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基于环氧合酶2途径的抗炎药物筛选模型

第35卷第4期Vol.35No.4南华大学学报#医学版

Journal of Nanhua University(Medical Edition)2007年7月Jul.2007

通讯作者:刘冬发,电话:139********.

基于环氧合酶2途径的抗炎药物筛选模型

刘冬发1

,黄兴国2

,呙爱秀

2

(1.耒阳市人民医院,湖南耒阳421800; 2.湖南环境生物学院医学部药学系)

摘 要:目的 建立基于环氧合酶(COX)2途径的抗炎药物筛选方法。方法 以无血清培养液诱导肺癌细胞A54912h,加入花生四烯酸和药物孵育一定时间后,用试剂盒分别检测培养液中COX2途径的产物PGE 2含量和C OX1途径产物6-keto-PGF 1A 含量。结果 无血清培养的A549PGE 2生成量明显增高。C OX2选择性抑制剂NS398和非选择性抑制剂阿司匹林对COX2途径的PGE 2生成有明显的抑制作用,而选择性COX1抑制剂SC560对此抑制作用弱。以50%抑制率为阳性标准,模型的稳定系数为0.91。结论 本模型性能稳定,能用于C OX2途径的抗炎药物筛选。

关键词:非甾体抗炎药; PGE 2; A549细胞; 环氧合酶

中图分类号:R97 文献标识码:A 文章编号:1672-7444(2007)04-0600-04

A Drug Screening Model for Anti -Inflammatory Agents Based

on Cyclooxygenase 2Pathway

LI U Dong-fa,Huang Xing-guo,GUO Ai-xiu

(1.Leiyang Peo ple .s Hos pital ,Leiyang ,Hunan 421800,China ;2.Pharmacy Department ,

Hunan Institute o f Environment &Biology )

Abstract :Objective To establish a drug screening model for anti-infla mmatory agents based on cyclooxy -genase (C OX)2pathway. Methods Lung cancer cells A549were induced by serum-free media for 12h.The induced cells were incubated with arachidonic acid and different COX2pathway inhibitors.PGE 2,a metabolite from COX2pathway,was determined by PGE 2assay kit;and 6-keto-PGF 1A ,a metabolite from COX1pathway,was deter mined by 6-keto-PGF 1A assay kit. Results There was more PGE 2synthesized by serum-free media in -duced cell than that by other treated cell;NS398,a selective C OX2inhibitor,and aspirin,a non-selective COX inhibitor,were able to inhibit PGE 2yield in a dose-dependent manner,but the effect of SC560,a selective C OX1inhibitor,was much weaker.The model set the threshold at 50%inhibition on COX2pathway,and the Z c -factor was 0.91;which suggests the model was stable enough for drug screening. Conclusions The model is suitable for screening anti-inflammatory agents based on COX2pathway with good stability.

Key words : NSAIDs; PGE 2; A549cell; COX 环氧合酶(c yclooxygenase,COX)即前列腺素H 2合酶(prostaglandin synthase H 2),是花生四烯酸(arachidonic acid,AA)的主要代谢酶之一,也是合

成前列腺素(prostaglandins,PGs)和血栓素(throm -boxanes)合成的限速酶。前列腺素和血栓素均参与哺乳动物的炎症反应,是两类重要的炎症因子,

600

前人对此早已进行过全面的综述[1]。研究表明, COX至少存在3种亚型,即COX1、COX2和COX3。COX1是组织型表达的COX,主要参与维持组织细胞的正常生理功能;COX2是病理状况下表达的COX,是参与病理反应的主要酶之一[2];近年发现的COX3主要分布在中枢神经系统[3],与炎症关系不大。由于经典的非甾体抗炎药(NSAIDs)不加选择地抑制了COX1和COX2,所以在产生治疗效应的同时产生了一些几乎不可避免的不良反应[3,4]。因而寻找COX抑制剂,特别是高选择性的COX2抑制剂一直是许多药学工作者的奋斗目标。而建立相应的筛选模型是基本的技术平台。本研究采用COX2高表达的A549细胞建立此筛选模型。

1材料和方法

1.1材料和试制A549细胞由南华大学提供; PGE2、6-keto-PGF1A酶联免疫检测试剂盒、NS396、SC560、阿司匹林(aspirin,ASA)和AA均购自美国Cayman公司;多功能酶标测读仪购自美国BioRad公司。F12培养液购自美国Hyclone公司,小牛血清由杭州四季青公司生产,脂多糖(lipopo-lysacc haride,LPS)购自美国Sigma公司。其它试剂为国产分析纯。

1.2细胞培养将A549用F12培养液(含10%小牛血清)37e5%CO2温孵,当细胞快长满培养瓶时用消化液(0.5%胰蛋白酶0.53mmol P L ED-TA)常规吹打消化成单个细胞,离心分离(1000r P min离心3min)。加入无血清F12培养液或加入完全培养液,或加入含LPS10L g P m L的完全培养液,调整细胞浓度为(1~3)@105P mL。取200L L 加入96孔板中,培养12h过夜[5]。

1.3溶液配制ASA先用10%碳酸钠溶液溶解,用PBS(配方:KCl0.2g,KH2PO40.2g,NaCl 8.0g,Na2HPO4#12H2O

2.08g,加三蒸水到1000 mL,pH7.2)稀释到所需浓度;NS398和SC560先用DMSO溶解,用PBS稀释至所需浓度,工作液中的DMSO浓度低于万分之一。

1.4加药处理弃去培养液,加入160L L PBS后再加入不同浓度的药液20L L,剂量的设计参照表1进行。37e温孵15min后,加入10L mol P L AA, 37e温孵30min。然后将上清转移至另一96孔板中,按试剂盒操作(竞争酶联免疫法)测定样品中PGE2、6-keto-PGF1A含量。

表1所用C OX抑制剂的IC50

COX1COX2

NS39875L M(人) 1.77L M(人)选择性COX2抑制剂SC5609n M(人) 6.3L M(人)选择性COX1抑制剂ASA0.75m M(绵羊) 1.25m M(绵羊)选择性C OX抑制剂

数据由美国Cay man公司提供

1.5稳定系数计算模型稳定系数Z c因子(Z c-factor)是衡量药物筛选模型稳定性的重要指标[6],计算公式如下:

Z c=1-

3?c++3?c-

L c+-L c-

式中R为标准差,L为均数,C+为高浓度,C -为低浓度。Z c因子与设定体系活性的标准值有关(本模型设定抑制达到50%为活性标准),与何种药物及浓度没有关系,只是测定时需要阳性药物帮助。

1.6统计学处理所有数据采用方差分析进行处理,组间比较采用最小差异法(LSD)进行,以P <0.05为具有统计学意义。

2结果

2.1PGE2和6-keto-PGF1A的诱导为了考察A549在何种条件下诱导的COX2通路活性最高(以生成PGE2的量来衡量)。特设定无血清诱导

基于环氧合酶2途径的抗炎药物筛选模型

组、LPS诱导组和正常培养组。不同处理因素对PGE2及6-keto-PGF1A的生成见图1。

图1不同处理方式对PGE

2

和6-keto-PG F

1A

的影响(n=3) Sam1:无血清诱导;Sa m2:10L g P mL LPS诱导(完全培养液);Sam3:正常培养。*:P<0.05,与Sam1组比较

601

2.2 抑制剂对A549PGE 2的影响 NS398、SC560和ASA 对PGE 2生成的影响见图2

基于环氧合酶2途径的抗炎药物筛选模型

图2 不同COX 抑制剂对PGE 2的影响(x ?s ,n =3)Ctrl 为无血清诱导组;NS396是COX2的选择性抑制剂,高中低浓度分别为20、2、0.2L mol P L;SC560为COX1选择性抑制剂,高中低浓度分别为100、10、1nmol P L;ASA 为阿司匹林,COX 非选择性抑制剂,高中低浓度分别为10、1、0.1mmol P L 。*:P <0.05,与对照组比较

2.3 模型的Z c 因子 一般认为Z c 因子大于0.5表示模型稳定性较好,可以用于药物筛选[6]

。本实验中,以抑制COX2通路50%值计算本模型Z c 因子为0.91,表明本模型能够用于高通量筛选。

3 讨 论

一般认为经C OX2途径生成PGE 2是病理致炎的重要原因之一,抑制C OX2或直接抑制PGE 2的合成可以减轻炎症症状。本模型依据此原理进行设计。

图1结果表明,无血清培养的A549细胞产生PGE 2含量最多,6-keto-PGF 1A 虽有所增加,但增加幅度小,6-keto-PGF 1A 的含量始终低于PGE 2的1P 50。由于PGE 2的生成反映了C OX2通路活性,而6-keto -PGF 1A 反映了COX1通路的活性[7]

。因而有理由认为,A549细胞中COX2通路处于主导地位,经LPS 或经无血清培养液诱导,COX2通路的活性可以进一步增高,而COX1途径在A549细胞中的影响可以忽略不计。本研究表明,无血清培养液诱导的效果优于10L g P mL LPS 。

从图2可见,NS396和ASA 对PGE 2的生成有一定的抑制作用并表现出一定的剂量依赖关系。NS398对PGE 2生成的抑制作用与厂家提供的COX2IC50接近。由于SC560是C OX1的选择性抑制剂,中低剂量对PGE 2的生成影响不大,只在高剂量时才产生一定的抑制作用,这与预期结果

一致。目前已有采用LPS 诱导的巨噬细胞原代培养建立模型筛选抗炎药物的报道

[7]

,也有采用无

血清培养的NI H 3T3细胞筛选抗炎药物的模型[8]

,甚至国外有商业化的重组COX2用来构建抗炎药的筛选模型。采用巨噬细胞则需要LPS 诱导[7]

,而且原代培养涉及到细胞的纯化鉴定,每次分离的巨噬细胞可能存在较大的活性差异;NIH 3T3为正常胚胎小鼠的肺成纤维细胞,COX1的活

性较高,为了减少干扰必须先用ASA 进行阻断[8]

再进行诱导,操作相对繁杂;而用重组纯化的

COX2建立筛选模型则忽略了PGE 2合酶的作用。本实验采用无血清诱导人肺癌细胞A549,实验方法简单,诱导出的PGE 2量高,能满足筛选检测的需要,而且不需LPS,减少了实验操作,有利于减少模型成本。

在模型的构建中发现,加入药物ASA 和NS398处理A549细胞10min 也能产生较好的抑制作用;但为了减少加样时间带来的相对误差,本

模型采用15min 。实验还发现AA 温孵30~60min 都是可以的,延长AA 的反应时间将增加PGE 2的检测值,对模型稳定性是有帮助的,在模型稳定性可以接受的前提下,为了提高效率,本实验采用30min 的反应时间。

理论上讲,本模型是基于C OX2途径的抗炎药物筛选,而非C OX2抑制剂筛选。COX2是AA 生成PGE 2的主要酶之一,同时还受PGE 2合酶的影响。通过此模型筛选出的阳性药物可能是COX2的,但不排除对PGE 2合酶的作用。事实上,PGE 2也是抗炎药作用的有效靶点[9]

。所以采用此模型既能筛选COX2抑制剂也能筛选PGE 2合酶抑制剂,提高了筛选的效率。与单纯的COX2抑制剂筛选模型相比,有利于提高抗炎药的筛选阳性率,减少筛选的假阴性。

总之,本模型采用高表达COX2的A549细胞建立COX2抑制剂的筛选模型,操作简单,模型稳定。可以用于COX2途径抗炎药的筛选。参考文献:

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(收稿日期:2007-04-22)

(上接第564页)

(78.33%),因此认为复方氢氧化钙糊剂更能有效诱导年轻恒牙根尖形成,值得推广应用。

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(收稿日期:2007-04-10)

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