西北植物学报2004,24(10):1912—1916
A cta
B ot.B orea l.-O cciden t.S in.
文章编号:100024025(2004)1021912205
培养基及培养条件对杜仲愈伤组织生长
及次生代谢产物含量的影响Ξ
李 琰3,王冬梅,姜在民,唐 锐
(西北农林科技大学,陕西杨陵 712100)
摘 要:以M S、L S、B5、N6、H、N itsch、W h ite、1 2M S为基本培养基,分别添加0.5m g L NAA和0.5m g L BA,分析不同类型培养基对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响,并以B5培养基进行光照条件、碳源、蔗糖浓度试验。结果表明:B5培养基不仅有利于愈伤组织生长,也有利于总黄酮的形成,而1 2M S培养基有利于绿原酸的积累;12h d光照对愈伤组织的生长及绿原酸和总黄酮的合成有明显的促进作用,黑暗不影响愈伤组织的生长,但却抑制绿原酸和总黄酮的形成;3种碳源中,愈伤组织的增长量、绿原酸和总黄酮的含量均以蔗糖为碳源时最高,葡萄糖最低;蔗糖浓度在10～50g L范围内绿原酸的含量随着糖浓度的升高而升高,40g L时愈伤组织的增长量和总黄酮的含量最高。
关键词:杜仲;组织培养;次生代谢产物
中图分类号:Q946.8;S722.37 文献标识码:A
Effects of ba sic m ed i a and culture cond ition s on growth of ca lluses and production of secondary m etabol ites of E uco mm ia u l m oides
L I Yan,W AN G Dong2m ei,J I AN G Zai2m in,TAN G R u i
(N o rthw est Sci2T ech U niversity of A griculture and Fo restry.Yangling,Shaanxi712100,Ch ina)
Abstract:T he M S,L S,B5,N6,H,N itsch,W h ite,1 2M S as basic m edia,supp lem en ted w ith0.5m g L NAA and0.5m g L BA w ere u sed to study their effects on callu s grow th and secondary m etabo lites p ro2 ducti on of E uco m m ia u l m oid es.L igh t,carbon sou rces and sucro se concen trati on w ere studied w ith B5as basic m edia.T he resu lts show ed that B5m edium w as best no t on ly fo r callu s grow th,bu t also fo r the accu2 m u lati on of flavono ids.1 2M S w as su itab le fo r the accum u lati on of ch lo rogen ic acid.12h d illum inati on increased the callu s grow th,ch lo rogen ic acid and flavono ids accum u lati on.D ark did no t influence callu s grow th,bu t no t beneficial fo r the ch lo rogen ic acid and flavono ids accum u lati on.Sucro se as carbon sou rce w as best fo r callu s grow th,ch lo rogen ic acid and flavono ids accum u lati on and gluco se w as least in the th ree carbon sou rces.In the range of10～50g L sucro se concen trati on,the ch lo rogen ic acid con ten ts increased along w ith concen trati on of sucro se.T he callu s increm en t and flavono ids con ten ts w as h ighest w hen the sucro se concen trati on w as40g L.
Key words:E uco m m ia u l m oid es O liv.;tissue cu ltu re;secondary m etabo lites
收稿日期:2003211221;修改稿收到日期:2004203217
基金项目:国家“十五”攻关项目(2001BA502B0403);西北农林科技大学青年科研专项部分内容
作者简介:李 琰(1971-),女(汉族),河南洛阳人,讲师,硕士,从事植物学及药用植物学的教学和研究。
杜仲(E uco m m ia u l m oid es O liv.)是杜仲科单属单种植物,为我国特有树种,是中国特有的第四纪孑遗植物种,已作为稀有植物被列入《中国植物红皮书——稀有濒危植物》第一卷。杜仲既是重要的特种工业原料植物,也是一种名贵的药用植物,其性味甘、微辛、温、无毒,久服能轻身耐老、延年益寿,是传统的、习用的补益类抗衰老中药,具有提高机体抗缺氧耐力、提高机体免疫功能、降低血脂、平衡调节血压等功效[1～3]。杜仲的药用成分主要为木脂素类、环烯醚萜类、黄酮类、松脂素二糖甙、绿原酸等次生代谢产物,其中桃叶珊瑚甙、绿原酸等为降血压的主要成分[4～6]。然而,无论是炮制的成品中,还是天然杜仲叶、皮生药中,这些由植物次生代谢途径生成的有效药用成分的含量都很低,在其它植物内的含量也很低,虽然可通过提取获得产品,但受含量低,原料、季节等条件的限制,提取量很有限。由于利用微生物或化学方法至今不能合成,杜仲的这些药用有效成分药物至今难以满足市场需求,所以用组织培养生产杜仲有用次生代谢物质是解决这一问题的有效途径。国内关于杜仲组织培养的研究起步较晚,在国外,仅见到日本对杜仲组织培养的一些研究,且都主要集中于愈伤组织诱导、植株再生等方面,杜仲组织培养中次生代谢物的研究并不多见[7～11],未见到优化培养基和培养条件方面的研究。本研究通过培养基和培养条件的优化组合,旨在筛选杜仲愈伤组织高增长量和次生代谢产物高含量培养基,为大规模组织培养生产杜仲药用有效成分提供依据。
1 材料和方法
杜仲愈伤组织诱导参照文献[12]的方法,茎段在M S+NAA1.0m g L+BA0.3m g L的培养基上,幼叶在B5+1.0m g L NAA+0.3m g L BA的培养基上诱导愈伤组织,继代培养在附加0.5m g L NAA+0.5m g L BA的B5继代培养基[13]上进行,培养两代的愈伤组织作为供试材料。以M S、L S、B5、N6、H、N itsch、W h ite、1 2M S为基本培养基,分别添加0.5m g L NAA和0.5m g L BA,进行不同培养基对不同来源愈伤组织生长及其次生代谢产物含量的影响试验;在B5+0.5m g L NAA+0.5m g L BA的培养基进行光照条件、碳源、蔗糖浓度对幼茎愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响试验。光照条件中暗光培养时将培养瓶放于不照光培养架上并用黑布覆盖,自然光处理时将培养瓶放于无人工
光源的培养架上;以上每个处理接种20瓶,每瓶接种大小基本相近的愈伤组织3块,鲜重控制在0.30～0.40g之间,培养条件除试验处理条件外,培养基中蔗糖30g L,用琼脂6g L固化,pH值用PH S22C型酸度计在高压灭菌前调至6.3。培养室温度(25±2)℃,光照12h d,光照强度1,000～1,500 lx。培养20d后收获,计算愈伤组织增长量。
计算方法为:愈伤组织增长量=收获量 瓶-接种量 瓶
愈伤组织中次生代谢产物的提取是先将收获的愈伤组织于烘箱中80℃烘至恒重,粉碎后精确称取1g放入烧瓶中,加入16mL60%酒精于80℃水浴中冷凝回流提取2次,每次1h,抽滤,合并滤液定容至50mL备用。绿原酸的测定采用反相高效液相色谱(H PL C)法[14]。色谱条件为:色谱柱N ova2p ak C18柱(4Λm,3.9mm×75mm),流动相:甲酸∶水∶冰乙酸(19∶80∶1);流速:1mL m in;检测波长:324 nm;总黄酮的测定采用硝酸铝2亚硝酸钠比色法[15],取提取液1mL于10mL容量瓶中显色,用U V2 2000紫外可见分光光度计在510nm比色。
2 结果与分析
2.1 8种基本培养基对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
组织培养的培养基一般可以分为含盐量高的、高硝酸钾、中等无机盐和低盐四种类型,不同类型的基本培养基对愈伤组织增长量和次生代谢产物含量的影响有明显差异(表1和表2)。愈伤组织的增长量在高硝酸钾类型的B5和N6培养基上远高于其它类型培养基,且这2种培养基的愈伤组织中次生代谢产物含量差异不明显。总黄酮的含量和产量也均以愈伤组织增长量最高的两种高硝酸钾培养基最高,以愈伤组织增长量最低的W h ite培养基最低。一般认为高硝酸盐对愈伤组织生长有利[16]。8种基本培养中,1 2M S虽然愈伤组织的生长一般,但其绿原酸的含量和总产量最高。起源于叶和茎的不同愈伤组织在不同类型培养基上的增长量、绿原酸含量和总黄酮含量不同,但其变化规律基本一致,叶和茎诱导的愈伤组织增长量、绿原酸含量和总黄酮含量不同,虽然茎的愈伤组织增长量高于叶,除N itsch 外,其它培养基以叶为外植体诱导的愈伤组织中绿原酸和总黄酮的含量及总产量均高于以茎为外植体诱导的愈伤组织。
3191
10期李 琰,等:培养基及培养条件对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响
表1 不同培养基对茎愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
T ab le1 Effects of differen t m edia on shoo t callu s grow th and secondary m etabo lites con ten t
培养基种类
Basic
m edia
增长量Increm ent
鲜重
F resh w eigh t
g flask(g)
干重
D ry w eigh t
g flask(g)
绿原酸含量
Ch lo rogenic acid
content(%)
绿原酸产量
Ch lo rogenic acid
yield(m g)
黄酮含量
F lavono ids
content(%)
黄酮产量
F lavono ids
yield(m g)
M S2.47bc BC0.306BcdC0.2309eE0.7065cC2.2209abAB6.7960bB L S2.51bc BC0.327cdBC0.2203eE0.7203cC2.1100bc AB6.8997bB B55.91aA0.633aA0.4120cCD2.6080abAB2.4104aA15.2578aA N65.87aA0.601aA0.4001cdCD2.4046bAB2.2305abAB13.4053aA H3.59bB0.418bB0.5401bB2.2576bB1.6290deCD6.8092bB N itsch3.51bB0.421bB0.4998bBC2.1042bB1.5992cdE6.7326bB W h ite1.90cC0.226dC0.3209deD0.7252cC1.4849eD3.3569cC
1 2M S3.14bc B0.354bc BC0.9324aA3.3007aA1.8896cdBC6.6892bB
注:均值后字母不同表示差异显著,小写与大写字母分别表示5%和1%的显著水平。下列各表同。
N o tes:M eans w h ich are significantly are fo llow ed letters,s m all and large letters indicate the different at5%and1%levels respectively. T he fo llow ing tables are just the sam e.
表2 不同培养基对叶愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
T ab le2 Effects of differen t m edia on leaf callu s grow th and secondary m etabo lites con ten t
培养基种类
Basic
m edia
增长量Increm ent
鲜重
F resh w eigh t
g flask(g)
干重
D ry w eigh t
g flask(g)
绿原酸含量
Ch lo rogenic acid
content(%)
绿原酸产量
Ch lo rogenic acid
yield(m g)
黄酮含量
F lavono ids
content(%)
黄酮产量
F lavono ids
yield(m g)
M S3.02b c BCD0.379c BC0.2451fD0.9289dD2.5011aAB9.4792bc BC L S2.29cdCD0.303cdCD0.2559fD0.7754dD2.4990aAB7.5720cdCD B55.69aA0.655aA0.5999cdBC3.9294bB2.5696aA16.8309aA N65.14aA0.619aA0.5706deBC3.5320bBC2.4010abAB14.8622aA H3.19bBC0.382c BC0.7001bB2.6744cC2.0191bBC7.7126cdCD N itsch2.98bc BCD0.360cCD0.6943bc B2.4995cC1.5872cC5.7132dD W h ite1.99dD0.249dD0.4970eC1.2375dD2.0730bABC5.1618eD 1 2M S3.59bB0.467bB1.3579aA6.3414aA2.4737aAB11.5522bB
2.2 光照条件对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
四种光照处理中(表3),12h d光照的愈伤组织增长量、绿原酸含量和黄酮含量均最高,其次为自然光、黑暗和全光照。在连续光照条件下,愈伤组织逐渐失去光泽,生长速度缓慢,增长量仅为12h d 光照的1 3,该条件也不利于绿原酸和总黄酮的形成。暗光培养的愈伤组织与12h d光照培养的愈伤组织相比,虽然增长量差异不明显,但绿原酸的含量最低,说明黑暗对愈伤组织的生长影响不大,但却抑制了绿原酸和黄酮的形成。两种光暗交替处理的愈伤组织增长量(干重)、绿原酸含量和黄酮含量高于全光和全暗处理,说明植物在系统发育过程中已完全适应了自然界这种光暗交替的昼夜变化,但最有利于愈伤组织生长和次生代谢产物积累的光周期中光照时间长短尚需进一步研究。
表3 光照条件对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
T ab le3 Effects of on callu s grow th and secondary m etabo lites p roducti on
光照条件Conditi on of ligh t
增长量Increm ent
鲜重
F resh w eigh t
g flask(g)
干重
D ry w eigh t
g flask(g)
绿原酸含量
Ch lo rogenic acid
content(%)
绿原酸产量
Ch lo rogenic acid
yield(m g)
黄酮含量
F lavono ids
content(%)
黄酮产量
F lavono ids
yield(m g)
12h d光照
12h d L igh t5.99aA0.650aA0.4944aA3.2136aA1.9595aA12.7075aA 自然光
N ature ligh t
5.13aA0.586aA0.3089bB1.8102bB1.3825bB8.1015bB
黑暗
D ark
5.87aA0.578aA0.1761cC1.0179c BC1.0464c BC
6.0587c B
连续光照L igh t 1.99bB0.229bB0.2914bB0.6673cC0.7259cC1.6623dC
4191西 北 植 物 学 报24卷
2.3 碳源对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
实验选用分析纯蔗糖、市售食用白糖、分析纯葡萄糖作为碳源,结果表明碳源不仅影响愈伤组织生长,也显著地影响次生代谢产物的含量(表4)。愈伤组织增长量、绿原酸和总黄酮的含量都以蔗糖最高,葡萄糖最低。葡萄糖为碳源的增长量仅为蔗糖的1 3左右,总黄酮和绿原酸产量与蔗糖差异极大。
表4 碳源对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
T ab le4 Effects of carbon sou rces on callu s grow th and secondary m etabo lites p roducti on
碳源Carbon sources
增长量Increm ent
鲜重
F resh w eigh t
g flask(g)
干重
D ry w eigh t
g flask(g)
绿原酸含量
Ch lo rogenic acid
content(%)
绿原酸产量
Ch lo rogenic acid
yield(m g)
黄酮含量
F lavono ids
content(%)
黄酮产量
F lavono ids
yield(m g)
蔗糖
Sucro se
5.99aA0.655aA0.4944aA3.2383aA1.9595aA12.8347aA
白糖
R efined sugar
5.54aA0.608aA0.3230bB1.9638bB1.5506abAB9.4276bB
葡萄糖
Gluco se
1.91bB0.201bB0.1791cC0.3600cC0.9438bB1.8970cC
2.4 蔗糖浓度对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
由表5可知,在10～40g L蔗糖浓度范围内,愈伤组织的增长量和次生物质的积累随蔗糖浓度的升高而增加,在40g L时愈伤组织增长量和黄酮含量达到最大值;蔗糖浓度50g L时,愈伤组织的生长受到抑制,黄酮含量和产量也下降,但绿原酸的含量和产量仍在提高。可见,愈伤组织中不同次生代谢产物合成的最佳蔗糖浓度是不同的。
表5 蔗糖对愈伤组织生长和次生代谢产物含量的影响
T ab le5 Effects of sucro se concen trati on on callu s grow th and secondary m etabo lites p roducti on
蔗糖浓度
(m g L)
Sucro se concentrati on
增长量Increm ent
鲜重
F resh w eigh t
g flask(g)
干重
D ry w eigh t
g flask(g)
绿原酸含量
Ch lo rogenic acid
content(%)
绿原酸产量
Ch lo rogenic acid
yield(m g)
黄酮含量
F lavono ids
content(%)
黄酮产量
F lavono ids
yield(m g)
103.86dC0.372dD0.1731c B0.6439cC0.7663dC2.8506eC 204.85c BC0.534cC0.2320c B1.2389cC1.0800c B5.7672dC 306.01bAB0.674bB0.4388bA2.9575bB1.5842bB10.6775c B 406.94aA0.954aA0.4982abA4.7528aA2.2396aA21.3658aA 505.59bc BC0.921aA0.5740aA5.2865aA1.5170bB13.9716bB
3 讨 论
不同培养基的无机元素浓度差异很大,对植物细胞生长和次生代谢产物的形成必然会有较大的差异。B5培养基不仅有利于愈伤组织生长,也有利于总黄酮的形成,而1 2M S有利于绿原酸的积累。这与杨振堂等人[7]得出的B5培养基对杜仲愈伤组织诱导率、月增殖倍数、杜仲胶含量均优于其它培养基相一致。说明杜仲愈伤组织的生长和绿原酸的积累对培养基的要求不一致,一些能促进细胞生长的培养基成分和浓度却不利于绿原酸的积累,因此用组织培养方法生产绿原酸时宜用二步培养法,即先在生长培养基B5上增加细胞的生物量,第二步在生产培养基1 2M S上生产绿原酸。
培养基中糖不仅起到碳源的作用,而且还有调节渗透的作用,因而对愈伤组织的生长和次生代谢产物的含量有明显影响,试验结果表明,对愈伤组织的增长量和绿原酸、总黄酮的含量都以蔗糖最高,葡萄糖最差,增长量仅为蔗糖的1 3。这与唐建军等人[10]的报道不同。虽然白糖和蔗糖的主要成分都是蔗糖,只是纯度不同,白糖效果不如蔗糖,可能是白糖中微量杂质如重金属,氯化物等对细胞生长和次生代谢物的形成都有一定的抑制作用。
高浓度的蔗糖能提高培养基中次生代谢产物的含量,其原因之一是提高了培养基的渗透压。试验中,愈伤组织的生长和绿原酸的合成所需的最佳蔗糖浓度是不同的,在10～40g L蔗糖浓度范围内,总黄酮的积累随蔗糖浓度的升高而升高,50g L时
5191
10期李 琰,等:培养基及培养条件对杜仲愈伤组织生长及次生代谢产物含量的影响
总黄酮的含量开始下降,说明高渗条件抑制了总黄酮的形成,但是高渗条件对细胞中绿原酸的合成还是有利的,绿原酸的含量随着糖浓度的升高而升高,这一点与郑穗平等人[17]报道的高渗有利于玫瑰茄中花青素的积累相一致,有关的机理尚需进一步的实验证实。
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6191西 北 植 物 学 报24卷
培养基的灵敏度测试 培养基的灵敏度测试是其质量控制的一个重要检测部分。方法如下： 1.用于菌数计数的半固体琼脂培养基促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查（促菌生长检查）。取预先制备好的琼脂培养基平皿3~5个，用表面涂布法每块平板表面接种30~100个试验菌，同时用已知质量保证的同型号培养基平皿3~5个（如较著名的如MERCK，DIFICOL产品）做对照试验，待培养基表面的菌液被琼脂培养基吸干或风干后，将培养皿倒置于培养箱的使用温度下培养48~72小时，（也可采用浇碟法进行）取出培养后的平皿点计菌落数。样品培养基上的微生物数量应不得低于对照培养基上微生物生长数量的70%。否则，需重新检查，或该培养基被视为不符合促生长要求。 2.用于控制菌检查的富集培养基的促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查。每100ml培养基内分别接入试验菌小于100cfu，每个菌种接种两瓶培养基，将接过种的培养基置于指定条件下培养。应在16~18小时后可明显观察到培养基内有微生物生长，则证明此培养基合格。 原则上无论是采用脱水培养基还是按相关处方配制的培养基，一旦制成成品培养基，则应对每个配制批号培养基进行促菌生长（灵敏度检查）试验，以考察培养基的质量。按脱水培养基的生产批号做灵敏度检查是基于培养基的灭菌程序已经经过验证。 如果实验室使用的是商购的成品培养基，供应商应随培养基提供相应批次的培养基质量检测报告，报告包括培养基的PH值、无菌检查结果和促菌生长（灵敏度）试验结果等项目。建议在使用某一新的成品培养基（新供应商或新培养基品种）时，应至少考察三个不同批次的培养基质量，只有三批质量均合格方可使用该培养基。微生物限度检查用成品培养基一旦初试确认合格后，可审查供应商的质检报告，而不必每批再作无菌检查和灵敏度检查，但半年应至少检查一次，以复核其质量。用于无菌检查试验的每批培养基，均必须按规定进行灵敏度检查试验，此规定同样适用于实验室自行配制的培养基。。 建议在正式使用前即应完成对培养基的质量检查。如果在进行灵敏度试验的同时，也使用该培养基进行样品检查，那么，一旦培养基的无菌性或灵明度不符合规定，则检验结果应无效。无论这些质量控制检查试验何时完成，实验室都必须在相关产品放行之前或检验报告发出之前，对所用培养基的无菌性及灵敏度试验资料的完整性和合格予以确认。 灵敏度（促生长）检查试验用菌悬液，可用标准菌种制得，也可向具备适当资质的供应商购买。目前市场上的商用产品，如microball公司的培养基质量检查用的定量质控菌株，小瓶内一个小球上含有10~100CFU。此类产品使用简单，但操作者需严格遵守供应商的使用要求。另外，尽管所购试菌种均附有质量证书，正式使用前，仍必须用倾注平皿法或铺表面法等标准检测方法对菌悬液的微生物数量进行复核确认。
无菌培养基灌装试验 验证方案 编号：VMP-XZGY-YZFA-001 ****药业有限公司
目录 1 概述 (1) 2 验证目的 (1) 3 验证范围及要求 (1) 4 验证小组成员及职责 (2) 4.1 验证小组成员 (2) 4.2 相关职责 (2) 5 验证前提条件 (2) 5.1 厂房和空调系统验证情况检查 (2) 5.2 设备和公用系统确认情况检查 (2) 5.3人员和物料情况检查 (3) 5.4检验仪器确认情况检查 (3) 5.5环境监测结果检查 (3) 6 验证标准 (3) 7 培养基适用性检查 (4) 7.1无菌性检查 (4) 7.2灵敏度检查 (4) 8 验证内容 (4) 8.1 取样及检测 (4) 8.2 验证程序 (7) 9 验证偏差和变更 (8) 10 再确认周期 (8) 11 确认结果评定及结论 (8)
共9页第1页 名称：无菌培养基灌装试验 验证方案 编号VMP-XZGY-YZFA-001版本号00 替代版本号—— 制定人审核人批准人 制定日期审核日期批准日期 制定部门生产部印数1份执行日期 颁发部门质量部存档部门质量部 分发部门生产部、质量部 变更记载： 版本号批准日期执行日期 变更历史及原因： 1、概述： 无菌培养基灌装试验是指由掌握了无菌操作的人员在一个有控制的环境中将培养基按工艺配制，并经除菌过滤后灌装于灭菌的容器中，并在适当条件下培养，确认没有菌生长，以证明无菌生产工艺的可靠性的过程。本试验是在与无菌灌装生产过程有关的其他验证合格后，且操作人员熟练掌握了岗位操作规程后进行的。培养基灌装作为无菌灌装的模拟实验，可以直观、方便、准确地反映出无菌灌装过程的污染情况及问题。 2 、验证目的 通过无菌培养基灌装试验证明灌装用的安瓿瓶、过滤器、灌注器等的染菌率是否达到规定的合格标准，确认小容量注射剂车间的洁净环境及进行无菌灌装过程中所采用的各种防止微生物污染的方法和规程的可行性，从而为保证所生产产品的无菌性提供依据。 3、验证范围及要求 本验证方案适用于新建或生产工艺进行过重大更改后的非最终灭菌小容量注射液的无菌灌装过程的验证。必须经连续三批合格的培养基灌装试验后方可证明被验证工艺的可靠性。不同批次的模拟灌装应在同一条生产线不同的工作日内进行。如实际生产中有不同的班次，则应对实际生产操作的每个班次进行培养基灌装试验，每班次连续进行3次合格试验。
培养基促生长实验操作 Prepared on 22 November 2020
1目的 制订培养基灵敏度实验操作，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行。 2 范围 适用于所有配制好并灭菌的培养基。 3 编写依据 4 术语 无 5 职责 QC卫检组人员负责培养基的配制、灭菌、灵敏度实验。 6 内容 使用的设备、器具 生物安全柜、无菌培养皿、无菌刻度吸管或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、酒精灯 等 使用的菌株 EP检测用ATCC的菌株: 金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 6538 大肠埃希菌Escherichia coli ATCC 8739 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 枯草芽孢杆菌 Bacilllus subtilis ATCC 6633 沙门氏菌Salmonella enterica subsp ATCC 14028 白色念珠菌Candida albicans ATCC 10231 黑曲霉Aspergillus niger ATCC 16404
培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5代, 并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。 检测频率 每批配制、灭菌后的培养基均应做灵敏度测试。 操作方法 6.4.1 对照标准培养基 用已经过实验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基. 6.4.2 实验培养基 将琼脂类的实验培养基加热融化后，冷却至45℃左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入15～20ml，备用。液体类的培养基直接使用。 6.4.3 菌悬液的制备 6.4.3.1 细菌菌悬液的制备 方法一：取细菌的斜面培养物1耳匙接种在酪蛋白大豆消化肉汤培养基中30～35℃培养18～24h，取上述培养物用无菌水按10倍系列稀释，分别制成10-7～10-8的菌悬液备用。 6.4.3.2 霉菌菌悬液的制备 取白色念珠菌的斜面培养物1耳匙接种在沙氏琼脂斜面上于20～25℃培养24～ 48h，加入无菌水4ml制成原液，取上述原液按10倍系列稀释，分别制成10-6～10-7的菌悬液备用。 取黑曲霉的斜面培养物加入无菌水4ml制成孢子悬液，取上述孢子悬液按10倍系列稀释，分别制成10-6～10-7的菌悬液备用。
培养基的制备与灭菌 一、目的要求 1.掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2.掌握培养基的配置原则和方法。 3.掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基：是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。 高压蒸汽灭菌：主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100℃的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。 三、实验材料 1.药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。 2.仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。 3.其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。 四、操作步骤 （一）玻璃器皿的洗涤和包装 1．玻璃器皿的洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。 2．灭菌前玻璃器皿的包装 （1）培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。 （2）移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约1~1.5cm。塞棉花时．可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。 先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管压紧．在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。 （二）液体及固体培养基的配制过程1．液体培养基配制 （1）称量（假定配制1000ml培养基） 按培养基配方比例依次准确地称取3.0g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0gNaCl放入烧杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。 （2）溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量（如约700ml），用玻棒搅匀，然后，在石棉网上
植物组织培养MS培养基配方 （一）母液配制与保存 配制培养基时，如果每次配制都要按着杨成分表依次称量，既费时，又增加了多次称量误差。为了提高配制培养基的工作效率，一般将常用的基本培养基配制成10～200倍，甚至1000倍的浓缩贮备液，即母液。母液贮存于冰箱中，使用时，将它们按一定的比例进行稀释混合，可多次使用，并在配制较多数量的培养基时，降低工作强度，也提高试验的精度。 基本培养基的母液有四种：大量元素（浓缩20倍），微量元素（浓缩100倍），铁盐（浓缩200倍），除蔗糖之外的有机物质（浓缩100倍） 1大量元素 配制大量元素母液时要分别称量，分别溶解，在定容时按表1中的序号依次加入容量瓶中，以防出现沉淀。倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保存。 表1大量元素母液（配1L20倍的母液） 序号成分配方浓度/（mg.L-1）称取量/mg 配1mL培养基吸取 量/mL 1 硝酸铵NH4NO3 1650 33000 50 2 硝酸钾KNO 3 1900 38000 3 磷酸二氢钾KH2PO 4 170 3400 4 七水合硫酸镁MgSO4.7H2O 370 7400 5 氯化钙无水CaCl2 440 6644 2微量元素母液 在配制微量元素母液时，也应分别称量和分别溶解，定溶时不分先后次序，可随意加入溶量瓶中定容（表2），一般不会出现沉淀现象。倒入磨口试剂瓶中，贴好标签和做好记录后，可常温保存或放入冰箱内保有存。 表2微量元素母液(配制1L100倍母液) 成分配方浓度/(mg.L-1) 称取量/mg 配制1L培养基吸取 量/mL 碘化钾KI 0．83 83 10 硫酸锰MnSO4.H2O 22．3 2230 硼酸H3BO3 6．2 620 硫酸锌ZnSO4.7H2O 8．6 860 钼酸钠Na2MoO4.2H2O 0．25 25 硫酸铜CuSO4.5H2O 0．025 2．5 氯化钴CoCl2.6H2O 0．025 2．5 3铁盐母液 由于铁盐无机化合物不易被植物吸收利用，只有基螯合物才能被植物吸收利用，因此需要单独配成螯合物母液表3）。 配制方法：称取5.56g硫酸亚铁和7.46g乙二胺乙酸二钠，分别用450ml的去离子水溶解，分别适当加热不停搅拌，分别溶解后将硫酸亚铁溶液缓缓加入到乙二胺四乙酸二钠溶液中，将两种溶液混合在一起，最后用去离子水定溶于1000mL，倒入棕色贮液瓶中，贴好标签和做好记录后放入冰箱内保存。
培养基模拟灌装实验方案考试卷 一、填空题（5分/题，共50分） 1. 本次培养基模拟灌装实验为新改建的洁净厂房内实施，为培养基模拟试验的首次验证，因此通过连续三批模拟灌装实验及结果有限性的评价，确认结果的重现性。 2. 对无菌灌装区的设备台面及可能接触到的表面进行无菌程度的检查，其合格标准为：灌装机设备台面微生物数量＜3个，设备输送带＜5个。 3. 培养基模拟灌装过程中对操作人员的无菌服、五指手套、口罩等部位微生物数量进行检测, 其合格标准为：五指手套微生物数量＜3个，一个操作人员双臂、前胸微生物总数＜5个，口罩微生物数量＜3个。 4. 粉针剂无菌分装间应控制合适的温度及相对湿度，其合格标准为：房间温度：20-22 ℃，相对湿度：45-50%。 5. 模拟分装过程：采用先灌装乳糖、再注入液体培养基的方式，其阳性对照样品为枯草芽孢杆菌和白色念珠菌。 6. 微生物培养条件：将全部样品在适宜的温度下培养14天，先在较低的温度（23-28℃）培养7天，然后在较高的温度下(30-35℃)培养7天，在第三天和第七天之间至少观察培养基样品的微生物的生长情况，通过最后一天的观察，确认有无微生物生长。 7. 对于培养基/乳糖样品的培养结果，若发现污染应明确记录瓶号、瓶数，同时应检查胶塞、铝盖的密封情况；若有破损应记录并检查其破损原因。对于被污染的样品进行鉴别试验，至少包括菌落数、细胞形态学记革兰染色特性等。 8. 试验结果与评价：评价无菌模拟灌装实验结果的主要指标就是污染水平，不管实验的数量有多少，其结果污染瓶均要为零，如果连续三批实验结果均出现1瓶，应进行再次实验，培养结果如出现2瓶以上，应停止生产，进行污染调查。 9. 对于已投入使用的粉针剂生产线，每年至少进行2次培养基模拟灌装实验，其生产线的每一位员工至少每年参加一次成功的培养基模拟灌装实验。 10. 当生产设备、设施、操作人员的结构、操作方法发生变动时，必须进行培养基模拟灌装实验，已确认其变动没有对该生产线的无菌保证产生影响。 二、问答题（50分） 1.简述培养基模拟灌装实验方案验证内容（15分）。 答：①培养基制备及无菌性检查，②培养基促生长实验，③无菌原料的制备、无菌性及抑菌性检验，④模拟灌装最差条件选择，⑤模拟分装过程，⑥灌装产品的培养，⑦根据培养，⑧结果确定本次模拟灌装实验的有效性，⑨模拟灌装过程记录。
实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin (100 mg/ml) IPTG (24 mg/ml) X-Gal (20 mg/ml) LB培养基■组份浓度 100 mg/ml Ampicillin ■配制量 50 ml ■配制方法 1. 称量5 g Ampicillin置于50 ml离心管中。 2. 加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3. 用0.22 μm滤器过滤除菌。 4. 小份分装（1 ml/份）后，-20℃保存。 ■组份浓度 24 mg/ml IPTG ■配制量 50 ml ■配制方法 1. 称量1.2 g IPTG置于50 ml离心管中。 2. 加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3. 用0.22 μm滤器过滤除菌。 4. 小份分装（1 ml/份）后，-20℃保存。 ■组份浓度 20 mg/ml X-Gal ■配制量 50 ml ■配制方法 1. 称量1 g X-Gal置于50 ml离心管中。 2. 加入40 ml DMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后， 定容至50 ml。 3. 小份分装（1 ml/份）后，-20℃避光保存。 ■组份浓度 1%（W/V）Tryptone，0.5%（W/V）Yeast Extract， 1%（W/V）NaCl ■配制量 1 L ■配制方法 1. 称量下列试剂，置于1 L烧杯中。 Tryptone 10 g Yeast Extract 5 g NaCl 10 g 2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 滴加5 N NaOH（约0.2 ml），调节pH值至7.0。 4. 加去离子水将培养基定容至1 L。 5. 高温高压灭菌后，4℃保存。
植物组织培养的培养基中，需要添加糖类作为碳源物质，因此糖类是影响植物组织培养成功与否的关键之一。高中生物教材中明确指出，植物组织培养的培养基中添加的糖类是蔗糖。那么为什么不添加葡萄糖呢？很多资料上解释为蔗糖较葡萄糖便宜，易被植物细胞吸收。其实并非如此。之所以以蔗糖作为碳源，主要有三个方面的原因： （1）同样作为碳源为植物细胞提供能量来源，蔗糖较葡萄糖能更好地调节培养基内的渗透压。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，因此若采用葡萄糖作为碳源，易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可相对长期的保持稳定。 （2）植物组织培养过程中，要时刻注意防止培养基受到微生物的污染。微生物生长所需的碳源最常用的是葡萄糖，一般很少利用蔗糖。因此，采用蔗糖作为培养基的碳源，可一定程度上减少微生物的污染。 （3）诱导作用。在培养基成分中，增加生长素的浓度，导致木质部形成，增加蔗糖浓度则导致韧皮部形成。当生长素水平恒定时，2％蔗糖使分化出的全部是木质部，4％蔗糖使分化出的几乎全部是韧皮部，3％蔗糖则可以分化出两者。所以，生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。因此，在植物组培中要选用蔗糖而不选用葡萄糖。 通过细胞膜内外的液体的浓度差来调节 当细胞膜内的浓度小于细胞膜外的时候蔗糖救能进入细胞中了 植物细胞培养中最常用的培养基的碳源是蔗糖，已知葡萄糖和果糖也能使某些植物生长得很好。植物细胞可以分解蔗糖，蔗糖是由一分子果糖和一分子葡萄糖组成的，蔗糖是可以直接进入细胞的，蔗糖跨质膜从质外体进入细胞是由载体介导并需要消耗能量的质子-蔗糖共运输机制进行的，另外，植物能够利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖等。葡萄糖更不稳定，培养基需添加葡萄糖一般都在灭菌后再兑换。实在要添加葡萄糖那么灭菌温度一般控制在108~110左右，120度灭出来的就有一定程度的碳化了。所以用蔗糖更简单 动物细胞只能吸收葡萄糖，二糖蔗糖是无法吸收的。 以蔗糖为植物培养基碳源有两个原因: 1.抑制杂菌生长.细菌等不能直接以蔗糖为碳源,故可起抑制其生长的作用 2.蔗糖被植物细胞利用机理目还无定论.主要有以下两个学说(1)植物细胞先以次级主动运输的方式在细胞内外形成质子梯度,然后蔗糖就会利用这个梯度被吸收进细胞. (2).植物的细胞壁中含有能分解蔗糖的相关酶,蔗糖先在细胞膜外被分解为单糖,然后这些单糖再以主动运输的方式进入细胞,从而被细胞利用.
制订培养基灵敏度实验操作，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全 进行。 范围 适用于所有配制好并灭菌的培养基。 编写依据 EP6.5 术语 职责 QC 卫检组人员负责培养基的配制、灭菌、灵敏度实验。 内容 生物安全柜、无菌培养皿、无菌刻度吸管或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、酒精灯等 EP 检测用ATCC 勺菌株: 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 6538 培养基灵敏度检测所用勺菌株传代次数不得超过 5 代 , 并采用适宜勺菌种保藏技术，以保证试验用 菌株勺生物学特性。 6.3 检测频率 每批配制、灭菌后勺培养基均应做灵敏度测试。 6.4 操作方法 6.4.1 对照标准培养基 大肠埃希菌 Escherichia coli ATCC 8739 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 枯草芽孢杆菌 Bacilllus subtilis ATCC 6633 沙门氏菌 Salmonella enterica subsp ATCC 14028 白色念珠菌 Candida albicans ATCC 10231 黑曲霉 Aspergillus niger ATCC 16404 6.1 使用的设备、器具 6.2 使用的菌株
15? 用已经过实验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基 6.4.2 实验培养基 20ml ，备用。液体类的培养基直接使用。 6.4.3 菌悬液的制备 6.4.3.1 细菌菌悬液的制备 24h ，取上述培养物用无菌水按 10倍系列稀释，分别制成 10-7?10-8的菌悬液备用。 6.4.3.2 霉菌菌悬液的制备 取白色念珠菌的斜面培养物 1耳匙接种在沙氏琼脂斜面上于 20?25 C 培养24?48h ，加入无菌水 4ml 制成原液，取上述原液按 10倍系列稀释，分别制成 10-6?10-7的菌悬液备用。 取黑曲霉的斜面培养物加入无菌水 4ml 制成孢子悬液，取上述孢子悬液按 10倍系列稀释，分别制 成 10-6 ?10-7 的菌悬液备用。 每株菌用 2管（或瓶）实验培养基，接种 0.1 ? 0.5ml 的菌悬液（约 10?100CFU 试验菌），同时用 2 个对照标准的培养基或用已知合格的酪蛋白大豆消化琼脂平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在 规定温度下培养 ,对比或计 数，在规定时间内能生长菌落为合格。 6.4.5 培养基的生长促进和抑制特性试验 6.4.5.1 液体培养基的生长促进特性试验 将琼脂类的实验培养基加热融化后，冷却至 45 C 左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入 方法一：取细菌的斜面培养物 1 耳匙接种在酪蛋白大豆消化肉汤培养基中 30?35 C 培养 18? 方法二：直接用杭州微球生物技术有限公司的产品 -培养基灵敏度指示剂，该产品已经帮我们精确 控制了细菌数量，只要直接拿稀释液稀释下就可以直接取到 10?100CFU 试验菌。使用方便，数量精 确。推荐用此方法操作。 6.4.4 培养基的生长促进实验 6.4.4.1 琼脂类培养基的生长促进实验 每株菌用 2 个实验培养基平皿，用表面涂布法在每个平皿表面接种 0.1 ? 0.5ml 的菌悬液（约 10? 100CFU 试验菌），同时用 2 个对照标准的培养基平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度 下培养 ,取出平皿点计菌落数。实验培养基上的微生物数量应为对照培养基上微生物生长数量的 70%-150%范围内。（注：每种培养基生长促进实验的具体菌株见附录 1） 6.4.4.2 液体类培养基的生长促进实验
" 起草人Prepared by: 起草日期 Date: ` _____________________ QC 审核人Reviewed by:>审核日期 Date:_____________________ QC？ 审核人Reviewed by:审核日期Date: ： QA 批准人Approved by: 批准日期 ^ Date: 质量部QD
目的 Purpose 为保障微生物检验的准确性及相关工作特制定本规定。 范围 Scope 本程序适用于微生物限度测定培养基的适用性检查及相关工作。 职责 Responsibility ！ 分析员：严格按照本操作规程执行。及时完成各类相关记录。在主管的指导下进行任何可能的OOS及偏差调查。 主管：监督本操作规程的执行。对检验员进行必要的培训。指导任何可能的OOS和偏差调查。 内容procedure 1检验员应根据培养基配制程序或培养基各自的说明书配制培养基。 2试验用菌种及培养基 2.1菌种: 2.1.1培养基灵敏度测试所用的菌株传代次数不得超过5代，从国家药检所或菌种保藏中心购买。 2.1.2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[ATCC 6633] 2.1.3~ 2.1.4大肠埃希菌(Escherichia coli) [ATCC 8739] 2.1.5金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [ATCC 6538] 2.1.6白色念珠菌(Candida albicans) [ATCC 10231] 2.1.7黑曲霉(Aspergillus niger)[ATCC 16404] 2.1.8伤寒沙门菌(Salmonella) [ATCC 14028] 2.1.9铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [ATCC 9027] 2.2培养基 2.2.1按照培养基说明书进行配制灭菌。 2.2.2| 2.2.3大豆酪蛋白消化肉汤 Soybean-Casein Digest Broth 2.2.4大豆酪蛋白消化琼脂 Soybean-Casein Digest Agar 2.2.5沙氏葡萄糖琼脂 Sabouraud Dextrose Agar
实验一、植物组织培养基母液配制的若干关键环节目的与要求： 熟悉MS培养基的组成，掌握贮备液的配制方法. 植物组织培养（plant tissue culture）是指植物的任何器官、组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化形成完整植株的过程.植物组织培养具有取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制等特点.因而被广泛应用于各种植物的快速繁殖之中. 为了避免每次配制培养基都要对几十种化学药品进行称量，应该将培养基中的各种成分，按原量10倍、100倍或1000倍称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做母液。这样，每次配制培养基时，取其总量的1/10、1/100、1/1000，加以稀释，即成培养液。现将培养液中各类物质制备母液的方法说明如下。 以MS培养基为例，其母液的配制包括大量元素、微量元素、铁盐、维生素、氨基酸、植物生长调节物质和有机附加物等种类.(见表1) 表1 MS培养基母液的配制 成分规定用量 /mg.L-1 扩大倍 数 称取量/ mg 母液定溶 体积/ml 配1LMS培 养基吸取量 /ml 大量元素 KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O KH2PO4 CaCl2·2H2O 微量元数 MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O 1900 1650 370 170 440 22.3 8.6 20 20 20 20 20 1000 1000 38000 33000 7400 3400 8800 22300 8600 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 50 50 50 50 50 1 1
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目的Purpose 为保障微生物检验的准确性及相关工作特制定本规定。 范围Scope 本程序适用于微生物限度测定培养基的适用性检查及相关工作。 职责Responsibility 分析员：严格按照本操作规程执行。及时完成各类相关记录。在主管的指导下进行任何可能的OOS及偏差调查。 主管：监督本操作规程的执行。对检验员进行必要的培训。指导任何可能的OOS和偏差调查。 内容procedure 1检验员应根据培养基配制程序或培养基各自的说明书配制培养基。 2试验用菌种及培养基 2.1菌种: 2.1.1培养基灵敏度测试所用的菌株传代次数不得超过5代，从国家药检所或菌种保藏中心购买。 2.1.2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[ATCC 6633] 2.1.3大肠埃希菌(Escherichia coli) [ATCC 8739] 2.1.4金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [ATCC 6538] 2.1.5白色念珠菌(Candida albicans) [ATCC 10231] 2.1.6黑曲霉(Aspergillus niger)[ATCC 16404] 2.1.7伤寒沙门菌(Salmonella) [ATCC 14028] 2.1.8铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) [ATCC 9027] 2.2培养基 2.2.1按照培养基说明书进行配制灭菌。 2.2.2大豆酪蛋白消化肉汤Soybean-Casein Digest Broth 2.2.3大豆酪蛋白消化琼脂Soybean-Casein Digest Agar 2.2.4沙氏葡萄糖琼脂Sabouraud Dextrose Agar 2.2.5肠道菌增菌肉汤Enterobacteria Enrichment Broth Mossel
五、实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin(氨卡青霉素)(100 mg/ml) 组份浓度100 mg/ml Ampicillin 配制量50 ml 配制方法 1.称量5 g Ampicillin置于50 ml离心管中。 2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3.用0.22 μm过滤膜过滤除菌。 4.小份分装(1 ml/份)后，-20℃保存。 IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(24 mg/ml) 组份浓度24 mg/mL IPTG 配制量50 mL 配制方法 1.称1.2 g IPTG置于50 ml离心管中。 2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3.用0 22 μm过滤膜过滤除菌。 4小份分装(1 ml，份)后，-20℃保存。 X-Gal (20 mg/ml) 组份浓度20 mg/ml X-Gal 配制量50 ml 配制方法 1.称量l g X-Gal置于50 ml离心管中。 2.加入40 ml DMF(二甲基甲酰胺)，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3.小份分装(1 ml/份)后，-20℃避光保存。 LB培养基 组份浓度1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨)，0.5%(W/V)Yeast Extract(酵母提取物)，1%(W/V)NaCl 配制量 1 L 配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。 Tryptone 10 g Yeast Extract 5 g NaCl 10 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加5 N NaOH(约0.2 m1)，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5高温高压灭菌后，4。C保存。 LB/Amp培养基 组份浓度 1%(W/V) Tryptone 0.5%(W/V) Yeast Extract 1%(W/V) NaCl 0.1 mg/ml Ampicillin
培养基适用性检查 计数实验的培养基适用性 该部分内容均为新增 规定了该内容的应用范围 采用标准菌种计数，回收率以及形态比较的判定方法 标准菌种为：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢 杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；规定了稀释后的工作菌液 的保存条件和保存期限 引入了对照培养基的概念 判定的依据：回收率大于70％，且形态一致 控制菌检查的培养基适用性 该部分内容均为新增 规定了该部分内容的应用范围以及检查的项目 采用标准菌种比较的判定方法 根据培养基的用途不同，分为增菌培养基的促生长能 力、固体培养基的促生长能力、培养基的抑制能力、固 体培养基的指示能力、液体培养基的指示能力等5种检 查方法 在检查中引入了涂布接种的概念 1. 概述 培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节。计数测定用培养基的促生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素，控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异，影响结果判断的客观性。 培养基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价拍段检验用培养基是否符合检验要求。 微生物限度检查用培养基主要分为细菌、霉菌及酵母菌计数测定用培养基和控制菌检查用培养基两部分。2010《版中国药典》微生物限度检
查法中收载了“适用性检查”对培养基质量进行控制。 2、培养基适用性检查实验的一般要求 2.1培养基适用性检查适用范围 2010版《中国药典》规定微生物限度检查中成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。 培养基使用性检查试验可用于确定实验室所用培养基(包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基干粉、按处方自行配制培养基不同批次的原材料等)、制备程序（包括水质控制、配制方法、灭菌程序等）、保存条件（温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等）等是否满足微生物限度检查用要求。即上述影响培养基质量的各关键控制点应通过培养基使用性检查试验确定，如果任一控制点发生变化应重新进行培养基适用性检查。但是影响培养基质量的关键控制点的变化应掌握在微生物实验室质量控制的一般原则内（见2.2），超过一般原则的培养及是否还能满足微生物限度检查用，无法通过培养基适用性检查确定。 当检查结果出现异常，或实验室质量控制需要，也可通过培养基适用性检查提供一定依据。总之，培养基适用性检查是在正常条件下关于培养基质量的实验室控制措施，并不一定在每次具体的微生物限度检查样品检测试验活动中都必须同时进行培养基使用性检查试验，但每次微生物检查所用培养基均应经过适用性检查。 2.2微生物限度检查用培养基质量控制的一般原则 2.2.1不同处方培养基的替代使用不能通过培养基使用性检查试验简单确定。 2.2.2.培养基适用性检查不能取代供应商或其他法定标准对培养基的有效期、保存条件、制备方法等的更严格等的规定。 2.2. 3.如果没有特殊规定，培养基配制采用蒸馏水或纯化水均可，但应采用一定措施加以检测控制，如蒸馏水应核实PH是否为5~7；采用离子交换法制备的纯化水，电阻值应不小于2MΩ等。
植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养概念（狭义）指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。 组织培养的步骤 一、培养基配制 配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。 自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。 1、配制几种母液 （1）配制MS大量元素母液 一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。 分别称取 NH4NO3 165g KH2PO4 17g KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g MgSO4·7H2O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 （2）配制MS微量元素母液 一般将微量元素配制成100倍母液。 依次称取 KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g ZnSO4·7H2O 0.86g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。 分别称取 CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g 各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。 （3）配制MS有机母液
培养基促生长实验操作精编W O R D版 IBM system office room 【A0816H-A0912AAAHH-GX8Q8-GNTHHJ8】
1目的 制订培养基灵敏度实验操作，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行。 2 范围 适用于所有配制好并灭菌的培养基。 3 编写依据 EP6.5 4 术语 无 5 职责 QC卫检组人员负责培养基的配制、灭菌、灵敏度实验。 6 内容 6.1 使用的设备、器具 生物安全柜、无菌培养皿、无菌刻度吸管或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、酒精灯等6.2 使用的菌株 EP检测用ATCC的菌株: 金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 6538
大肠埃希菌Escherichia coli ATCC 8739 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 枯草芽孢杆菌 Bacilllus subtilis ATCC 6633 沙门氏菌Salmonella enterica subsp ATCC 14028 白色念珠菌Candida albicans ATCC 10231 黑曲霉Aspergillus niger ATCC 16404 培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5代, 并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。 6.3 检测频率 每批配制、灭菌后的培养基均应做灵敏度测试。 6.4 操作方法 6.4.1 对照标准培养基 用已经过实验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基. 6.4.2 实验培养基 将琼脂类的实验培养基加热融化后，冷却至45℃左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入15～20ml，备用。液体类的培养基直接使用。 6.4.3 菌悬液的制备
第五章微生物的营养和培养基 一、选择题 1. 大多数微生物的营养类型属于：（） A. 光能自养 B. 光能异养 C. 化能自养 D. 化能异养 2. 蓝细菌的营养类型属于：（） A．光能自养 B. 光能异养C．化能自养 D. 化能异养 3. 碳素营养物质的主要功能是：（） A. 构成细胞物质 B. 提供能量 C. A，B 两者 4. 占微生物细胞总重量70%-90% 以上的细胞组分是：（） A. 碳素物质 B. 氮素物质 C. 水 5. 能用分子氮作氮源的微生物有：（） A. 酵母菌 B. 蓝细菌 C. 苏云金杆菌 6. 大肠杆菌属于（）型的微生物。 A. 光能无机自养 B. 光能有机异养 C. 化能无机自养 D. 化能有机异养 7. 自养型微生物和异养型微生物的主要差别是：（） A. 所需能源物质不同 B. 所需碳源不同 C. 所需氮源不同 8. 基团转位和主动运输的主要差别是：（） A. 运输中需要各种载体参与 B. 需要消耗能量 C. 改变了被运输物质的化学结构 9. 单纯扩散和促进扩散的主要区别是：（） A. 物质运输的浓度梯度不同 B. 前者不需能量，后者需要能量 C. 前者不需要载体，后者需要载体 10. 微生物生长所需要的生长因子（生长因素）是：（） A. 微量元素 B. 氨基酸和碱基 C. 维生素 D. B，C二者 11. 培养基中使用酵母膏主要为微生物提供：（） A. 生长因素 B. C 源 C. N 源 12. 细菌中存在的一种主要运输方式为：（） A. 单纯扩散 B. 促进扩散 C. 主动运输 D. 基团转位 13. 微生物细胞中的C素含量大约占细胞干重的：（） A. 10% B. 30% C. 50% D.70%
表皮葡萄球菌 产气肠杆菌 鼠伤寒沙门氏菌 单核增生李斯特氏菌 大肠埃希氏菌 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 表面接触碟/表面接触皿 https://www.doczj.com/doc/b25957042.html, 金黄色葡萄球菌 酿酒酵母菌 脑心浸出液肉汤(BHI) 品红亚硫酸钠液体培养基 MFC肉汤 CFU培养基基础 4-甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基蛋白胨 胰蛋白胨 胰酪蛋白胨 酵母浸粉 大豆蛋白胨 酸水解酪蛋白 明胶蛋白胨 马铃薯浸粉 琼脂粉 琼脂粉 动物组织胃蛋白酶消化物 肉胃酶消化物 牛肉浸粉 牛肝浸粉 牛肝浸粉 牛心浸粉 多价蛋白胨(多聚蛋白胨) 月示蛋白胨 玉米浸出粉 一次性培养皿 表面接触碟 一次性培养皿（密理博浮游菌采样）表面接触碟/表面接触皿 https://www.doczj.com/doc/b25957042.html, 金属玻璃培养皿（可重复使用） 金属玻璃表面接触碟
嗜热脂肪肝菌芽孢菌片（ATCC7953 枯草杆菌黑色变种芽孢菌片（ATCC9372）121度高压灭菌化学指示卡 132℃压力蒸汽灭菌指示卡 葡萄糖 氯化钠 L-半胱氨酸盐酸盐 氧化酶试剂 三磷酸腺苷二钠盐（ATP） 费尔休林（无吡啶） SDS-PAGE凝胶配制试剂盒 SDS-PAGE电泳液 SDS-PAGE上样缓冲液5倍 考马斯亮蓝R-250染色套装 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 大肠埃希氏菌 大肠埃希氏菌 产气肠杆菌 乙型副伤寒沙门氏菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 表面接触碟/表面接触皿 https://www.doczj.com/doc/b25957042.html, 黑曲霉 生孢梭菌 大豆酪蛋白肉汤培养基(胰酪胨大豆肉汤) 大豆酪蛋白肉汤培养基(胰酪胨大豆肉汤) 无菌大豆酪蛋白肉汤培养基(胰酪胨大豆肉? 大豆酪蛋白肉汤培养基(胰酪胨大豆肉汤) 大豆酪蛋白消化液培养基 大豆酪蛋白琼脂培养基 大豆酪蛋白琼脂培养基 无菌大豆酪蛋白琼脂培养基 卵磷脂-吐温80营养琼脂培养基基础 胰化大豆坚固绿琼脂(TSFA) 营养肉汤(NB) 营养琼脂(NA) 0.5%葡萄糖肉汤培养基 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 三糖铁琼脂培养基(TSI) 三糖铁琼脂培养基 R2A琼脂
植物组织培养的培养基配制、分装与灭菌 一、实验目的 1.配制培养基母液是植物组织培养的基本技术。掌握植物组织培养基母液的配制方法和分装原则与方法。 2.掌握大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物质、植物激素的配制和灭菌方法。 二、仪器设备及试剂 电磁炉天平(0.0001 g) 高压灭菌锅、量筒: 10ml、20ml、100ml、500 ml烧杯: 1000ml、500 ml、250 ml 、移液管: 1ml、2ml、5 ml 吸管若干、记号笔、三角瓶或试管、试管架锡铂纸、玻璃棒配制好的各种母液，如大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物、生长调节剂等，个别生长调节剂要随配随用。蒸馏水、pH试纸蔗糖、琼脂等 1 molL NaOH溶液、1 mol/L HC1溶液。 三、方法和步骤 1.量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配1升培养基,先量取约700 m1体积的水。 2.根据培养基配方，用量筒量取所需要的各种元素的母液。 物质加入体积或重量大量元素母液(10x)100ml 、微量元素母液( 100)1 ml有机物质母液(200x)5ml 、铁盐母液(200x)5 ml、肌醇(200x)5 ml、蔗糖30g、琼脂7g
吸取母液时,注意应先将几种母液按顺序排好,不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素，如培养康乃馨侧芽或茎段时加入1ml的1mg/ml 的6 BA;而胡萝卜愈伤组织培养中应加入2ml的1mg/ml 的24-D。加入一种母液后应先搅拌均匀,避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀,琼脂可在加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌,以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。 3.调节培养基的pH值，用pH计或pH试纸测定 培养基的pH按照培养材料的要求分别用1moILNaOH溶液、1molL HC1溶液来调节所配制培养基的pH值，- -般培养基的pH值约为5.8,培养的材料不同，对培养基的pH值要求也不同 4.分装 加热至沸腾片刻,以使琼脂充分溶解,检查时可注意烧杯内溶液是否透明。将配制并加热好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶,用封口膜封口，注明标签,然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。 5.培养基的灭菌 一般用医用高压锅来灭菌(方法略)，本实验采用全自动高压灭菌锅。 5.培养基的保存 毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，一般应在消毒后的两周内用完,最好不要超过一个月。 四、注意事项