样品中硝酸还原酶活力测定 1.在取材的前一天加50mmol/L KNO3或NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。 2.称取作物叶片0.5g（共3份，剪成1cm 左右的小段（均匀），放入3只三角瓶中，其中 1份作对照，另外2份作酶活性测定用。 3.反应：先向对照三角瓶中加入1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入9ml 0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽气30分钟（期间几次通入空气，再 抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在25℃黑暗中反应0.5小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入1ml30%三氯乙酸终止酶反应。
谷氨酰胺合成酶活性的测定 一．试剂 （1）酶提取缓冲液（0.05mol/L Tris- HCl，pH 8.0；内含2mmol/L Mg2+、2mmol/L DTT、0.4mol/L蔗糖） 称取 Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]1.5295 g，MgSO4·7H2O 0.1245g，DTT（二硫苏糖醇）0.1543 g和蔗糖34.23 g，去离子水溶解后，用0.5~1.0 mol/L HCl调至pH 8.0，最后定容至250 mL。 （2）酶反应液 1.对照反应液A（0.1mol/L Tris- HCl缓冲液，pH 7.4；内含80mmol/L Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA-Na2）称取1.2236 g Tris、1.9918 g MgSO4·7H2O、0.3451 g谷氨酸钠盐、0.2422 g半胱氨酸、0.0744 g EDTA-Na2，分别用去离子水浴解后，用0.5~1.0mol/L HCl调至pH 7.4，定容至100mL。 2.完全反应液B（含盐酸羟胺、pH 7.4的0.1mol/L Tris- HCl缓冲液） 除了反应混合液A的成分外，再添加80mmol/L盐酸羟胺（每100 mL 中含0.5560 g盐酸羟胺）。 （3）显色剂（0.2mol/L TCA、0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液） 称取3.3176 g TCA（三氯乙酸）和10.1021 g FeCl3·6H20，用去离子水溶解后，加5mL浓盐酸，定容至100mL。 （4）40mmol/L ATP溶液
称取0.2420 g ATP溶于10 mL去离子水中（临用前配制）。 二．实验步骤 （1）粗酶液的提取 取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加5mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,12000g离心20min,上清液即为粗酶提取液 （2）GS活性的测定 取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中，加入0.5mL粗酶液和0.5mL ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5 h，加入1mL显色剂终止反应，摇匀，室温下放置5min后，于3500r/min下离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度，以加入1.0mL对照反应液A的为对照。三．结果处理及计算 GS活性[A540/(g·h）]= A540为540nm处的吸光度； m 为样品质量（g）； Vt为粗酶液总体积（mL）； Vs为反应体系中加入的粗酶液体积（mL）； t 为反应时间（h）。
谷氨酰胺合成酶活性测定 原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP 和M g 2+ 存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ—谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ—谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg －1 protein·h －1 。也可间接用540nm 处吸光值的大小来表示，单位A·mg －1 protein·h －1 。【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 ·7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g 蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml；反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 ·7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl 调至pH7.4，定容至250ml；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A 的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 ·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml 浓盐酸，定容至100ml；40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去离子水中（临用前配制）。【方法】1.粗酶液提取称取植物材料1g 于研钵中，加3ml 提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4℃下15,000g 离心20min，上清液即为粗酶液。2.反应 1.6ml 反应混合液B，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml ATP 溶液，混匀，于37℃下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g 下离心10min，取上清液测定540nm 处的吸光值，以加入1.6ml 反应混合液A 的为对照。3.粗酶液中可溶性蛋白质测定取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml 用考马斯亮蓝G-250 测定可溶性蛋白质（见实验28）。 4.原始数据记载 5.结果计算：GS 活力(A·mg －1 protein·h －1 )＝式中A—540nm 处的吸光值；P—粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）；V—反应体系中加入的粗酶液体积（ml）；T—反应时间（h）。
植物体内谷氨酰胺合成酶活力的测定 一、实验原理 谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的γ─谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位μmol·mg﹣1protein·h ﹣1。也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A·mg﹣1 protein·h﹣1。 二、仪器与用具 冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2ml、1ml）。 三、试剂 1、提取缓冲液：0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，内含2mmol/LMg2+，2mmol/L DTT， 0.4mol/L蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4·7H 2 O， 0.1543g DTT（二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 调至pH8.0，最后定容至250ml； 2、反应混合液A（0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）：内含80mmol/L Mg2+，20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EGTA，称取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4·7H 2 O, 0.8628g谷氨酸钠盐，0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子 水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容至250ml； 3、反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4； 4、显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3·6H 2 O，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定 容至100ml； 5、40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。