中南大学生物科学与技术学院
分子生物学研究中心
教案
授课科目: 医学分子生物学
授课内容:疾病产生的分子基础
授课对象：临床医学七年制、八年制
授课时数：4 学时
授课教师：
授课地点：湘雅医学院新教学区
授课时间：
授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材），
胡维新主编，北京：科学出版社，2007年2月，第一
版；
医学分子生物学（卫生部8年制规划教材），冯作化
主编，北京：人民卫生出版社，2005，第一版
第十一章疾病产生的分子基础
一、目的求：
掌握：基因突变的概念、类型及特点。
熟悉：基因突变的发生机制；疾病相关基因的研究策略。
了解：基因突变与疾病发生；血红蛋白病等常见单基因病的发病分子机制。二、讲授重点：
基因突变的类型及特点。
三、讲授难点：
基因突变的分子机制。
四、教学方法：多媒体教学、板书
五、教具：多媒体课件、多媒体设备、电子光标笔、粉笔、黑板、教材
六、讲授内容：
第一节基因结构改变引起疾病
一、基因结构改变:在基因的特定DNA序列中，其碱基组成及排列顺序可因机体内外因素的作用发生改变，导致DNA一级结构发生改变，改变基因结构，形成基因突变（mutation）。如果基因突变使蛋白质发生了质的改变，即理化性质、
生物化学性质、免疫学性质及生物学功能的改变，或使蛋白质量的改变超过了生理范围，就会导致疾病的发生。
基因突变的多种类型：
点突变是单个碱基的改变；可分为转换（transition）和颠换（transversion）两种。转换指同类型碱基之间的取代，即一种嘧啶碱基被另一种嘧啶碱基取代或一种嘌呤碱基被另一种嘌呤碱基取代形成的点突变。颠换指不同类型碱基之间的取代，即一种嘧啶碱基被一种嘌呤碱基取代或一种嘌呤碱基被一种嘧啶碱基取代形成的点突变。
缺失（deletion）是一个或多个核苷酸的丢失；插入（insertion）是一个或多个核苷酸的增加；
倒位是一段核苷酸序列方向倒转：基因内部的DNA序列可发生重组，使一段DNA序列的方向反置，如由原来的5ˊ→3ˊ方向排列整段倒置为3ˊ→5ˊ方向排列，或一段DNA序列在基因内部位置迁移，使基因结构发生改变，形成的突变称为倒位。
基因突变还分为配子突变与体细胞突变；动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变。
二、基因突变的遗传效应
不同的基因突变引起不同的遗传效应。
(1)碱基置换突变(substitution mutation)
a. 同义突变(consense mutation or silent mutation)
b. 错义突变(missense mutation)
c. 无义突变(nonsense mutation)
d. 终止密码子突变或延长突变
(terminator codon mutation or elongation mutation)
e. 起始密码子突变(initiation codon mutation)
f. 非编码序列点突变(point mutation in noncoding sequence)
例如：无义突变是突变后产生缩短的多肽键使它所编码的蛋白质发生改变；
错义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变为
决定另一种氨基酸的密码子的基因突变叫错义突变。这种基因突变有可能使它所编码的蛋白质部分或完全失活，例如人血红蛋白β链的基因如果将决定第6位氨基酸（谷氨酸）的密码子由CTT变为CAT，就会使它合成出的β链多肽的第6位氨基酸由谷氨酸变为缬氨酸，从而引起镰刀形细胞贫血病。
(2) 缺失或插入突变(deletion or insertion mutation)
a. 密码子缺失或插入(codon deletion or codon insertion)
b. 移码突变(frame-shift mutation)
c. 整基因或大片段缺失
(deletion of a whole gene or a large segment)
(3) 融合突变(fusion mutation)
细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基因间错位配对，
产生两种含不同等位基因的染色体。
(4) 基因突变影响 hnRNA 的剪接
基因突变发生在 hnRNA 的一级结构上特定的剪接位点上，导致 hnRNA 的剪接错误，产生异常的 mRNA，最终产生异常的蛋白表达产物，改变生物性状。
三、结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病：
血红蛋白病的类型、特点与结构基因的变化关系、珠蛋白(globin)基因的时、空特异性表达。
血红蛋白结构：
1. 血红蛋白是由4条肽链（两个α和两个β链）组成的。每条肽链都类似
于肌红蛋白的肽链，都结合一个血红素。
2.血红蛋白的脱氧（T）和氧合（R）构象在氧的亲和性方面有很大区别。
由于结构上的相互作用是与它的三级和四级结构有关，所以血红蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同性。
3. 人类珠蛋白基因有典型的真核基因结构特点。珠蛋白基因包括已鉴定的8
个功能基因、3个假基因及一个新发现的基因。它们在染色体上成簇排列。珠蛋白基因的表达在时空上受到遗传因素的精确调控。
血红蛋白分子一级结构上的轻微差别就可能导致功能上的很大不同，正常成年人血红蛋白中的β链的第六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就会导致镰刀形细胞贫血病的异常血红蛋白HbS 的生成。
(1) 人α-珠蛋白基因簇及α珠蛋白基因结构
(2) 人β-珠蛋白基因簇及β珠蛋白基因结构(按图例讲解)
血红蛋白病类型：
异常血红蛋白: 珠蛋白结构(质)变异，导致贫血。
地中海贫血: 珠蛋白合成(量)减少，又称珠蛋白合成障碍性贫血。
镰状红细胞贫血症是一种常染色体退化遗传病。引起镰状红细胞贫血症的原因就是β珠蛋白基因的第6位密码子点突变，即编码血红蛋白β链上一个决定谷氨酸的密码子GAG变成了GTG，使得β链上的谷氨酸变成了缬氨酸，引起血红蛋白的结构和功能发生了根本的改变（图11-1）。与正常血红蛋白相比，该病患者的红细胞由正常的圆盘形变成了镰刀形。血红蛋白基因上单个核苷酸的替换（A→T），恰好使该基因片段丢失了可被限制性内切酶Mst II酶切开的一个位点CCTNAGG序列（N代表四个碱基中的任意一个）。由于基因突变改变了限制性酶切的结果，可用Southern印迹杂交分析方法和限制性片段长度多态性(简称RFLP)分析方法，对镰状红细胞贫血症胎儿进行产前诊断，或对发病家族成员的基因型进行分析。
图11-1 镰状红细胞贫血症β珠蛋白基因突变方框内突变的核苷酸
另常见单基因病如囊性纤维化病(cystic fibrosis, CF)举例。
囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTCR)的基因突变所致，产生缺陷型蛋白，致使使氯离子的转运障碍，黏液在呼吸道黏膜内淤滞，黏膜形成囊性增生，造成呼吸道堵塞；因反复感染，导致患者呼吸衰竭而死亡。
发病频率(0.4 ‰)，常染色体隐性遗传；致病基因CFTR；典型症状：进行性肺损伤及其他。
Gene therapy of CF：将重组CFTCR基因cDNA-病毒载体，用涂布鼻腔、或喷雾吸入气管及肺部等方法，转入患者呼吸道上皮细胞中，获得正常CFTCR 基因的表达，纠正Cl＋转运缺陷，减少黏液分泌。
病理生理变化过程：（如图）
四、调控序列变异导致基因表达水平变化
基因调控序列也称顺式作用元件，是基因的重要组成部分，虽然其遗传信息不会被表达传递到蛋白质的肽链中去，基因调控序列的突变也不会改变蛋白质的一级结构，但调控序列的突变会改变基因的表达强度，引起蛋白质生物合成量的改变。这种量的改变超过一定的范围，同样会导致蛋白质功能的紊乱，引起相应的疾病。
β珠蛋白基因转录起始位点上游30（-30）处有TATA盒、-90及-105处有CACACCC 序列，它们都是β珠蛋白基因的转录调控序列，如TATA盒调控正常的转录起始
及其效率。这些调控序列如果发生基因突变，就会使β珠蛋白基因的转录效率降低，β珠蛋白合成减少，引起β＋-地贫。不仅是调控序列变异能影响基因的表达，使相应蛋白质的合成减少，一些内含子的变异也会影响蛋白质的合成，使体内相应蛋白质含量减少或缺失。
第二节细胞间异常信号导致基因表达异常
正常的细胞间信号，能保证基因表达的正常时间特异性、空间特异性以及正常的表达水平。相反，错误的细胞间信号，会破坏基因表达的时间特异性和空间特异性，使胚胎后细胞合成胚胎型蛋白质、或使一种细胞合成另一种细胞特有的蛋白质，还会使基因表达水平过高或过低，这些都会导致疾病的发生。
细胞间信号异常导致基因表达异常从而引起疾病：
人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系，调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。
例如AFP接受异常的细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素。甲胎蛋白（AFP）是一种具有胚胎时间表达特异性的蛋白质，胚胎发育过程中，AFP的增强子始终处于激活状态,而沉寂子处于抑制状态,因此增强子的信号可以顺利到达启动子启动AFP基因，AFP基因大量表达。AFP具有免疫抑制作用,可以保护胎儿免受母体的免疫攻击。胎儿出生后,沉寂子活化,阻碍了增强子的启动效应,使AFP表达受到抑制。但在异常细胞增殖信号的作用下，c-myc、c-fos和c-jun 等癌基因表达异常增加，其表达产物与AFP基因顺式作用元件相结合，激活AFP 基因的表达，重新大量合成AFP。大量合成的AFP通过细胞膜上AFP受体介导,影响淋巴细胞或肝癌细胞的肿瘤坏死因子（TNF）家族及其受体的表达,导致肝癌细胞逃避机体免疫监视,同时又能促进癌基因表达,引起肝癌细胞大量生长。可见，由于肝细胞接受了异常的细胞增殖信号，破坏了AFP表达的时间特异性，使AFP在胚胎后肝脏异常表达，在肝癌的发生发展中起着十分重要的作用。
再如粉尘刺激的细胞间信号异常导致基因表达异常引起矽肺发生：粉尘刺激→肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞→分泌TGF-β1→成纤维细胞→促细胞分裂和ECM 蛋白基因表达→ ECM 增加→矽肺发生
可见，矽肺发生的重要分子机制是成纤维细胞获得了异常的细胞间信号，使多种ECM蛋白质基因的表达增强，相应的蛋白质合成和分泌增加，造成ECM在肺组织病理性蓄积，最终形成矽肺。
第三节细胞内因素导致基因表达异常引起的疾病
基因的表达不仅受基因本身结构和细胞间信号的影响，也受一些细胞内因素的影响，这些影响达到一定的强度或超过一定的范围，或破坏基因表达的时间特异性和空间特异性，或使基因表达水平过高或过低，均可导致疾病的发生。
细胞内因素导致基因表达异常引起疾病：
①异常的细胞内信号导致基因表达异常引起疾病
高血糖→ DAG↑→激活PKC →激活 ACE → AngⅡ↑
②异常的DNA甲基化导致基因表达异常引起疾病
DNA甲基化导致基因表达变化是肿瘤形成的重要原因。肿瘤细胞与正常细胞比较，DNA 甲基化模式显著不同。不同的DNA甲基化模式，会产生不同的基因表达谱。基因表达谱失去平衡，就会导致疾病发生，如原癌基因过度扩增、表达异常增强，或/和抑癌基因的“沉寂”，相应表达产物减少甚至消失，都会使细胞增殖平衡受到破坏而引起恶性肿瘤的发生。
hCG5' 转录起始区低甲基化→非滋养层细胞hCG ↑→受体结合→激活胞内cAMP信号传导途径→调节肿瘤细胞的其他“生长因子、细胞
因子”的产生，Tumor ↑
③病原生物基因的体内表达导致疾病的三种方式
第四节翻译后加工运输障碍引起疾病
在机体细胞内，通过mRNA指导的蛋白质生物合成将基因DNA序列中所含的遗传信息表达于蛋白质中，并通过蛋白质的生物功能体现机体的生命活动。但是，即使没有任何突变、所含遗传信息完全正确，刚刚合成的、未成熟的蛋白质没有生物活性，不能正确地完成其生物学功能。要使新合成的蛋白质具有完整的
生物学活性，还需对其进行翻译后加工，其方式包括：除去信号肽、基团修饰、蛋白质的折叠、亚基聚合、运输至发挥功能的靶部位等。其中任何一个环节的障碍，都会使蛋白质功能紊乱，导致疾病的发生。
酪氨酸酶是黑色素细胞中催化黑色素生成的限速酶,在黑色素的生成过程中起着关键的作用。酪氨酸酶肽链合成后，需先在内质网进行折叠，再从内质网运输至高尔基体进行糖基化加工,然后由运转囊泡将其转运至黑色素体发挥作用。多种蛋白质（包括酶蛋白）参与了酪氨酸酶的这一成熟及转运过程。所以，不仅酪氨酸酶本身的基因变异会使酪氨酸酶功能紊乱，参与酪氨酸酶成熟和转运的蛋白质基因变异，也可以导致酪氨酸酶不能成熟或不能运输至靶部位，使酪氨酸酶功能紊乱，黑色素合成障碍，导致一些色素病的发生。
I型泛发性白化病就是一种色素病,主要表现为眼、毛发、皮肤的色素缺失,易发生皮肤及眼部的肿瘤,由先天性酪氨酸酶基因缺陷引起。变异的酪氨酸酶蛋白在内质网的折叠障碍是I型泛发性白化病的一种重要的分子机制。
在酪氨酸酶的成熟及转运过程中，一种被称为P蛋白的蛋白质起着重要的作用。P蛋白是一种含12跨膜结构域的膜蛋白，参与酪氨酸酶蛋白从高尔基体到黑色素体的运输。P蛋白基因突变，会使P蛋白的功能障碍，酪氨酸酶不能正确地转运至黑色素体，导致酪氨酸酶功能紊乱，黑色素合成障碍，引起Ⅱ型泛发性白化病。
第五节蛋白质降解异常引起疾病
基因表达及蛋白质合成是影响体内蛋白质含量的重要因素，但不是唯一的因素。蛋白质的降解也是调节体内蛋白质含量的一个重要因素，事实上，是蛋白质的合成及降解之间的相对速度大小或量的多少决定体内蛋白质含量。某蛋白质合成大于降解、则该蛋白在体内的含量增加，反之亦然。
一、哺乳动物体内蛋白质降解有两条基本途径：
①一是溶酶体，主要降解细胞吞入的胞外蛋白质。
②另一条是泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway；UPP），主
要降解细胞内泛素化的蛋白质，是细胞质和细胞核内依赖于ATP、非溶
酶体途径的蛋白质降解通路,能高效并高度选择性进行细胞内蛋白质降
解,尤其降解半衰期短的功能蛋白、癌基因产物和变性、变构蛋白等,应
急状态下也降解细胞内结构蛋白。
二、泛素-蛋白酶体途径由泛素(ubiquitin，Ub)、特异性泛素激活酶(ubiquitin-
activating enzyme，E1)、泛素结合酶( ubiquitin-conjugating enzyme，E2)、泛素连接酶( ubiquitin ligase，E3) 、蛋白酶体(proteasome) 组成，泛素-蛋白酶体途径是在这些酶的顺序作用下的底物蛋白泛素化过程及泛素化蛋白最后被降解为小肽。
三、在某些有害的环境，如氧化应激、内质网应激和老化过程中，蛋白质会受到
损害而发生折叠错误；即使新合成的蛋白质，在翻译后修饰加工过程中，会发生异常裂解。
①泛素-蛋白酶体系统受损，蛋白质从细胞内降解清除，就会使其在细胞内
积聚，造成细胞功能障碍、甚至死亡，引起相应的疾病。
②如果该系统功能异常增强，就会使一些正常功能或结构蛋白被降解、导
致蛋白质的功能紊乱或细胞结构破坏，引起疾病。一些蛋白质，特别是
调节蛋白质，它们在完成功能后，需及时被降解清除，以适应机体代谢
或其它功能调节的需要。这些调节蛋白的降解清除，也主要靠泛素-蛋白
酶体系统来完成。如果该系统的功能异常，不能及时地降解清除这些调
节蛋白，就会使这些调节蛋白持续地发挥作用，失去调节意义，导致机
体功能紊乱，引起疾病。
举例1：泛素-蛋白酶体系统在维持正常载脂蛋白含量中起着重要的作用，该系统功能障碍，会导致载脂蛋白含量异常。Apo B100内源性甘油三酯及胆固醇代谢中起着重要的作用，并直接参与了血浆LDL 的清除，对维持正常的血浆LDL及LDL-胆固醇（LDL-C）水平具有十分重要的意义。用培养的仓鼠原代肝细胞建立肝脂质代谢模型，发现大约40%新合成的apo B被泛素化并降解；在人的脂蛋白代谢模型中，脂质核心再循环受到限制，原因是部分apo B 通过泛素-蛋白酶体系统被迅速降解。给予蛋白酶体抑制剂ALLN或MG132, apo B的多聚泛素化及降解都受到剂量依赖性抑制，提示蛋白酶体抑制剂可能抑制泛素化的apo B
被降解。血浆apo E水平与动脉粥样硬化的敏感性相关,巨噬细胞源性的apo E 可清除动脉壁的胆固醇而发挥抗动脉粥样硬化作用。在RAW264.7单核巨噬细胞及HepG2细胞转入泛素使其过表达，结果发现apo E 明显泛素化并降解, 而蛋白酶体抑制剂乳胱素可使apo E降解速率减慢，导致apo E聚集。
举例2：阿尔茨海默病（AD）是一种以进行性痴呆为主要临床表现的大脑变性疾病。其病理特征包括老年斑、神经原纤维缠结、海马锥体细胞中颗粒空泡变性及血管壁淀粉样蛋白沉积。研究发现, AD患者脑组织蛋白酶体活性的下降,尤其是在海马、海马旁回、颞上回、颞中回及顶下小叶,且蛋白酶体活性下降与其表达下降不一致,因此认为AD患者脑细胞蛋白酶体活性可能受到抑制。淀粉样蛋白(amyloid proteinβ，Αβ)是细胞外淀粉样斑的主要成分,并存在于神经元内的神经原纤维缠结内,研究发现，Αβ可选择性地抑制20S蛋白酶体糜蛋白酶样活性,且在病理状态下可通过抑制26S蛋白酶体活性来影响泛素依赖性蛋白的降解。可见，泛素-蛋白酶体系统的功能紊乱在AD的发生发展中起着重要的作用。
第六节病原生物基因引起的疾病
人体疾病可以由外源性基因，也就是病原生物的感染引起。由于不同的外源性基因各有特点，相应病原生物的生活特性也各不相同，不同的病原生物基因引起人类疾病的机理也各有特点。
①外源性基因通过病原生物的感染进入体内，在人体的特定组织器官表
达，病原生物得以生成、繁殖，引起机械或生物学损伤。
②病原生物基因在人体内大量表达，病原生物大量繁殖，与人体争夺营
养物质，造成人体营养物质缺乏，引起疾病。
③病原生物基因在人体表达，可产生生物毒素作用于人体细胞，使细胞
的一些生理功能或代谢异常，引起疾病。
④病原生物的基因还可以整合到人体基因组中，改变一些基因的结构，
或改变机体原有基因表达产物的结构和功能、或改变机体原有基因的
表达水平、或引起新的异常蛋白的表达，引起疾病的发生。
第七节疾病分子机制的研究策略
针对如此复杂的疾病发生分子机制，对不同的疾病就要采取不同的研究策略。
一、通过结构分析确定基因变异在疾病发生中的作用
基因结构改变即基因突变是人类疾病发生的重要原因之一。对于由基因结构改变引起的疾病，弄清其发病机制的基本策略是突变基因的结构分析，并通过对突变基因的结构分析找到致病突变。主要方法有：核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、化学切割错配、酶促切割错配等。（讲解课件上的图例）
1.核糖核酸酶切分析
①基本原理: 在一定条件下，异源双链核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA
中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小，即可确定错配的位置。
② Watterson et al., J Clin Microbiol (1998)
– Mutation scanning ；
③Cleave with RNase 1 and T1 (not RNase A)；Inner promoter primers
– SP6 and T7；
④ Gel detection; could include isotope incorporation
⑤缺点：
?当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；
?分析DNA的一条链，突变检出率为 30%；同时分析DNA的两条链，突变检出率为 70%；
?需要制备特异性的RNA探针
2.杂合双链分析法（heteroduplex analgsis, HA）
直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环形突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率。
化学切割错配法（Chemical cleavage of mismatch, CCM）
基本原理：将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺和哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。
特点：
?突变检出率高；
?如使用荧光检测系统，灵敏度较高；
?可检测长度达 2Kb的核酸片段；
?步骤多、费时、有毒；
?碳化二亚胺检测法
3.酶促切割错配 (enzyme mismatch cleavage )
①polymorphisms can be identified by EMC in DNA–DNA heteroduplexes.
② T4 Endo nuclease VII
③ Enzymes cleave adjacent to the mismatch and products are resolved
via gel or capillary electrophoresis.
④ the cleavage enzymes often nick complementary regions of DNA as
well. ( increases background noise, lowers specificity, reduces
the pooling capacity of the assay)
二、基因表达水平分析
基因表达分析的主要方法包括Northern印迹杂交法、消减杂交技术、差异显示法、定量RT-PCR、基因表达芯片、基因表达系列分析技术等，在这里主要讨论差异显示法、消减杂交技术和基因表达系列分析技术。
1. 差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription chain
reaction, DDRT-PCR) 指在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同
阶段、在生物体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同
的，这就是基因的差别表达（differential expression）。原理：利用两组特
殊的引物对差别表达的基因进行扩增。3’端引物：利用mRNA的poly A
尾巴设计。根据mRNA结构分析知道，poly A尾巴之前的两个碱基只有
12种可能的排列组合：根据这12种排列组合，设计12种不同的引物，
这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由11~12个T及两个其它的
碱基组成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示，M为A、G、C的任一
种，N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。
5’端引物：5’端为10个碱基（10-mer）组成的随机引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交，杂交位点也可能在mRNA 的不同位点上。
用一种3’锚定引物和一种5’随机引物进行扩增，可获得50~100条100~500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带，应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5’随机引物。
2. 抑制性差减杂交(suppressive subtractive hybridization, SSH)
基本原理：SSH是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理，丰度高的单链DNA退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，使不同丰度的单链DNA得到均衡；抑制PCR利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离。
方法：提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经识别 4 碱基的限制性内切酶切割；实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头；进行2轮差减杂交和抑制性PCR；获得富集的目的基因。
?优点采用两次差减杂交和PCR，保证了高特异性(假阳性率可降至?6％); 在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，获得低丰度差异?表达基因;操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法。?缺点起始材料需要 g 级量mRNA; SSH差减克隆片段较小，获取?cDNA全长序列有一定难度。
3. 基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)
是一种用于定量、高通量基因表达分析的实验方法(Velculescu et al., 1995)。SAGE原理: 分离每个转录本的特定位置的较短的单一的序列标签（约9-14个碱基对），这些短的序列被连接、克隆和测序，特定的序列标签的出现次数就反应了对应基因的表达丰度。
三、基因功能研究以确定基因在疾病中的作用
弄清基因的生物学功能，才能明确基因在疾病发生中的具体作用、弄清疾病发生的分子机制。常用的基因功能分析策略包括转基因技术、基因敲除技术、反义技术、基因诱导超表达技术和RNA干扰技术等。
（一）转基因技术确定基因在疾病中的作用
转基因技术是将人工分离和修饰过的外源基因导入培养细胞和/或生物体内，通过导入基因的表达改变细胞或生物体的性状，形成性状的可遗传性修饰。通过对这些性状改变的分析，就能了解导入基因的生物学功能。
举例:如有人用大鼠弹力蛋白酶I基因的增强子与激活的H-ras基因重组成融合基因并导入小鼠，制备的转基因小鼠几乎100%都产生胰腺癌。用这种方法直接证明了原癌基因的突变是肿瘤发生的重要原因。
用转基因技术研究基因的功能或确定基因在疾病中的作用可以在细胞水平进行，也可以通过转基因动物在整体水平进行，基本策略都是细胞的基因转染。
转染基因包括质粒DNA、RNA和寡核苷酸。转染分为瞬时转染和稳定转染，瞬时转染将外源基因导入宿主细胞核内但不整合到染色体中；稳定转染不仅将外源基因导入宿主细胞核内，还将其整合到宿主细胞的染色体中或形成附加体。转染的方法有物理方法(如电穿孔法)、化学方法(如磷酸钙法、阳离子脂质体法、非脂质体脂类法)和生物学方法(如逆转录病毒等病毒介导法)。非脂质体脂类转染试剂对一些细胞的毒性比一般阳离子脂质体的要小,可提高转染效率和扩大使用细胞的范围。影响转染效率的因素较多，如培养细胞的密度、核酸（外源基因）的用量、核酸与转染试剂的比例、转染时间、转染后培养时间等；所以，要获得理想的转染效率，通常要对这些转染条件进行优化。
影响转染的因素：
①细胞培养物，如细胞培养代数、培养基种类、培养基中血清的含量等；
②载体，包括载体大小及形式(超螺旋或线性)；
③导入基因，包括其核酸的纯度、杂质的种类及含量；
④转染方法，不同的转染方法在不同的细胞有不同的转染效率。
（二）基因敲除技术确定基因在疾病中的作用
基因敲除(gene knockout)又被称为基因打靶(gene targeting)，是一种通
过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组、精细地定点修饰和改造染色体基因片段的技术。基因敲除是在胚胎干细胞技术和同源重组技术基础上发展起来的一门新兴生物技术,具有位点专一性强、打靶后目的片段可以与染色体DNA共同稳定遗传的特点,不仅是一种较理想的改造生物遗传物质的实验方法，也是研究基因的功能、确定基因在疾病发生中的作用最直接和最有效的方法之一。
基因敲除最常使用的细胞是小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞),因为ES细胞在体外有白血病抑制因子(LIF)的条件下培养,可增殖并维持多潜能未分化状态,具备发育成胚系各种组织的能力。
用转染的方法将重组载体导入ES细胞中，使之与ES细胞染色体上的靶基因发生同源重组,把突变或缺失的外源基因置换到ES细胞中,从而使内源性目的基因的转录子中断,阻断ES细胞中目标基因的表达,从表达的角度讲，这个目标基因就被剔除了。转染ES细胞后，通过外源基因上的筛选标记筛选出发生同源重组的ES细胞并将其在体外扩增，再将带有此ES细胞的囊胚移植到假孕鼠的子宫内,使之发育成一个嵌合体。然后将这些ES细胞植入假孕小鼠的子宫内，产生F1代嵌合鼠，F1代小鼠互相交配就可能产生杂合子和纯合子基因敲除小鼠。研究杂合子和纯合子基因敲除小鼠的表型改变,就能了解敲除的目的基因的功能、确定目的基因在疾病发生中的作用。如小鼠是一种对动脉粥样硬化有抗性的动物，当把小鼠的载脂蛋白（apo E）基因敲除后，纯合子apo E基因敲除小鼠在普通饲料或脂肪含量稍高的饲料喂养2～3月，血浆残粒脂蛋白胆固醇含量大大升高，主动脉和冠状动脉出现明显的动脉粥样硬化板块，从而证实了apo E促进残粒脂蛋白代谢、抗动脉粥样硬化的作用。
基因敲除技术的不足：
①操作复杂,实验周期长,费用昂贵；
②存在基因不完全敲除(incomplete knockout)而导致泄漏突变(leaky mutation)。在基因敲除过程中,被阻断表达的只是染色体中靶基因的某一个或几个外显子而不是该基因的全部编码区,残留的编码序列可能获得新的未知功能,给表型分析带来麻烦；
③基因敲除过程中的染色体片段破坏会导致其它基因的编码区或调控元件破坏,造成多基因删除或死表型；
④基因的冗余和代偿机制也会给表型分析带来很大困难；
⑤同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除获得的表型会有很大差异。
（三）反义技术确定基因在疾病中的作用
反义技术(antisense technique)是根据碱基互补原理,用人工或生物合成特异的互补DNA或RNA片段(反义核酸)，使之能特异地与目的核酸片段互补结合，从而特异地抑制甚至阻断目的基因的表达的一种技术。根据所采用的反义核酸的不同，反义技术又可分为反义寡核苷酸技术、反义RNA 技术和核酶技术等。
1.用反义寡核苷酸技术确定基因在疾病中的作用
反义寡核苷酸(antisense oligonuleotides，ASON)技术根据碱基互补结合原理、人工或生物合成与目的DNA或RNA互补的寡核苷酸,将其导入细胞后与胞内目的DNA或RNA特异地结合，从而抑制甚至阻断目的基因的表达或目的RNA 的翻译,达到人工调控表达基因的目的。目的基因被抑制后会发生表型的变化，通过表型改变的分析，就能了解被抑制基因的功能、确定其在相关疾病发生中的作用。
ASON主要通过以下几种机理抑制或阻断目的基因的表达：
①通过与染色体DNA的互补结合，ASON掺入基因组特异区域并形成三股螺旋DNA(triplex DNA)或D环(D-loop)结构、或通过对转录因子的套圈作用,封闭目的基因，使目的基因不能被复制，也不能被转录成RNA。
②ASON进入细胞后，与细胞内目的mRNA互补结合，形成DNA·RNA具有双链结构的异源杂交体。
③ASON能与核内不均一RNA（hnRNA）互补结合，使其不能被正确地被剪切，阻断mRNA的成熟，相应的基因在转录后不能被翻译成蛋白质，基因的表达被阻断。
④ASON能与核糖体rRNA的mRNA结合位点互补结合，阻止mRNA与rRNA 结合，进而阻止蛋白质翻译的正确启动，相应基因的表达就会被阻断。
⑤真核细胞RNA转录完成后需经过转录后修饰并移至胞浆的特定部位才能被翻译。特异的ASON与mRNA互补结合后能阻止其进入正确的翻译部位，mRNA 不能被翻译成蛋白质，相应基因的表达被阻断。
由于ASON进入机体或细胞后很容易被降解,为提高其稳定性、延长其半寿期，在实际运用过程中往往要对ASON进行修饰。如将ASON磷酸骨架上的氧用硫原子或乙基、甲基代替，形成硫化、乙基化、甲基化的反义寡核苷酸，是第一代修饰方式，其中以硫代修饰使用最多。修饰后的ASON虽然增加了稳定性、延长了其半寿期，但也同时增加了其细胞毒性、还降低了其细胞吸收率。
近年来发现，以2-氨基乙基甘氨酸为基本骨架的多肽链是一种核酸类似物，每个氨基酸残基间由酰胺键连接到多肽骨架上,碱基通过亚甲基羰基连接到多肽骨架上。与核酸不同的是,这种多肽链不含任何戊糖或磷酸成分,而是以酰胺键连接骨架取代核酸中以磷酸二酯键连接骨架。由于这种多肽链能与RNA或DNA互补结合形成稳定的多肽链:DNA或RNA杂合链，所以这种多肽链被称为肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)。PNA具有较强的蛋白酶、核酸酶抗性，在机体内或细胞中具有较强的稳定性，当它与DNA或RNA结合后，能阻止其转录或翻译，从而阻断相应基因的表达，是较好的反义抑制剂,被称为第三代反义核酸。
2．反义RNA技术确定基因在疾病中的作用
反义RNA（antisense RNA）是一类自身没有编码功能,但能通过配对碱基间氢键与目的RNA、特别是mRNA的特定区域互补结合，抑制目的RNA功能、调控相应基因表达的小分子RNA。
反义RNA技术就是采用反义RNA抑制目的基因表达，然后通过表型改变的分析，探讨目的基因的功能及其在疾病发生中的作用的一种研究手段。反义RNA 的作用机理比较复杂，它对基因表达在多水平、多作用点发挥抑制作用。
在反义RNA技术中，针对目的mRNA设计并合成人工反义RNA是其关键环节之一，选择目的mRNA特异靶序列是设计高效、特异反义RNA的第一步。一般认为，在原核细胞中，反义RNA针对目的mRNA的SD序列和AUG区域比针对编码区有更强的抑制作用；而针对编码序列不同区域的反义RNA，其抑制程度的差别比较大。在真核系统中，靶序列的选择较复杂，可根据目的mRNA的特点，选择针对其不同区域的反义RNA。针对mRNA前体5ˊ末端的反义RNA 能阻止加“帽”反应及翻译；针对外显子-内含子交界区域的反义RNA能阻止剪接；针对3ˊ末端的反义RNA能阻止mRNA的加尾作用，并阻止mRNA由胞核内向胞浆转运；针对编码区的反义RNA能直接阻止核糖体与mRNA的结合与
翻译的延伸过程。通过这些反义RNA能抑制目的mRNA的基因表达、翻译成蛋白质。蛋白质合成被阻断后，就会产生相应的表型改变。分析这些表型改变，就能确定被抑制基因在疾病发生中的作用。
3．核酶技术确定基因在疾病中的作用
核酶就是具有生物催化活性的RNA，能按碱基互补原理识别特定核苷酸序列并特异地剪切底物RNA分子。
根据分子大小可以分成大分子核酶和小分子核酶两类。大分子核酶包括第一型内含子(group I intron), 第二型内含子(group II intron)和核糖核酸酶P 的RNA亚基,它们都是由几百到几千个核苷酸组成的结构复杂的大分子。小分子核酶可按结构分为多种,其中包括锤头型 (hammerhead)、发夹型(hairpin)、肝炎病毒D (hepatitis delta virus)和VS核酶(V arkud satellite ribozyme)，其大小多在35～155个核苷酸之间。
由于核酶能识别目的RNA的特定序列并使RNA降解而无法进行转录和翻译, 所以核酶是一种具有催化活性的特殊反义RNA,用核酶抑制基因表达的核酶技术是研究基因的功能及其在疾病发生中作用的一种有效手段。
在核酶技术的应用过程中，一般都采用小分子核酶。由于锤头核酶的结构最为简单,易于人工设计,对其进行的研究也最多；所以应用最广；其次是发夹核酶,因为其催化效率较高,受金属离子和pH值变动的影响也较小。在实际应用过程中，现根据核酶的结构特点和目的RNA的特异序列特征，设计并合成针对目的RNA特异序列核酶的基因，构建表达载体，然后将其导入细胞。核酶基因就会表达产生核酶，通过特异序列识别并降解目的RNA,使其不能翻译成蛋白质，相应基因的表达被抑制。
（四）RNA干扰技术确定基因在疾病中的作用
RNA干扰（RNA interference，RNAi）的概念:是指由双链RNA分子介导的、特异的mRNA降解，导致转录后水平的基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）现象，广泛存在大肠杆菌、真菌、线虫、果蝇、植物、动物卵和哺乳动物等细胞中，是生物在长期进化过程中形成的抵御外来核酸入侵和抑制转座子诱导基因组DNA突变的重要途径。基因沉默使宿主将外源核酸作为对自身有害的序列而将其降解,阻止外源核酸在宿主细胞内发挥毒性作用。这种降解
作用具有很强的序列特异性，能有效地保持宿主细胞基因组的完整性。
RNAi过程:分为起始和效应两个阶段。
①起始阶段，dsRNA被dsRNA特异性核酸内切酶(dsRNA-specific
endonuclease)Dicer切割为21～25个核苷酸的小分子干扰RNA片段
(small interfering RNAs，siRNA)。
②效应阶段，siRNA与螺旋酶、特定的核酸内切酶等结合在一起形成
RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。该
复合物形成以后，会使RISC中的siRNA变性，双链解开，卸下正
义链，反义链仍保留在RISC上并按碱基互补原则识别目的mRNA
的互补序列，通过反义链与目的mRNA互补序列的结合，将RISC
与目的mRNA结合在一起。这时，RISC中的核酸内切酶就会在与
siRNA中点对应的位置将目的mRNA裂解，使目的mRNA失去指导
蛋白质合成的活性，从翻译水平上阻断相应基因的表达。
RNAi用于研究基因的功能及其在疾病发生中的作用。
先根据目的基因（mRNA）的结构特点，设计siRNA，并将其导入细胞。进入细胞的siRNA就会启动RNAi，目的基因的mRNA被降解，相应基因的表达被阻断并产生相应的表型改变。分析表达阻断前后的表型变化，就能了解目的基因的功能、确定目的基因在疾病发生中的作用。
向细胞内引入siRNA的方法有两种，一种是设计并合成目的mRNA特异的siRNA并将其直接引入细胞，或用一种具有发夹结构的小分子RNA(small hairpin RNA，shRNA)转染到细胞，shRNA在细胞中会自动被加工成为siRNA。另一种是构建特定的siRNA表达载体，通过质粒在体内表达产生siRNA。
（五）基因诱导超表达技术确定基因在疾病中的作用
将目的基因全长序列与高活性启动子或组织特异性启动子融合，经过转化后，在诱导剂的作用下或在特定的组织细胞中，目的基因超表达，相应的基因表达产物大量积累。比较加入诱导剂前后的表型变化，从而确定目的基因在疾病发生中的作用。
七、思考题：
1. 什么是基因突变? 它的形成有何意义?
2. 简述研究疾病相关基因的主要策略。
3. 什么是无义突变、错义突变、移码突变？
八、参考文献：
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《植物营养分子生物学基础》教学大纲 一、基本信息 课程名称植物营养分子生物学基础 课程编 号 ARGE4208 英文名称 Molecular biology for plant nutrition 课程类 型 专业选修课 总学时36 其中：理论学 时36 实验学 时 实践学 时 学分 2 预修课 程生物化学，植物营养学 适用对 象 农业资源与环境 专业 课程简介（200字左 右） 《植物营养分子生物学基础》课程内容（1）讲解植物分子生物学基本理论和基础知识（2）讲解植物分子生物学领域的基本研究方法和技术，其中包括植物转基因所需的植物组织培养技术（3）介绍植物分子生物学基础知识和基本技能在植物养分吸收利用机理研究的应用，包括其必要性、研究现状以及取得的研究成果。目的是为学生进一步利用分子生物学手段深入研究植物养分吸收利用机理打下坚实基础。 二、教学目标及任务 通过本课程的教学，使学生掌握植物分子生物学的基础知识和基本理论，了解植物分子生物学的基本研究方法与手段，为学生进一步利用分子生物学手段深入研究植物养分吸收利用机理打下坚实基础。 三、学时分配 教学课时分配
章节章节内容讲课实验实践合计绪论一、引言 二、植物分子生物学与植物营养分 子生物学简史 三、植物营养分子生物学基础课程 内容及特点 四、植物营养分子生物学展望 2 2 第一章基础分子生物学知识 第一节植物基因组的特点及多 样性 (2学时) 2 2 第二节 DNA的复制、转录、修复 和重组（6学时） 一、染色体与DNA的结构 二、DNA的复制 三、DNA的重组 四、RNA的转录 五、启动子与转录起始 六、原核生物与真核生物mRNA的 特征比较 七、终止与终止子 八、内含子的剪接、编辑及化学 修饰 6 6 第三节蛋白质的生物合成（4学 时） 一、mRNA及遗传密码---三联子 二、tRNA 三、核糖体 四、蛋白质的合成 五、蛋白质的运转 4 4 第四节基因表达的调控（4学 时） 一、原核基因表达调控 二、真核细胞的基因结构 三、顺式作用元件与基因调控 四、反式作用因子对转录调控 五、其他水平的基因调控 4 4 第二章植物分子生物学研究方法第一节重组DNA技术发展史上的 重大事件 第二节 DNA操作技术 第三节基因克隆的主要载体系统 第四节基因的分离与鉴定 第五节植物组培及转基因技术。 8 8
植物钾离子通道的分子生物学研究进展 闵水珠 (浙江大学生命科学学院，浙江杭州，310029) 摘 要：钾离子通道是植物钾离子吸收的重要途径之一。近年来，已从多种植物或同种植物的不同组织器官 中分离到多种钾离子通道基因，包括内向整流型钾离子通道基因( 如OsAKT1，DKT1，Ktrrl ，KIl l ，KZM1，ZMK2 等) 和外向整流型钾离子通道基因(如CORK ，PTOR K ，STOR K 等) 。文章分别从结构、功能以及相关基因等三 方面综述了关于植物钾离子通道的分子生物学研究进展，并对应用生物工程技术改良植物的钾营养性状进 行了讨论。 关键词：钾离子通道；结构；基因 中图分类号：Q945；Q735 文献标识码：A 文章编号：1 004 —1 524(2005)03—01 63—07 T he progress on the m olecular biology of t h e K channels in plants M G Shui— zhu ( Co／e ge o f Li fe Science ， 慨 Un ive rsity ，Ha．~ hou 310029 ，China ) A bstract ：Tif s review summar i zed recent progresses on molecular biology of K channels in plants ，including structure and their elevant genes in specialty．The latter is d i v i ded into inward-rectifying K channel(K in) genes(OsAKT 1，DKT1， KFrl ，KDC1，KZM1，ZMK2，etc．) and o utward-~ tifyin g K channel(K out) gene s (C O R K ，FIDR K ，STOR K ，etc．) ．The possibilit y of impr o v i n g potassium nutr i tion of pla n t by bioengineerin g is also d i scussed in this paper． K ey words ：K channel；structure ；gene 离子通道(ion channe1) 是跨膜蛋白，每个蛋 白分子能以高达l08个／秒的速度进行离子的被 动跨膜运输，离子在跨膜电化学势梯度的作用下 进行的运输，不需要加入任何的自由能。一般来 讲，离子通道具有两个显著特征：一是离子通道 是门控的，即离子通道的活性由通道开或关两种 构象所调节，并通过开关应答相应的信号。根据 门控机制，离子通道可分为电压门控、配体门控、
中科院研究生院硕士研究生入学考试 《生物化学与分子生物学》考试大纲 一、考试内容 1.蛋白质化学 考试内容 ●蛋白质的化学组成，20种氨基酸的简写符号 ●氨基酸的理化性质及化学反应 ●蛋白质分子的结构（一级、二级、高级结构的概念及形式） ●蛋白质一级结构测定的一般步骤 ●蛋白质的理化性质及分离纯化和纯度鉴定的方法 ●蛋白质的变性作用 ●蛋白质结构与功能的关系 考试要求 ●了解氨基酸、肽的分类 ●掌握氨基酸与蛋白质的物理性质和化学性质 ●了解蛋白质一级结构的测定方法（目前关于蛋白质一级结构测定的新方法和新思路很多，而教科书和教学中 涉及的可能不够广泛，建议只让学生了解即可） ●理解氨基酸的通式与结构 ●理解蛋白质二级和三级结构的类型及特点，四级结构的概念及亚基 ●掌握肽键的特点 ●掌握蛋白质的变性作用 ●掌握蛋白质结构与功能的关系 2.核酸化学 考试内容 ●核酸的基本化学组成及分类 ●核苷酸的结构 ●DNA和RNA一级结构的概念和二级结构要特点；DNA的三级结构 ●RNA的分类及各类RNA的生物学功能 ●核酸的主要理化特性 ●核酸的研究方法 考试要求 ●全面了解核酸的组成、结构、结构单位以及掌握核酸的性质 ●全面了解核苷酸组成、结构、结构单位以及掌握核苷酸的性质 ●掌握DNA的二级结构模型和核酸杂交技术 ●了解microRNA的序列和结构特点（近年来针对非编码RNA的研究越来越深入，建议增加相关考核） 3. 糖类结构与功能 考试内容 ●糖的主要分类及其各自的代表 ●糖聚合物及其代表和它们的生物学功能 ●糖链和糖蛋白的生物活性 考试要求 ●掌握糖的概念及其分类 ●掌握糖类的元素组成、化学本质及生物学功用 ●理解旋光异构 ●掌握单糖、二糖、寡糖和多糖的结构和性质 ●掌握糖的鉴定原理 4. 脂质与生物膜 考试内容
一、植物组织培养：狭义指对植物体组织或由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养直至生成完整植株。广义：无菌操作分离植物体一部分(即外植体)接种到培养基，在人工条件下培养直至生成完整植株。生物技术中的一个基本技术。 MS：MS培养基是Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其营养丰富，养分的数量和比例合适，不需要添加更多的有机附加物，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。 愈伤组织愈伤组织callus在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面上产生。 cDNA文库：包含细胞全部的mRNA信息的反转录所得到的cDNA的集合体。 胚状体：是指植物在离体培养条件下，非合子细胞经过胚胎发生和发育的过程形成的胚状结构，又称体细胞胚。 体细胞杂交：体细胞杂交又称体细胞融合，指将两个GT不同的体细胞融合成一个体细胞的过程。融合形成的杂种细胞，兼有两个细胞的染色体。 分子标记：是指在分子水平上DNA序列的差异所能够明确显示遗传多态性的一类遗传标记。 基因工程原称遗传工程，亦称重组DNA技术，是指采用分子生物学手段，将不同来源的基因，按照人类的愿望，在体外进行重组，然后将重组的基因导人受体细胞，使原有生物产生新的遗传特性，获得新品种，生产新产品的技术科学。 细胞培养指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长。过程：①取材和除菌；②培养基的配制；③接种与培养。 生物反应器是适用于林木细胞规模化培养的装置。 生物技术biotechmlogy：也称生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。 外植体explant：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。 植物细胞的全能性：植物每一个具有完整细胞核的体细胞，都含有植物体的全部遗传信息，在适当条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。 再分化：脱分化的分生细胞（愈伤组织）在一定的条件下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株的过程。 器官发生organogenesis：亦称器官形成，一般指脊椎动物个体发育中，由器官原基进而演变为器官的过程。各种器官形成的时间有早有晚，通过器官发生阶段，各种器官经过形态发生和组织分化，逐渐获得了特定的形态并执行一定的生理功能 体细胞胚胎发生：单细胞或一群细胞被诱导，不断再生非合子胚，并萌发形成完整植株的过程。 PCR：聚合酶链式反应是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。Recombinant DNA重组DNA：是指采用分子生物学手段，将不同来源的基因，按照人类的愿望，在体外进行重组，然后将重组的基因导人受体细胞，使原有生物产生新的遗传特性，获得新品种，生产新产品的技术科学。 细胞融合：两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。 悬浮培养：悬浮培养是细胞培养的基本方法，不仅为研究细胞的生长和分化提供了一个
机体是如何维持血糖平衡的（说明血糖的来源、去路及调节过程）？ 血液中的葡萄糖称为血糖，机体血糖平衡是糖、脂肪、氨基酸代谢协调的结果，也是肝、肌、脂肪组织等器官代谢协调的结果（由于血糖的来源与去路保持动态平衡，血糖是组织、中枢神经、脑能量来源的主要保证）。 A.血糖来源（3分） 糖类消化吸收：食物中的糖类经消化吸收入血，这是血糖最主要的来源；肝糖原分解：短期饥饿后，肝中储存的糖原分解成葡萄糖进入血液；糖异生作用：在较长时间饥饿后，氨基酸、甘油等非糖物质在肝内异生合成葡萄糖；其他单糖转化成葡萄糖。 B.血糖去路（4分） 氧化供能：葡萄糖在组织细胞中通过有氧氧化和无氧酵解产生ATP，为细胞供给能量，此为血糖的主要去路。合成糖原：进食后，肝和肌肉等组织将葡萄糖合成糖原以储存。转化成非糖物质：可转化为甘油、脂肪酸以合成脂肪；可转化为氨基酸、合成蛋白质。转变成其他糖或糖衍生物（戊糖磷酸途径），如核糖、脱氧核糖、氨基多糖等。血糖浓度高于肾阈时可随尿排出一部分。 C.血糖的调节（2分） 胰岛素是体内唯一降低血糖的激素，但胰岛素分泌受机体血糖的控制（机体血糖升高胰岛素分泌减少）。胰岛素分泌增加，糖原合酶活性提高、糖原磷酸化酶活性降低，糖原分解降低、糖原合成提高，血糖降低。否则相反（胰岛素分泌减少，糖原合酶活性降低、糖原磷酸化酶活性提高，糖原分解提高、糖原合成降低，血糖提高）。胰高血糖素、肾上腺素作用是升高机体血糖。胰高血糖素、肾上腺素分泌增加，糖原合酶活性降低、糖原磷酸化酶活性提高，糖原分解提高、糖原合成降低，血糖提高。否则相反。 老师，丙酮酸被还原为乳酸后，乳酸的去路是什么 这个问题很重要。 肌组织产生的乳酸的去向包括：大量乳酸透过肌细胞膜进入血液，在肝脏进行糖异生转变为葡萄糖。大量乳酸进入血液，在心肌中经LDH1催化生成丙酮酸氧化供能；部分乳酸在肌肉内脱氢生成丙酮酸而进入到有氧氧化供能。大量乳酸透过肌细胞膜进入血液，在肾脏异生为糖或经尿排出体外。 下面问题你能回答出来不 1说明脂肪氧化供能的过程 （1）脂肪动员：脂肪组织中的甘油三酯在HSL的作用下水解释放脂酸和甘油。 （2）脂酸氧化：经脂肪酸活化、脂酰CoA进入线粒体、β-氧化、乙酰CoA进入三羧酸循环彻底氧化成H2O 和CO2并释放能量。 （3）甘油氧化：经磷酸化、脱氢、异构转变成3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛循糖氧化分解途径彻底分解生成H2O 和CO2并释放能量。 1．丙氨酸异生形成葡萄糖的过程 答：（1）丙氨酸经GPT催化生成丙酮酸。（2）丙酮酸在线粒体内经丙酮酸羧化酶催化生成草酰乙酸，后者经苹果酸脱氢酶催化生成苹果酸出线粒体，在胞液中经苹果酸脱氢酶催化生成草酰乙酸，后者在磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶作用下生成磷酸烯醇式丙酮酸。（3）磷酸烯醇式丙酮酸循糖酵解途径至1，6-双磷酸果糖。1，6-双磷酸果糖经果糖双磷酸酶催化生成6-磷酸果糖，再异构成6-磷酸葡萄糖。6-磷酸葡萄糖在葡萄糖-6-磷酸酶作用下生成葡萄糖。
?评 述?一个科技里程碑:分子生物学的中心法则 王志珍(中国科学院生物物理研究所,北京100101) 编者按 王志珍院士的这篇评述,从历史的角度简述了“分子生物学的中心法则”的发展过程。正如作者指出的“中心法则所包含的划时代的生物学意义在于它揭示了生命最本质的规律,今天和昨天的生命科学都是建立在分子生物学的中心法则上”。文中也提到了蛋白质空间结构的“第二遗传密码”在本世纪的研究前景。本文想必会受到读者的欢迎。本刊希望今后能收到更多的这类评述。 一、分子生物学中心法则的提出 分子生物学的中心法则最早是由英国剑桥大学的物理学家佛郎西斯.克里克(Francis H. C.Crick)在1958年提出的,在英国的实验生物学会第12届讨论会“大分子的生物复制”会议录(Sym p.S oc. Exp.Biol.XII,138,1958)发表。中心法则是在前人工作的基础上,特别是在克里克本人和杰姆斯.沃森(James Wats on)一起揭示了DNA分子的双螺旋结构的基础上,总结出来的生命遗传信息的流动方向或传递规律。但是由于当时对转录、翻译、遗传密码、肽链折叠等都还了解不多,在那个时候与其说中心法则是一种准确的科学原理,不如说是一种强烈的科学信念。这个科学信念在以后分子生物学的发展过程中越来越成为多数人的坚定信念,因为它的正确性得到越来越多的实验证明,为越来越丰富的内容所充实、延伸、发展而变得越来越完善。 二、早期对中心法则的认识 克里克在1958年描绘的中心法则,如图1所示,箭头表示在三大类生物大分子脱氧核糖核酸DNA、核糖核酸RNA和蛋白质之间信息传递或流动所有可能的方向。这里的信息是指这些大分子的组成单元的序列所赋予的信息,即组成DNA的脱氧核糖核苷酸的序列,组成RNA的核糖核苷酸的序列,以及组成蛋白质的氨基酸的序列所赋予的信息。他做了进一步的分析,如图2所示,这些可能的信息传递大体上可以分成三大类:实线箭头表示很有可能的(probable)信息流动,而虚线箭头表示有可能发生的(possible)信息流动,从蛋白质流向蛋白质或DNA 或RNA的三条途径被认为是不可能的(im possible),因而应该取消 。 图1 1958年克里克最初提出的 分子生物学中心法则 图2 克里克对中心法则进行的分析
“生物化学与分子生物学” 题库 第二军医大学基础医学部 生物化学与分子生物学教研室编制 2004年7月
第一篇生物大分子的结构与功能 第一章蛋白质的结构与功能 一、单项选择题（A型题） 1.蛋白质的一级结构是指下面的哪一种情况？( ) A、氨基酸种类的数量 B、分子中的各种化学键 C、氨基酸残基的排列顺序 D、多肽链的形态和大小 E、氨基酸的连接方式 2.关于蛋白质分子三级结构的描述，其中错误的是:( ) A、天然蛋白质分子均有这种结构 B、具有三级结构的多肽链都有生物学活性 C、三级结构的稳定性主要是次级键维系 D、亲水基团多聚集在三级结构的表面 E、骨架链原子的空间排布 3、学习“蛋白质结构与功能”的理论后，我们认识到错误概念是（）。 A、蛋白质变性是肽键断裂所致 B、蛋白质的一级结构决定其空间结构 C、肽键的键长较单键短，但较双键长 D、四级结构蛋白质必定由二条或二条以上多肽链组成 E、蛋白质活性不仅取决于其一级结构，还依赖于高级结构的正确 4、通过“蛋白质、核酸的结构与功能”的学习，认为错误的概念是（）。 A、氢键是维系多肽链β-折叠的主要化学键 B、DNA分子的二级结构是双螺旋，维系其稳定的重要因素是碱基堆积力 C、蛋白质变性后可以恢复，但DNA变性后则不能恢复 D、谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三者组成GSH E、蛋白质亚基具有三级结构，而tRNA三级结构呈倒L形 5、“蛋白质分子结构与功能”一章学习，告之我们以下概念不对的是（）。 A、氢键不仅是维系β-折叠的作用力，也是稳定β-转角结构的化学键 B、活性蛋白质均具有四级结构 C、α-螺旋的每一圈包含3.6个氨基酸残基 D、亚基独立存在时，不呈现生物学活性的 E、肽键是不可以自由旋转的 6、关于蛋白质分子中α-螺旋的下列描述，哪一项是错误的？（） A、蛋白质的一种二级结构 B、呈右手螺旋
第六章 分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术
基因功能的研究思路主要包括: 1. 基因的亚细胞定位和时空表达谱; 2. 基因在转录水平的调控； 3. 细胞生化水平的功能研究：对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位； 4. gain-of-function & loss-of-function: 分别在细胞和个体水平，做该基因的超表达和敲除，从表型分析该基因的功能。 功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究，综合分析。
本章内容 ?基因表达研究技术 ?基因敲除技术 ?蛋白质及RNA相互作用技术?基因芯片及数据分析 ?利用酵母鉴定靶基因功能?其他分子生物学技术
6.1 基因表达研究技术 6.1.1 基因表达系列分析技术6.1.2 RNA的选择性剪接技术6.1.3 原位杂交技术 6.1.4 基因定点突变技术
6.1.1 基因表达系列分析技术 基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression，SAGE）是1995年由Velculescu 等建立的技术，在整体水平上对细胞或者组织中的大量转录本同时进行定量分析，而无论其是否为已知基因。 9概念： 以DNA测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术，能直接读出任何一种细胞类型或组织的基因表达信息。
9原理： 根据理论上任何长度超过9～10(49=262144)个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特异序列（转录本），因此，选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性9～10个碱基的核苷酸序列并制成标签，将这些序列标签连接、克隆和测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。
分子生物学的应用及发展 摘要：本文在文献检索的基础上，对分子生物学的发展简史，基本原理，研究领域等作了简单介绍，阐述了分子生物学在人们日常生活中的应用并结合药学专业着重讨论了其在药学及中药开发发面的应用，并进一步对分子生物学未来的研究技术、方向和前景做了展望。 一前言 生物以能够复制自己而区别于非生物。生命现象最基本的特征是进行“自我更新”。进行“自我更新”体现了一种最高级和最复杂的运动状态。这种运动就是生物机体从环境中摄取物质和能量，以更新本身的物质组成，而山现生长、繁殖，在这样的过程中保证了将自身的特征传给历代；同时也不断地向环境输送一些物质和释放能量。在生物机体的组成物质中，防水分外，有各种无机盐类和各种有机化合物。其中生物大分子——核酸和蛋白质在进行自我更新运动中，以其功能的重要性占第一位。为探索生命现象的本质问题，产生了分子生物学这一学科[1]。 分子生物学(molecular biology)是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域[2]。 分子生物学的最终目标是远大的，从产生基本细胞行为类型的各种分子的角度，来理解这五类行为类型：生长、分裂、分化、运动和相互作用。即分子生物学力图完整地描述细胞大分子的结构、功能和相互联系，从而理解细胞为什么要采取这种方式[3]。 分子生物学作为一门新兴的边缘学科。它的迅速发展及其在整个生命科学领域的广泛渗透和应用，促使人们对生物学等生命科学的认识从细胞水平进入分子水平。在农业、畜牧、林业、微生物学等领域发展十分迅速，如转基因动植物等。在医学领域，为医学诊断、治疗及新的疫苗、新药物研制等开辟了新的途径，使医学科学中原有的学科发生分化组合，医学分子生物学等新的学科分支不断产生，使医学科学发生了深刻的变革，不认识到这一点就很难跟上科学发展的步伐。 分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。 二分子生物学发展简史 分子生物学的发展大致可分为三个阶段[4-7]：
第0章绪论 一、名词解释 1.分子生物学 2.单克隆抗体 二、填空 1．分子生物学的研究内容主要包含（）、（）、（）三部分。 三、是非题 1、20世纪60年代，Nirenberg建立了大肠杆菌无细胞蛋白合成体系。研究结果发现poly(U)指导了多聚苯丙氨酸的合成，poly(G)指导甘氨酸的合成。（×） 四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么？ 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？ 3. 分子生物学研究内容有哪些方面？ 4. 分子生物学发展前景如何？ 5. 人类基因组计划完成的社会意义和科学意义是什么？ 6．简述分子生物学发展史中的三大理论发现和三大技术发明。 7. 简述分子生物学的发展历程。 8. 二十一世纪生物学的新热点及领域是什么？ 9. 21世纪是生命科学的世纪。20世纪后叶分子生物学的突破性成就，使生命科学在自然科学中的位置起了革命性的变化。试阐述分子生物学研究领域的三大基本原则，三大支撑学科和研究的三大主要领域？ 答案： 一、名词解释 1.分子生物学：分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类；分子生物学以遗传学、生物化学、细胞生物学等学科为基础，从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究。
2.单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。 二、填空 1.结构分子生物学，基因表达与调控，DNA重组技术 三、是非题 四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么？ 答案： 有人把它定义得很广：从分子的形式来研究生物现象的学科。但是这个定义使分子生物学难以和生物化学区分开来。另一个定义要严格一些，因此更加有用：从分子水平来研究基因结构和功能。从分子角度来解释基因的结构和活性是本书的主要内容。 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？ 分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。狭义：偏重于核酸的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程，其中也涉及与这些过程有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。 3. 分子生物学主要包含以下三部分研究内容：A.核酸的分子生物学，核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（moleculargenetics）是其主要组成部分。由于50年代以来
简答题 6．为什么利用RNAi抑制一个基因的表达较利用反义RNA技术更为彻底。 答：RNAi是外源或内源性的双链RNA 进入细胞后引起与其同源的mRNA特异性降解.dsRNA进入细胞后，在Dicer作用下，分解为21－22bp的SiRNA.SiRNA结合相关 酶，形成RNA介导的沉默复合物RISC.RISC在ATP作用下，将双链SiRNA变成单链 SiRNA,进而成为有活性的RISC,又称为slicer.slicer与靶mRNA结合，导致其断裂，进 而导致其彻底降解。 反义RNA是与靶mRNA互补的RNA，它通过与靶mRNA特异结合而抑制其翻译表达，反义RNA是与靶mRNA是随机碰撞并通过碱基互补配对，所以，mRNA不一定完全 被抑制。 8．简述真核基因表达的调控机制。 答：（1）DNA和染色质结构对转录的调控： ①DNA甲基化，②组蛋白对基因表达的抑制，③染色质结构对基因表达的调控作 用，④基因重排，⑤染色质的丢失，⑥基因扩增； （2）转录起始调控： ①反式作用因子活性调节，包括表达调节、共价调节，配体调节等蛋白质相互作用 调节），②反式作用因子与顺式作用原件结合对转录过程进行调控； （3）转录后调控： ①5’端加帽和3’端多核苷酸化调控，②选择剪接调控，③mRNA运输调控，④mRNA 稳定性调控； （4）翻译起始的调控： ①阻遏蛋白的调控，②对翻译因子的调控，③对AUG的调控，④mRNA 5’端非编 码区的调控，⑤小分子RNA； （5）翻译后加工调控： ①新生肽链的水解，②肽链中氨基酸的共价修饰，③信号肽调控。 9．简述mRNA加工过程。 答：（1）5′端加帽（由加帽酶催化5′端加入7-甲苷乌苷酸，形成帽子结构m7GpppmNP-）。（2）3′端加入Poly(A)尾（A、组蛋白的成熟mRNA无需加polyA尾；B、加尾信号包括AAUAAA和富含GU的序列；C、加尾不需模板；D剪切过程需要多种蛋白质因 子的辅助）。 （3）mRNA前体的剪接（剪接加工以除去内含子序列，并将外显子序列连接成为成熟的有功能的mRNA分子。内含子两端的结构通常是5′-GU……AG-3′。选择性剪接的作 用机制包括；A使用不同的剪接位点，B选择使用外显子，C、反式剪接，D、使用 不同的启动子，E、使用不同的多腺苷酸化位点）。 （4）RNA的编辑（发生于转录后水平，改编mRNA序列，C→U或A→G，增加遗传信息容量）。 10．简述生物的中心法则。 答：中心法则(genetic central dogma)，是指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。
生物化学与分子生物学名词解释
生化名解 1、肽单元（peptide unit）:参与肽键的6个原子Ca1、C、O、N、H、Ca2位于同一平面,Ca1和Ca2在平面上所处的位置为反式构型，此同一平面上的6个原子构成了肽单元，它是蛋白质分子构象的结构单元。Ca是两个肽平面的连接点，两个肽平面可经Ca的单键进行旋转，N—Ca、Ca—C是单键，可自由旋转。 2、结构域（domain）:分子量大的蛋白质三级结构常可分割成1个和数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，具有独立的生物学功能，大多数结构域含有序列上连续的100—200个氨基酸残基，若用限制性蛋白酶水解，含多个结构域的蛋白质常分成数个结构域，但各结构域的构象基本不变。 3、模体（motif)：在许多蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象。一个模序总有其特征性的氨基酸序列，并发挥特殊功能，如锌指结构。 4、蛋白质变性(denaturation)：在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失。主要发生二硫键与非共价键的破坏，不涉及一级结构中氨基酸序列的改变，变性的蛋白质易沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性。 5、蛋白质的等电点( isoelectric point, pI)：当蛋白质溶液处于某一pH时，
而改变酶的活性，此过程称为共价修饰。主要包括：磷酸化—去磷酸化；乙酰化—脱乙酰化；甲基化—去甲基化；腺苷化—脱腺苷化；—SH与—S—S—互变等；磷酸化与脱磷酸是最常见的方式。 10、酶原和酶原激活(zymogen and zymogen activation)：有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，必须在一定的条件下水解开一个或几个特定的肽键，使构象发生改变，表现出酶的活性，此前体物质称为酶 原。由无活性的酶原向有活性酶转化的过程称为酶原激活。酶原的激活，实际是酶的活性中心形成或暴露的过程。 11、同工酶（isoenzyme isozyme）：催化同一化学反应而酶蛋白的分子结构，理化性质，以及免疫学性质都不同的一组酶。它们彼此在氨基酸序列，底物的亲和性等方面都存在着差异。由同一基因或不同基因编码，同工酶存在于同一种属或同一个体的不同组织或同一细胞的不同亚细胞结构中，它使不同的组织、器官和不同的亚细胞结构具有不同的代谢特征。 12、糖酵解(glycolysis)：在机体缺氧条件下，葡萄糖经一系列酶促反应生成丙酮酸进而还原生成乳酸的过程称为糖酵解（糖的无氧氧化）。糖酵解的反应部位在胞浆。主要包括由葡萄糖分解成丙酮酸的糖酵解途径和由丙酮酸转变成乳酸两个阶段，1分子葡萄糖经历4次底物水平磷酸化，净生成2分子ATP。关键酶主要有己糖激酶，6-磷酸果糖激酶-1和丙酮酸激酶。它的意义是机体在缺氧情况下获取能量的有效方式；某些细胞在氧供应正常情况下的重要供能途径。
植物抗低温机理的分子生物学研究进展 摘要：笔者从不同的方面综述了植物低温抗性的分子生物学研究进展，对低温抗性的机理做了阐释，并且给出以后的研究方向和重点。 关键词：低温抗性细胞膜透性不饱和脂肪酸丙二醛保护酶系统 脱落酸钙调素低温诱导蛋白 温度在植物营养生长、生殖生长的过程中都具有重要的作用。对于温度的调控是改善植物生长环境，调节植物生长状态的一项重要措施。在自然环境下，植物对于低温的抗性，体现了植物在温度方面的适应性，体现植物物种、品种的生态位的广度。也影响着植物产品的质量和产量。植物的低温胁迫根据温度的不同范围分为两种类型：冷害，是指零上低温对于植物生理机制的影响所造成的伤害；冻害，是指零下低温对于植物生理机制的影响所造成的伤害。目前，对于植物影响较大的是冷害。【1~4】冷害的影响程度不仅取决于温度低的程度，也取决于植物受低温影响的时间的长度。温度越低，时间越长则冷害对于植物的影响越大。由于温度这一自然因素存在于植物体的整个生命周期中，因此，对于温度的调控，抗低温机制的研究就显得至关重要。以往的研究中，有对于低温敏感植物和低温驯化植物的对比研究，说明了对植物的低温驯化可以在一定程度上提高植物的抗低温能力。也有从水分的平衡，蛋白质，碳水化合物，氨基酸，核酸水平上的研究；还有从细胞壁的特性，细胞膜的结构的研究以及生长调节物质的影响。前面的这些的研究，都说明了植物对于低温的反应和这些条件对于植物抗低温机制的一些影响。然而所有这些因素都不是某一种因素的单独作用，而是多种因素共同作用，相互影响的结果，不同因素之间存在着互作、制约等的作用。上面的这些研究也只是停留在膜保护系统、冷调节蛋白的生理调节的水平。随着生物分子工程、基因工程方面的研究水平的不断提高，给植物抗低温的研究有提出了一个新的方向。特别是低温信号转导的研究，分子标记的应用，将进一步揭示低温适应性的调控机理。 1、通过影响植物细胞膜透性影响植物低温抗性 20世纪70年代，Lyons等提出细胞膜是低温冷害的首要部位，在低温条件下，植物细胞膜由液晶态转变为凝胶态，膜收缩，导致细胞膜透 性改变，膜酶和膜功能系统代谢改变，功能紊乱。【5】 膜脂中不饱和脂肪酸的含量，和植物的低温抗性呈正相关。膜脂的不饱和脂肪酸含量越高，膜脂的相变温度越低，膜脂的结构对于低温的 忍耐性越强。低温敏感植物和低温抗性植物相比，膜脂中的不饱和脂肪 酸含量低，在抗低温驯化过程中，膜脂中的不饱和脂肪酸的含量增加， 低温抗性增强。 在生物技术方面，近年来对于膜脂结构对植物低温抗性影响研究有了新的进展。Los等发现蓝细菌的desA基因与低温抗性有关。研究发现，
生物化学与分子生物学知识总结 第一章蛋白质的结构与功能 1.组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和 S。 2.蛋白质元素组成的特点各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。 100克样品中蛋白质的含量 (g %)= 每克样品含氮克数× 6.25×100 3.组成人体蛋白质的20种氨基酸均属于L- -氨基酸氨基酸 4.可根据侧链结构和理化性质进行分类 非极性脂肪族氨基酸极性中性氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸 5.脯氨酸属于亚氨基酸 6.等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。 色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。 氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物 7.蛋白质的分子结构包括: 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure) 1）一级结构定义:蛋白质的一级结构指在蛋白质分子从N-端至C-端的氨基酸排列顺序。主要的化学键:肽键，有些蛋白质还包括二硫键。 2）二级结构定义：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及
氨基酸残基侧链的构象主要的化学键：氢键 ?蛋白质二级结构 包括α-螺旋 (α -helix) β-折叠 (β-pleated sheet) β-转角 (β-turn) 无规卷曲 (random coil) 3）三级结构定义：整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。主要的化学键: 8. 模体(motif)是具有特殊功能的超二级结构，是由二个或 三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象。 9.分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。 蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。 ?蛋白质胶体稳定的因素: 颗粒表面电荷、水化膜 10.蛋白质的变性： 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。 变性的本质：破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。 ?造成变性的因素: 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。 由于空间结构改变，分子内部疏水基团暴露，亲水基团被掩盖，故水溶性降低。由于变性蛋白质分子不对称性增加，故粘度增加。由于变性蛋白质肽键暴露，易被蛋白酶水解。
生物化学与分子生物学试题库 0101A01 在核酸中一般不含有的元素是（） A、碳 B、氢 C、氧 D、硫 0101A02 通常既不见于DNA又不见于RNA的碱基是（） A、腺嘌呤 B、黄嘌呤 C、鸟嘌呤 D、胸腺嘧啶 0101A03 下列哪种碱基只存在于mRNA而不存在于DNA中（） A、腺嘌呤 B、尿嘧啶 C、鸟嘌呤 D、胞嘧啶 0101A04 DNA与RNA完全水解后，其产物的特点是（） A、戊糖不同、碱基部分不同 B、戊糖不同、碱基完全相同 C、戊糖相同、碱基完全相同 D、戊糖相同、碱基部分不同 0101A05 在核酸分子中核苷酸之间的连接方式是（） A、3′，3′，-磷酸二酯键 B、糖苷键 C、3′，5′，磷酸二酯键 D、肽键 0101A06 核酸的紫外吸收是由哪一结构所产生的（） A、嘌呤和嘧啶之间的氢键 B、碱基和戊糖之间的糖苷键 C、戊糖和磷酸之间的酯键 D、嘌呤和嘧啶环上的共轭双键 0101A07 含有稀有碱基比例较多的核酸是（） A、mRNA B、DNA C、tRNA D、rRNA 0101A08 核酸分子中储存、传递遗传信息的关键部分是（） A、核苷 B、戊糖 C、磷酸 D、碱基序列 0101A09 按照结构特征划分，下列不属于丝氨酸蛋白酶类的是：（） A、胃蛋白酶 B、胰蛋白酶 C、胰凝乳蛋白酶 D、弹性蛋白酶 0101A10 关于氨基酸的脱氨基作用，下列说法不正确的是：（） A、催化氧化脱氨基作用的酶有脱氢酶和氧化酶两类； B、转氨酶的辅助因子是维生素B2； C、联合脱氨基作用是最主要的脱氨基作用； D、氨基酸氧化酶在脱氨基作用中不起主要作用。 0101B01 鸟类为了飞行的需要，通过下列哪种排泄物释放体内多余的氨（） A、尿素 B、尿囊素 C、尿酸 D、尿囊酸 0101B02 胸腺嘧啶除了在DNA出现，还经常在下列哪种RNA中出现（） A、mRNA B、tRNA C、5SrRNA D、18SrRNA 0101B03 下列哪一个代谢途径是细菌和人共有的（） A、嘌呤核苷酸的合成 B、氮的固定 C、乙醇发酵 D、细胞壁粘肽的合成0101B04 脱氧核糖核酸（DNA）分子中碱基配对主要依赖于（） A、二硫键 B、氢键 C、共价键 D、盐键 0101B05 人细胞DNA含2.9×109碱基对，其双螺旋的总长度约为（） A、990mm B、580mm C、290mm D、9900mm 0101B06 核酸从头合成中，嘌呤环的第1位氮来自（） A、天冬氨酸 B、氨甲酰磷酸 C、甘氨酸 D、谷氨酰胺 0101B07 m2G是（） A、含有2个甲基的鸟嘌呤碱基 B、杂环的2位上带甲基的鸟苷 C、核糖2位上带甲基的鸟苷酸 D、鸟嘌呤核苷磷酸二甲酯 0101B08 核苷酸从头合成中，嘧啶环的1位氮原子来自（）
分子生物学的产生与发展 分子生物学是指从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。不同于传统的生物物理学和生物化学，研究某一特定生物体或某一种生物体内的某一特定器官的小分子物质在生物体内的物理、化学变化，分子生物学着重在大分子研究水平上，主要是蛋白质、核酸、直至体系以及部分多糖及其复合体系，阐明整个生物界所共同具有的基本特征。1953年沃森、克里克提出DNA分子的双螺旋结构模型是分子生物学诞生的标志。而在DNA分子的双螺旋结构模型发现以前，对蛋白质、核酸的发现和认识为后来分子生物学的发展奠定基础，整个分子生物学发展的准备阶段可以追溯到19世纪中期。 一、蛋白质的发现和认识 19时期前半世纪，法国化学家盖·吕萨克发现酵母可以将糖转化为酒精。1833年，帕耶恩和珀索兹从麦芽提取液中得到一种对热不稳定的物质，它可以使淀粉水解为可溶性糖，这种物质是历史上发现的第一个酶——淀粉糖化酶。1835年伯齐利厄斯提出了催化作用概念，生化现象中起催化作用的物质被称为酵素或者生物催化剂。1878年费德里克·威廉·库恩指出，发酵现象中不是酵母本身，而是酵母中的某种物质催化了酵解反映，被给这种物质取名为酶。1897年爱德华?毕希纳发现一种离体酵母提取物可以使酒精发酵，即酵母细胞产生一种酶，这种酶引起发酵，他们证明离体酵母提取物可以象活体酵母细胞一样将葡萄糖转变为酒精和二氧化碳。也就是说，这一转变并不依赖于酵母细胞，而是依赖于无生命的酶。由此奠定了现代生物化学的基石。德国化学家费歇尔，生物化学的创始人，1899年开始对氨基酸、多肽及蛋白质的研究，发展和改进了许多分析方法，认识了19种氨基酸，并认为蛋白质都是由20种氨基酸以不同数量比例和不同排列方式结合而成的。 经过一个半世纪的摸索，人们从酵母中率先认识到能对生物产生催化作用的酶，进而继续研究开始对蛋白质的认识。直到19世纪末期，费谢尔发现蛋白质是由20种氨基酸按不同比例组合而成的。根据不同的排列组合，形成我们机体形形色色的蛋白质物质，成为构成细胞的基本有机物，它们生命活动的主要承担者，至此，对蛋白质的认识开启了人们进一步研究生命的大门，同时也奠定了生物化学的基础。 二、核酸的发现和认识 1869年瑞士生物化学家约翰?米歇尔在蒂宾根研究脓细胞的时候获得了十分重要的发现。当时人们认为脓细胞主要是由蛋白质构成，然而米歇尔注意到某种不属于迄今已知的任何蛋白质物质的存在。事实上，他证明了这种物质完全不是蛋白质并且不受消化蛋白酶——胃蛋白酶的影响。他同时还证明这种新物质仅仅来自细胞核，因此取名为“核素”，1889年，阿尔特曼命名了“核酸”一词。德国生物化学家科塞尔，细胞化学的奠基人，他在著作《细胞核的化学成分》中提到：核物质也是这种组成，化学分析表明，首先在许多情况下核物质分解成两部分，其中之一有蛋白质特性。这部分除正常的蛋白质外，不具有其他原子团。然而，另一部分有特殊的结构，已给它命名为核酸。他又进一步提出，核酸包含4种含氮基团：胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤。1910年因其对蛋白质和核酸的研究荣获诺贝尔生理学与医学奖。至此，核酸进入到研究领域，在接下来的时间里，人们开始对核酸及其性质进行研究。 1909年，俄裔美国生物化学家莱文和雅各布斯通过鉴定存在于酵母核酸中的碳水化合
1、Each allele has a different phenotype ,why(illustrate by example). 位于染色体同一位置的分别控制两种不同性状的基因是等位基因，等位基因之间具有多种关系。比如，果蝇中white位点的存在对红眼的形成是必要的。这个位点是根据无义突变命名的，该突变使果蝇在突变杂合子中具有白色的眼睛。表述野生型和突变型基因时，通常在野生型基因后面加上＋。 当等位基因存在时，一个动物可能是携带两种突变基因的杂合子。这种杂合子的表型依赖于每一个突变所遗留下的活性。从本质上讲，两个突变基因间的关系与野生型和突变型间没有区别，一个突变可能都是显性的，也可能部分是显性的。在任何一个遗传位点上并非一定要有一个野生型基因。人类学行系统的比较就提供了一个例子：缺失功能有空白型表示，即O型；但是功能性的A型和B 型是共显性的，并且对O型表现出显性。 2、Conservation of exons and its application. 外显子的保守性可以做为鉴定编码区的基础，即通过确认那些在许多生物体中都存在的序列片段。对于含有这样基因的区域，即在许多生物中这些基因的功能长期被保留下来，这个序列所代表的蛋白质应当有两个特性：它必须有一个开放的阅读框（ORF）；在其它生物中很可能存在与它相关的序列。 物种杂交可作为鉴定基因的第一条标准，将来自一定区域的短片段作为探针，通过Southern杂交检测来自不同物种的相关DNA，如果我们发现几个物种中的杂交片段与某一探针相关（探针通常来源于人的DNA），则这个探针就可成为一条基因外显子的候补片段。将这些候补片段进行测序，如果它们有阅读框，则它们就可被用来分离周围的基因组区域；如果它们是一个外显子的一部分，则可以用它来鉴定整条基因，分离相应的cDNA和mRNA,从而最终分离出蛋白质。3、Chromosome walking and its application. 从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠的顺序和染色体的其它顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻片段，等于在染色体上移了一步，称为染色体步移。 染色体步移技术是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效