第四节基因工程
一、基因工程定义
?是指在基因水平上的遗传工程，它用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新育种技术。可以超远缘杂交。
二、基因操作的基本步骤
细菌
取出质粒
用相同的限制酶切出粘性末端
供体细胞
取出DNA分子
用限制酶切取目的基因
将目的基因插入质粒切口
用连接酶将目的基因与质粒相连将重组DNA分子导入受体细胞重组DNA分子增殖、表达
目的基因产物
基因工程的基本步骤
三、基因工程的基本操作
1．目的基因的获得：
①从适当的供体细胞的DNA中分离；
②通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA；
③由化学方法合成特定功能的基因。
2．载体的选择
载体必须具有以下条件：
①是一个有自我复制能力的复制子；
②有较高的复制率：即能在受体细胞内大量繁殖；
③载体上最好只有一个限制性内切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上；
④载体上必须有一种选择性遗传标记。
常用载体
u原核受体细胞：细菌质粒和λ噬菌体u真核受体细胞：
u动物：SV40病毒
u植物：Ti质粒
3．目的基因与载体DNA的体外重组
4．重组载体引入受体细胞
受体细胞有：微生物细胞、动物细胞和植物细胞。其中微生物细胞中使用最广泛的是E. coli，另外枯草杆菌和酿酒酵母也越来越多地用作基因工程中的受体。
5. 重组受体细胞的筛选和鉴定
6. 工程菌或工程细胞的大规模培养
第五节菌种的衰退、复壮及保藏
一、菌种的衰退与复壮的概念
u 定义:菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现
1.菌种的衰退（degeneration ）u 常见的衰退现象：
菌落和细胞形态的改变；
生长速度缓慢，产孢子越来越少；
抵抗力、抗不良环境能力减弱等；代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；
2、防止菌种衰退的方法
①控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8~10-9，采用良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代的次数）；
②选择合适的培养条件；
③采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）；
④采用有效的菌种保藏方法。
3、菌种的复壮（rejuvenation）
u定义:使衰退的菌种恢复原来优良性状。
狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；
广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。
4. 菌种的复壮措施
①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。
②通过寄主体内生长进行复壮；
③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。④采用有效的菌种保藏方法。
二、菌种保藏
1. 目的：
①存活，不丢失，不污染
②防止优良性状丧失
③随时为生产、科研提供优良菌种
2. 原理：挑选典型菌种或典型培养物的优良纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽孢等）;创造降低微生物代谢活动强度、生长繁殖受抑制、难以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养以及添加保护剂等）。
菌
连续在培养基上（内）移种种
生活态：传代培养保藏法连续在活宿主上（内）移种
保
固体斜面藏
湿法
半固体琼脂柱方休眠态液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法干法藏在玻璃管内
吸附在合适的载体上3.菌种保藏的方法
干法保藏菌种的方法
滴入小试管（在放入大试管干燥器中）
藏在玻璃管内封入安培瓶菌液直接真空干燥法（L-干燥法）
冷冻真空干燥法
细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒）
合适的载体球块状载体（硅胶、瓷球）
有机基质（曲料、麦粒）
滤纸片
薄片状载体明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成）
血清蛋白小片（…乙烯薄膜…）
4、常用菌种保藏方法：
①低温保藏法
方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代
原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。
②石蜡油低温保藏法
橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。
③干燥保藏法
将菌种置于土壤、细沙、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏时间几至几十年。
④真空冷冻干燥法
加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。
⑤液氮超低温保藏法
将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196℃）。
适用于各种微生物的较理想的保藏方法。
几种常用菌种保藏方法的比较简便简便简便简便有效简便有效3~6月6~12月1~2年1~10年5~15年以上各大类细菌、酵母菌各大类**产孢子微生物各大类低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低
温、有保护剂冰箱保藏法（斜面）
冰箱保藏法（半固
体）
石蜡油封藏法*
沙土保藏法
冷冻干燥法评价保藏期适宜菌种主要措施方法名称
微生物菌种保藏及复壮 5.1. 微生物菌种保藏 在发酵工业中，具有良好性状的生产菌种的获得十分不容易，如何利用优良的微生物菌种保藏技术，使菌种经长期保藏后不但存活健在，而且保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力，即很少发生突变，这对于菌种极为重 要。 微生物菌种保藏技术很多，但原理基本一致，即采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好是它们的休眠体，使微生物生长在代谢不活泼，生长受抑制的环境中。具体常用的方法有：蒸馏水悬浮或斜面传代保藏；干燥-载体保藏或冷冻干燥保藏；超低温或在液氮中冷冻保藏等方法。 5.1.1. 蒸馏水悬浮法 这是一种最简单的菌种保藏方法，只要将菌种悬浮于无菌蒸馏水中，将容器封好口，于10℃保藏即可达到目的。好气性细菌和酵母等可 用此法保存。 5.1.2. 斜面传代保藏 斜面传代保藏方法是将菌种定期在新鲜琼脂斜面培养基上、液体培养基中或穿刺培养，然后在低温条件下保存。它可用于实验室中各类微生物的保藏，此法简单易行，且不要求任何特殊的设备。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变、菌种退化、菌株污染等不良现象。
因此要求最好在基本培养基上传代，目的是能淘汰突变株，同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并降低代谢活性。此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。 5.1.3. 矿物油中浸没保藏 此方法简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。是将琼脂斜面或液体培养物或穿刺培养物浸入矿物油中于室温下或冰箱中保藏，操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经160℃干热灭菌1~2h或湿热灭菌后120℃烘去水分的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，这样可使菌种保藏时间延长至1~2年。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验，因为某些菌株如酵母、霉菌、细菌等能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏，为了预防不测，一般保藏菌株 2~3 年也应做一次存活试验。 5.1.4. 干燥-载体保藏 此法适用于产孢子或芽孢的微生物的保藏。是将菌种接种于适当的载体上，如河砂、土壤、硅胶、滤纸及麸皮等，以保藏菌种。以沙土保藏用得较多，制备方法为：将河砂经24目过筛后用10%~20%盐酸浸泡
实验15 微生物菌种保藏方法 一、实验原理 为了保持微生物菌种原有的各种优良特征及活力，使其存活，和丢失，不污染，不发生变异。根据微生物自身的生物学特点，通过人为的创造条件，使微生物处于低温、干燥、缺氧的环境中，以使微生物的生长受到抑制，新陈代谢作用限制在最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保藏的目的。 常用简易保藏法包括常规转接斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物保藏法及沙土管保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊实验设备，操作简便易行，故为一般实验室及生产单位所广泛采用。 常规转接斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长好的培养物置于4-5℃冰箱中保藏，并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层已灭菌的液体石蜡，再置于4-5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气的作用，使外界空气不与培养物直接接触，从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。 含甘油培养物保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15%已灭菌的甘油，然后再置于-20或-70℃冰箱内保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，而且，在-20或-70℃条件下，可大降低细胞代谢水平，但却仍能维持生命活动状态，达到延长保藏时间的目的。 沙土管保藏法，将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上，经培养后，制后孢子悬浮液，无菌操作将孢子悬浮液滴入已灭菌的沙土管中，孢子即吸附在沙土上，将沙土管置于真空干燥器中，通过抽真空达到吸干沙土管中水分，然后将干燥器置于4℃冰箱中保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。 二、操作步骤 (一) 斜面传代保藏法 l．贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。 2．斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。 3．培养细菌37℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。
菌种保藏 （一）、菌种保藏的目的 微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要. （二）、菌种保藏的原理 无论采用何种保藏方法,首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏,最好保藏它们的休眠体,如分生孢子、芽孢等.其次,应根据微生物生理、生化特点,人为地创造环境条件,使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态.这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧,另外,避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果. （三）、菌种保藏的方法 1、斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏,不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这一改进可使菌种的保藏期延长. 该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变异和被污染. 2、石蜡油封藏法 此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出斜面顶端lcm,使培养物与空气隔绝,加胶塞并用固体石蜡封口后,垂直放在室温或4℃冰箱内保藏.使用的液体石蜡要求优质无毒,化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分. 由于液体石蜡阻隔了空气,使菌体处于缺氧状态下,而且又防止了水分挥发,使培养物不会干裂,因而能使保藏期达1～2年,或更长.这种方法操作简单,它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等,对霉菌和酵母菌的保藏效果较好,可保存几年,甚至长达10年.但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差,尤其不适用于某些能分解烃类的菌种. 3、砂土管保藏法 这是一种常用的长期保藏菌种的方法,适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌,对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用. 其制作方法是,先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛,土用120目筛),按砂与土的比例为(1～2)：1混匀,分装于小试管中,砂土的高度约1cm,以121℃蒸汽灭菌1～1.5h,间歇灭菌3次.50℃烘干后经检查无误后备用.也有只用砂或土作载体进行保藏的.需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养,再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入
ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所 SH 上海市农业科学院食用菌研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 IA 中国医学科学院抗菌素研究所 SIA 四川抗菌素工业研究所 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS 中国科学院微生物研究所 AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心 CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 ID 中国医学科学院皮肤病研究所 NICPB 卫生部药品生物制品监察所 IV 中国医学科学院病毒研究所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心 CIVBP 中国兽医药品监察所 YM 云南省微生物研究所 GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCTCC 中国典型培养物保藏中心，武汉大学 CCDM 华中农业大学菌种保藏中心，华中农业大学 CMBGCAS 海洋微生物中心 HKUCC 香港大学保藏中心，香港大学 CUHK 香港中文大学保藏中心，香港中文大学 BCRC 台湾生物资源保藏研究中心，台湾新竹 国外 ATCC(American Type Culture Collection）美国典型菌种保藏中心 ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研究。 该中心保藏有藻类111株，细菌和抗生素16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。 另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。 NBRC (NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心 NBRC（IFO）是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心。主要从事农业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研究。 该中心保藏有细菌1446株，真菌568株，酵母164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保藏中心。该中心保藏的菌种可出售。 NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心
设计实验：微生物菌种的分离纯化、培养、、鉴定以及保藏技术 一．实验目的 1.学习大肠菌群分离纯化、鉴定的原理。 2.掌握平板表面涂布法、平板划线法的分离技术。 3.学习掌握菌种保藏的原理和方法。 二.实验原理 菌种的分离纯化 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1.涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。 2.平板划线法 最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。 大肠菌群的培养鉴定 大肠菌群能在乳糖胆盐液体培养液中生长，并且产气产酸，使培养液变色。还能在伊红美兰固体培养上生长，形成黑紫色的菌落，有的还有金属光泽。其他病原菌的菌落呈粉红色。再做镜检观察是无芽孢的革兰氏阴性杆菌（呈红色）。即可鉴定是有大肠菌群的菌存在。 菌种保藏 菌种保藏是将微生物的菌种经长时间的保存，不污染其它杂菌，及可保持其形态特征和生理性状，减少变异，防止衰老，以便于将来使用。 保藏菌种一般是选用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要创造一个低温；干燥；缺氧；避光和缺少营养的环境条件，以利于休眠体能长期地处于休眠状态。对于不产孢子的微生物，应使其新陈代谢处于最低状态，又不会死亡，从而达到长期保存的目的 三.实验器材 1.菌种：污水中的大肠菌群、酵母菌和霉菌 2、培养基：乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、麦芽汁固体斜面培养基 和马铃薯固体斜面培养基。 3.器材：接种环、安培瓶、干燥器、冰箱、产气管、试管、培养皿、无菌平皿、无菌玻璃涂棒移液管、电炉、双目显微镜、恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温干燥箱等。 4.试剂：革兰氏一(草酸铵结晶紫)、革兰氏二(路哥氏碘液) 、革兰氏三（95%乙醇）、 革兰氏四（蕃红）；试剂：医用液体石腊（比重0.83～0.89）。 四．试验方法及步骤 1.大肠菌群的分离纯化 第一天 a．涂布平板法：将已熔化的营养琼脂培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的含大肠菌群的污水滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，置培养箱中37℃培养24小时。经培养后挑取单个菌落。 第二天 b．平板划线法：经培养后挑取单个菌落，接种环以无菌操作沾取少许菌落，在无菌伊红美兰琼脂培养基平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果
几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法） 定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2 接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。 2.1.4 密波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。 2.1.5 挖块接种法 挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。
借用一下 标准菌验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理 介绍了微生物实验中使用的标准菌的验收、制备、保藏、传代、使用、销毁的管理规程规定了质量管理部门实验用标准菌种的验收、制备、储管、使用、以及销毁等的相关规定。适用于微生物限度检查、无菌检查、抗生素微生物（效价）测定、评价防腐剂和抗菌剂的抑菌效果和确认灭菌效果、检验方法的验证、培养基的适用性检查，样品检验时的阳性对照等。依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书 1.标准菌的来源 标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（China Medical culture collection ,CMCC）提供的冷冻干燥菌种（0代）或由上级药检部门已接种好的菌种斜面（3代）。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签CMCC （B）代表细菌（bacteria）,CMCC(F)代表真菌（fungi）每种菌具有固定的代号。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～8 ℃，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球 3.2培养基 改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮. 液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮. 3.3操作步骤： a.打开洁净工作台。 b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。 c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。 d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。 e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。 f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。 g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培
微生物菌种保藏方法 1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。 传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。 一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。 传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。 2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。 3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如： ①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
菌种管理制度 1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。 3、定义 标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。 4、职责 4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。 4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 5、规程 5.1菌种的申购 部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。 5.2菌种的接收 菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。 5.3菌种的保存 5.3.1工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而
第14章 微生物的保存技术 工业、农业、医学和科学研究的需要促进了微生物保存技术的发展。例如，当发现微 生物就是某些传染性疾病的特殊病原时，为发展疫苗、抗生素和化学药品，人们需要分离、鉴定和保存微生物。农业上最明显的例子就是对固氮菌的研究，关于工业应用微生物的例 子更是不胜枚举。微生物发酵还提供了大量的食品、饮料和药品。在分子生物学研究中， 用先进的DNA重组技术可以修饰微生物（U.S.Congress 1981），微生物是基因工程的基础。 微生物是重要的生物资源，保存微生物的目的，不仅使微生物菌株以活的生命状态保 存下来，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变。这也是保护微生物多样 性的重要手段，还使后人能更好地应用先进技术开发和运用微生物，为人类造福。为此， 世界各发达国家都设有专门的菌种保藏机构。如美国的典型菌种保藏中心（ATCC），英国的 国家典型菌种保藏所（NCTC），日本的大阪发酵研究所（IFO）等。我国也设有中国微生物 菌种保藏委员会（CCCCM）。 微生物的保存方法很多，根据不同的微生物菌（毒）株或不同的实验要求，可选用不 同的保存方法。这些保存方法的原理大同小异。首先要挑选典型菌种的优良纯种，再创造 一个适合其长期休眠的环境条件，诸如低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养等，使被保存 的微生物减少代谢率及繁殖和利用营养的比率（Halliday，Baker 1985）。然而，所有减少 代谢率的方法都会导致一定比率的活力下降。为了防止菌株的丢失，还需要开发出不仅能 减少代谢率，而且能防止活力下降的方法。 与保存技术有关、但较为费时的另一项关键性工作是档案记录（Halliday，Baker1985）。这一工作不仅包括菌种或毒株的培养史和诊断特征等方面的准确记录，还包括对保存物的 定期复苏和培养记录，以确定其活力、验证其纯度及基因的稳定性。 最常用的微生物保存法有冻干保存法和超低温冻存法（Gherna 1981；Halliday，Baker 1985；Malik 1990；Rudge 1991）。这两种方法均可保存相当长的时期（通常可长达30年）。其他保存微生物的方法还有：低温保存法、传代培养保存法、砂土保存法等（Gherna 1981）。 14.1 细菌的冻干保存法 14.1.1 一般概念 冻干是目前最常用的微生物保存技术（Day，Mclellan 1995）。美国ATCC在1985年第16版《细菌、噬菌体和rDNA载体目录册》及1987年第17版《真菌／酵母目录册》中，记载有 11 000株细菌、噬菌体和rDNA载体及 21 000株真菌、酵母用冻干法保存（Gherna等 本章作者：田保平，韦剑珊，俞乃胜
第五节菌种的衰退、复壮和保藏 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。 由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。 一、斜面冰箱保藏法 一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。保存期3月到6月。 二、沙土管保藏法
适合于产孢子或芽孢的微生物。 首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。一般沙80目，土80一100目。 其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。 保存期1年左右。 三、菌丝速冻法 不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。甘油最终浓度为25％。 操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。 四、石蜡油封存法 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。保存期约1年 五、真空冷冻干燥保藏法 是目前国内外较理想的常用方法。其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。菌种可保存5年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种M 都适用。所以，都已较普遍地应用。 基本操作：将M制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓿管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封。低温保藏。 保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分(细胞膜)的构型，防止细胞膜因为冻结而破坏。保护剂还可以起支持作用，使M疏松地固定在上面。牛奶可用离心或加热的方法脱脂。
实验十 微生物菌种保藏方法 [日期：2009- 5-30]来源： 作者：孔庆学 [字体：大 中 小] 实验十微生物菌种保藏方法 菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、不衰、不变，以便于研究与应用。 (一)常规保藏方法 1 目的 1.1 了解菌种保藏的基本原理 1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。 2 原理 菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。 3 材料 3.1菌株 待保藏的适龄菌株斜面 3.2培养基 肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。 3.3 试剂 10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。 3.4 器具 用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。 4 流程 斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏
5 步骤 5.1斜面保藏 5.1.1流程 标记试管→接种→培养→保藏 5.1.2步骤 5.1.2.1贴标签 取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。 5.1.2.2斜面接种 将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。 5.1.2.3培养 置37恒温箱中培养48小时。 5.1.2.4保藏 斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一船可保藏三个月至半年。 5.2半固体穿刺保藏 5.2.1流程 标记试管→穿刺接种→培养→保藏 5.2.2 步骤 5.2.2.1贴标签 取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。 5.2.2.2穿刺接种 用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。 5.2.2.3培养 置37恒温箱中培养48小时。 5.2.4保藏 半固体直立柱长好以后，放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏半年至一年。
4.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。 4.2 菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 4.3 传代和接种 4.3.1 菌种冻干粉复苏 4.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。 4.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。 4.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 4.3.2菌种斜面传代操作 4.3.2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 4.3.2.2点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。
菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。 营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水 培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程 原则：目的明确、营养协调、经济节约 物理化学条件适宜 方法：生态模拟、查阅文献 精心设计、试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查培养基种类： 一、按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途 基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基
消毒与灭菌： 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。 方法： 一、物理的方法：加热、过滤、辐射 二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 加热法： （1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。 1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。 （2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。
衰退（degeneration）：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。经分析发现，导致这一现象的原因有以下几方面。 1. 基因突变 （1）有关基因发生负突变导致菌种衰退 菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降；如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。菌种在移种传代过程中会发生自发突变。虽然自发突变的几率很低(一般为10-6～10-9)，尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退了的菌株。 （2）表型延迟造成菌种衰退 表型延迟现象也会造成菌种衰退。如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。 ）质粒脱落导致菌种衰退3（ 质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响（如高温），致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒，经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。 2. 连续传代 连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。 3. 不适宜的培养和保藏条件 不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。 1.合理的育种选育菌种时所处理的细胞应使用单核的，避免使用多核细胞；合理选择诱变剂的种类和剂量或增加突变位点，以减少分离回复；在诱变处理后进行充分的后培养及分离纯化，以保证保藏菌种纯碎。这些可有效的防止菌种的退化。 2.选用合适的培养基有人发现用老苜蓿根汁培养基培养“5406”抗生菌—细黄链霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌产生菌—藤仓赤霉的培养基中，加入糖蜜、天门冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物质时，也有防止菌种退化的效果。也有选取营养相对贫乏的培养基做菌种保藏培养基，如培养基中适当限制容易利
（生物科技行业）菌种保存和微生物常识
菌种保存和微生物常识 1、常用培养基的制备、灭菌与消毒 营养：从外部环境摄取其生命活动所必需的能量和物质，满足生长和繁殖需要的一种生理过程。是生命活动的物质基础，是生命活动的起点。 营养物：具有营养功能的物质。也包括光能。提供生物的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。 营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水 培养基：人工配制、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的混合养料。要求：应具备6大营养要素；物质比例合适；必须灭菌。 2、选用和设计培养基的原则、方法及制备过程 原则：目的明确、营养协调、经济节约 物理化学条件适宜 方法：生态模拟、查阅文献 精心设计、试验比较 步骤：称量、熔化、调PH、过滤、分装、 加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查
培养基种类： 一、按成分的不同分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基 二、按培养基的物理状态分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基 三、按培养基用途 基础培养基、选择培养基、加富培养基鉴别培养基 消毒与灭菌： 消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体 灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。 方法： 一、物理的方法：加热、过滤、辐射 二、化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等。 加热法： （1）干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌。
1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。 2、热空气灭菌利用高温干燥空气（160－170C）加热灭菌1－2h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。 3、注意事项： 1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法； 2）温度控制在<180°； 3）物品不能太挤； 4）温度降至70°时才开箱门。 （2）湿热法：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。 高压蒸汽灭菌法： 1、设备：高压灭菌锅 2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。
中国医学微生物菌种保藏管理办法根据中国微生物菌种保藏委员会管理和组织条例的规定，为了加强医学微生物菌种(以下简称菌种)的保藏管理，特制定本管理办法。 第一条组织及任务 在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心: 中国医学真菌菌种保藏管理中心:由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。 中国医学细菌菌种保藏管理中心:由卫生部药品生物制品检定所负责。 中国医学病毒菌种保藏管理中心:由中国预防医学中心病毒学研究所负责。 保藏管理中心的任务是: (一)负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应; (二)开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究; (三)组织学术交流和经验交流; (四)办理国内外菌种交换; (五)编制保管的菌种目录。 保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。其具体任务是: (一)负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应; (二)承担本专业有关疑难菌种鉴定; (三)开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用; (四)办理对外交流和交换菌种。
各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。 生物制品生产、检定用的菌种按"生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程"执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。 第二条菌种的分类 菌种的分类根据其危险性决定(包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况)。依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。 一类:实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。如: 鼠疫耶尔森氏菌、霍乱弧菌(包括EL-tor弧菌); 天花病毒、黄热病毒(野毒株)、新疆出血热(克里米亚刚果出血热)病毒、东、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、拉沙热(Lassa)病毒、马堡(Marburg)病毒、埃波拉(Ebola)病毒、猴疱疹病毒(猴B病毒); 粗球孢子菌、荚膜组织胞浆菌、杜波氏组织胞浆菌。 二类:实验室感染机会较多、感染后的症状较重及危及生命，发病后不易治疗及对人群危害较大的传染病菌种。如: 土拉弗郎西丝氏菌、布氏菌、炭疽芽胞菌、肉毒梭菌、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌; 狂犬病病毒(街毒)、森林脑炎病毒、流行性出血热病毒、国内尚未发现病人在国外引起脑脊髓炎及出血热的其它虫媒病毒、登革热病毒、甲、乙型肝炎病毒; 各种立克次体(包括斑疹伤寒、Q热); 鹦鹉热、鸟疫衣原体、淋巴肉芽肿衣原体;
1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。 传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。 一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。 传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。 2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。 3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如 ①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。 使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤(5克)置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基(以含水量为土壤最大持水量的60%为宜)，然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种，培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止，移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封，冷藏或室温保存。 ②砂土保存法：取清洁的砂，过60目筛去掉大砂粒，并用磁铁吸去砂中铁屑，再用NaOH 溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后，置于试管或安瓶管中保持2～3cm深，再经