第一部分概述
第一章生化实验技术实验的基本要求
一、实验室规章制度
1. 实验前认真预习实验教材中相关的实验内容，了解实验目的、要求和基本的实验过程。
2. 进入实验室必须穿戴好实验服，实验室内保持安静，严禁大声喧哗；无故不得迟到或早退，不得在实验室内吸烟和用餐。
3. 上课认真听讲，按照教材和老师的指导进行实验，实验过程中若有疑问或遇见问题，请及时询问教老师，切勿自己盲目处理。
4. 保持实验台的清洁整齐，实验试剂取用完毕后应几时归放原位，及时盖好试剂瓶盖，避免实验试剂被污染。公用物品用毕放回原处，不得私自占用。
5. 实验仪器的使用严格按照操作规程进行，要爱护实验室的仪器设备，文明使用，如遇仪器设备的故障请及时与老师联系。如人为因素引起的实验仪器设备损坏将按照规定进行赔偿。
6. 注意用水、用电的安全，强酸、强碱、有毒及腐蚀性试剂的使用要特别注意，要戴手套进行操作。不得将高温、强酸、强碱、有毒及腐蚀性试剂抛洒在实验台上，避免伤害性事故的发生。
7. 实验废弃物应分类处理，一般性液体废弃物可倒入水池，并放水冲走；强酸、强碱可在稀释后倒入水槽并放水冲走，有毒或腐蚀性试剂应倒入指定的废液瓶中集中处理；动物尸体应放入指定的容器中集中处理。
8. 实验室内不准抽烟、进食，不准用实验室的容器盛放食物，不能在实验室的冰箱内存放食物，严禁将实验室的任何试剂入口。
9. 实验完毕，须将试剂排列整齐，整理好公用物品，清理打扫自己的实验台面，关闭仪器设备的电源，请指导教师检查，允许后方可离开。
二、实验注意事项及应急处理
（一）实验室安全和注意事项
实验的参与人员必须时刻把实验室安全放在首位，严格遵守实验室的规章制度和实验操作规范。
1. 实验操作过程中凡遇有能产生烟雾或有毒性腐蚀性气体时，应放在通风柜内进行。如果实验室内无此种设施，则必须注意及时打开窗户通气。
2. 以吸管取用试剂应使用橡皮吸球。对于剧毒或有腐蚀性的试剂的取用更要注意安全，应使吸管的尖端固定在液面下适当的位置，以防试剂进入吸球。如果不慎已吸入球内，则应随时洗净晾干。
3. 乙醚、乙醇、丙酮、氯仿等易燃试剂不可直接放在火源上蒸煮，以防容器破裂而引起火灾。遇有火险绝不要慌乱，应根据火情妥善处理。如系少量试剂引起的小火，可用湿抹布轻轻盖住即可熄灭；如已酿成大火，则应首先关闭电源（如实验室建筑有自动灭火装置，则不可关闭电源！），用二氧化碳灭火机或粉末灭火机扑灭（千万不可用水或酸碱泡沫灭火机
灭火！）；如果衣服着火，切勿惊慌，可以跑到室外就地打滚即可将身上的火扑灭。
4. 含有强腐蚀性试剂、毒害试剂的实验废液应随即倒入下水道，并用流水冲洗管道至少3分钟，以防废液滞留，损坏下水管道。
(二)应急处理（实验室意外事故的急救）
1. 皮肤灼伤处理皮肤不慎被强酸、溴、氯等物质灼伤时，应用大量自来水冲洗，然后再用5%碳酸氢钠溶液洗涤。
2. 强酸溶液进入口内的处理应立即用清水或0 1 mol/L氢氧化钠溶液漱口，再服用氯化镁、镁乳等和牛奶混合剂数次，每次约200毫升；或服用万应解毒剂（配法：木炭末2份、氧化镁1份及鞣酸1份混合而成）1茶匙。但不宜服用碳酸钠溶液，以免因和酸作用而产生过量气体反而加剧对胃的刺激。
3. 强碱溶液进入口内的处理立即用大量清水或5%的硼酸溶液漱口，再服用5%醋酸溶液适量，或服用上述万应解毒剂1茶匙。
4. 石炭酸类物质进入口内的处理立即用30%～40%酒精漱口，然后再服用30%～40%酒精适量，并设法尽可能将胃内容物呕吐出。
5. 氰化物进入口内的处理应立即用大量清水漱口，再服用3%过氧化氢溶液适量；静脉注入1%美蓝20毫升，再吸入亚硝酸异戊酯，并注意呼吸情况，必要时可进行人工呼吸。
6. 汞及汞类化合物进入口内的处理应立即服用生鸡蛋或牛奶若干，再设法使胃内容物尽量呕吐出来。
7. 碘酒或碘化合物进入口内的处理应立即服用米汤或淀粉若干，再设法使胃内容物尽量呕吐出来。
8. 酸、碱等化学试剂溅入眼内的处理先用自来水或蒸馏水冲洗眼部，如溅入酸类物质则可再用5%碳酸氢钠溶液仔细冲洗；如系碱类物质，可以用2%硼酸溶液冲洗，然后滴1～2滴油性物质起滋润保护作用。
9. 被电击的处理生化实验室内电器设备众多，如某项设备漏电，使用中则有触电危险。如有人不慎触电，首先应立即切断电源。在没有断开电源时绝不可赤手去拉触电者，宜迅速用干木棒、塑料棒等绝缘物把导电物与触电者分开，然后对触电者进行抢救。若发现触电者已失去知觉或已停止呼吸，则应立即施行人工呼吸；待有了呼吸即可移至空气新鲜、温度适中的房间里继续进行抢救。
10. 酸、碱等化学试剂溅洒在衣服鞋袜上的处理强酸或强碱类物质洒在衣服鞋袜上，应立即脱下用自来水浸泡冲洗；溅洒物如系苯酚类物质，而衣服又是化纤织物，则可先用60%～70%酒精擦洗被溅处，然后再将衣物放清水中浸泡冲洗。
以上仅是一般应急处理方法，重症者应送医院急诊室处理。
第二章实验样品制备的原则、策略和方法
第一节实验样品的制备的基本原则和策略
一、实验样品的制备的基本原则
生物样本是指植物、动物、微生物等生物的组成成分或是代谢物，一定数量和足够纯度
的生物样本的制备是进一步进行结构和功能研究的基础。由于生物样本的来源广泛、种类众多、组成复杂、容易失活等特点。所以在生物样本的制备过程中应当注意以下几个基本原则：
1. 实验材料的的选择
应根据实验的目的和要求，选择合适的实验材料进行实验，基本原则是应选择富含目标生物分子的实验材料，兼顾一些其它影响目标生物分子含量和检测的因素。
2. 避免或减少样品制备过程中可能产生的污染
根据制备不同的目标生物分子的要求，有选择性的避免一些可能的污染因素，在实验的器具，容器和制备过程中都需要注意。如在微量元素测定时要避免相关的金属离子的污染；提取蛋白质或核酸样品时应避免蛋白酶或核酸酶的污染，必要时应加入蛋白酶或核酸酶的抑制剂；酶的提取时应避免一些重金属的污染或金属螯合剂的污染。
3. 实验条件的选择
对于制备不同的目标生物分子，要根据实验的目的和要求，尽可能采取简单的样品制备过程，减少实验步骤。许多生物（大）分子一旦离开了生物体内的环境就极易失活，要注意控制实验过程的温度，尽量采取温和的实验条件，制备溶液体系的酸碱度和缓冲体系也很重要。所以生物分子的制备一定要选择最适宜的实验条件。
二、实验样品的制备的基本策略
生物样品的制备是一个复杂的实验过程，基本的实验过程和策略是：
1. 材料的选择和处理
选择富含目的组分的实验材料，如提取胰岛素要用生物的胰腺；选择一定生理状态的细胞，如染色体制备细胞周期的选择，微生物对数生长期时，酶和核酸的含量较高；去除一些杂质成分，如动物组织的结缔组织、脂肪等。
2. 组织、细胞的破碎
提取组织细胞内的物质，需要对细胞膜、乃至核膜、细胞器膜进行破碎，才能提取其中的生物组分或分子。不同生物的组织细胞破碎的方法有所不同，概括起来分为物理法、化学法和酶法。
3. 提取、分离
利用溶解或其它分离技术（如离心、过滤等）获取需要分离的靶组分（蛋白质，核酸、糖、脂肪、细胞器、细胞核或染色体），并将其与其它组分（杂质）进行初步的分离。
4. 纯化
在初分离的基础上，利用一系列的技术方法和手段（如盐析、电泳、层析，超离），进一步去除杂质组分，获取高纯度的目标组分。
5. 纯度检测
对于分离纯化得到的目标组分的纯度进行检测，如蛋白质的纯度分析，一般需要两种以上基于不同原理的分析方法证明某种蛋白质是纯的，它才有可能是纯的，而足够纯的生物组分的获取是进一步研究的基础。
6. 活性或功能检测和理化性质分析
实验样品制备的目的往往是为了获取有生物活性或功能的生物组分，所以靶生物组分的生物活性和功能的检测显得非常重要；理化性质的研究分析也是实验样品研究的重要内容。
7. 保存
获得了具有较高纯度和生物活性或功能的目标组分以后，需要将其进行保存，供后续研究使用。不同方法获得的不同生物组分的保存方法有所不同，可以是液态、固态或结晶。
第二节常用实验样品的制备
在分子医学的实验过程中，无论分析生物体内各种物质的含量，或是探索组织中的物质代谢过程，或是生物分子以及染色体样本的制备，都需要利用预先处理过的特定生物样品。掌握此种实验样品的正确处理与制备方法是做好分子医学实验的先决条件，最常用的实验样品如血液、组织样品（肝、肾、心肌、胰、肌肉）、微生物样品和植物样品等。由于不同的实验有不同的要求，因此对采集到的生物样品又往往需要预先做适当处理。掌握此种实验样品的正确处理与制备方法是做好生化实验的先决条件。
一、血液样品
1. 全血取出血液后，迅速盛于含有抗凝剂的试管内，同时轻轻混匀，使血液和抗凝剂充分混匀，以免血液凝固。取得的全血如不立即进行实验，应储存于4℃冰箱中。常用的抗凝剂草酸盐（1~2mg/ml全血）、柠檬酸盐（5mg/ml全血）、氟化钠（5~10mg/ml全血）、肝素（0.01~0.2mg/ml全血）。可将抗凝剂配成适度的水溶液，按需要量加入试管中，并涂布于试管壁，横放烘干备用。
2. 血浆将上述抗凝之全血在离心机中离心，白细胞下沉，上清液即为血浆。分离血浆时必须严格控制溶血，除采血时一切用具都需要清洁干燥外，取出之血液也不能剧烈振摇。
3. 血清收集的血液不加抗凝剂，在室温下约5~20分钟即自行凝固，通常经3小时，血块收缩而分离出血清。血块收缩后，应及早分离出血清，以免溶血。若血块粘着容器壁过紧，血清不易分离出来，可用细玻璃棒轻轻剥离，将血液离心，可分离得较快、较多。
4. 无蛋白血滤液分析血液中某些成分时，为了避免蛋白质的干扰，需预先除去血中的蛋白质成分。常用三氯醋酸、钨酸或氢氧化锌等沉淀剂与蛋白质作用，然后用过滤或离心方法制成无蛋白血滤液。
二、组织样品
在生物化学实验中，常常利用离体组织研究各种物质代谢与酶系的作用，也可以从组织中提取各种物质或酶进行研究。但生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。因此，利用离体组织作为提取材料或代谢研究材料时应在冰冷条件下迅速取出所需要的组织，并尽快进行提取或测定。
三、微生物样品
微生物细胞由于具有繁殖速度快，培养方便等特点，现已成为制备生物大分子的主要样品材料，如分子克隆表达产物的制备。微生物样品包括培养上清液（胞外组分）和菌体（胞内组分），胞内组分可以通过破碎菌体而获得，常用的方法有：超声波法和溶菌酶法。
四、植物样品
植物样品也是生物化学和中药学研究中经常使用的实验样品，主要是为了提取和制备植物中的生物活性组分，如植物多糖，皂甙类物质，黄酮类物质等。植物中的生物活性组分往
往可耐高温，所以植物样品处理可使用烘干等方法，有效成分的提取也可采用水煮法，其它植物样品的破碎方法还有：研磨法、匀浆法等。
第三节生物大分子的制备
生物大分子主要是指蛋白质（酶）和核酸，生物大分子的制备是对其研究的首要工作。生物大分子的制备的一般程序包括：①生物材料的选择与预处理；②破碎组织细胞；③抽提（适当的缓冲液－往往是低盐溶液）；④分离、纯化（沉淀如盐析法或有机溶剂法等，常需离心；层析法或电泳法）；⑤纯度的分析鉴定；⑥产物的浓缩、干燥。
生物大分子的制备时需注意：建立一个方便及灵敏的分析方法，估计每一步的提纯程度；选择富含生物大分子的实验材料；尽可能减少提纯步骤；避免生物大分子的变性如保持低温、适当的酸碱度、避免强烈搅拌、防止产生大量泡沫等；加入蛋白酶抑制剂可防止蛋白质的水解作用，添加二巯基苏糖醇等可避免氧化，添加金属离子螯合剂如乙二胺四乙酸（EDTA），可防止重金属离子对酶的失活，此外，在提取DNA时，EDTA可螯合DNase激活剂镁离子，从而抑制DNase的活性，防止DNA降解。最后还需注意提纯后的生物大分子很有可能会发生一定的结构变化并导致活性变化。
一、生物材料的选择与预处理
一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出实验所需脏器或组织，除去外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷的生理盐水洗去血液（必要时可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液），再用滤纸吸干，即可用于实验。
二、细胞的破碎
破碎细胞的方法有：
1．研磨或匀浆
适用于组织材料。准确称取新鲜组织，剪碎、加入适当的匀浆制备液，常用的匀浆制备液有生理盐水、PBS缓冲液等。（1）研钵研磨：加磨料（如玻璃粉、石英砂、氧化铝等）研磨。可将动物组织、植物组织、细菌或细胞与玻璃粉及缓冲液按一定比例混合成稠糊状，置冷研钵内用力研磨5分钟，离心取上清液。要注意磨料不能对所需成份有吸附作用。（2）在玻璃匀浆器内匀浆：由一根内壁经过磨砂的玻璃管和一根一端为球状（表面经过磨砂）的粗杆组成。操作时先把样品置于管内，再套入磨杆用手上下移动，左右旋转，反复多次即可将细胞破碎。在制匀浆时，一般需要将匀浆器或匀浆管置于冰浴中。匀浆器的内磨砂面与管壁磨砂面之间一般只有十分之几毫米，细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，机械切力对生物大分子破碎较少，但手动效率很低。有条件时可用电搅拌器带动磨杆，注意避免打碎匀浆器。
2．超声波破裂法
多用于处理微生物材料。超声波通常由超声震荡器发生。高频电发生器产生高强度超声信号，电功率转送器把超声波传送到它接触的溶液中去，这些超声波形成的冲击和振动引起细胞的破坏，选用各种大小的探头可以处理几毫升到1毫升的样品量。缺点是电功率转送器内产生大量的热。必需仔细注意被处理液的温度并使之保持冷却。破碎效果与样品浓度及所用频率有关。经足够时间的超声处理可以破碎细菌和酵母细胞，如在悬液中加进玻璃珠则时
间可缩短。超声处理时易形成自由基，而某些氧化性的自由基常常使一些不稳定的酶失活，提取一些对超声波敏感的核酸及酶宜慎重使用，加入半胱氨酸等巯基化合物可对某些酶起保护作用。
3．冻融法
把动物组织冷至-15至-20℃使之冰冻，然后缓慢融解。反复操作，大部分细胞及细胞内颗粒可被破碎。交替冷冻及融化也能使细菌细胞破裂，例如鼠伤寒沙门氏菌混悬液经几十次反复冻融，残存率极低，可能是自溶过程起作用。
4．酶法
使用分解细胞壁或细胞膜组成成份的酶类使细胞破裂。如溶菌酶它能专一性地破坏细菌细胞壁，水解糖肽组份的β-1，4-糖苷键。特别适用于革兰氏阳性细菌。
5．化学法
（1）表面活性剂：近年已广泛应用（特别用于分离呼吸链成份）。常用的有十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠、非离子型表面活性剂吐温40（Tween 40）或Triton X-100等，能破坏细胞膜使细胞瓦解，有时使酶易溶解，除去表面活性剂后酶仍留在上清液中。
（2）有机溶剂：常用丙酮、乙醇、丁醇等选择性地溶解细胞膜或某些含酯和类脂的细胞组份。可用于制备一些酶，但也易使一些酶失活，需在低温进行。
总的说来，化学法局限性相当大，因为表面活性剂、有机溶剂等能使多种生物活性成分遭破坏。反复冻融的效率较低，反复经历常温条件，有失活与自溶危险。所以只有一些机械的碎裂法和酶解法较常用，也可综合运用两种或两种以上的方法。
三、抽提
通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。目的是去除杂质，或提出有效成分。多数需要离心技术。抽提液包括缓冲液、稀酸、稀碱、有机溶剂等。一般理想的抽提溶液应具备的条件：①对有效成分溶解度大，破坏作用小；②对杂质不溶解或溶解度很小；③来源广泛、价格低廉、操作安全等。在提取过程中一般需注意低温操作，避免强烈搅拌，防止产生大量泡沫，避免与强酸、强碱及重金属离子作用等。如果需要从生物材料中提取酶和蛋白质时，可以考虑在抽提液中添加蛋白酶抑制剂，如二异丙基氟磷酸（DFP）、甲苯磺酰氟（PMSF）、对氯汞苯甲酸（PCMB）；或用亲和吸附等方法除去蛋白水解酶以保证所需的酶和蛋白质免遭蛋白水解酶的破坏，从而使质量与收率得到提高。如需要从生物材料中提取核酸时，则考虑在抽提液中添加蛋白酶如蛋白酶K，以去除核酸提取物中的蛋白质。
四、生物大分子的分离、纯化
常用的生物大分子分离纯化的方法和技术有沉淀、透析、超滤、离心、层析和电泳等。
（一）蛋白质（酶）的分离、纯化
1. 沉淀
有效成分作为沉淀与其它组分分离或杂质作为沉淀弃掉，多数需要离心技术。沉淀基本原理是根据各种物质的结构差异（如蛋白质分子表面疏水基团和亲水基团之间比例的差异）来改变溶液中的某些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），就能致使抽提液中有效成分的溶解度发生变化，也称溶解度法。有效成分与杂质溶解度的不同，经过适当处理，即可达到从抽提液中分离有效成分的目的。①盐析法——盐析/盐溶交替，硫酸铵；②有机溶剂沉淀法——甲醇/乙醇/丙酮；③聚乙二醇沉淀法——非离子型聚合物；④选择性沉淀法
——改变理化因子。
1）盐溶和盐析
在蛋白质水溶液中，加入少量的中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等，会增加蛋白质分子表面的电荷，增强蛋白质分子与水分子的作用，从而使蛋白质在水溶液中的溶解度增大，这种现象称为盐溶。当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析(salting out) 。盐析的原理是中性盐使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，使蛋白质从溶液中沉淀析出。盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。不同的蛋白质盐析所需的盐浓度不同，可进行分段盐析。如半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。
稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中常加入少量中性盐如0.15M的NaCl。
（2）有机溶剂沉淀蛋白质
凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。其沉淀原理是：①脱水作用；②使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。
（3）非离子多聚物沉淀法
非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂，最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒，近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。这类非离子多聚物包括不同分子量的聚乙二醇、葡聚糖、右旋糖酐硫酸钠等，其中应用最多的是聚乙二醇。用非离子多聚物沉淀生物大分子和微粒，一般有两种方法：①选用两种水溶性非离子多聚物组成液液两相体系，不等量分配，而造成分离。此方法基于不同生物分子表面结构不同，有不同分配系数。并外加离子强度、pH值和温度等影响，从而扩大分离效果。②选用一种水溶性非离子多聚物，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥相互凝聚而沉淀析出。
（4）选择性变性沉淀
其原理是利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。此方法可分为：①利用表面活性剂(三氯乙酸)或有机溶剂引起变性；②利用对热的不稳定性，加热破坏某些组分，而保存另一些组分；③利用对pH值的稳定性不同引起的酸碱变性。
2. 层析法
层析是分离纯化蛋白质最为常用的实验技术和方法。如离子交换层析，分辨力强，分离量大；凝胶过滤，基于分子筛的排阻效应，用于分离相对分子质量有明显差别的蛋白质，分辨力强，不会引起蛋白质变性，但将引起样本溶液的大量稀释，此外，也可用于除盐；亲和层析，利用蛋白质与配体分子之间特异的非共价结合的特性进行分离，分辨力很强，但一种配体只能用于一种或一类蛋白质。
3. 电泳法
种类繁多，其基本原理都是根据蛋白质在电场中泳动的速率与电场强度和蛋白质颗粒表面的净电荷量成正比。但蛋白质的泳动速率除决定于分子本身的性质外，还受电泳介质的性质等影响。
4. 透析法
利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。用途：脱去盐、小分子、水。
5. 超滤法
应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，可用于脱盐、脱水和
浓缩蛋白质溶液。
（二）核酸分离、纯化
核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，可用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法进行。分离、纯化过程应条件温和，防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，同时还应防止核酸酶作用（加入EDTA）。由于体内核酸都是与蛋白质结合以核蛋白体的形式存在，所以在制备核酸时要去除蛋白质。苯酚、氯仿等都是蛋白质的变性剂，能沉淀蛋白质而将核酸与蛋白质分开，另外还常加入蛋白水解酶（如蛋白酶K）以水解残留的蛋白质。此外，还可用非离子多聚物沉淀法分离核酸，如可以葡聚糖和聚乙二醇为两相系统分离单链DNA、双链DNA和多种RNA制剂。由于所用材料及方法的不同，得到的DNA 产量及质量均不同，所以获得基因组DNA后，均需检测DNA的产量（含量）和质量（纯度）。
五、纯度的分析鉴定
1. 蛋白质纯度鉴定：电泳法、层析法、免疫学方法等；
2. 核酸纯度鉴定：紫外分光光度法测定DNA、RNA的纯度；此外聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳（溴化乙啶，EB染色）亦可鉴定其纯度。参见生物大分子的分析。
六、产物的浓缩、干燥
1. 浓缩粗提样品减少体积或纯品浓缩。其目的是减小体积、初步分离、更换溶剂等。常用的方法有沉淀、吸附层析、离心、透析、超滤、冷冻干燥。
2. 冰冻干燥法通过升华从冻结的生物产品中去掉水份或其他溶剂的过程。冰冻干燥的过程中样品的结构不被破坏，固体成份被坚冰支持，冰升华时，在干燥的剩余物质里留下孔隙，保留了物质的生物和化学结构及其活性的完整性。
第二部分生化实验技术常用的实验技术和方法（离心分离技术、分光分析技术、电泳技术、层析技术）
第三章离心分离技术
离心技术是利用旋转运动所产生的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异而发展起来的一种分离技术，主要用于物质的分离、制备、纯化和分析。离心机是利用离心力分离液相中非均一物质或颗粒的仪器设备。不同的离心机结构、性能和用途等差别很大，如制备型离心机一次可以分离提纯大量的样品，比层析和电泳的样品制备量要大得多；分析型离心机不仅可以测生物大分子的分子量，还可以检验物质的纯度、构象和沉降系数等。
最早阶段的离心机为手摇式离心沉降器。以后根据生产和科学试验的发展需要，发明了水流驱动离心机和蒸汽驱动离心机。1910年出现了小型电动离心机。1924年，制成了油涡
轮驱动的分析型离心机。1927年发明了压缩空气驱动离心机。1948年，Ivan Sorvall 先生创建的索福公司开始研制离心机，于1950年推出全球第一台高速冷冻离心机 RC-1，以后发展了RC-2、RC-2B、RC-5、RC-5B Plus和RC-5C Plus。
第一节离心的基本原理和基本概念
一、离心的基本原理
离心是利用机械的旋转运动产生的离心力而对液体中的颗粒物进行分离、沉淀的一种实验技术和方法。液体中的颗粒物在容器内作圆周运动时受到一个向外的离心力的作用（F），同时也受到浮力（F'）的作用，颗粒物在离心场中沉降与否取决于F和F'的大小。
当悬浮液静置不动时，由于重力场的作用，液体中的颗粒状物逐渐沉降，粒子越重下沉越快，反之密度比液体为小的粒子就向上浮。微粒在重力场中移动的速率与微粒的密度、大小和形状有关，并且又与重力场的强度和液体的粘度有关。像红细胞大小的直径为数微米的微粒可以利用重力来观察它们的沉降速率。小于几个微米的微粒、病毒和蛋白质分子，则不可能仅仅利用重力作用来观察它们的沉降过程，因为微粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重，所以需要利用离心作用以产生强大的离心力场，克服溶液中微粒的扩散以加速其沉降的过程。
二、离心的基本概念
1.离心力（centrifuge force，F）
所谓离心力是指物体作圆周运动时形成的一种使物体脱离圆周运动中心的力。当离心机转子以一定的角速度ω（孤度/秒）旋转，颗粒的旋转半径为r（cm）时，任何颗粒均经受一个向外的离心力，即：F=ω2r
2.相对离心力（relative centrifuge force，RCF）
相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力加速度的倍数，单位是重力加速度g（980cm/s2），即RCF=ω2r/980。实用上，这一关系式常用每分钟的转数n（或revolutions per minute，rpm）来表示。由于ω=2πn/60，于是：
RCF=4π2n2r/（36003980）=1.119310-5n2r 。
在离心条件的表述上一般情况下，低速离心常以rpm来表示，高速或超速离心时用相对离心力“3ｇ”表示，ｇ是斜体，前面是乘号。例如300003ｇ表示的是作用在被离心物质上的离心力是地心引力的3万倍。在计算相对离心力时，应该注意旋转半径r的不同，由于离心管的不同位置与中心轴的距离往往是不同的，所以位于离心管中不同位置的被离心物所受到的相对离心力也是不同的，一般文献报道的相对离心力的数据常指其平均值（RCF 平均），即离心管中点的离心力。
为了真实反映颗粒在离心管不同位置处所受的离心力的不同及其动态变化情况。以固定角式转子的顶部（Rmin = 4.8cm）和底部（Rmax = 8.0cm）为例计算相对离心力RCFmin和RCFmax，转速为12000 rpm，计算结果为：
RCFmin = （1.119310-5）3（12000）234.8 = 77343ｇ
RCFmax= （1.119310-5）3（12000）238.0 = 128913ｇ
图3-1-1 角转离心机示意图
角转离心机的结构如图1-1-1所示，从以上计算结果来看，作用于离心管顶部和底部的离心力相差将近1倍，通常报道中所说的离心力往往指的是平均相对离心力（RCF平均）。可见仅仅用转数来表述离心力的大小是不太严谨的。
为了方便转速和离心力之间的换算，人们制作了半径（r）、相对离心力（RCF）和转速（n）三者之间的关系图（图1-1-2），降颗粒在离心管中所处位置不同，所受离心力也不同。计算颗粒的相对离心力（RCF）时，应注意离心管与转轴中心的距离r。
图3-1-2 离心机转数与离心力的列线图
3．沉降速率（v）
沉降速率指在强大离心力作用下，单位时间内颗粒沉降的距离。一个球形颗粒的沉降速率不但取决于所提供的离心力，也取决于颗粒的密度和半径，以及悬浮介质的粘度。计算公式为：v = Vω2r (σ-ρ)/η
式中，V为颗粒体积；σ为颗粒的密度；ρ为介质密度；η为溶液的粘度。
4．沉降系数（S）
沉降系数是指在单位离心力作用下待分颗粒的沉降速率。计算公式为：S= v /ω2r= V (σ-ρ)/η。沉降系数（S）与被离心物质的体积、密度差呈正比，与溶液的粘度成反比。S的单位是秒，为了纪念超速离心的创始人Svedberg，规定10-13秒称作一个Svedberg单位（S），即1S=10-13秒。S的数值受到相对分子质量和形状等特征的影响，因此常用来表示一种特殊分子或结构特性。例如细菌的核蛋白体的亚基具有40310-13秒和60310-13秒沉降系数的颗粒，分别称为40S和60S。
第二节离心机分类离心方法
一、离心机分类
1.按用途分类分为制备型离心机和分析型离心机。
2.按转速分类不同级别离心机的性能比较见表1-1-1
表3-2-1 不同级别离心机的性能比较
3.按结构、类型和用途分类 分为台式离心机、落地式离心机；普通室温离心机；冷冻高速离心机；血液洗涤台式离心机；台式低速自动平衡离心机等。
二、离 心 方 法
离心方法根据目的不同可分为制备离心方法和分析离心方法。制备离心法又可分为两大类型：差速离心法与密度梯度区带离心法。
（一）差速离心法
采用逐渐增加离心速率或低速与高速交替进行离心，使沉降速率不同的颗粒，在不同离心速率及不同离心时间下分批离心的方法，称为差速离心法。差速离心一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。进行差速离心时，首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。离心力过大或离心时间过长，容易导致大部分或全部颗粒沉降及颗粒被挤压损伤。当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，进一步加大转速对分出的上清液再次进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的沉淀及含更小而轻颗粒的上清液。如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得沉淀是不均一的，仍混杂有其他成分，需经再悬浮和再离心（2～3次），才能得到较纯的颗粒。差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。其优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。
类型
普通离心机 高速离心机 超速离心机 最大转速（rpm ）
10000 25000 可达75000 最大RCF （g ）
15000 89000 可达700000以上 分离形式
固液沉淀 固液沉淀分离 差速离心和密度梯度离心 转子
角式和外摆式转子 角式、外摆式转子等 角式、外摆式、区带转子等 仪器性能和特点 转速控制不是和精
确，基本是室温下
操作
有消除空气和转子间摩擦产热的制冷装置，速度和温度控制较为精确 备有消除空气和转子间摩擦产热的制冷装置和真空装置，速度和温度控制更为精确 应用
收集易于沉淀的较
大的颗粒或细胞 收集微生物、细胞碎片、大的细胞器、蛋
白和核酸沉淀物等 分离多重细胞器、病毒、以及蛋白质、核酸、多糖等
图3-2-1 差速离心示意图
（二）密度梯度区带离心法（简称区带离心法）
区带离心法是样品在一惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。该法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，既能分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点是：①离心时间较长；②需要制备梯度；③操作严格，不易掌握。区带离心法又可分为差速区带离心法（动态法或沉降速率法）和等密度离心法（平衡法或沉降平衡法）。
1. 差速区带离心法
将样品置于一个平缓的介质梯度中沉降。样品的颗粒按照其不同的沉降速率沉降，从而互相分离。离心一定时间后不同大小的颗粒将沉降于不同的层次，产生所谓“区带”。界面的移动可用适当的光学系统观察和拍照。这种方法适用于分离密度相似而大小有别的样品。沉降系数越大，往下沉降得越快，所呈现的区带也越低。沉降系数较小的颗粒，则在较上部分依次出现。从颗粒的沉降情况来看，离心必须在沉降最快的颗粒（大颗粒）到达管底前或刚到达管底时结束，使颗粒处于不完全的沉降状态，而出现在某一特定区带内。在离心过程中，区带的位置和形状（或宽度）随时间而改变，因此，区带的宽度不仅取决于样品组分的数量、梯度的斜率、颗粒的扩散作用和均一性，也与离心时间有关。时间越长，区带越宽。适当增加离心力可缩短离心时间，并可减少扩散导致的区带加宽现象，增加区带界面的稳定性。差速区带离心的分辨率受颗粒的沉降速率和扩散系数、实验设计的离心条件、离心操作的熟练程度的影响。
2. 等密度离心法
当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）形成区带，称为等密度离心法。离心时样品被置于一个较陡峭的密度梯度中沉降。该梯度的最大密度高于样品混合液的最大密度，梯度的最小密度低于样品混合液的最小密度，当样品颗粒沿梯度运动到与颗粒的浮力密度相同的密度层时，就停止了运动，经过一段较长时间的离心，样品中所有不同密度的颗粒都将停止在各自的等密度区域。此方法适用于分离大小相近而密度不同的样品。离心达到平衡后，不同密度颗粒各自分配到其等密度点的特定梯度位置上，形成不同的区带。大颗粒的平衡时间可能比梯度本身的平衡时间短，而小颗粒则较长，因此，离心所需时间应以最小颗粒到达平衡点的时间为准。等密度离心的有效分离取决于颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒的大小和形状无关。但后两者决定着达到平衡的速率、时间和区带的宽度。颗粒的浮力密度不是恒定不变的，还与其原来密度、水化程度及梯度溶质的通透性或溶质与颗粒的结合等因素有关。例如某些颗粒容易发生水化使密度降低。等密度离心的分辨率受颗粒性质（密度、均一性、含量）、梯度性质（形状、斜率、粘度）、转子类型、离心速率和时间的影响。颗粒区带宽度与梯度斜率、离心力、颗粒相对分子质量成反比。
第三节离心机的使用操作
1．将离心机放在平整坚固的台面或是地上，低速转动离心机检查离心机转动状态是否平稳。
2．检查套管与离心管大小是否相配，离心管应能在套管内自由转动不至太紧，套管软垫（用棉花或橡皮）是否铺好。套管底部是否有碎玻璃片或漏孔（玻璃片必须取出，漏孔经修补好后才能使用）。
3．检查合格后，将一对离心管分别放入一对套管中，然后连同套管一起分别置粗天平两侧，使两侧的总重量平衡（包括离心管、离心套管、离心管内装溶液的重量的总和），用滴管向较轻的一侧离心管与套管之间加水，直至天平两侧彼此相等为止。在配平时，勿使离心管套外部沾水，否则会影响结果。将各对已平衡的套管连同内容物放置于离心机内，两个等重的管必须放在对称位置，严禁在对称两侧离心管套中，仅一侧放置离心管。离心时离心机内不得留有离心管套。将离心管放入后，应先盖好离心机盖，检查所需电源电压的大小，再按要求将电源接通。
4. 接通电源开关，逐步旋转转速旋钮，速度调节应缓慢，增加离心机转速直至所需的转速。
5. 离心机转动时，如果机身不稳或声音不均匀时，应立即停止离心，重新检查重量是否对称和离心机是否放平稳。离心时，玻璃管、套管打碎应立即清除，重新配平后再离心。
6. 离心达规定时间后，将转速旋钮逐步回转到零。再关闭电源。不可以用手强制使其停止转动，因这样既损伤离心机，同时沉淀又可能被搅动浮起，待离心机停稳后，取出离心管及管套，最后将电源插头拨下。
第四章电泳技术
电泳（electrophoresis）是指带电颗粒在电场中的泳动。许多重要的生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都含有可电离基团，在非等电点条件下均带有电荷，在电场力的作用下，它们向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳技术就是利用样品中各种分
子带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品进行分离、纯化和鉴定的一种综合技术。可用于样品的制备、纯度鉴定、分子量测定等。
早在1809年俄国物理学家Reǔss就进行了世界上第一次电泳实验，从此这一技术不断地得到应用和发展。1937年瑞典生化学家Tiselius将电泳发展成为一种分离技术，建立了研究蛋白质的自由界面电泳方法，并因此荣获诺贝尔奖。由于自由界面电泳没有固定支持介质，扩散和对流作用较强，影响分离效果，于是在二十世纪50年代相继出现了固相支持介质的区带电泳。然而对于复杂的生物大分子，用滤纸、硅胶或醋酸纤维素膜等作为支持介质进行电泳，其分离效果仍不理想。1959年，Raymond和Weintraub，Davis和Ornstein先后利用人工合成凝胶作支持介质建立了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了区带电泳的分辨率和分离效果，增强了电泳技术的发展以及与其他技术结合配套的能力，电泳技术的发展也进入了突飞猛进、种类繁多、应用广泛的时期。
第一节基本原理
一、电泳的基本原理
已知当带电分子被置于电场中时，其在电场中所受到的力（F）等于电场强度（E）与该物质所带净电荷的数量（Q）的乘积，即F=EQ。这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F′）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F’的大小服从Stokes定律，即F′＝ 6πrην，式中r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，ν是粒子泳动速度(单位时间粒子运动的距离)。当带电分子匀速移动时，即达到动态平衡，F＝ F′，可得EQ＝ 6πrην。
ν/ E表示单位电场强度时带电颗粒的运动速率，称为迁移率（mobility），也称为电泳速率，以u表示，即
u＝ν / E＝Q/6 π r η。
由此式可见，粒子的迁移率在一定条件下决定于粒子本身的性质，即其所带电荷及其大小和形状，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。两种不同的带电颗粒（如两种蛋白质分子）一般具有不同的迁移率，故在电场中移动的速度一般会有所不同。在具体实验中，移动速率v为时间（以秒为单位）内移动的距离（以cm为单位），即
ν＝d / t 。
式中，t为时间；d为时间t内带电颗粒在电场中移动的距离。
又电场强度E为单位距离内电势差（以伏特为单位），即
E＝V / l （V表示电压），
以v ＝d / t，E = V / l代入前式即得
u=v/E=d/t÷V/l=dl/Vt 。
所以迁移率的单位为厘米2秒-1伏特-1。
某物质（A）在电场中移动的距离为
d A ＝u A Vt/l ；
物质（B）的移动距离为
d B ＝u B Vt/l 。
两物质移动距离的差为：
Δd ＝（dA-dB）＝（uA-uB）Et/l 。
该式指出，物质A和B能否分离决定于两者的迁移率。如两者的迁移率相同，则不能分离；如有差别则能分离。实验所选的条件如电压、电泳时间以及电场的距离这些在实验条件下是固定的。
在同一电场中，不同的带电颗粒具有不同的移动速率。移动速率常用迁移率u表示，定义为每单位电场强度下的泳动速度，即u ＝ν/E，故可导出：u = Q/（6πrη），由此可见，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。
由于粒子在电场中的迁移率在一定条件下决定于粒子所带电荷以及它的分子大小和形状，因而具有各自不同电荷和形状大小的分子在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离，如等电聚焦电泳；而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离，如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
二、影响带电粒子在电场中泳动的因素
1．生物大分子的性质待分离生物大分子所带电荷的多少、分子大小和性质都会对电泳产生明显影响。一般而言，分子所带电荷越多、直径越小、形状越接近球形，其电泳迁移速度越快。
2．缓冲液缓冲液pH值直接影响生物大分子的解离程度和带电性质，溶液pH值距离等电点愈远，生物大分子所带净电荷就越多，电泳时速度就越快。当缓冲液pH大于等电点时，生物大分子带负电荷，电泳时向正极移动；当缓冲液pH小于等电点时，生物大分子带正电荷，电泳时向负极移动。一般电泳还要求缓冲液的离子强度保持在一定范围（0.02～0.2）之间，离子强度过低则缓冲能力差，但离子强度过高则会形成较强的离子扩散层，引起电泳速度降低。此外，缓冲液粘度越大，电泳时受到的阻力越大，电泳分离速度越慢。
3．电场强度电场强度指每单位介质长度的电位梯度（又称电位差或电位降）。一般而言，电场强度越大，电泳速度越快。但随着电场强度的增大会引起通过介质的电流强度增大，从而造成电泳过程产生的热量增多，最终导致介质温度升高，可产生：①样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带加宽；②产生对流，引起待分离物的混合；③引起热敏感样品如蛋白质变性；④引起介质粘度下降、电阻降低等。降低电流强度，可以减少产热，但会延长电泳时间，引起生物大分子扩散增加，同样影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以通过适当冷却系统降低温度以获得较好的分离效果。
4．电渗液体在电场中对于固体支持介质的相对移动称为电渗。由于支持介质表面存在一些带电基团，如滤纸表面含有羧基，琼脂含有硫酸基等。这些基团电离后使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子在电场作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动。当电渗方向与电泳方向相同时则加快电泳速度；当电渗方向与电泳方向相反时，则降低电泳速度。
5．支持介质的筛孔支持介质的筛孔大小对生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之则泳动速度慢。
第二节电泳技术的分类
一、根据电泳中是否使用支持介质分为自由电泳和区带电泳
1. 自由电泳不使用支持介质，电泳在溶液中进行。这类电泳又分为非自由界面电泳和自由界面电泳两类。非自由界面电泳指悬浮在溶液中的带电粒子（如各种细胞）通电后全部移动，不出现界面，如显微电泳等。自由界面电泳指被分离的物质集中在某一层，形成各自的界面而进行定性或定量分析。自由界面电泳需要昂贵精密的电流仪器，仅在少数特殊电泳如等电聚焦电泳和等速电泳中使用。
2. 区带电泳需使用支持介质，根据支持介质不同可分为滤纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳等。此外，根据支持介质的装置形式不同又可分为水平板式电泳、垂直板式电泳、垂直盘状电泳、毛细管电脉、桥形电泳和连续流动电泳等。
二、根据电泳时电压的高低分为高压电泳和常压电泳
1. 高压电泳使用的电压在500～1000V，电位梯度可高达50～200V/cm。这类电泳分离速度快，但热效应较大，必须具备冷却装置，主要适用于小分子化合物的快速分离。
2. 常压电泳使用的电压在500 V以下，电位梯度为2～10 V /cm。这类电泳的分离速度较慢，但对电泳设备要求简单。
三、根据电泳系统pH是否连续分为连续pＨ电泳和不连续pＨ电泳
1. 连续pH电泳是指电泳全过程中pH保持不变，如纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳等。
2. 不连续pH电泳是指电极缓冲液和电泳支持介质中的pH不同，甚至电泳支持介质不同区段的pH也不相同，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳和等速电泳等。
四、根据工作目的和分离样品的数量多少分为分析电泳和制备电泳。
五、根据结合配套的技术种类不同分为免疫电泳、层析电泳、等电聚焦电泳、转移电泳、双相电泳、脉冲梯度电场凝胶电泳和相互垂直交替电场凝胶电泳等。
六、根据电泳物质类别不同分为细胞电泳、核酸电泳、蛋白质电泳等。
第三节电泳装置
电泳装置主要包括两个部分：电泳仪和电泳槽。电泳仪提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。水平式电泳是将凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，电泳时将凝胶直接浸入缓冲液中，常用于琼脂糖凝胶中核酸的分离和分析。电泳装置见图4-3-1～3
图4-3-1垂直板状电泳装置
图4-3-2水平电泳装置
第四节电泳结果的检测、分析和回收
一、电泳示踪剂
电泳常用的示踪剂有溴酚兰和二甲苯青FF。示踪剂一般与蔗糖、甘油组成上样缓冲液，蔗糖、甘油可增加溶液密度，使其比重增加，以确保样品均匀沉入加样孔内。
二、电泳染色剂
电泳后，被分离的样品需经染色后才能显现出带型，检测蛋白质最常用的染色剂是考马斯亮蓝R-250、银染色法；检测糖蛋白可用凝集素-酶-底物染色法；检测脂蛋白可用亲脂染料如苏丹黑B染色法；检测核酸最常用的是溴化乙锭染色法，其次是银染色法；如果样品有放射性标记，则可通过放射性自显影等方法进行检测。
（一）蛋白质染色法
1. 考马斯亮蓝染色法：通常用甲醇：水：冰醋酸（体积比为45：45：10）配制成0.1％～0.25％（W/V）的考马斯亮蓝溶液作为染色液。这种酸-甲醇溶液使蛋白质变性，固定在凝胶中，防止蛋白质在染色过程中在凝胶内扩散，一般染色需30min～1h。脱色液同样是酸-甲醇混合物，但不含染色剂，脱色通常需在摇床上摇动过夜，其间更换脱色液2～3次。考马斯亮蓝染色灵敏度高，在聚丙烯酰胺凝胶中可以检测到0.1μg/每条带。
2. 银染色法：银染色法比考马斯亮蓝染色的灵敏度高出100余倍，可以检测低至1ng 的蛋白质，它通过银离子（Ag+）在蛋白质上被还原成金属银形成黑色来指示蛋白区带。银染可以直接进行也可以在考马斯亮蓝染色后进行，这样凝胶主要的蛋白带可以通过考马斯亮蓝染色分辨，而考马斯亮蓝染色检测不到的细小蛋白带再由银染检测。虽然银染的灵敏度高而备受青睐，但它也有成本高、实验步骤复杂、对某些蛋白质不能着色等缺点。
（二）核酸染色法
1. 溴化乙锭染色法：溴化乙锭(ethidium bromide，EB)是一种荧光染料，具有致癌作用，操作时需戴手套避免污染。EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光。可在凝胶溶液中加入终浓度为0.5μg/mL的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入EB溶液中染色10min～20min。核酸EB染色，可以检测低至5ng的DNA。现在更多的是用DNA green，其染色原理与EB类似，但毒性较低。
2. 银染色法：银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。银染色法的灵敏度比EB染色法高200倍，但银染色后，DNA不宜回收。
3. DNA green染色法：是一种具有EB 稳定性和SYBR Green I 低毒性的新型核酸染料，其特点如下：
（1）低毒。其主要成分未发现对人体有致癌性、未被列入有毒有害品，有利于保护使用者的健康。
（2）灵敏。检测灵敏度跟 EB 相当，能满足常规核酸电泳实验要求。
（3）稳定。对光、水和热的稳定性跟 EB 相当，可加入琼脂糖凝胶中反复熔化。
（4）无分子间位移现象。不会出现 SYBR 染料常见的条带模糊和扭曲现象。
（5）使用方法多样。既可以加入熔化的胶中，也可以电泳后染色，还可用于 PAGE。
（6）跟各种常用的核酸电泳缓冲液（如 SuperBuffer-2、TBE、TAE）兼容，但在SuperBuffer-2 和TBE 中背景最低。
（7）观察时不需要任何额外的仪器设备或 UV 光源，可以使用现成的观察EB 的300nm UV。
（8）可用于 RNA 染色(也呈绿色)。
（9）DNA 或RNA 浓度较高时还可以直接在日光下观察（需要将胶放在黑色背景下）。
（10）由于避免了UV 对DNA 的伤害，尤其适用于胶回收实验。
注意:
虽然本产品的主要成分未发现对人体有致癌性、未被列入有毒有害品，但操作时最好戴上塑料手套。
使用方法之一：电泳中染色DNA （RNA 的染色跟DNA 完全一样）。
本方法是将DNAGREEN 直接加入溶化的凝胶中使用，只适用于琼脂糖凝胶电泳，不适用于PAGE。
1. 将DNAGREEN 直接加入到融化的琼脂糖凝胶中，每100mL 凝胶加3-10 uLDNAGREEN，混合均匀后倒胶。琼脂糖凝胶中不能含任何其他染料（如EB 和SYBR Green I，否则会相互干扰）。在100mL 琼脂糖凝胶中加入DNAGREEN的量不要超过10 uL，否则背景将很强。注意：一定要保证琼脂糖彻底熔化，尤其是在第一次熔化胶的时候，否则未熔化的小颗粒将产生跟染料相同的荧光。
2. 将 DNA 样品与DNA 上样液按比例混合后上样。注意：一定要使用不含SDS 等去污剂的上样液，否则SDS 会跟染料结合，极大地降低灵敏度。
3. 上样后电泳，电泳参数同常规的电泳。如果使用本公司五分钟核酸电泳液SuperBuffer-2，需要较高电压，详见该产品使用手册。
4. 电泳结束后在 300 nm 左右的UV 下观察。注意：不要使用波长为260 nm 或360 nm 的UV，否则检测灵敏度会降低。如果DNA 或RNA 浓度较高，还可以直接在日光下直接观察（需要将胶放在黑色背景下），避免UV 对DNA 的伤害，尤其适用于胶回收实验。
5. 用配置了 520-550 nm 滤光片（一般呈黄色或深黄色）的相机拍照。注意：不要使用与EB 兼容的红色滤光片（它能阻挡520-550 nm 的光）。如果能再加上能滤去UV 的滤光片，效果会更好。
6. 后续 Southern、转膜或DNA 胶回收实验按常规操作进行。
使用方法之二：电泳后染色DNA
本方法是在电泳后对DNA 进行染色，适用于琼脂糖凝胶电泳和PAGE。但该方法需要单独的染色处理，染料用量较大，不推荐用于琼脂糖凝胶的染色。
1. 按照常规方法进行电泳。
2. 用去离子水将DNAGREEN 稀释500 倍后（ 100 mL 水需要加0.2 mLDNAGREEN），将凝胶放入，室温下摇晃染色30 分钟（对琼脂糖凝胶）或15 分钟（对PAGE）。
3. 用水脱色 10-30 分钟，具体时间需根据背景强弱决定，其余同方法一。
注意：电泳后染色液可以反复使用次数。
三、电泳结果的检测及回收
1．扫描法
高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。
他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问
【实验操作考核要点】 一、目的要求 1．掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2．了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3．正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4．熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5．正确掌握溶液转移的操作。 6．正确操作使用分光光度计。 二、操作考核内容 按百分制计。 1．吸量管操作（20分）； 2．可调式微量移液器操作（20分）； 3．溶液混匀操作（视具体情况，采用合适的混匀方法）（15分）； 4．溶液转移操作（10分）； 5．分光光度计比色操作（25分）。 6．整体表现（10分）。 三、操作考核标准 （一）吸量管操作（20分，每项操作5分） 1．执管 要求右手拿吸量管，左手拿橡皮球，只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节吸取液量的刻度；吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。 2．坐姿 要求腰、背保持竖直，看刻度时眼睛保持平视。 3．吸取溶液 吸量管插入液面深度约0.5cm，不能一插到底，也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内；调控吸量管吸取液量的刻度时，吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。 4．排出液体
吸量管尖应靠上受纳容器内壁，让管内溶液自然流出。不能用橡皮球吹压，而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3秒。 （二）可调式微量移液器操作（20分，每项操作5分） 1．设定容量值 转动加样器的调节旋钮，反时针方向转动旋钮，可提高设定取液量。顺时针方向转动旋钮，可降低设定取液量。在调整设定移液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。 2．吸液 （1）选择合适的吸头安放在取液套筒上，稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙； （2）把按钮压至第一停点，垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮，吸入液体，等一秒钟，然后将吸头提离液面，贴壁停留2-3秒，使管尖外侧的液滴滑落。 3．放液 （1）将吸头口贴到容器内壁底部并保持100°~40°倾斜； （2）平稳地把按钮压到第一停点，等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体； （3）压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过，再松开按钮。按吸头弹射器除去吸头。 4．压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。取液器吸嘴为一次性使用。实验完毕，将取液器读数调至最大量程值，竖立放于支架上。 （三）溶液的混匀（操作流程中下划实线的三处，每项操作5分，共15分）1．肝糖原的提取与鉴定操作中，肝匀浆上清液中加5ml 95%乙醇后的混匀最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 2．肝糖原定量测定中，肝组织消化液沸水浴后全部转入100 ml容量瓶，加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。 3．肝糖原定量测定中，加蒽酮溶液后的混匀，可将试管倾斜约45o再作旋转混匀。因蒽酮溶液（浓硫酸配制）比重大于样品水溶液很多，一加入便沉于管
《生物制药技术》实验指导 实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型） 实验目的： 掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。 实验原理： 层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。 分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快（阻力小）。 薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层色谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析后进行显色，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。 材料、试剂和器材： 仪器和设备： 玻璃层析缸；层析板（薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售）；吹风机；紫外投射仪；离心机（1.5ml转子） 试剂：
实验一基因的PCR扩增技术 一、实验目的与原理简介 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）是体外克隆基因的重要方法，它可在几个小时内使模板分子扩增百万倍以上。因此能用于从微量样品中获得目的基因，同时完成了基因在体外的克隆，是分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。 常规PCR反用于已知DNA序列的扩增，具体可分为三个主要过程：一、变性。通过升高温度使DNA双链模板分子中氢断裂，形成单链DNA分子，温度为94℃，时间1min。二、复性。降低温度使DNA单链分子同引物结合。温度为55℃，时间1min。三、延深。升高温度，在DNA聚合酶最佳活性的条件下在引物3端加入dNTP，实现模板的扩增，温度为72℃，时间2min。同时第一步变性前要在94℃下预变性5分钟，使DNA双链完全解开。经过 25-35个循环之后，在72℃下继续延伸10分钟。 PCR反应包含的七种基本成分： 1）热稳定性DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶是最常适用的酶，商品化Taq DNA酶的特异性活性约为80000单位/mg. 2）寡核苷酸引物：寡核苷酸引物的设计是影响PCR扩增反应的效率与特异性的关键因素。 3）脱氧核苷三磷酸（dNTP）：标准的PCR反应体系应包括4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。每种dNTP的浓度一般在200-250μl之间，高浓度的dNTP对扩增反应会起抑制作用，可能是dNTP与Mg2+螯合有关。 4）二价阳离子：一般需要Mg2+来激活热稳定的DNA聚合酶，由于dNTP与寡聚核酸结Mg2+合，因而反应体系中阳离子的浓度一般要超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L。 5）维持PH值的缓冲液：用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的PH值调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液浓度在10mmol/L。在72℃温育时，反应体系的温度将下降1个多单位，致使缓冲液的PH值接近7.2。 6）一价阳离子：标准PCR缓冲液内含有50mmol/L的KCl，它对扩增大于500bp长度的DNA是有益的。 7）模板DNA：含有靶序列的模板DNA可以以单链或双链形式加入到PCR混合液中，闭环DNA的及增效率略低于线性DNA。 学习PCR反应的基本原理和基本技术。 了解引物设计的一般要求。 二、材料和试剂 10Х扩增缓冲液 4种dNTP贮存液（20mmol/L，PH 8.0） Tap DNA 聚合酶 5端引物（20μmol/L）及3端引物（20μmol/L） 模板DNA 琼脂糖凝胶 PCR仪（Bio-Rad公司）移液枪（0.5-10μL 5-50μL）枪头微量移液管 一、实验操作 1）按照以下次序，将各成分加到微量离子管内混合： 10Х扩增缓冲液2.5μl M g2+1.5μl 5端引物1μl
大学生生物化学实验技能大赛初赛试题及答案 一、选择题 1、下列实验仪器中，常用来取用块状固体药品的仪器是（）。 A. 药匙 B. 试管夹 C. 镊子 D. 坩埚钳 2、托盘天平调零后，在左盘衬纸上置氧化铜粉末，右盘衬纸上置1个5g砝码，游码标尺示数如下，此时天平平衡。则被称量的氧化铜质量为（）。 A. 8.3 g B. 7.7 g C. 3.3 g D. 2.7 g 3、用减量法从称量瓶中准确称取0.4000 g分析纯的NaOH固体，溶解后稀释到100.0 mL，所得NaOH溶液的浓度为（）。 A. 小于0.1000 mol/L B. 等于0.1000 mol/L C. 大于0.1000 mol/L D. 三种情况都有可能 4、已知邻苯二甲酸氢钾（KHC8H4O4）的摩尔质量为204.2 g/mol，用作为基准物质标定0.1 mol/L NaOH溶液时，如果要消耗NaOH溶液为25 mL左右，每份应称取邻苯二甲酸氢钾（）g左右。 A. 0.1 B. 0.2 C. 0.25 D. 0.5 5、NaHCO3纯度的技术指标为≥99.0%，下列测定结果哪个不符合标准要求？（）。 A. 99.05% B. 99.01% C. 98.94% D. 98.95% 6、精密称取马来酸氯苯那敏对照品12 mg，应选取（）的天平。 A. 千分之一 B. 万分之一 C. 十万分之一 D. 百万分之一 7、实验室标定KMnO4溶液，常用的基准物质是（）。 A. Na2CO3 B. Na2S2O3 C. Na2C2O4 D. K2Cr2O7 8、标定氢氧化钠常用的基准物质是（）。 A. EDTA B. K2Cr2O7 C. 草酸 D. 邻苯二甲酸氢钾 9、下列物质可以作为基准物质的是（）。 A. KMnO4 B. Na2B4O7·7H2O C. NaOH D. Na2S2O3 10、下列物质中，可以用直接法配制标准溶液的是（）。 A. 固体NaOH B. 浓HCl C. 固体K2Cr2O7 D. 固体Na2S2O3
污水处理生化调试技术方案 一污泥的培养 方法有同步与异步培养与接种,同步是培奍与驯化同时进行或交替进行，异步是先培后驯化，接种是利用类似污水的剩余污泥接种。 活性污泥可用糞便水经曝气培养而得，因为粪便污水中，细菌种类多，本身含有的营养丰富，细菌易于繁殖。?通常为了缩短培菌周期，我们会选择接种培养。?先说粪便水培菌?具体步骤:?将经过过滤的粪便水投入曝气池,再用生活污水或河水稀释，至BOD约为3００-400，进行连续曝气。这样过二,三天后,为补充微生物的营养物质和排除由微生物产生的代谢产物,应进行换水,换水根据操作情况分为间断和连续操作。?１.间断操作：?当第一次加料曝气并出现模糊的活性污泥绒絮后,就可停止曝气，使混合液静止沉淀，经1－１.５小时后排放上清液,把排放的上清液约占总体积的60-７0%。?然后再加生活污水和粪便水,这时的粪便水可视曝气池内的污泥量来调整,这样一直下去，直至ＳV达到30%。一般需2周，水温低时时间要延长。 在每次换水时，从停止曝气,沉淀到重新曝气的总时间要控制在２小时之内为宜?成熟的污泥应具有良好的混凝，沉降性能，污泥内有大量的菌胶菌和终生?纤毛类原生动物，如钟虫,等枝虫,盖纤虫等,并可使污水的生化需氧量去除率达90%左右 2.连续操作：?在第一次加料出现绒絮后,就不断地往曝气池投加生活污水或河水,添加粪便水的控制原则与间断投配相同。往曝气池的投加的水量,应保证池内的水量能每天更换一次,随着培奍的进展，逐渐加大水量使在培养后期达到每天更换二次。在曝气池出水进入二次沉淀池后不久(0．5-1）就开始回流污泥,污泥的回流量为曝气池进水量的5０%?驯化的方法：可在进水中逐渐增加被处理的污水的比例，或提高浓度,使生物逐渐适应新的环境开始时，被处理污水的加入量可用曝气池设计负荷的20-３0%，达到较好的处理效率后,再继续增加，每次以增加设计负荷的１0-20％为宜，每次增加负荷后，须等生物适应巩固后再继续增加，直至满负荷为止。?如果被处理工业污水中,缺氮和磷以及其它营养物时，可根据BOD：N：P为100:5:1的比例来调整。?个人认为在此阶段，必要的超赿管路要具备，工艺没设计的可用消防管代替。 而且各种分析要跟上去,和种参数需及时测定,特别是镜检,因为有经验的人可能通过镜检和数据就可以很好的完成任务,另外良好的心理素质也比较重要,有些现象要果断处理,有些则需等侍再认定上面是异步法,同步就是在污泥培养过程中，不断加入工业污水，使污泥在增长过程中逐渐适应工业污水的环境，这样虽可缩短培养和驯化的时间,但在这一过程中发生的问题，又缺实践经验则难以判断问题出在哪一个环节上。 若有条件,就是接种培养，这样可缩短时间，若是相似的污水的污泥,更可提高驯化效果。 二、试运行
生物化学实验报告 姓名：吴瑞 学号： 3120016004 专业年级： 2012级临床医学（妇幼保健) 组别：第四实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验室规则 1．实验前应认真预习实验指导，明确实验目的和要求，写出预实验报告。 2．进入实验室必须穿白大衣。严格遵守实验课纪律，不得无故迟到或早退。不得高声说话。严禁拿实验器具开玩笑。实验室内禁止吸烟、用餐。 3．严格按操作规程进行实验。实验过程中自己不能解决或决定的问题，切勿盲目处理，应及时请教指导老师。 4．严格按操作规程使用仪器，凡不熟悉操作方法的仪器不得随意动用，对贵重的精密仪器必须先熟知使用方法，才能开始使用；仪器发生故障，应立即关闭电源并报告老师，不得擅自拆修。 5．取用试剂时必须“随开随盖”，“盖随瓶走”，即用毕立即盖好放回原处，切忌“张冠李戴”，避免污染。 6．爱护公物，节约水、电、试剂，遵守损坏仪器报告、登记、赔偿制度。 7．注意水、电、试剂的使用安全。使用易燃易爆物品时应远离火源。用试管加热时，管口不准对人。严防强酸强碱及有毒物质吸入口内或溅到别人身上。任何时候不得将强酸、强碱、高温、有毒物质抛洒在实验台上。 8．废纸及其它固体废物严禁倒入水槽，应倒到垃圾桶内。废弃液体如为强酸强碱，必须事先用水稀释，方可倒入水槽内，并放水冲走。 9．以实事求是的科学态度如实记录实验结果，仔细分析，做出客观结论。实验失败，须认真查找原因，而不能任意涂改实验结果。实验完毕，认真书写实验报告，按时上交。 10．实验完毕，个人应将试剂、仪器器材摆放整齐，用过的玻璃器皿应刷洗干净归置好，方可离开实验室。值日生则要认真负责整个实验室的清洁和整理，保持实验整洁卫生。离开实验室前检查电源、水源和门窗的安全等，并严格执行值日生登记制度。
生物化学实验技能大赛活动方案 一、活动目的 通过举办生物化学实验技能大赛，使广大学生树立崇尚科学，勇于创新，开拓进取，敢于实践的精神风貌，增强专业素养。在深化教育改革，推进素质教育的要求下，不断提高学生实验设计及实验操作的能力，从而提高广大学生学习《生物化学》这门课程的兴趣，推动生物化学实践教学的改革；增加同学们的合作交流，促进相互间的学习与沟通，拓展知识的应用范围，培养创新意识及团队精神，提高综合实验设计、分析和生物化学实验操作技能，提高大学生动手能力和实践技能，促进我校良好学风的建设，营造浓厚的学习、学术氛围，特此举行此次生物化学实验技能大赛。矚慫润厲钐瘗睞枥庑赖賃軔。 二、组织机构 主办单位：韶关学院教务处 承办单位：英东生命科学学院团委 三、参赛对象 韶关学院全日制在校学生均可参加，自行组队(可跨专业)，团队人数1至4人。 四、比赛流程： 1.初赛 各参赛队伍需上交报名表（附件1）并按照作品格式要求（附件2）独立完成实验设计，于2016年11月9日-11月20日将实验设计和报名表（放在同一文件夹压缩打包命名为：学院+实验课题+队长姓名+队长短号）发送至邮箱（）参加初赛，纸质版需上交到英东楼B309生科院辅导员办公室处。评委老师对实验设计进行评定后，筛选出约20支参赛队伍进入复赛。 2.复赛 2016年11月26日09:00—17:00为预实验阶段，实验室开放，各参赛队伍可在当天熟悉比赛场地或对所需材料、仪器、试剂等作实验前的预处理。 2016年11月27日09:00—17:00为正式复赛阶段，进入实验室按照实验设计进行操作，并当场完成实验报告，复赛分数根据实验过程及实验报告进行评定。 复赛评选出8支队伍进入决赛，决赛名单当场公布。 复赛地点：英东实验室 决赛 2016年12月3日19:00—22:30为决赛阶段，进行实验报告答辩，决赛分为四个环节：报告陈述、现场答辩、观众提问、专家点评。获奖的实验报告将在英东大厅展示15天。 决赛地点：图书馆学术报告厅 五、参赛要求 1.作品内容 （1）物质提取类 如从柑橘皮中提取果胶；从果蔬中提取类胡萝卜素；从芦荟中提取碳水化合物；从鸡蛋清中提取某蛋白；从三七中提取三七皂等。 （2）物质检验类 如检验市面上某几种品牌牛奶是否掺假；检验市面上某几种食品是否含有防腐剂；检验某品牌的食用植物油是否含胆固醇等。 （3）物质含量测定类 如洗衣粉磷含量分析；测定某品牌奶粉的蛋白质含量是否达标；比较几种饲料中某物质的含量等。
邻二氮菲法测定蔬菜中铁的含量 摘要 用邻二氮菲分光光度法直接测定蔬菜中的铁含量，方法简便、快速、准确，为指导人们合理食用蔬菜进行补铁及进一步开发蔬菜产品提供了可靠的理论依据[1 2]。 关键词蔬菜铁含量邻二氮菲 1.前言 铁作为必需的微量金属元素，对于人体的健康十分重要。铁是血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素及其它酶系统的主要组分，可协助氧的运输，还能促进脂肪的氧化。蔬菜是人们摄取微量铁的主要途径之一，缺铁可造成贫血并容易疲劳，而过多则会导致急性中毒。所以，蔬菜中铁含量的测定具有重要的营养学意义，可为指导人们合理食用蔬菜进行补铁以防治缺铁性贫血，提供可靠的理论依据。 2.实验目的 综合运用所学知识，用仪器分析法测定金属元素含量；练习灵活运用各种基本操作和查阅资料的能力。 3.实验原理 蔬菜中金属元素常与有机物结合成难溶或难于解离的物质，常采用有机物破坏法是被测的金属元素以氧化物或无机盐的形式残留下来，以便测定。本实验采用有机物破坏法（干法），即在高温下加入氧化剂，使有机物质分解。根据不同浓度的物质具有不同的吸光度，采用分光光度法来测定蔬菜中的铁含量。在pH值4～6的条件下，以盐酸羟胺将三价铁还原为二价铁，二价铁再与邻二氮菲（phen）生成桔红色络合物［3］，用分光光度计在510nm测定蔬菜中铁的含量。 盐酸羟胺还原三价铁的反应如下： 2 Fe3++2NH2OH·HCl→2 Fe2++N2+2H2O+4H++2Cl- 邻二氮菲与二价铁的反应式如下： Fe2+ + 3(phen) =Fe(phen)3 4.实验器材 722型分光光度计（1台），电子天平（1台）蒸发皿（4个），100mL容量瓶(4个)，
《分子生物学检验技术》实验指导 【实验目的】 把握动物组织DNA提取的方法； 把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。 【实验原理】 获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。 DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化D NA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。
260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。 【实验器材和试剂】 1、动物 小白鼠 2、设备 移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。 3、试剂 （1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K （7）生理盐水，4℃贮存 （8）无水乙醇、70%乙醇 【操作步骤】 1、制备肝匀浆 迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 μl蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。 2、提取DNA （1）加入1.5 μl RNase A，颠倒混匀，37℃孵育15-60 min。
生物化學實習 1 緒論 (一) 原理 1. 光依據其波長來分類： (1) 200nm~400nm 短波屬於紫外光 (2) 400nm~700nm 可見光波長 (3) 700nm~900nm 長波屬於近紅外光 2. 光通過溶液時，特定波長的光被吸收，眼睛察覺到的是沒有被吸收的波長。 核黃素會吸收450nm 的光，紅光與黃光會通過溶液而被肉眼所見。
第一單元 生化實驗基本原理及技術 2 圖1-1光譜儀 光譜儀可用來鑑定及定量純或不純的溶液中所含有的特定化合物，主要原理是基於兩個物理定律：1.柏朗定律；2.比爾定律 。 1. 柏朗定律：每單位厚度溶液其吸收入射光的比率為定值，被溶液吸收的入射光量與入射光強度無關。被每單位厚度溶液吸收的入射光比率為定值，每一單位厚度溶液若吸收10%的光，則光經過每一單位厚度溶液時，其強度即減少10%。 I ＝I 0 ? e -αι I ：穿透光強度 I 0：入射光強度 α ：溶液吸光係數 ι：光路徑長度 柏朗定律中以對數為底轉換公式，將吸光係數α轉換成比例常數K → log 10 I 0 / I ＝K ι log 10 I 0 / I ＝ 吸光值(absorbance ；A) 或光密度值(optical density ； OD)
生物化學實習 3 2. 比爾定律：光經過吸光物質所產生的吸光值，與溶液中每單位面積所含的吸光物質數目成比例。 比爾定律描述比例常數K 與待測吸光溶液中溶質的濃度有關。 K ＝εc ε：消光指數 c ：吸光物質濃度 I ＝ I 0? 10-εc ι log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ι＝ εc ι 當ι（光路徑長度）＝1 cm 時 log 10 I 0 / I ＝ A ＝log 1010εc ＝ εc 特定溶質在特定波長下，消光係數ε為一常數。因此，當吸光物質的濃度變成兩倍，於相同的光路徑下，被吸收的光量也會變成兩倍。 圖1-2 22 μM 溶於0.1M 磷酸鈉，pH 7.06，1公分 光路徑(light path)的條件下測定 波長 吸 光 值
生物化学实验报告 姓名：郭玥 学号： 3120100021 专业年级： 2012级护理本科 组别：第8实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】 实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别， 可分离纯化各种蛋白质。 3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可 使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由 于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃 至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷 大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆 的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。 它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中 各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电 泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α 2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱 DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液 醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸 1%BaCl 溶液氨基黑染色液 2 漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 电泳仪、电泳槽 实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 实验步骤： （一）盐析+凝胶柱层析除盐：
生命科学学院 关于举办首届大学生生物化学实验技能竞赛的通知 一、竞赛目的 激励大学生自主学习，培养大学生创新意识和团队精神，增强综合实验设计能力，提高生化实验操作技能，营造浓厚学术创新氛围，促进良好学风的建设，选拔优秀项目和选手参加山东省第五届生物化学实验技能大赛。 二、竞赛组委会 组长：王宝山、魏成武 成员：戴美学、杨桂文、谭效忠、苗明升、张鸿雁、杜希华、王珂、原永洁三、参赛对象 生命科学学院在校本科生，不限年级和专业。参赛队伍2-3人为一队，每队一名指导教师。每个参赛队限提交一份实验设计书，每个指导教师指导的项目数一般不超过6项。 四、参赛作品内容及要求 （一）作品内容 1、物质提取类 如从柑橘皮中提取果胶；从果蔬中提取类胡萝卜素；从芦荟中提取碳水化合物；从鸡蛋清中提取某蛋白；从三七中提取三七皂等。 2、物质检验类 如检验市面上某几种品牌牛奶是否掺假；检验市面上某几种食品是否含有防腐剂；检验某品牌的食用植物油是否含胆固醇等。 3、物质含量测定类
如洗衣粉磷含量的分析；测定某品牌奶粉的蛋白质含量是否达标；比较几种饲料中某物质的含量等。 4、探索物质在某一方面的应用类 如探索蛋白酶对草菇保鲜的影响机理；探索木瓜蛋白酶在食物色氨酸测定上的应用等。 5、比较不同品牌物质的营养价值 如对不同品牌螺旋藻片营养成分测定和营养价值的评价测定；对不同品牌饲料中营养价值比较等。 6、其他参赛者感兴趣的方面 （二）作品要求 1、作品要求在保证安全性的前提下，具有一定的科学性、实用性、创造性，具有较强的实际意义，以创新及紧密联系生产生活实际为佳，同时在实验室内的可操作性强。 2、每组参赛队严格按照实验设计书设计格式要求撰写实验设计书，并提交至大赛邮箱，一经提交不得修改，违者则取消决赛资格。 3、参赛作品原则上不能与山东省大学生生物化学实验技能大赛前四届作品相同（前几届作品请参考大赛相关网站：http://202.194.131.160/G2S/ Template/View.aspx?action=view&courseType=0&courseId=282），亦不可抄袭外省比赛作品，否则取消参赛资格。 4、实验设计书设计的项目最好进行过预实验（可利用寒假在指导教师指导下利用实验室条件进行预实验），并在“生科院首届大学生生物化学实验技能竞赛报名表”中如实注明是否做过预实验。 5、实验设计内容应能在8小时内完成，便于决赛时在限定的时间内进行实验操作。
《生化制品技术》实验大纲 一、实验目的 本实验是《生化制品技术》课程的配套实验，目的是增加学生对生物药物及生物技术制药的感性认识及提高学生的实验操作能力。要求学生熟悉并掌握生物药物的制备过程和生物技术制药的基本操作方法。 二、适用专业及层次 适用于生物制药技术专业学生 三、实验内容和学时分配
实验一牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备 一、实验目的 1.掌握盐析法的原理和操作。 2.掌握等电点沉淀法的原理和基本操作。 二、实验原理 乳蛋白素是一种广泛存在于乳品中，合成乳糖所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白（caseins），酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此一性质，可先将pH降至4.8，或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将去除掉酪蛋白的滤液的pH调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质即可随澄清液出去。在经过一次pH沉淀后，即可得粗乳蛋白素。 三、实验器材 烧杯（250ml和100ml）、玻璃试管（10mm×100mm）、离心管（50ml）、磁力搅拌器、pH计、离心机、水浴锅。 四、试剂和材料 脱脂牛乳或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸缓冲溶液0.2mol/L （pH4.6）、乙醇。 五、操作步骤
1.盐析或等电点沉淀制备酪蛋白 （1）将50ml牛乳倒入250ml烧杯中，于40℃水浴中加热并搅拌。 （2）向上述烧杯中缓缓加入（约10min内分次加入）10g无水硫酸钠，再继续搅拌10min（或加热到40℃，再在搅拌下慢慢地加入50ml40℃左右的乙酸缓冲液，直到pH达到4.8左右，将悬浮液冷却至室温，放置5min）。 （3）将溶液用细布过滤，分别收集沉淀和滤液。沉淀悬浮于30ml乙醇中，倾于布氏漏斗中，过滤出去乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿上摊开以除去乙醇，干燥后得到的是酪蛋白。准确称重。 2.等电点沉淀法制备乳蛋白素 （1）将制备酪蛋白操作步骤（3）所得滤液置于100ml烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3±0.1。 （2）将溶液倒入离心管中，6000r/min离心15min，倒掉上层液。 （3）在离心管内加入10ml去离子水，振荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.5～9.0（以pH试纸或pH计判定），此时大部分蛋白质均会溶解。 （4）将上述溶液以6000r/min离心10min，上层液倒入50ml烧杯中。 （5）将烧杯置于磁搅拌加热板上，一边搅拌，一边利用pH计以0.1mlo/L 盐酸调整pH至3±0.1。 （6）将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。取出沉淀干燥，并称重。 六、结果与讨论 1.计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量，并与理论产量（3.5g）相
运动生物化学实验指导 实验一实验基本技术操作 一、实验目的 （一）了解实验室规则及注意事项。 （二）学习运动生物化学实验常用仪器的使用及清洗方法。 （三）学习721型分光光度计的使用方法。 二、实验原理 运动生物化学是研究人体运动时体内的化学变化。运动生物化学的实验方法基本上是化学的方法，用定量及定性的分析方法来观察机体内物质代谢的规律，所以实验时必须做到定性的洁净及定量的精确，因此实验取样要准确、样品要无污染。 对于相同物质和相同波长的单色光来说，溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。配制各种浓度的CuSO4溶液，然后在780nm波长下比色，测定各种浓度的CuSO4溶液吸光度值，并制作曲线图。 三、实验器材 试管、CuSO4溶液、蒸馏水、721分光光度计、移液管、吸耳球等。 四、实验步骤 （一）玻璃仪器的清洗。 （二）使用移液管的移液操作及721分光光度计的使用。 取4支大试管，编号，按表7-1进行操作： 表7-1 CuSO4溶液的测定 以CuSO4溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，将3种不同浓度的CuSO4溶液的光密度值分别点在坐标纸上，通过3点绘制成曲线图，并对实验结果进行分析。 五、注意事项 （一）玻璃仪器清洗后注意检查，管壁不能留有水珠。 （二）使用移液管吸取液体时一定要缓慢平稳，不要太快、太猛。 六、作业与思考 （一）玻璃仪器的清洗有哪些基本要求？ 实验二血红蛋白的测定 血红蛋白（Hb）是红细胞中的一种重要蛋白质，1分子的Hb是由4分子的亚铁血红素和1分子的珠蛋白结合而成的。 Hb的主要生理功能是运输氧气（O2）、二氧化碳（CO2）和对酸性物质（H+）起缓冲作用，参与体内的酸碱平衡调节。运动时机体需氧增加，故血红蛋白增加，有利于为组织提供氧气，促进物质的有氧代谢和带走CO2，而且也能起中和酸性的作用。如果血红蛋白下降，氧供应减少，影响运动能力。 运动员安静时血红蛋白值与正常人没有明显差异。一般人Hb的正常值男性为120-160g/L；女性110-150g/L。临床上常用判断贫血的标准，即成年男性低于120 g/L；成年女性低于110 g/L；而14岁以下的少年、儿童，不论男女，均以低于120 g/L作为贫血。
生物化学与分子生物学实验技术 实验安全与实验基本操作 2实验室安全规则 3实验室安全事故案例 ●1995年9月香港科技大学化学系大四学生梁同学因吸入别的同学泼洒的酸 酐而不治身亡。 ●1997年香港科技大学物理系访问学者因未按规定使用通风橱造成他人肺部 伤害而永不被香港各大学录用。 4推行实验室安全规则的目的 1.为了达到研究所研究学习安全之目的。 2.为了满足人性安全感的基本需要。 3.为了人性的尊严─生命是无价的。 4.减少工作中产生灾害，确保全教职工和学生之安全及健康。 5. 保护大家共同的环境。 5安全事故原因分类分析 天灾 占2％ 凡不知、不顾、不理、不能、粗心、迟钝、疲劳、失检、情绪各种内在外在的行为 不安全行为 人为因素 占98% 工作场所中，工作环境、设备设施对人所产生之危险因素 不安全环境 6专业性实验室安全工作守则 ●化学药品的操作 ●放射性物质（另有专门培训） ●废料处理 ●紫外线的接触 ●化学药品溢泼的处理 7实验室常用化学试剂的使用安全 8二甲苯 ●无色液体，有芳香气味，易挥发。用来制造、染料、塑料和药物。属低毒类， 对皮肤和黏膜有刺激作用，高浓度有麻醉作用。神经系统会受损害，还会使肾和肝受时性损伤。
●眼毒性：蒸气会刺激眼睛，液体导致严重刺激，发红肿胀和灼伤。通常影响 是暂时性的。皮肤毒性：产生灼伤感、干燥。可以用微温的缓慢流水冲洗至少20分钟，用无摩擦性的肥皂从皮肤上洗去二甲苯。 ●易燃，有爆炸危险。属于甲类防火危险物质。用二氧化碳或干粉或泡沫灭火 剂，不宜用水。 9三氯甲烷 ●无色透明易挥发液体，有特殊的香甜气味。沸点：61.2℃，医药上用作麻醉 剂。也用作萃取剂和溶剂。 ●有很强的麻醉作用，在光的作用下，能被空气中的氧反应生成氯化氢和剧毒 的光气。通常加入1—2%乙醇，使生成的光气与乙醇作用而生成碳酸乙酯，以消除其毒性。 ●吸入高浓度蒸汽时，开始刺激眼、口腔、鼻孔粘摸，发生流泪、感觉麻醉、 呕吐、痉挛、直到昏睡、不省人事。 ●在空气、水分和光的作用下，酸度增加，因而对金属有强烈的腐蚀性 10乙醚 ●透明、无色、易挥发有芳香刺激性气味的液体。沸点：34.6℃；对人体有麻 醉性能。当吸入含量为3.5%时，30~40分钟就可失去知觉。 ●人体过量吸入，会引起严重的急性中毒。呼气中带醚味，并出现呕吐、出汗、 喷嚏、咳嗽、头痛、记忆力减退、无力、兴奋。 ●微溶于水，易溶于盐酸，能与醇、醚、石油醚、苯、氯仿等有机溶剂混溶。 应储存于阴凉、干燥、通风的低温库房内，库温最好控制在25℃以下。远离热源、火种，避免阳光直射。 ●本品易燃。与强氧化剂反应能起火爆炸。在空气中与氧长期接触或受光照会 生成不稳定的过氧化物，受热能自行着火爆炸。着火时，可用干粉、泡沫、二氧化碳、沙土灭火。用水灭火无效，但可用水保持火场容器冷却。 11乙醇 ●无色有酒味，易挥发的澄清液体。沸点78.5℃：用于溶剂、清洗剂、分析 试剂等。属微毒类，对眼睛黏膜有轻微刺激作用。 ●乙醇可使皮肤发干，长期受大剂量作用时，可使神经系统、消化器官等发生 严重的器质性疾病。 ●易燃，手热或遇明火有燃烧爆炸危险，燃烧时，发出兰色火焰。蒸气能与空 气形成爆炸性混合物，在火场中，受热的容器有爆炸的危险。着火时，用二氧化碳、雾状水、干粉、1211或抗泡沫灭火。用水冷却火场中的容器，驱散蒸气，赶出溢出液体，使其稀释成为不燃性混合物
生化实验五大技术 一.分光光度技术 1.定义:根据物质对不同孩长的光线具有选择性吸收,每种物质都具有其特异的吸收光语。而建立起来的一种定t 、定性分析的技术。 2.基本原理:（图1-1光吸收示意） 透光度T=It/lo 吸光度A=lg(lo/ I1) 朗伯-比尔(lambert-Beeri)定律:A=KLc K 为吸光率，L 为溶液厚度(em), c 为溶液浓度 (mol/L)] 摩尔吸光系数日ε:1摩尔浓度的溶液在厚度为 I.cm 的吸光度。 c=A/ε 3. 定量分析: (1)标准曲线(工作曲线)法 (2) 对比法元-KCLCx (3)计算法: e=A/ε (4)差示分析法(适用于浓度过浓成过稀) (5) 多组分湖合物测定 4.技术分类 分子吸收法&原子吸收法:
可见光(400-760 nm) &紫外光(200~ 40m) &红外光(大于760 nm)分光光度法； 5.应用方向 有机物成分分析&结构分析红外分光光度法测定人体内的微量元囊原子吸收分光光度法 二电脉技术 1.定义:带电荷的供试品在情性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电 极方向按各自的速度进行脉动。使组分分离成族窄的区带，用透宜的检洲方法记录其电泳区带图请或计算其百分含量的方法。 2.基本原理: 球形质点的迁移率与所带电成正比，与其半径及介质粘度成反比。v=Q/6xrη 3.影响电泳迁移率的因素: 电场强度电场强度大，带电质点的迁移率加速 溶液的PH值: 溶液的pH离pl越远，质点所带净电荷越多，电泳迁移幸越大 溶液的离子强度:电泳液中的高子浓度增加时会引起质点迁移率的降低 电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗 4:技术分类: 自由电泳(无支持体) 区带电泳(有支持体):法纸电泳(常压及高压)，博层电泳(薄膜及薄板).凝波电泳(琼脂，琼脂糖、淀粉胶、柔丙烁配胶凝胶)等 5. 电泳分析常用方法及其特点: 小分子物质滤纸、纤维素、硅胶薄膜电泳复杂大分子物质凝胶电泳 ⑴醋酸纤维素薄膜电泳 ①这种薄顺对蛋白质样品吸阴性小，消除纸电沫中出现的“拖尾”现象 ②分离理应快，电泳时间短 ③样品用最少: ④经过冰最酸乙醉溶液或其它看明液处理后可使膜透明化有利丁对电泳图潜的光吸收措测店和爱的长期保 ------别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测(胰岛素、游菌酶、胎儿甲种球