引物设计注意事项
引物设计在基因的相关研究中极其重要，其中自己比较熟悉的一点是基于引物设计的全长cDNA文库的构建。
全长cDNA序列的获取是一个十分困难的过程，因此这类数据在GeneBank库中存储较少。在过去的试验中，常见的方法是利用PCR对mRNA序列进行多次扩增，尽可能地获得“全长”的cDNA序列，但是这样的方法很难得到完整的UTR区域。
自2000后，发展较迅猛的一个方法是日本一个研究所的“Oligo-capping"方法。该方法的过人之处在于：为mRNA的设计了两个不同的引物。在3‘UTR区域，PolyA信号的存在可以很方便地设计对应的引物，在5’UTR区域，该方法用一段寡聚核甘酸代替mRNA的帽子结构，从而很容易地设计出对应的引物。
从理论上讲，这种试验方法可以得到100％的全长cDNA，但是试验中多种因素的制约，使得该方法得到的cDNA中约有50％～80%的全长cDNA。
如果试验生物学家能够解决这个难题，那么生物信息中对基因组的研究将会有很大的飞跃。。。
汗ing，偶没有做过相关的试验，算是抛砖引玉了，，表砸我。。
基本PCR引物设计参数
引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率。特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子，在EB染色的琼脂糖凝胶上可见到；引物效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。
①引物长度；
特异性一般通过引物长度和退火温度控制。如果PCR的退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体的解链温度）几度的范围内，18到24个碱基的寡核苷酸链是有很好的序列特异性的。引物越长，扩增退火时被引发的模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于54℃的最短的引物，可获得最好的效率和特异性。
总的来说，最好在特异性允许的范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成的寡核苷酸链（18～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。
②引物的二级结构
包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的3’末端形成的二聚体，应控制其ΔG大于- 5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5’端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以3’端或近3’端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免3’末端有发卡结构的引物。
③引物GC含量和Tm值
PCR引物应该保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20个碱基的寡核苷酸链的Tm值大概在56～62℃范围内，这可为有效退火提供足够热度。一对引物的GC含量和Tm值应该协调。协调性差的引物对的效率和特异性都较差，因为降低了Tm值导致特异性的丧失。这种情况下引物Tm值越高，其错误引发的机率也越大。若采用太高的退火温度，Tm值低的引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好的寡核苷酸中选择一对新的引物时，这种GC含量和 Tm值的协调非常关键。一般来说，一对引物的Tm值相差尽量不超过2～3摄氏度，同时引物和产物的Tm值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好。
④引物的额外序列与退火温度
若有额外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长的引物。一般说来，引物5’端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5’端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。
在引物上添加限制酶位点时一个重要的考虑是大多数限制酶的有效切割要求在它们的识别序列的5’端有2至3个非特异的额外碱基，这样就会增加引物的非模板特异序列的长度。长引物序列的另一个缺点是影响溶解温度的精确计算，而这对于确定PCR反应时的退火温度又是必须的。对于低于20个碱基的引物，Tm值可以根据Tm=4(G+C)+2(A+T)计算。而对于较长的引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大多数都采用这种方式。
⑤引物的3’末端核苷酸组成
引物3’末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3’末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。
引物3’末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在3’末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。
引物3’末端的稳定性由引物3’末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的ΔG。此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3’末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发。
需要注意的是，引物3’末端应尽量避免T。实验证明，以T结尾的引物即使与T, G或C 错配仍可有效延伸。
⑥PCR产物的长度及在耙序列内的位置
所有的计算机程序都提供对PCR产物长度范围的选择。一般说来，PCR产物长度对扩增效率有影响。特定的应用情况下，PCR产物长度部分取决于模板材料。
预期产物的特定长度经常取决于应用的需要。若目的是建立测定特异DNA片段的临床检验方法，120～300bp的小DNA扩增产物可能是最好的。产物应具有好的特异性和高的产生效率，并含有能用于探针捕捉杂交实验的足够信息。这一长度范围的产物可以通过采用两步扩增循环方法得到，从而减少扩增时间。
其他PCR方法有不同的最佳产物长度。例如，通过定量的RNA-PCR检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物和竞争物都能够在凝胶上很容易的分辨出来。这些产物一般在250～750bp范围内。
⑦补充说明
若在cDNA序列内找寻PCR引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在mRNA 的编码区域内，因为这是生成蛋白质的独特序列，不像3’末端非编码区域与许多其他mRNA 有同源性；第二，尽力把引物放在不同的外显子上，以便使RNA特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。
若PCR的目的是克隆一个基因或cDNA的特异序列，产物的大小是根据具体应用预选的。在这里，计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对的信息。
在选择用来扩增来自不同物种DNA的引物时，应避开mRNA的5’和3’末端非翻译区序列，因为它们可能没有任何的同源性。
3．简并引物设计
①设计简并引物时，一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码的简并度。很显然，我们期望选择简并度最低的氨基酸，达到提高特异性的目的。
②充分注意物种对于密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。
③应努力避免3’末端的简并，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物3’末端不要位于密码子的第三位。
④在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。
4．测序引物设计
当然，测序引物的设计一般都由测序公司来完成，如果需要自己设计的话；那么除了按照上面所提到的引物设计通用标准外，还需要注意两点：
①测序引物的特异性的标准掌握应该更严格一些，也就是说设计时更优先考虑特异性。因为在测序反应中，如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果对来很大的干扰甚至造成结果无法识读。
②测序引物的Tm值适当高一些。现在大部分测序反应均选用耐热的测序级DNA聚合酶来催化，并采用PCR的热循环程序。选用的测序引物的Tm值稍高一些，有助于使反应顺利跨过待测模板的二级结构区，也有助于降低非特异反应。
5．探针的设计
探针的设计，根据不同的用途各有其设计特点，这里只是就通用的原则进行讨论：
①探针的长短一般在20-50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。
②注意G和C的含量努力控制在40-60％，同时一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。
③探针自身序列不能形成二聚体，也不能有“发夹”结构存在，这一点上的要求就要比普通引物设计严格得多。
④如果探针地靶目标是多个基因的混合物，就必须控制该探针与无关基因之间的相似性在70%以下。
PCR中常见问题分析与对策．
PCR产物的电泳检测时间
一般认为PCR产物应在48h以内完成电泳检测，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型就会出现不规则，甚至消失。
Trouble shooting guide
1．假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因为酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时PCR时忘了加Taq酶或电泳时忘了加溴化乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物使用过程中应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20μl、30μl、50μl或100μl，应用
多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20μl后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，否则容易失败。
物理原因：温度对PCR扩增来说相当重要。如果变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下PCR仪或水浴锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
2．假阳性
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。②除了酶及其他不耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3．出现非特异性扩增带
PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时，重新设计引物。②减低酶的量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用
二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸，也叫两步法)。
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
② 产物不能形成二级结构。
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤ 碱基要随机分布。
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧ 引物5′端可以修饰。
⑨ 引物3′端不可修饰。
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度
寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
4.G+C含量
G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间
两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3′端
引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。
在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A∶A错配使产量下降至1/20，A∶G和C∶C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。
9.引物的5′端
引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
10.密码子的简并
如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
特殊目的的引物设计将在有关章节讨论。随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，下面将讨论有关引物计算机设计方法。
关于如何地NCBI验证在文献中查找的引物序列是否正确
A：进入blast，在窗口中将找到的序列输进去，点blast，如果序列正确的话得到的结果会显示出基因名称，在全长中的位置，可以根据位置算出大小，如果与文献上的描述吻合，就验证了你找到的引物序列了。
B：copy引物序列
进入NCBI的BLAST选项，选short blast
paste引物序列在对话框，点击blast
点击新页面的format按钮
等待
C：short blast比对单个引物，common blast 可以比对引物对。
引物对blast:
输入的引物之间用空格或移行隔开；结果显示，正确的靶序列应是plus/plus+plus/minnus，即在同一序列内出现成上下游关系的两个反向引物序列。
但是有的引物对的比对结果出乎意料：只找到与其中之一相匹配的序列和位置，另一个就没有了。这种情况多出现在物种间同源序列的引物比对结果和变异速率较快的序列比对结果中。
利用BLAST来分析自己设计的引物
具体的操作步骤如下：
先打开Blast页面
https://www.doczj.com/doc/b63740687.html,/BLAST/
然后
第一步、点击“Nucleotide”这边的“Search for short, nearly exact matches”（下图的1所示）。
第二步、等页面全部出来以后，将上游引物序列或下游引物序列的互补序列输入或粘贴入“Search”框（下图的2所示，大小写都可以）。如果下游引物序列为5'-GCAAGTCCTTGGACTATGCTGG-3'那它的互补序列为5'-CCAGCATAGTCCAAGGACTTGC-3'。可选择你有搜索的物种或不作任何选择”（下图的3所示）。然后点击“BLAST！”（下图的4所示，页面中间的或页面下端的都可以）。
第三步、新页面完全出来以后，点击“Format!””（下图的5所示），会弹出一个新页面，
慢慢等待结果全部出来。
第四步、从Blast结果中你就可以看到你的引物序列和哪些基因的某段匹配（下图的6所示）及其匹配程度（下图的7所示）了。
(Click the picture to see the source)。
当然使用图1中一行的blastn也可以。不过，“Blastn"和“Search for short, nearly exact matches”还是有区别的。
BLAST Program Selection Guide”是从网上下的，pdf文挡。
内容包括：
1. Common BLAST databases
2. Program Selection
3. Explanation for the program choices
4. Appendix
巢式PCR是指用一对半(三条)或两对引物实现对目的片段的特异性扩增.更精确的来讲,用一对半引物的应该叫做半巢式PCR.
其步骤就是,先用一对外侧引物,扩增模板得到包含你想要的目的片段,比你想要的片段更大的区域.然后用另一对内侧引物(即该对引物在第一轮所用的引物的序列内侧),将你第一轮扩增得到的PCR 产物为模板,再进行扩增.为了节约引物,可以使用一对半引物.即以第一轮扩增中用到的引物中的一个作为第二轮中的一个引物,与第三条引物分别作为上游和下游引物进行半巢式PCR扩增.进行两轮PCR 的目的在于提高扩增的灵敏性.根据文献报道,经巢式PCR扩增后,产物扩增灵敏度较之第一轮能提高10的3次方倍.
你想进行结核杆菌的分型实验.需要先从NCBI 下载该菌所有的核酸序列.经过比对后,找该菌的保守区,在保守区内设计针对所有结核杆菌的通用引物,作为外侧引物,实现第一轮PCR.再在不同型别的菌间,找其型保守序列,做为特异性引物,即内侧引物再进行第二轮PCR.建议你在将所有结核杆菌的通用引物作为外侧引物的原因在于,减少了你设计和验证引物的工作量,也能把所有的待分型的结核杆菌放在同一个尺度上.
用FASTPCR设计简并引物
一、从别无选择的蛋白序列设计简并引物，如：
M(A/T)ASV(E/D)NR(Q/H/Y)F
你只需要用FastPCR的DNA、Protein互转功能即可。
1、分析可能的组合，如下（FASTA format）：
>1
MAASVENRQF
MTASVDNRHF
>3
MTASVDNRYF
将以上可能序列粘贴到FastPCR，如下图：
(Click the picture to see the source)
二、、将蛋白序列转换为DNA序列
、结果显示在result.txt中
4、综合各简并序列，将各位置的碱基合并，如下：
>Degenerate DNA
atggcngcntcngtngaraaycgncartty
atgacngcntcngtngayaaycgncaytty
atgacngcntcngtngayaaycgntaytty
综合为：
atgacngcntcngtnganaaycgnyantty
5、计算简并倍数（Degenerate Fold）,本例为：
1×1×1×1×1×4×1×1×4×1×1×4×1×1×4×1×1×4×1×1×2×1×1×4×2×1×4×1×1×2＝131072
6、适当去除末端碱基，用I代替若干N，减少简并倍数，一般有效简并引物的简并倍数<1000，（当然也有例外）。引物设计完成。如下：
atgacngcntcnIgtIgaIaaycg
最后引物简并倍数为128
三、二、从若干完全保守区设计简并引物
1、输入保守区蛋白序列
>1 //
MAASVDNRQYARLEPGLNGVVR
>2 //
RKGGALNVCFEGSEDLPGG
>3 \\
MMNNCWFRVKTNVCKPHKGEI
>4 \\
ILLREELDGWAEQYPDRLK
（//表示设计Left primer，\\表示设计Right primer）
(Click the picture to see the source)
四、 2、选择序列为Protein
3、改变PCR primer options（同特异引物设计）
4、选择PCR类型，，RUN。（同特异引物设计）
5、选择质量较高的引物，计算简并倍数（同上）
6、用I代替若干N，减少简并倍数。引物设计完成。
五、三、介于完全保守于不保守蛋白序列间的简并引物设计可参照以上两种引物的设计方法。
转贴
第一:引物长度. 根据你需要扩增的目的片段长度,你所需引物的长度也不一样,400-500bp 需要引物长度的是18-19bp.2-3Kb则需要24-25bp.
第二:GC含量.一般掌握在百分之50左右.
第三:引物的3端不能有太多的G\C,即3端最后五个碱基不能超过一半是G或C.
第四:根据你的实验目的,考虑是否需要引入酶切位点.
看看楼上的都是转贴，偶发表一下个人的看法。偶在实验室一直帮别人设计引物，估计到现在也设计了上百条了吧，在这里谈谈偶的感想，希望对大家有帮助。
1、设计引物首先以“引物设计原则”为据，当然只是参照，也不能一成不变。具体问题要具体分析。
2、重点考虑5端和3端引物的退火温度大致相当，GC含量等次考虑之。
3、尽量避免多的二聚体和发夹结构的存在，当然，在设计用于表达的引物时加入酶切位点，肯定会使二聚体的产生几率增加，这也无可避免。不要顾虑太多。
4、有时为了节省钱，偶经常在一条引物上设计上2－3个酶切位点，当然这么多酶切位点导致引物自身容易产生二聚体，但是只要引物序列与模板序列特异性较好，这些都不成问题。
5、偶经常用primer5设计后，再用OLIGO分析各项指标，尽量使设计的引物各项指标与引物设计原则的要求不会偏离太远。偶也用DNAman来分析两条引物之间可能会形成的二聚体等，最后用在线的软件https://www.doczj.com/doc/b63740687.html,/biotools/oligocalc作进一步校验。
6、完成上述几步，引物就设计完成，然后送去合成。
当然，如果批量设计引物，有专门的软件，经常用的一款是https://www.doczj.com/doc/b63740687.html,/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi。
以上拙见，希望能对大家有用
转贴
① 引物应用核酸序列保守区内设计并具有特异性。引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源
② 产物不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性
④ G+C含量在40%~60%之间。G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳，上下游引物的GC 含量不能相差太大。
⑤ 碱基要随机分布。引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互
补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性
⑧ 引物5′端可以修饰。引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。
⑨ 引物3′端不可修饰。引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。
⑩ 引物3′端要避开MM子的第3位。如扩增编码区域，引物3′端不要终止于MM子的第3位，因MM子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数
商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在
这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据经验，自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。故认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”
进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。
确定引物的另外一种方法（自我体会）：
1.查找与研究主题的相关的文章（最好权威杂志），找到使用的引物序列
2.验证引物的优劣：a.在pubmed上blast，同时找到基因序列，RNA，DNA，cDNA，CCD，在blast的基础上自己一个一个碱基核对（引物最好跨越外显子和内含子）；b.还可进一步在引物设计软件上评分，意义有限，低分的也可进行的很好。
3.去合成就行啦（心中有数）
转贴
引物延伸实验问题与解答
1)什么是引物延伸实验？
引物延伸实验用于定量mRNA的量，测定低丰度的mRNA的种类。另外引物延伸实验可标定转录产物的5`-端，确定转录的精确起始。特异的末端标记的引物退火到RNA链的互补区域，随后用RNA作为模板，用反转录酶延伸引物得到cDNA，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析cDNA。cDNA的长度为引物的标记的核苷酸到RNA-5`末端间的碱基数，所得cDNA的量和目的RNA 的起始量成正比。理想的引物是ssDNA, 长度为20-40个核苷酸，与要分析的转录产物的5`末端区域互补。延伸产物小于150个核苷酸，可得到最佳分离效果。引物延伸实验非常灵敏，可检测2pg的转录产物，这相当于1个细胞中的1个RNA。引物延伸实验非常适合于对单个基因作定量和定性分析。
2)作这样一个实验必须用什么试剂？
引物延伸实验需要模板RNA，可用总RNA或poly(A)+RNA。一个特异的末端标记的核苷酸或DNA片段作为引物，用反转录酶合成cDNA。除RNA模板和标记的引物，还需要反转录酶，AMV 或MMLV反转录酶、反应溶液、脱氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝胶试剂，和电泳装置。所得结果用放射自显影和磷成像仪分析。
3)引物延伸系统中有些什么组分？
引物延伸系统中AMV反转录酶和反应溶液、焦磷酸钠、正对照RNA模版和对照引物、去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 标准分子参照物、T4多核苷酸激酶和溶液、样品溶液、AMV 反转录酶 2X溶液 100mMTris-HCl（pH8.3, 42oC）、100mM KCl、 20mMMgCl2、20mMDTT、2mM每一种dNTP、1mM精胺。PhiX174标准分子参照物和T4 多核苷酸激酶用作引物标记，和确定延伸产物长度的标准。对照RNA可得到87个碱基的延伸产物作为正对照。参照技术手册TB113查阅引物延伸系统和AMV反转录酶的其它信息。
4)反应中用焦磷酸钠的目的是什么？
引物延伸反应中用焦磷酸钠和精胺可增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。虽然其作用方式未确定，但结果是增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。MMLV 被焦磷酸钠和精胺抑制，如使用MMLV，放线菌素D可用于增加全长cDNA的得率，抑制模板RNA产生发卡结构。焦磷酸钠和放线菌素D抑制cDNA第二条链的合成。
5)为成功进行引物延伸实验需对哪些因素作优化？
引物延伸实验中所用的杂交温度是最关键的需优化的因素。一般而言，最高紧密度，或引物和互补序列完全杂交所需的最适条件是，低于引物溶解温度的5oC。低于最高紧密度的温度可极大地增加杂交速度。应在不同的紧密度的杂交温度下作杂交，以控制引物和特异RNA 的杂交。增加杂交紧密度时，带来的延伸产物的丢失表明，引物和相关的却不是等同的转录产物杂交。在碱和双价阴离子的存在下，RNA在较高温度会降解，应用甲酰胺杂交操作方案，这可有效降低溶解温度，因此可使杂交在较低的温度进行。可在杂交步骤中用以下的溶液：40mMPIPES、1mMEDTA、0.4mM NaCl、80%的甲酰胺。如用这个杂交溶液，延伸步骤前甲酰胺和盐需用乙醇沉淀后除去。
模板RNA和引物的量需优化。以下讨论了所用RNA模板和引物的起始量。反转录酶对不同模板使用的效率不同。这部分是由于RNA中存在的次级结构干扰反转录酶的聚合酶活力。如产生短的产物，这通常不是一个问题。如用AMV反转录酶，延伸温度可达55oC。
6)每次反应所用RNA的量是多少？
每次反应所用RNA和引物的量取决于分析的RNA的种类（总RNA或poly(A)+RNA）,目的RNA 的相对丰度。如用总RNA，起始量为10ug，但分析稀有信号，每次反应用100 ugRNA。poly(A)+RNA每次反应用0.1-1.0 ug，具体决定于总RNA中poly(A)+RNA的富含量，需分析的特异RNA的浓度。在引物延伸分析前需检查目的RNA的完整。通过凝胶分析总RNA，应有完整的18S和28S核糖体RNA带。在引物延伸反应中用Northern印迹和RT-PCR分析来确定特定RNA的存在。
7)每次反应所用引物的量是多少？
用引物延伸实验定量RNA，标记的引物必须多于目的RNA。引物应是互补RNA的5-10倍。但一般，总RNA或poly(A)+RNA中，特定目的RNA量未知。对未分析的转录物，初次分析用50 ug总RNA和100fmol引物。如所有RNA中与引物互补的位点饱和，测试信号和投入的RNA 的量成正比，而不依赖于引物的浓度。引物应至少为20个核苷酸，杂交位点应位于转录产物5`-末端下游的100个碱基处，而不会自互补。也可用从限制性酶切片段所得的ssDNA作为探针，长度应不长于50-100个核苷酸，以获得最佳分辨率。
8)用AMV和MMLV各有哪些优点和缺点？
引物延伸反应通常用AMV，AMV性能更好，对次级结构耐受。用AMV的延伸温度可达55oC, 以消除次级结构，但在这样温度下，引物延伸反应的得率通常降低。MMLV的最适温度为37 oC，在更高温度下，MMLV不稳定，但MMLV可合成更长的产物，这一特点对引物延伸反应不适用，因引物延伸反应所得的产物一般较短，为100-500个核苷酸。
9)有哪些因子会导致非特异，短的和多个引物延伸产物？
所研究的转录的差异程度可导致产生不同长度的延伸产物，它们来源于选择式剪切和使用不
同的转录起始位点。差异核RNA的存在也能导致产生多个延伸产物。引物和RNA中相关或无关序列的交叉杂交也会导致非特异延伸产物的产生。产物短于预测可能和RNA模板的降解有关，或者是转录产物中次级结构阻制了反转录酶的合成，产生断缺的cDNA。RNA样品中存在DNA污染同样可得延伸产物，加放线菌素D（75ug/ml）可抑制这类产物的产生。应作无RNA 模板的负对照实验，以确定所用试剂中无RNA和DNA污染。同时还应用从不表达目的转录产物的细胞或组织中提取的RNA模板作负对照实验。
10)如何计算RNA转化为cDNA的量？
RNA转化为cDNA的量可对引物延伸产物，和`无RNA`对照实验的cpm作测量得到。从凝胶中分别切割引物延伸产物和`无RNA`对照实验中产物，在闪烁液中测定凝胶块的读数，可有效平衡聚丙烯酰胺凝胶的湮灭和32P的衰退。
以下的例子表明如何计算fmol的RNA转化为cDNA，在这个例子中，一半的引物延伸产物（20ul/40ul）加入凝胶中作分析。`无RNA`对照实验的引物浓度为100 fmol，一半的反应液加入凝胶中作分析。切割的带的读数为：
样品为3912 cpm
引物为142359 cpm
首先计算引物cpm/ fmol：cpm/ fmol=142359 cpm/[100 fmolX（20/40）]=2847 cpm/ fmol
接下来计算引物延伸产物的fmol，或cDNA：3912 cpm/[2847 fmolX（20/40）]=2.75 fmol cDNA。所得值表明引物延伸中所得的cDNA的量。
11)用什么分子标准参照物确定引物延伸产物的精确长度？
为确定引物延伸产物的精确长度，应同同位素标记的DNA分子标准参照物对照。DNA分子标准参照物末端作了标记，上变性凝胶前先作变性，引物延伸产物也作变性。长度在20-500核苷酸范围的分子标准参照物在确定引物延伸产物的长度方面很有用。去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 标准分子参照物非常方便，已去磷酸，可作5`末端标记，分子标准参照物的长度为24-726核苷酸。
12)能用测序胶分离引物延伸产物吗？
用于引物延伸产物分离的聚丙烯凝胶的规格为16X18cm, 含8%聚丙烯、7M尿素、1′TBE溶液。这种胶和测序胶很相似，故一般可用测序胶。应注意不使引物延伸产物和自由引物跑到胶外，特别是需对cDNA定量时。
有关文献：
1. Krug, MS, and Berger SL (1987) Meth Enzymol 152, 316
1. Boorstein WR and Craig EA (1989) Meth Enzymol 180, 347
3. Sambrook J Freitsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York
4. Freeman W M, Vrana SL, and Vrana KE (1996) Biotechniques 20, 782
作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能：如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。
一，普通引物对的搜索：
以Mouse 4E（cDNA序列）为例。我们的目的是以Mouse 4E（2361 bp）为模板，设计一对引物来扩增出600－800bp长的PCR产物。
1，点击“Search“菜单中的”For Primers and Probes“命令，进入引物搜索对话框；2，由于我们要设计的是一对PCR引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上Compatible pairs。
在Oligo默认的状态下，对此引物对的要求有：a，无二聚体；b，3’端高度特异，GC含量有限定，d，去除错误引发引物等。
3，剩下的工作是确定上、下游引物的位置及PCR产物的长度以及引物设计参数。
①单击：“search Ranges”按钮，弹出“Search Ranges”对话框。输入上游引物的范围：1－2000，下游引物的位置：100－2300；PCR产物的长度600－800bp。
②单击“Paramaters”按钮进入“Search Parameters”对话框，对话框种分三个活页，分别是：不同设定，参数以及更多参数。
③在“普通设定”窗口，为我们提供了对引物非常直观的设定方法，从高到低分六个等级，最后还有一个用户定制选项。
④当我们对引物的各种参数的含义及应该设定多大值并不是特别清楚时，就可以直接设定Very high/High等来完成对引物设计参数的设定。
⑤当我们选中“Automatically Change String”后，Oligo会在引物搜索过程中：如果在高等级设定中无法找到引物对时自动降低一个定级来进行搜索，知道找到引物对。在设计反向PCR引物对时，就选中“Inverse PCR”复选框。
⑥我们还可以让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE？（Prime Effitions，引发效率）。也可以限定所选引物对的最大数目。
⑦在“Parameters”窗口中，实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据试验的要求作相应的改变，如23nt。其他参数就使用Oligo的默认值，一般无需改变。在“More Parameters“窗口中，一般也无需作任何改变，直接用Oligo的默认值。
4，点击“确认”－“Ok”进入搜索窗口，再次单击“OK”后，Oligo自动完成引物对的搜索，并出现一个搜索结果窗口。显示出得到的引物对数目。
5，点击“Ok”，出现“PrimerPairs”窗口，在窗口中列出了7对引物的简单信息，引物位置，产物长度，最佳退火温度及GC含量。单击“Sort”按钮，可以按产物长度，最佳退火温度及GC含量从小到大或从大到小的顺序排列。
6，点击任意一对引物，在旁边马上弹出一个叫“PCR”的窗口，在窗口中我们可以看到这对
引物在模板中的大概位置，最佳退火温度（该温度可以直接应用于我们实际PCR中的第二步退火）。另外还有引物的Tm值，GC含量，引发效率，同时还计算出了产物的Tm值于引物Tm值的差异以及引物间Tm值的差异。一般我们尽量保持前者在20度以内，后者在5－6度以内。点击不同的引物对时，PCR窗口内容同时作相应的改变。
7，要想了解引物的详细信息，如二聚体，发卡结构形成情况、组成、Tm值和错误引发位点等，这时只需点击“Analyze”菜单中的相应命令，就可以分别得到相关信息。例如点击“Duplex Formation”，我们就可以得到上游引物间，下游引物间及上下游引物间形成二聚体的情况。同理，“Hairpin Formation”，“Composition and Tm”，“False Priming Sites”等命令就可以显示出相关信息。所有这些分析的结果都有助于我们从Oligo搜索得到的多对引物中选择最佳的引物对。
需要说明的是，1，如果一次搜索得到的引物对太多时，我们可以适当提高选定的条件和规定更合适的搜索范围来减少引物对数；2，引物一般尽量不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体，同时二聚体的自有能绝对值尽量小于10；3，对于错误引发，在普通PCR中，如果引发效率在160 points以上时，就可能出现杂带，在测序反应中，错误引发效率则应该严格控制在120 points以下。
8，Oligo中每对引物的详细信息可以直接导出为一个文本文件：
首先点击“File”菜单中的“Print/Save Options”，在出现的对话框中的普通设定选中“Selected”；在“Analyze I”中选择需要保存的信息，在“Analyze II”中选中PCR。单击确定按钮退出，这时再次点击“File”菜单，Save浮动命令中的“Data Save as”，选择路径及文件名即可。
二，测序引物的设计：
在oligo中，测序引物设计过程与普通引物设计大部分都很相似。
还是以Mouse 4E为例，假如我们要在600－800bp的位置设计一条测序引物。
Open－Search
在“Search”窗口中，选中“Sequece Primer”，同时去除负链Search的选中
在“Search Range”窗口，输入正链的600－800bp
在“Parameters”中选定 very high ，引物长度改为18bp
结果得到11条测序引物，与普通引物同理，根据其详细信息就可以挑选到一条最佳的测序引物。
三，探针的设计：
探针的设计与测序引物设计基本相同，只需使“Search”窗口的探针设计选中，改变探针的长度就可以。
四，评估引物对：
我们在各种文献中查到的引物，如果直接进行PCR，往往很难重复别人的实验结果。这时就想到，是不是引物的质量有问题？能不能用软件来对这些问题引物进行一些分析呢？答案时肯定的。
1，点击File菜单中的New命令；
2，在“Edit New Sequence”的窗口中用键盘输入上游引物；
3，如果该引物的首位置不是1的话，可以在“Edit”窗口中输入新的5’端位置数字，如
20；
4，点击Accept/Discard菜单的Accept命令；
5，如果引物序列长度不同于当前的引物的话，可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度；
6，选取当前序列为上游引物（点击“upper”按钮）；
7，从Edit菜单中选取“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列；8，在Edit窗口的上角处，输入相应的5’位置；
9，选取“Accept and Quit”命令；
如果想让程序给出最佳退火温度，在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所占百分比，一般哺乳动物的cDNA序列中GC大约占44％。
10，点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。
我要做的一个基因大约2.5K长的蛋白,引物长24bp,各项指标都符合设计要求,但不论Tm如何变,效果非常差,我在实验过程中,也碰到过G+C大于80%的蛋白,只有手动设计,但效果不好,还真不知道有啥好办法,各位老大能否给点建议.
关于引物设计，谈一点自己的经验：
１引物的保守性与特异性：可以先登陆NCBI,找出要扩增基因的保守区,并在此区域内设计引物;引物的3'端十几个碱基一定要严格配对
2 分析一下引物的Tm值及GC含量:可以用DNA star等软件帮助分析, 引物二聚体不能太牢固,引物自身不要配对厉害
3 另外,需要注意的是引物3'端不要以A结尾
纯属个人经验：
本人自己设计的不超过50对，但帮别人设计不下100对。只是简单谈谈自己的看法。
1、选择自己熟悉的软件，primer3，5；或者DNAstar等等，根据特殊情况可能需要其他的特有软件。
2、避免产生引物自己配对和引物2聚体，最好不要有连续3个以上的碱基配对，尤其是g、c。
4、对于指定位置，即锁定末端引物时可适当放宽条件，不过需要在pcr过程中摸条件啦。
5、软件生成的引物进行电子pcr UCSC 或ncbi都可以。个人比较喜欢ucsc。
6、实际上一般设计的引物都可以批出，后期摸条件很重要，这里就不详细讲了，一般touchdown 或剃度PCR都很不错。
PCR原理引物设计载体
现代生物技术包括基因工程,蛋白质工程,细胞工程,酶工程和发酵工程等五大工程技术.其中基因工程技术是现代生物技术的核心技术.基因工程的核心技术是DNA的重组技术,也就是基因克隆技术.重组,顾名思义,就是重新组合,即利用供体生物的遗传物质,或人工合成的基因,经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子,然后在将
重组DNA分子导入到受体细胞中.在我们实验室就是构建到表达载体中,由抗原组生产融和蛋白.这一讲的内容分为CR原理引物设计载体选择
一,PCR技术的基本原理
类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的
寡核苷酸引物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
引物的延伸NA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的"半保留复制链",而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需2～4分钟,2～3小时就能将待扩增的目的基因扩增放大几百万倍.(Plateau). 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝.
Pcr体系:Taq酶,dNTP,Primer,Template,buffer.
Pcr程序:94℃ 2min; (94℃ 1min,55℃1min,72℃ 2min) ×25; 72℃ 5min
二,PCR扩增产物
可分为长产物片段和短产物片段两部分.短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间,是需要扩增的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3'端开始延伸,其5'端是固定的,3' 端则没有固定的止点,长短不一,这就是"长产物片段".进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即 "长产物片段")结合.引物在与新链结时,由于新链模板的5'端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内,形成长短一致的"短产物片段".不难看出"短产物片段"是按指数倍数增加,而"长产物片段"几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析. 三,引物设计
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段,使其能有效地扩增模板DNA序列. 合适的区段: 1同源性抗体检测时条带的单一性;
2亲水性抗原的水溶性;
3抗原性刺激动物产生抗体的强弱;
4编码区同框正确编码目的蛋白.
引物确定以后,可以对引物进行必要的修饰,例如可以在引物的5′端加酶切位点序列;标记生物素,荧光素,地高辛等,这对扩增的特异性影响不大.但3′端绝对不能进行任何修饰,因
Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 最后说一句，敢于尝试就会成功。 第二贴 －－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。 －－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 －－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 －－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 －－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。 －－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。 谈一下我学这个引物设计的过程吧：
设计师出设计方案注意事项： 1、设计师接单：必须了解业主的装修设计风格意向,业主居住人口、性别、年龄、 空间布局需求，同时记录，以备忙时忘记查看或因需要转交其他设计师时所需。必须要有业主的联系方式，多向业主或业务营销人员索取客户详细资料与交流的信息，确保设计方案与业主需求相近，便于下次会面与谈单的沟通，缩短洽谈时效，提高工作效率。 2、接到业务单子，首先了解：房屋结构，墙体是否可动，（不建议改动承重墙， 或明令禁止的部位）。如确需改动结构应先向业主详细说明，我们可代为操作或协助操作，施工合同与预算中不得体现出来，费用应另外支付，如万一有事，我们可出面代为调解，责任与费用应由甲方自负。 3、注意房屋内的梁、柱、层高、窗台高度的结构，进出水管道位置，，排污出口， 油烟机、换气风管出口，煤气管道，空调内外机摆放位置，是否需要安装新风系统、地热、中央空调、太阳能热水器、锅炉、电热水器、燃气热水器，是否需要安装监控、智能配电、纯净水净化器。 4、平面布局，日常用品，家具摆放，家电位置，开关插座，常规使用，特殊要 求，把业主的家结合业主的要求综合自己的设计思路，当做自己的家来设计布局。 5、公司承诺：接到户型图48小时内，设计师应出1-3套平面方案，认为最满意 的一套方案出顶面，为方便与业主见面谈单，也体现我们公司员工的认真、负责的态度与工作的效率。第一次见面要主动递上名片与公司简介资料。去洽谈见面，千万别忘记带上设计协议，永远记住，卖不出去的图纸，叫废纸。 6、洽谈方案如果满意，深入洽谈立面效果，色彩搭配，诚挚要求业主签约设计 协议，预交设计订金。（注：如有能力收设计费最好收进，设计费按公司规定比例分成） 7、立面布局，应结合实际，家具常规尺寸图，顶部标高尺寸图、侧视图、俯视 图、接点图，如有特殊要求，应在图纸上注明，水路管道也应画出走向图。 公司规定给水管全部走顶面或墙面，禁止地面施工，预算内必须有防水处理项目，以防漏水现象发生。 8、强弱电布置应合理到位，有线电视线旁应放置网络线，客厅考虑音响线。电 脑桌旁应安置电话线，注明强弱电禁止走同一管道，壁挂电视应放置隐墙穿线孔?50-?75两根，靠近窗帘部位尽量少放插座，防止用电打火花引起火灾。 9、木制作造型设计尽量简洁明快，现代感强，整体方安尽量考虑空气对流，通 风采光到位，色彩搭配协调一致，背景墙纸柔和，耐人寻味，品位无穷，多做亮点，争取把作品体现到最佳状态。 10、设计制作完毕，别忘记把图纸设计制作说明打印出来，与客户签定合同 后，千万别忘记给施工人员做开工前交底，并做好交底确认记录，开工放样，以防止施工中途出现大量更改图纸。开工后应多跑工地，公司规定每套工地应不低于七次到场验收与察看。多了解施工工艺与制作用材及方法，为下一次谈单作更好的准备。请记住有备无患；一分耕耘，一分收获，付出了就有回报。服务好每一位业主是我们神圣的职责，努力让我们的每一位顾客享受到服务，使用了我们的产品，脸上都露出真挚微笑。 杭州艺创装饰工程有限公司 2006年10月16日
mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能
安规设计注意事项 1.零件选用 (1)在零件选用方面,要求掌握: a .安规零件有哪些?(见三.安规零件介绍) b.安规零件要求 安规零件的要求就是要取得安规机构的认证或是符合相关安规标准; c.安规零件额定值 任何零件均必须依MANUFACTURE规定的额定值使用; I 额定电压; II 额定电流; III 温度额定值; (2). 零件的温升限制 a. 一般电子零件: 依零件规格之额定温度值,决定其温度上限 b. 线圈类: 依其绝缘系统耐温决定 Class A ΔT≦75℃ Class E ΔT≦90℃ Class B ΔT≦95℃ Class F ΔT≦115℃ Class H ΔT≦140℃ c. 人造橡胶或PVC被覆之线材及电源线类: 有标示耐温值T者ΔT≦(T-25)℃ 无标示耐温值T者ΔT≦50℃ d. Bobbin类: 无一定值,但须做125℃球压测试; e. 端子类: ΔT≦60℃ f. 温升限值 I. 如果有规定待测物的耐温值(Tmax),则: ΔT≦Tmax-Tmra II. 如果有规定待测物的温升限值(ΔTmax),则: ΔT≦ΔTmax+25-Tmra 其中Tmra=制造商所规定的设备允许操作室温或是25℃ (3).使用耐然零件: a.PCB: V-1以上; b.FBT, CRT, YOKE :V-2以上; c.WIRING HARNESS:V-2以上; d.CORD ANONORAGE: HB以上; e.其它所有零件: V-2以上或HF-2以上; f.例外情形: 下述零件与电子零件(限会在失误状况下,因温度过高而引燃的电子零件)若相隔
13mm以上,或是相互间以至少V-1等级之障碍物隔开,则其耐燃等级要求如下: I.小型的齿轮,凸轮,皮带,轴承及其它小零件,不须防火证明; II.空气载液的导管,粉状物容器及发泡塑料零件,防火等级为HB以上或HBF以上 g.下述件不须防火证明: I.胶带; II.已获认证零件; III.密封于无开孔且体积小于0.06m 金属壳之零件; IV.仪表壳,仪表面,指示灯或宝石,置于至少V-1等级的PCB上的IC,晶体管,光耦合器及其它小零件的外壳. 2.整体配置 (1)安全距离(沿面距离和空间距离) 如果知道了工作电压及绝缘等级,就可决定所需之安全距离. 表一: 绝缘等级及各式绝缘适用情形
自建房随想1 一、关于大门 “开门不宜见的三种景象 1、大门如果正对着向下的楼梯，在堪舆学是“败财局”的一种，也是由“以水为财”的传统理念引伸而来的，因为假如屋前有水运气就会顺势流走，所以最简单的化解方法就是在门口放一盆大叶的土养植物，用此避免“水”的流失。” （从这点上说目前看过的大部门自建房的大门与楼梯设置显然都没有考虑到这一点（入门对着上下夹层的楼梯），切记避免） 上图为一户别墅的楼梯设计，利用房间的面宽优势，巧妙将房屋大门与上行楼梯错开“2、大门如果正对走廊或通道，堪舆上称其形“如利剑穿心”所以有不吉之论，结合环境角度说，人从走廊经过所产生的急促气流、沙尘、噪声会从正对走道的大门“直冲”入屋，确实
对家居环境造成一定的影响，传统的化解方式为在门下加上门槛或在屋内正对着大门的位置设一玄关。 3、大门如正对电梯，住宅的气场会在梯口不断开闭之际，被其分流吸散，所以从堪舆学角度说本来作为聚气、养气之所的住宅如果与电梯直对，会导致家人运反复入门宜见及不宜见的景象 1、入门三宜见： （1）开门见绿，即一开门就见到绿色植物，生趣盎然，又可收养眼目之功效。（2）开门见红，也叫开门见喜，即一开门就见到红色的墙壁或装饰品，入屋放眼则觉喜气洋洋（3）开门见画，一来可体现屋主的涵养，二则可缓和进门后的仓促感。 2、入门三不宜见： （1）开门见厕，污秽之气扑面而至，无论从环境学或卫生角度都不适宜。（2）开门见灶，古代学中有“开门见灶，钱财多耗”之说，先不论钱财问题，入门见到厨房，灶中热火气会迎面而至，首先不利健康。（3）开门见镜，由于镜子有折射作用，会令进门者因折射光线带来心理及视线不适。 3、大门三大忌讳：（1）大门正对阳台或窗，引用前文观点，就是达不到“藏风聚气”的效果，可通过设置玄关及挂布帘缓解这点不足。（2）横梁压门，如一进门即受压制，在堪舆理念上主家中人丁无法抬头做人，终生仰人鼻息，最常用的化解方法是在梁下两端挂“蝠鼠金钱”（蝙蝠口衔古钱的一种吉祥物摆设）（3）大门做成拱形门，则状若墓碑，会对年长者的心理产生负面阴影。” 二.关于客厅 一般客人进到房间第一眼看到的就是客厅，客厅是门面，除了大门之外，客厅就是客人直接面
倒勾处理(滑块) 一?斜撑销块的动作原理及设计要点 是利用成型的开模动作用，使斜撑梢与滑块产生相对运动趋势，使滑块沿开模方向及水平方向的两种运动形式，使之脱离倒勾。如下图所示： 上图中： β=α+2°～3°(防止合模产生干涉以及开模减少磨擦) α≦25°(α为斜撑销倾斜角度) L=1.5D (L为配合长度)
S=T+2～3mm(S为滑块需要水平运动距离；T为成品倒勾) S=(L1xsina-δ)/cosα(δ为斜撑梢与滑块间的间隙,一般为0.5MM； L1为斜撑梢在滑块的垂直距离) 二?斜撑梢锁紧方式及使用场合 简图说明 适宜用在模板较薄且上固定 板与母模板不分开的情况下配 合面较长，稳定较好
适宜用在模板厚、模具空间大 的情况下且两板模、三板板均 可使用 配合面L≧1.5D(D为斜撑销直径) 稳定性较好 适宜用在模板较厚的情况下 且两板模、三板板均可使用， 配合面L≧1.5D(D为斜撑销直径) 稳定性不好,加工困难. 适宜用在模板较薄且上固定板 与母模板可分开的情况下 配合面较长，稳定较好 三?拔块动作原理及设计要点 是利用成型机的开模动作，使拔块与滑块产生相对运动趋势，拨动面B拨动滑块使滑块沿开模方向及水平方向的两种运动形式，使之脱离倒勾。 如下图所示：
上图中： β=α≦25°(α为拔块倾斜角度) H1≧1.5W (H1为配合长度) S=T+2～3mm (S为滑块需要水平运动距离；T为成品倒勾) S=H*sinα-δ/cosα (δ为斜撑梢与滑块间的间隙,一般为0.5MM； H为拔块在滑块的垂直距离) C为止动面，所以拨块形式一般不须装止动块。(不能有间隙)
引物设计 首先引物与模板的序列要紧密互补， 其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构， 再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 (22)bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，如GGG或CCC，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同 的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 非配对结构最好出现在引物中间。 另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，3’端尽量不含互补碱基。 5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。 上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。 Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱 基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5kcal/mol）易导致产 生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
豪宅户型设计要求 600-800平米：空中四合院 ●层高不低于3.6米，体现顶级豪宅的空间尺度。 ●一层一户设计，位于单层面积400平米以上楼座的顶层，设计时结合不同楼 座平面的面宽和进深尺寸，合理设计户型。 ●采用两层设计，采用内院式空间组织方式，打造中式社交府邸。 ●要求首层体现礼仪会客功能： ?以围合式院落打造传统中式和院空间，四周围合设计建筑，中间为主庭院空间，通过边庭院的设计保证每一个居室空间采光均好； ?采用三进式入户空间设计，从前院-中庭-室内构成完整的入户序列，同时，入户空间通过影壁的设计进一步增强私密和尊贵的入户观感； ?主要功能空间需要有中西双厨、双餐厅，南向中堂超大会客厅，书房、小型会客室等多重接待空间，中心庭院要求尽量方正，面积达到100平米以上； ?如空间允许，建议考虑私家小泳池； ?考虑首层地面覆土深度，尽量实现可在中心庭院及边庭院中种植小乔木。 ●要求二层设计为休息功能： ?主人休息区与客房区相对分离； ?在庭院上空设计“回”形游廊，起到连接各个居室的作用，同时保证每个空间都可做到一步观景；
?要求设计四间以上卧室，且均为套房设计； ?主卧采用双套房设计，满足男女主人不同作息时间的生活起居，套房内包含全明卫生间和可步入式衣帽间； ?顶部设计采用全封闭的天幕，实现有天有地的传统人居模式。 500-600平米：云顶别墅 ●层高不低于3.6米，体现顶级豪宅的空间尺度。 ●一层一户设计，位于300平米以上产品的顶层，设计时结合不同楼座平面的 面宽和进深尺寸，合理设计户型。 ●采用两层式设计，实现功能分层，营造别墅级居住感受。 ●要求实现极致的大面宽、短进深设计，实现舒适度升级。 ●要求首层设计为接待及客房居住空间： ?入户花园式设计，增加入户空间的情趣； ?超大客厅，预留充足的接待空间，可直接进入空中花园； ?分别设计中西双厨及独立双餐厅，并连接开敞式阳台； ?要求至少设计两间客房，采用套房式设计，具备独立的卫生间及衣帽间； ?首层考虑工人卧室与生活阳台一体化设计，由公共电梯直接进入，最大化避免工人工作对主人生活的影响。 ●二层为主人居住空间及私家会所空间： ?主卧采用双套房设计，满足男女主人不同作息时间的生活起居，套房内包含全明卫生间和可步入式衣帽间； ?设计家庭厅，可用于影音室、茶室等多功能空间，可供家人休息娱乐，注
1、鞋柜的隔板不要做到头，留一点空间好让鞋子的灰能漏到最底层，水槽和燃气灶上方装灯。定卫生间地漏的位置时一定要先想好，量好尺寸。地漏最好位于砖的一边，如果在砖的中间位置的话，无论砖怎么样倾斜，地漏都不会是最低点。 2、卫生间，空调插座均未设计开关。特别是卫生间电热水器，以一双级开关带一插为宜。如要关去电热，拔插头有危险 3、关于面砖阳角部分的处理方法，归根到底是看工人的水平。如果泥水工工人水平不错，而且磨瓷砖的工具比较好的话，就应该毫不犹豫的选择磨45度角的做法。从效果上来看，只要磨的好，磨45度角的阳角做法，是最漂亮的！如果工人的水平确实不怎么样，那么你还是选择用阳角条吧，因为磨的不好的45度角做法还不如用阳角条的效果。 4、排好水管后的水管加压测试也是非常重要的。测试时，大家一定要在场，而且测试时间至少在30分钟以上，条件许可的，最好一个小时。10公斤加压，最后没有任何减少方可测试通过。 5、塑钢门的时候一定要算好塑钢门门框凸出墙壁的尺寸，知会安装人员，使得最后门框和贴完瓷片的墙壁是平的，这样既美观，又好做卫生。 6、木工的包门套和泥工的贴瓷砖也是要配合的，包门套的时候，要考虑下面的地面（门的两边地面的任何一面）是否还要贴瓷砖或者其他水泥砂浆找平的事情，因为门套如果在贴瓷片前钉好，一直包到地面，将来用水泥的时候，如果水泥和门套沾上了，就会导致门套木材吸水发霉 7、床垫下方和床板一定要透气。床板一般用杉木板最好 8、做油漆尽量多用纸胶带 9、买灯具要注意：一般尽量选用玻璃、不锈钢、铜或者木制（架子）的，一般不要买什么铁上面镀什么其他镀层啊、什么漆啊之类的，容易掉色。 10、脸盆尽量用陶瓷盆，玻璃盆难搞卫生 11、水电改造要自己计划好，要求他们按直线来开曹。自己看着他们画线，全按画的线开曹。每一项都要自己验收才行。 12、防水一定要做好，一定要试水！ 13、很多施工中口头上的协议成了结帐时被宰的缺口,一定要写成白纸黑字，增减的项目都一定要把价格问清，写出来! 14、地面如果装地板，地面均要重新做水泥层重新抹平。 15、厨房门，还是要装修的木工做木制的吊轨门为好。 16、客厅里尽量多地装电源插头。 17、洗手间的淋浴外还是要做隔断。不能图省事拉一个浴帘了事，实际很不方便，水流满地。 18、做门与门框的材料要选木纹细致的材料。 19、在安装橱柜前一定要确认你家的水路是否OK。 20、厨卫地砖一定别挑白色。 21、天花板要特别注意抹平腻子后才能抹多乐士 22、客厅灯光盏数不宜过多，简洁为好，否则象灯具店！ 23、买那些需要安装的东西尽量要求卖货的安装，实在不包安装，也一定要坚持安装完后才付完全款！！ 24、装修期间，把你以前所收集到的厂家商家的名片随身带着 25、铝扣板的保护膜最好在装之前就去掉。 26、鞋柜最好用百叶门，防臭。鞋柜边可以留一个插座，用来插烘鞋。 27、切菜的地方可以安个小灯。 28、方便的话餐厅也可以安排气扇，这样吃火锅或做烧烤时就不会弄脏厅屋的天花板。 29、门口最好安排一个放杂物的柜子，可以放在鞋柜的上面。把常用的东西，如伞，包，剪刀，零钱，常吃的药等等放在那里，这样就很方便了。
方案阶段 1.建设场地不能选在危险地段。 由于结构设计在建设场地的选择中一般是被动的接受方，因此，在结构方案及初步设计阶段，应特别注重对建设场地的再判别。对不利地段，应根据不利程度采取相应的技术措施，相关节。规定见《抗规》4.32.山地建筑尤其需要注意总平布置。 《抗规》第 3.3.5条规定: 山区建筑场地应根据地质、地形条件和使用要求, 因地制宜设置符合抗震设防要求的边坡工程; 边坡附近的建筑基础应进行抗震稳定性设计。建筑基础与土质、强风化岩质边坡应留有足够的距离, 其值应根据抗震设防烈度的高低确定, 并采取措施避免地震时地基基础破坏。 《抗规》第4.1.8 条规定: 当需要在条状突出的山嘴、高耸孤立的山丘、非岩石的陡坡、河岸和边坡边缘等不利地段建造丙类及丙类以上建筑时,除保证其在地震作用下的稳定性外, 尚应估计不利地段对设计地震动参数可能产生的放大作用, 其地震影响系数最大值应乘以增大 系数。其值可根据不利地段的具体情况确定, 在1.1~1.6 范围内采用。 此条为强条; 台地边缘建筑地震力放大系数也意味着单体建筑成本的增加。实际上, 有时边坡支护的费用可能远远大于边坡上单体的费用。曾经有的方案设计单位布置总平时将18~33层的高层布置在悬崖边缘或跨越十多米高的边坡, 这些都是对结构及地质不了解才会产生的错误。3.是否有地下室。 高层建筑宜设地下室；对无地下室的高层建筑，应满足规范对埋置深度的要求。4.高度问题房屋高度有没有超限。房屋高度是多少，室内外高差是多少， 5.结构高宽比问题 《高规》3.3.2条规定，6、7度抗震设防烈度时，框架-剪力墙结构、剪力墙结构高宽比不宜超过6。高宽比控制的目的在于对高层建筑结构刚度、整体稳定、承载能力和经济合理性（主要影响结构设计的经济性，对超高层建筑，当高宽比大于7时，结构设计难度大，费用高）的宏观控制。6.结构设计应与建筑师密切合作优化建筑设计和结构布置。 采取必要的结构和施工措施尽量避免设置各类结构缝（伸缩缝、沉降缝、防震缝）。当必须设置时，应符合现行规范有关缝的要求，并根据建筑使用要求、结构平面和竖向布置的情况、震要求等条件、综合考虑后地基情况、基础类型、结构刚度以及荷载、作用的差异、 抗 . . . . 确定。 各缝宜合并布置，并应按规范的规定采取可靠的构造措施和保证必要的缝宽，防止地震时发生碰撞导致破坏。结构长度大于规范时, 应设置伸缩缝, 高层建筑结构伸缩缝的最大间距: 。45m剪力墙结构为框架结构为55m, 7.结构平面布置不规则问题 《抗规》：1）扭转不规则，规定水平力作用下位移比大于1.2；2）凹凸不规则，平面凹进的尺寸，大于相应投影方向总尺寸的30%；3）楼板局部不连续，楼板的尺寸和平面刚度急剧变化，例如，有效楼板宽度小于该层楼板典型宽度的50%或开洞面积大于该层楼面面积的，或较大的楼层错层。30%8.《高规》限制结构长宽比 结构长宽比6、7度不应大于6。限制长宽比，其目的就是要在结构设计中控制长矩形平面的使用，当平面的长宽比大于3时，虽然未超过规范规定的限值，但已对抗侧力构件（如剪力墙等）的设置及楼盖结构的整体性提出了较高要求（见《抗规》6.1.6条及《高规》8.1.8条等）。框架抗-震墙及板柱-抗震墙结构以及框支层中，楼板的整体性对结构的协同工作影响很大，结构设计时应特别注意加强楼板的整体性及面内刚度。9.《高规》3.4.3条规定，不宜采用角部重叠的平面图形或细腰形平面图形。
住宅户型设计要点 住宅户型设计要点 第一部分：住宅户型设计一般注意的几个问题1、户型需求户型需求是运动的，它随着市场的变化而变化。其中包括： ○目前的户型需求多样化，市场上并无绝对的主尊户型。 ○户型的需求随时间、区域而变化。 ○户型需求的多样化源自市场消费层次的多样化：比如作为移民城市的深圳，人口来自全国各地，多种地域文化形成撞击，不同地域、不同文化层次的消费构成了不同的需求层次，消费心理难以一一把握，销售难度往往集中于如何将不同需求导向某个需求目标。而在黄石，购房群体只要是在本城区，文化层次较集中，消费习惯易于把握。 ○购买群年轻化，购房者年龄大都在25—45岁之间，年轻化使需求呈现复杂的个性化。 ○潜在的够房者绝大部分为“非常人口”——有限的收入使其难以实现近期购房的年轻者，其置业计划必然是远期的，并且购房很难把握，也许会选择过度性的小面积户型，也许
会一步到位，选择较大面积的户型。还有一种就是有固定住房，追求自在新潮的生活，经济实力强的上班族，其购买心理也是不确定性，因为其购房主要目的调节生活或者争脱父母的束缚。 2、户型适用 适用是住宅建设的基本要求，户型设计的第一位选择因素就是使用方面，舒适度较高，离开这点就谈不上户型设计的先进和前瞻性。 ○面积适当的厅，满足会客、团聚、视听、休闲的公共性活动功能。 ○厅内要有良好的光照、通风和视野。 ○厅内不要有太多的洞口和门，以方面家具的摆设和隐私的保护。 ○厨房最好靠近门口，以利购买菜蔬与处理垃圾，避免污染。○厨房和餐厅最好相邻，以便用餐和撤除餐具。 ○卫生间与卧室要相近，夜间使用时，不然老人儿童使用均不便。 集中归纳起来，动静分区、干湿分区、公私（公用区和私密区）分区应是使用功能合理的基本原则。 3、平面形式 平面形式上的变化主要表现在两个方面： 一是每一层的户数在减少，尤其是小高层和高层住宅。以前
新手必读（一）给排水设计过程与注意事项——排水设计的新手往往只知道要查规范去画图，而对一个工程如何展开、各专业如何提资协作建筑对于刚从事给 ~直到竣工验收，并没有一个清晰准确的认识。为了让大家更快进入设计师的角色，收集了一些资料在此奉上！流程介绍分为设计阶段（工程建议书—可行性研究报告—初步设计—施工图设计—施工图审查、消防 审查、人防审查）和施工阶段（图纸会审——工地处理——竣工验收）。一、工作阶段划分工程建议书——可行性研究报告——初步设计（扩初设计）——施工图设计——施工图 1、设计阶段：审查、消防审查、人防审查。图纸会审——工地处理——竣工验收。 2、施工阶段二、设计工作流程施工图绘制按下面八个步骤进行，根据情况也可交叉进行：人员提供平面、立面、剖面。水专业提资，确定互相提资时间，列出工作计划，建筑设计1、召集各专业开会个阶段，第一阶段提管井位置、面积，电容量，水池容积，设备房面积等，一般时间在一周之内；第二阶段应分3第三阶段向概算专业 3周；提设备房布置，消火栓、湿式报警阀、水流指示器位置等，一般时间在中前期，约2～提设备材料表，一般在出图前一周。其它专业应向本专业提的资料必须明确提资时间并写入工作计划。第一阶段空调应提供空调补充水量，第二阶段建筑应该提供卫生间大样，时间也是在中前期，使本专业绘制完设备房大样图后第一次建筑提资一般比较简单，在做第一阶段提资能马上进入卫生间大样的绘制，提资的时间一定要坚持尽早。 的同时，仔细看一次图纸，不清楚的地方一定要问，设计范围要明确，管井分布面积要落实。还要着手写联系函给业主要求提供相关资料（如市政自来最低水压、管径、位置，市政排雨水管道标高、位置等，由业主相关部门索要资料），明确做法（如住宅卫生间大样画到什么程度，水表怎么设置，有什么特殊要求等），确定管道材料等等，而且要业主来文答复，作为设计依据，发生纠纷时有据可查（保护自己），并作为归档资料的一部分归档。 2、写统一技术条件，交审核人签字认可。设计依据，建筑等级，计算的方法，各个系统的技术方案（如给水系统方案是否市政水直供、水泵－水箱供水），关键的技术指标（用水定额、消防用水量等），采用的管材一定要写清楚，技术方案和设计的关键问题应该先与审核人取得一致意见，否则校审时才修改工作量太大，而且影响其它专业。 3、写计算书。这阶段先计算涉及向其它专业提资的内容，如水池容积计算，水泵选型等，计算完成后给校对人检查。 4、向各相关专业第一阶段提资，接受各专业提资。要严格按工作计划提资，一定要按质量管理体系要求填写提资单，出现问题的有据可查，避免承担不必要的责任。提资单给校对及专业负责人签字时应该提交相应部分的计算书。 5、画图，完成计算书余下内容，第二阶段提资。绘制施工图的顺序应该是大样图?平面图??系统图。画图当中注意与建筑等工种的沟通和协商，经常发生建筑修改或某专业要求修改建筑不通知其它专业的情况。 6、设计人自校。提交校审时出现图纸相互矛盾等错误是不应该的，而且不允许出现很明显的简单错误，例如立管编号错编成其它系统的，编号重复等等。 7、校对审核。提交校审时应一起提交统一技术条件和计算书，白纸图设计人应签好名。 8、会签，出图。 三、画图注意事项． 。计算编制计算书时关键的技术指标（用水定额、消防用水量等）必须取自经审核人认可的统一技术条件1、的步骤应详细列出使用的计算公式，然后列式将数值代入计算，给水管径可在给出计算公式后列表计算。所有需要计算的设计数据均应在计算书中表示，不能漏项。：设计总说明—平面图—大样图—系统图—设备材料表—采用的标准图集。2、图纸目录编排顺序；尺寸及标高标注的数字高为4mm，数字高3～3、全套图纸字体大小要统一。一般说明中单线汉字高5mm ，尺寸及标高标注的数字为2.5mm。；使用window字库中的ture type字型时在说明中为4mm2.5mm 0.6mm。0.54、粗线宽度一般为～。建筑提资的图上有很多尺寸、标注是其专业本身的，如门窗号与尺寸、建筑选用的图集、突出本专业内容5做法等，可以删去，只保留总尺寸、轴线尺寸、需要的细部尺寸标注。建筑的墙线要变成细线。本专业不同系统的给排水制图标准》设置。管线要用图例、颜色、图层来区别。图例应严格按照《。按顺序画平面图时自校大样图，画系统图时自校平面图，最后自校系统图，提交校审前再、6坚持严格自校自校一次，花费的时间不多，可以避免自相矛盾的错误。四、图纸绘制应注意的一些问题1、卫生间大样画卫生间大样首先要确定给排水立管的位置，要根据各层平面图特别是转换层是否能方便连接考虑，排水立管布置尽量靠近大便器。住宅卫生间没有蹲厕的应设地漏。公用卫
PCR引物设计原则 引物(Primer)是人工合成的两段寡核苷酸序列。 1、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2、G十C含量：应在40%-60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm 值引物的Tm值减去5-10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4(G十C)十2(A十T)。 3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发. 4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构. 5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。引物3’端最好选T，错配的几率与A 相比大大的降低了。G、C之间错配的概率小于A、T. 6、引物的5’端可以修饰，而3’端不能进行修饰。5’端的修饰包括：加酶切位点，标记生物素，荧光，地高辛、Eu3+等，引入蛋白质结合的DNA序列，引入点突变，插入突变、缺失突变序列、引入启动子序列。因为引物的延伸是从3’端开始的，因而3’端不能进行任何修饰，另外3’端也不能有形成任何二
级结构的可能。 如何设计引物 不同的核苷酸序列表达的氨基酸氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。 引物最好在模板cDNA的保守区域内设计（DNA的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对（Alignment）,各基因相同的序列就是该基因的保守区）。 PCR引物设计 PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。 引物设计软件 Primer Premier5.0 （自动搜索）* vOligo6 （引物评价） vVector NTI Suit vDNAsis vOmiga vDNAstar vPrimer3 （在线服务）
四、设计人员易出现的问题 初学者经常会出现忘记加出血线；在填加黑色时，往往用四色黑，那样黑色印出来，小字会重影；拼大版时版心过大，容易忽略角线给印刷裁切带来不便，忘记模式转（RGB转CMYK）、图像精度不够，出现乱码等。虽然这是初学者易犯的错误，但对于有经验的设计师来说也应注意。 （一）设计制作检查 1、文字校对； 2、版面尺寸设置； 3、页面上各元素前后层次关系对否； 4、图像分辨率设置是否合理； 5、EPS图是否正确加网； 6、汉字是否做过heavy处理； 7、叠在底图上的黑色文字、线条及色块是否做了套印处理； 8、色块相接处是否做了扩缩； 9、文字与色块套印是否有必要做扩字缩底处理； 10、分色版中是否有专色。 （二）输出检查
1、线设定正确与否（包括无素信息、半色调加网、打印和RIP的设置）； 2、阴、阳片药膜面正反设定正确与否； 3、裁切线及折标设定与否； 4、打印机类型和页面尺寸及方向的设定正确与否。 （三）菲林片检查 1、软片网点密度如何； 2、网点锐利否以及信息对否； 3、线条特性如何； 4、分色版上颜色名对否； 5、软片是否平整、干净、无明显折痕、划痕及污迹是否有不规则线或网出现。（四）打样检查 1、成品版式及尺寸是否符合要求； 2、色彩正确与否； 3、折手对否。 （五）“组版十查”口诀 一查图形，二查字，三查位置，四查序；
五查颜色，六查网，七查尺寸，八规矩； 九查周边无差错，十查格式要仔细； 保证质量最重要，问题解决组版里。 了解到这里有一些刚入门的朋友，对印刷设计的相关常识知之甚少，发一些东西，以供参考。 这些东西还不全，但很多是做平面设计的人必须要知道的。 还有什么不知道的可以跟贴提问，我会尽快回答。 1、什么是图像分辨率？为什么强调它？ 答：高分辨率的图像比相同尺寸的低分辨率的图像包含的像素多，图像信息也较多，表现细节更清楚，这也就是考虑输出因素确定图像分辨率的一个原因。如一幅图像若用于在屏幕上显示，则分辨率为72像素/英寸即可；若用于600Dpi的打印机输出，则需要150像素/英寸的图像分辨率；若要进行印刷，则需要300像素/英寸的高分辨率才行。图像分辨率设定应恰当：若分辨率太高的话，运行速度慢，占
引物设计常见问题与解答(二) 17. 长链引物为什么出错的几率非常高 答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%,产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。 18. 如果测序发现突变，该如何处理 答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。 19. 如果测序发现引物突变，是否有补偿 答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%.您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。 20. 引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入 答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。 21. 为什么OPC或PAGE纯化的引物，再用HPLC鉴定纯度不高
安规设计注意事项(doc 14页)_New
安规设计注意事项(doc 14页)
安规设计注意事项 1.零件选用 (1)在零件选用方面,要求掌握: a .安规零件有哪些?(见三.安规零件介绍) b.安规零件要求 安规零件的要求就是要取得安规机构的认证或是符合相关安规标准; c.安规零件额定值 任何零件均必须依MANUFACTURE规定的额定值使用; I 额定电压; II 额定电流; III 温度额定值; (2). 零件的温升限制 a. 一般电子零件: 依零件规格之额定温度值,决定其温度上限 b. 线圈类: 依其绝缘系统耐温决定 Class A ΔT≦75℃ Class E ΔT≦90℃ Class B ΔT≦95℃ Class F ΔT≦115℃
a.
b.例外情形: 下述零件与电子零件(限会在失误状况下,因温度过高而引燃的电子零件)若相隔13mm以上,或是相互间以至少V-1等级之障碍物隔开,则其耐燃等级要求如下: I.小型的齿轮,凸轮,皮带,轴承及其它小零 件,不须防火证明; II.空气载液的导管,粉状物容器及发泡塑料 零件,防火等级为HB以上或HBF以上 g.下述件不须防火证明: I.胶带; II.已获认证零件; III.密封于无开孔且体积小于0.06m 金属壳内之零件; IV.仪表壳,仪表面,指示灯或宝石,置于至少V-1等级的PCB上的IC,晶体管,光耦合 器及其它小零件的外壳. 2.整体配置 (1)安全距离(沿面距离和空间距离) 如果知道了工作电压及绝缘等级,就可决定所需之安全距离.
表一: 绝缘等级及各式绝缘适用情形绝缘等级适用情形 操作型(OPERAATIONAL INSULATION) 介于两不同电压之零件间 介于ELV(SELV)及接地导电零件 间 基本型(BASIC INSULATLON)介于具危险电压零件及接地导电 零件间 介于具危险电压零件及依赖接地 SELV电路间 介于PRI的电源导体及接地屏蔽 物或主电源变压 器的铁心间 做为双重绝缘一部分 补充型(SUPPLEMENTARY INSULATION)介于可触及导体零件及在基本绝 缘损坏后有可 能带有危险电压的零件间 做为双重绝缘一部分 介于PRI电路及可触及未接地导 电零件间
教学设计要素的注 意事项
教学设计要素的注意事项： 教学设计一般包含有下列基本要素：教学内容、教学理念、教材分析和学情分析、教学目标、教学重难点、教学策略、课前准备、教学过程等要素，它们相互联系、相互制约，构成了教学设计的总体框架。 1、教学任务及对象分析 新课程理念下，课堂教学不再仅仅是传授知识，教学的一切活动都是着眼于学生的发展。在教学过程中如何促进学生的发展，培养学生的能力，是现代教学思想的一个基本着眼点。因此，教学由教教材向用教材转变。以往教师关注的主要是“如何教”问题，如今教师应关注的首先是“教什么”问题。也就是需要明确教学的任务，进而提出教学目标，选择教学内容和制定教学策略。 ①教学内容分析 教学内容是要完成的教学任务，是实现教学目标的主要载体。以往我们仅关注教材分析，在这种分析过程中，教师将教科书作为主要依据，教材分析基本关注教学的重点、难点及考点方面，比较注重显性教材的运用而忽视隐性教材的挖掘和利用，较少关注与学习教材内容有密切关系的认知和心理因素，以及教材对学生能力的要求，而对教学的重点和难点也只是阐述其内容，没有做进一步的分析。在新课改背景下，教学内容分析既要求对显性教材的运用，也要求对隐性教材的挖掘和利用。
②教学对象分析 学生是分析教学任务必须要考虑的因素，分析学生是为了帮助学生解决学习中的困难，完成教学任务。要求我们教师做到以下两点：一是要了解教学活动开始前学生在认知、情感、态度等方面已经达到了什么样的水平，这一水平标志着学生已经能做什么，说什么，想明白了什么等等（即学生的学历和学情）。这是学生掌握新的学习任务的起点水平。二是要了解教学活动结束后预期学生在认知、情感、态度等方面必须达到的状态。对这种状态的把握最终会转化为确定的教学任务与具体的学习目标。只有当教师的心中对教学前和教学后这两种状态的差距做到心中有数时，才能根据学生的实际情况，确定真正恰当的切合学生实际的教学任务和学习目标。 2、教学目标设计 教学目标是教育者在教学过程中，希望受教育者达到的要求或产生的变化结果，也是教师完成教学任务的归宿。 在对教学目标的理解和陈述上，与以往传统教案相比应该有较大变化，具体体现在目标的维度、目标陈述的主体等方面。 ⑴教学目标的主体和维度 教学目标以学生的学习目标为依据，学习目标对于学生的学习具有指向性，同时还能够作为学习效果的检测标准。因此制定准确、适合学生的学习目标是非常重要的。 新课程标准从关注学生的学习出发，强调学生是学习的主