毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
工业发酵进展
微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的
毕赤酵母表达系统研究进展 作者：齐连权， 陈薇， 来大志， 于长明， 王海涛 作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名： 中国生物工程杂志 英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次 参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)
发酵工业中常用常见的酵母菌 （一）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 这是发酵工业上最常用的菌种之一（图2-84）。按细胞长与宽的比例可将其分为三组。 1）细胞多为圆形或卵形，长与宽之比为1～2。这类酵母除了用于酿造饮料酒和制作面包外，还用于乙醇发酵。其中德国2号和12号（RasseII和RasseXII）最有名，但因其不能耐高浓度盐类，故只适用于以糖化的淀粉质为原料生产乙醇和白酒。 2）细胞形状以卵形和长卵形为主，也有些圆形或短卵形细胞，长与宽之比通常为2。常形成假菌丝，但不发达也不典型。这类酵母主要用于酿造葡萄酒和果酒，也可用于酿造啤酒、蒸馏酒和酵母生产。葡萄酒酿造业称此为葡萄酒酵母（Sac．ellisoideus）。 3）大部分细胞长宽之比大于2，它以俗名为台湾396号酵母为代表。我国南方常将其用于糖蜜原料生产乙醇。其特点为耐高渗压，可忍受高浓度盐类。该酵母原称魏氏酵母（Sac．willanus）。 在啤酒酿造中最早采用的酵母是卡尔斯伯啤酒厂的E．C．Hansen（1842～1909年）在1883年分离的卡尔斯伯酵母（Saccharomyces carlsbergensis），这是一种底面发酵酵母。酿酒酵母也可用于啤酒酿造，但属上面发酵酵母，这两种酵母发酵的过程和啤酒风味都有所不同。 目前在分类上皆采用酿酒酵母的学名。 底面发酵酵母其细胞为圆形或卵圆形，直径为5～10μm。它与酿酒酵母在外形上的区别是，卡氏酵母部分细胞的细胞壁有一平端。另外，温度对这两类酵母的影响也不同。在高温时，酿酒酵母比卡氏酵母生长得更快，但在低温时卡氏酵母生长较快。酿酒酵母繁殖速度最高时的温度为33℃，而卡氏酵母需在36℃。但在8℃时卡氏酵母较酿酒酵母繁殖速度几乎快一倍。
毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主
发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统 至于装液量的问题，应该从以下几个方面考虑： 1、保持在你所需要的转速培养情况下（尤其是在后期，菌丝很多时，转速很高时），不能让发酵液把你的塞子湿掉，容易造成染菌。 2、装液量的体积在消毒过程中，不能因为沸腾把塞子湿掉，或者跑出三角瓶，装液量太多会出现这样的情况。很容易染菌。 3、根据你的菌种的情况和发酵液的粘度，需要的混匀程度等等方面也要考虑。 4、建议你做一个梯度试验（40－50－60－70－80等）就可以找到你所需要的装液量。 关于剩余空气的排除在灭菌完毕后（100度左右），立刻用盖子或者其他的用品把你的培养摇瓶盖好，有时候这么点空气根本对兼性厌氧发酵没有什么影响，如果你的菌种要求很严的话，最好用干冰加入已经灭菌的空摇瓶后，立刻用其他的样品培养基分装即可。当然也可以用氮气。最好是二氧化碳。 你可以再查查看是否有其他的方法，我说的也不完全。！！
产蛋白酶K毕赤酵母重组菌株高密度发酵 及酶学性质分析 姓名：李善军 学号：2015304120225 院系：华中农业大学生科院
摘要蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性, 在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。毕赤酵母是近十几年来发展起来的真核表达体系，将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。本实验利用产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌进行高密度的液体发酵，掌握毕赤酵母菌全自动液体发酵工艺，同时对的到产物酶酶学性质进行分析。经实验结果得知，毕赤酵母基因工程菌发酵最高密度达到湿重283.97g/L，得到的蛋白酶K最大酶活为29000U，蛋白酶K的分子质量为31ku,最适温度为65度，最适PH为8，Na+、K+、Ca+和Mg+对蛋白酶K酶活有促进作用，而Ni+和Zn+对酶活反应则是抑制作用。 关键词：蛋白酶K、毕赤酵母菌、高密度发酵、酶学分析
本实验的蛋白酶 K 属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球产生的一类主要蛋白酶。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶 K。蛋白酶 K 具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸 C 末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。利用其这个特性，在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K 都有着重要的应用。由于林伯氏白色念球菌生长缓慢难以达到高密度培养的目标，而且菌体在产生蛋白酶 K 的同时还会分泌表达其他蛋白酶，加之对林伯氏白色念球菌的基因操作比大肠杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等常用基因工程菌困难许多，这些都给蛋白酶K的高效大规模生产带来困难。 毕赤酵母是近十年来发展起来的真核表达体系,它的生长环境除了包括十分环保而廉价的无机盐，微量元素和必须的碳氮源外，还要添加生物素，甲醇能够作为它的唯一碳源保证其生长。将蛋白酶 K在毕赤酵母中重组表达将是突破其高效表达的一个重要步骤。本实验对产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵工艺进行探讨，并对产物酶蛋白酶K的酶学性质进行分析，使对产蛋白酶K 的毕赤酵母基因工程菌及其产物有一个较为深刻的理解。 1、产蛋白酶K的毕赤酵母基因工程菌高密度液体发酵 1.1种子液培养 1.1.1种子培养基 YPD培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%（琼脂1.5%） YPG培养基：酵母粉1%、蛋白胨2%、甘油2% 1.1.2培养温度与菌龄 挑取YPD平板上的单菌落（生科院发酵实验室）到8瓶100/500 mLYPG 培养基中，30℃，250 r/min 摇床培养28h。 1.2发酵罐培养 1.2.1菌体培养 清洗干净发酵罐，校正pH、DO电极后插入发酵罐，加入20LBSM（配方见下
温度对酿酒酵母的影响 酿酒是一个复杂的生化反应过程。影响微生物生长发育的环境因素很多,常见的有温度、pH、氧气、搅拌等环境因素。其中温度具有极其重要的作用。本实验探讨温度对酵母酿酒产酒量的影响,检验不同温度下酿酒酵母的出酒率。结果表明:酵母菌在28℃出酒率最高。低温下发酵品质好。 酿酒过程实质上是一个微生物摄取原料中的养分,通过体内的特定酶系,经过复杂的生化反应,把原料转化为酒精的过程。工业上主要是由薯类和谷类以及野生植物原料经过蒸煮,淀粉糊化成为溶解状态,再加入一定量的糖化剂,使溶解状态的淀粉,变为酵母能够发酵的糖类(糖化醪)。这一个由淀粉转变为糖的过程,称为糖化过程。糖化过程是由淀粉酶或酸水解的作用,使淀粉糖化转变为可发酵性糖。最后由酿酒酵母发酵产生酒精。生产上常用的糖化剂有麦芽和酒曲两种。我国普遍使用酒曲作为糖化剂。酒精是由微生物通过糖酵解(EMP)途径将葡萄糖分解而产生,是酵母菌的代谢产物。影响微生物生长的因素很多,其中环境因素对微生物的生长影响比较大。在生产上最常遇到的是温度、水分、氧气、pH、某些重金属离子、乙醇及发酵副产物等的影响。温度是影响微生物生长和存活的主要环境因素之一。对发酵的影响很大。温度对微生物生长发酵的影响具体表现在:①影响酶的活性。每种酶都有最适宜的酶促反应温度,温度的变化影响着酶促反应率,最终影响细胞物质合成。②影响细胞质膜的流动性。温度高细胞质流动性大,有利于物质的运输;温度低细胞质的流动性降低,不利于物质的运输。因此温度影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的分泌和运输。③影响物质的溶解度。物质只有溶于水才能被微生物吸收或分泌,除了气体外,物质随着温度的升高而溶解度增加,温度的降低,物质的溶解度也降低,最终影响微生物的生长。酿酒酵母是一种嗜温性微生物,它的最低温度是1—3℃,最高温度是54℃(几乎致死)。本实验目的在于探讨温度对酵母酿酒产酒量的影响,检验不同温度下酿酒酵母的出酒率。 可以看出,温度不仅影响着酒的颜色,还影响着酵母菌的酶促反应,最终影响代谢产物的类型及产量。温度高,颜色深;温度低,颜色浅。温度过高或过低,糖发酵不完全,糖度高,酒精相对含量少;温度在26℃～30℃之间,特别是在28℃,糖度低,酒精相对含量高。原因是温度对酶的结构和组成有较大的影响,它关系到代谢途径和代谢产物的生物合成。因此,根据不同的需要及发酵微生物的不同,可以通过调节温度来得出所需要代谢产物或提高产量。 有研究表明低温发酵最好。因为发酵过程比较缓慢,代谢产物反应完全、彻底。营养成分也发酵完全、彻底,脂化时间充分,营养价值高,有利于口感和品质的改善。这与本实验结果相一致,低温酿出来的酒, 清澈透明,香味浓溢,口感好。若要求酒质和口感更佳,发酵时间要延长到20～30天,因此低温发酵周期长。工业上常要求在高温下发酵,在高温下发酵具有反应迅速、发酵快、经济利益高等优点。但也影响了酒的口感和品质。寻求发酵周期短、经济利益高且酒的口感和品质好的最适条件,还有待进一步研究。
毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册 2010-07-15 10:54:56| 分类：毕赤酵母| 标签：|字号大中小订阅 一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制二．毕赤酵母表达的培养基配制 三．主要试验环节的操作 3.1 酵母菌株的分离纯化 3.2 pP ICZαA原核宿主菌TOP10F’的活化培养 3.3毕赤酵母表达的试验方法 3.4 毕赤酵母电转化方法 3.5 P ichia酵母表达直接P CR鉴定重组子的方法 3.6 毕赤酵母基因组提取方法 3.7 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验 关键词：酵母实验毕赤酵母表达 pichia pastoris expression 毕赤酵母酵母菌株 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：P ichia、Candida等．以P ichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］； ⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。 ⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。 ⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。 ⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。 P ichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、E GF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］。目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥
酵母发酵的影响因素 在面包的实际生产中，酵母的发酵受到以下因素的影响： 1 温度 在一定的温度范围内，随着温度的增加，酵母的发酵速度也增加，产气量也增加，但最高不要超过38℃~39℃。一般正常的温度应控制在26℃~28℃之内，如果使用快速生产法则不要超过30℃，因为超过该温度，将发酵过速，面团未充分成熟，保气能力则不佳，影响最终产品品质。 2 pH值 PH值：面团的PH值最适于4~6之间。 3 糖 糖的影响：可以被酵母直接采用的糖是葡萄糖，果糖。蔗糖则需要经过酵母中的转化酶的作用，分解为葡萄糖和果糖后，再为发酵提供能源。还有麦芽糖，是由面粉中的淀粉酶分解面粉内的破碎淀粉而得到的，经酵母中的麦芽糖酶转化变成2分子葡萄糖后也可以被利用。 4 渗透压 渗透压：渗透压是指为阻止渗透作用所需要加给溶液的额外压力，外界介质渗透压的高低，对酵母的活力有较大的影响。是因为酵母细胞的外层的细胞膜是个半透膜，即具有渗透作用，故外界介质的浓度会直接影响酵母的活力，高浓度的糖，盐，无机盐及其他可溶性的固体物质都会造成较高的渗透压力，抑制酵母的发酵。其原因是当外界介质浓度高时，酵母体内的原生物渗出细胞膜，原质浆分离，酵母因此被破坏，而无法生存。在这方面，干酵母比鲜酵母更有较强的适应能力。当然也有一些酵母在高浓度下仍可生存，并发酵。 在面包生产中，影响渗透压大小的主要是糖，盐这两种原料。当配方中的糖量为0%~5%时，对酵母的发酵不起抑制作用，反而可促进酵母发酵作用。当超过6%时，便会抑制发酵作用，如果超过10%时，发酵速度会明显减慢，在葡萄糖，果糖，蔗糖和麦芽糖中，麦芽糖的抑制作用比前三种糖小，这是因为麦芽糖的渗透压比其他糖要低。 盐的渗透压更高，对酵母发酵的抑制作用更大，当盐的用量达到2%时，发酵即受影响。
发酵工艺优化---现代发酵工业调控策略 发布日期：2010-04-10 来源：[标签:来源] 作者：[标签:作者] 浏览次数：716 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH 值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率。在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。基于此，华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化的有关现象，研究细胞代谢物质流与生物
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展 夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏2 1.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039； 2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071； 3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000 ［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78 ［文献标识码］A ［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04 Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer?mentation XIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2* 1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039; 2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850; 3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China *Corresponding author,E-mail:liuzhm@https://www.doczj.com/doc/bc7741804.html, ［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently. High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ?est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ?um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questions existing in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentation course 综述 doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.026 20世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类 疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。近20年来，毕赤酵母 大规模培养已成为生物制药领域非常重要的关键技术之一，并不断推动生物技术产业的迅速发展。毕赤酵母表达系统在表达外源蛋白方面具有非常明显的优势，这是因为毕赤酵母本身为单细胞真核生物，易于分子遗传学操作，且外源基因可以整合到酵母的染色体上，随染色体一起复制和遗传，不易造成外源基因的丢失现象；具有强诱导性和强启动性的醇氧化酶基因启动子，适用于外源基因的高水平诱导表达；并且毕赤酵母在高水平表达外源蛋白的同时，自身背景蛋白分泌却很少，不需要破菌等复杂操作，有利于后续纯化；毕赤酵母发酵产物的积累不会对自身宿主菌产生大的毒副作用，这更有利于大规模 的高密度发酵。目前，越来越多的国内外研究者选择毕赤酵母作为外源蛋白的优先表达系统，表达产物包括干扰素、白介素2、抗体等[1-3]，且已有产品上市。尽管毕赤酵母有自身的优点，但对于不同的具体目标产品，表达水平参差不齐。如胞内分泌表达的巴西三叶胶腈水解酶的产量高达22g/L [4]，破伤风片段C 产量高达12g/L [5]，胞外分泌表达的明胶的产量达到14.8g/L [6]等，而最低的报道只有1mg/L ，其间相差可达10000倍。因此，要提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵（high-density fermentation ）也成为一个关键技术环节。 1 毕赤酵母工程菌的选择和改良 1.1 工程菌的选择 目前毕赤酵母工程菌株常常呈现2种表型，分别为mut +和mut s ，aox1基因缺失的酵母在甲醇限制 性培养基上生长缓慢（methanol utilization slow ， mut s 或mut -），它们只能利用弱的aox2基因启动合成 收稿日期：2012-08-20基金项目：国家高技术研究发展计划（2009AA02Z108）作者简介：夏姗（1990-），女，硕士研究生通信作者：刘志敏，（E-mail ）liuzhm@https://www.doczj.com/doc/bc7741804.html,