作者单位:510080广州,中山大学中山医学院生化教研室(翁云); 524023湛江,广东医学院生化教研室(梁念慈)
作者简介:翁云(1972~),女,医学硕士,现在职攻读中山医学院生物化学与分子生物学专业博士研究生。#综述#
真核生物DNA聚合酶D的研究进展
翁云综述梁念慈审校
=摘要>DNA聚合酶D(DN A polymer ase D,pol D)是真核生物DN A聚合酶B家族的成员,由四个分子量分别为125kD、68kD、50kD和12kD的亚基组成,其中125kD和50kD的亚基构成了pol D酶的核心部分。pol D在真核生物DNA复制、损伤修复、细胞周期调控和肿瘤发生等方面都发挥重要的作用。
=关键词>DNA聚合酶D;结构;DNA复制;修复;细胞周期调控;肿瘤
DNA聚合酶(DNA polymerase,pols)在DNA复制和修复中起着重要的作用。目前为止,在真核细胞中已发现9种DNA聚合酶,分别为:pol A、pol B、pol C、pol D、pol E、pol F、pol G、pol H和pol I,其中pol A、pol D和pol E 是真核生物DNA复制过程中不可缺少的DNA聚合酶,属于真核生物DNA聚合酶B家族的成员。DNA 聚合酶pol D最早是由Byrnes JJ等[1]于1976年从牛骨髓中分离出来的,经过二十多年的研究,目前认为DNA聚合酶D在真核生物DNA复制、损伤修复、细胞周期调控和肿瘤产生等方面都发挥重要的作用。本文拟就DNA聚合酶D的结构和功能进行阐述。
真核生物DNA聚合酶D的亚基组成和结构
11亚基组成:DNA聚合酶pol D是一个多亚基聚合体。早期从哺乳动物组织中分离纯化的DNA聚合酶D主要由两个亚基组成,分别为125kD的催化亚基和50kD(或48kD)的功能尚未清楚的小亚基。Zhou 等人报道采用细菌病毒表达系统在昆虫细胞中表达出来的pol D两个亚基复合体具有聚合酶的活性。然而以酵母为研究对象时发现,从人体酵母菌s pombe 中分离纯化的DNA聚合酶D至少由4个亚基组成,即大分子的催化亚基pol3(125kD)和3个小分子亚基Cdc1(55kD)、Cdc27(54kD)和Cdm1(22kD),从啤酒酵母菌中分离出来的DNA聚合酶D则含有3个亚基,分别为催化亚基Pol3p(125kD)和2个小亚基Pol31p/H y2P(55kD)、Pol32p(40kD),编码酵母的2个催化亚基Pol3和Pol3p的基因与人的pol D125kD 催化亚基具有同源性,而编码Pol31p和Cdc1的基因与人的pol D50kD亚基具有同源性,这2个亚基都是真核细胞生长所必需的,并认为是pol D的核心部分。最近,利用pol D的125kD催化亚基抗体制备的免疫亲和层析柱从牛胸腺中分离出与DNA聚合酶D的125kD和48kD的亚基紧密结合的2个多肽,经测定其分子量分别为68kD和12kD[2]。对68kD的多肽进行顺序分析,发现它与人的编码KIAA0039蛋白的cDNA基因相似;而编码12kD的多肽基因与人cDNA 克隆AA402118基因具有同源性。由于p68/p66和p12分别与酵母的Pol32p/Cdc27和Cdm1的氨基酸顺序部分相似,而且通过分离纯化和酵母双杂交实验显示它们和pol D核心部分联系紧密,因此现在认为p68和p12为哺乳动物pol D的第3和第4亚基[3]。
采用cDNA克隆和Northern Blot等技术研究人的DNA聚合酶pol D的催化亚基,发现其基因PolD1位于第19号染色体q13.3~q13.4上。从人HepG2细胞中克隆得到的pol D催化亚基cDNA全长3 443bp,该基因片段可编码1107个氨基酸残基,分子量约为124kD,其C末端含有2个锌指结构域,N末端有增殖细胞核抗原(PCNA)结合位点。而人体酵母菌s pombe和中啤酒酵母菌的pol D催化亚基Pol3和Pol3p分别为1084和1097个氨基酸残基。人pol D 催化亚基的氨基酸残基顺序与人体酵母菌有54%相同,其中核心部分的氨基酸顺序相似性达63%;与啤酒酵母菌的氨基酸残基顺序有48%的相同,其中核心部分的氨基酸顺序相似性达64%,这表明真核生物的pol D催化亚基具有高度的保守性。
采用远PCR分析人-仓鼠杂交细胞的DNA,发现人pol D p50小亚基基因位于第7号染色体上。从鼠细胞中克隆得到的pol D p50小亚基基因组位于第11号染色体上,cDNA全长为1584bp,编码528个氨基酸,分子量为51kD,与人的pol D P50小亚基基因有93%的一致性和96%相似性,和酵母的Pol31p基因有34%的一致性和57%的相似性。用酵母双杂交系统分析发现鼠的pol D125kD催化亚基和人pol D50kD
小亚基相互结合,表明在体外不同种类间的pol D P50小亚基和P125催化亚基之间可以相互结合,证实它们结构的高度保守性。
真核生物pol D的第3个亚基在种属间并没有高度的保守性。人pol D P68蛋白与酵母的pol D第3个亚基比较,除了P68的C-末端氨基酸也有一个Qx xx xFF的PCNA结合区,且P68和Pol32p都有核酸结合区外,其余的氨基酸区域有较大区别。人pol D P68亚基有一个独有的富含脯氨酸的区域。采用Clustal W1.8系统比较pol32p和Cdc27、P68/P66和Cdc27、P68/P66和Pol32p的氨基酸排列,发现它们相互之间的氨基酸顺序只有15%~16%的一致性,但是这些氨基酸顺序一致或相似的区域正是这些蛋白的重要功能区域。
关于pol D的第4个亚基的存在仍有些争议。因为在出芽酵母中没有发现pol D的第4个亚基,而增殖酵母中有pol D的第4个亚基Cdm1存在,根据Cdm1氨基酸数目计算其分子量为18.5kD,在凝胶电泳中得到的该蛋白质分子量为22kD。取从牛胸腺中分离纯化的pol D的12kD蛋白的一段氨基酸序列QFD-LAWQYGPCTGITR经测序搜索后发现与人EST AA402118阅读框编码的一段肽链序列相似。但由于EST AA402118基因没有确定的起始阅读框,因此以人体酵母的第4个亚基Cdm1蛋白序列为基准来恢复人的EST AA402118顺序。从ATCC中得到EST 的cDNA克隆并进行测序,其含512个碱基,编码107个氨基酸,多肽分子量为12.4kD,其中从牛胸腺中分离纯化的pol D的12kD蛋白的特异氨基酸序列与其51~65的氨基酸序列一致。再将人的这段基因序列与人体酵母第4亚基Cdm1比较发现两者氨基酸序列有25%的一致性和39%的相似性。P12蛋白顺序与人体酵母第4亚基Cdm1相似的区域主要在C-末端,P12蛋白从48~94的氨基酸序列与Cdm1从96 ~142的氨基酸序列有44%相似[2]。
21全酶结构:由于真核生物pol D的亚基组成还没有完全确定,所以关于pol D的全酶结构也还处在争论阶段。目前研究pol D的亚基的分子组成主要通过分子筛凝胶层析和甘油梯度离心的方法。Johansson E等[4]采用分子筛分离纯化啤酒酵母pol D时发现它的3个亚基形成一个分子量为500~600kD的球状复合体,并初步认为可能是通过pol D的Pol32p亚基将pol D核心酶部分连接而形成双聚体。但是在体外研究啤酒酵母pol D的3个亚基复合体时发现它在溶液中是以单体形式存在。Zuo SJ等[5]利用细菌病毒感染昆虫细胞获得的人酵母Schiz osacharomyces p om be pol D,经分子筛纯化后发现其组成有两种形式:一种形式是以Pol3(125kD)、Cdc1(55kD)和Cdm1(22kD)3个亚基组成的单体复合物;另一种形式是Pol3(125kD、Cdc1(55kD)、Cdc27(54kD)和Cdm1(22kD) 4个亚基组成的双聚体复合物。对两种pol D复合物功能研究表明,四个亚基复合物催化DNA复制的效率要高于3个亚基复合物,和Johansson等的观点一致。Zuo SJ等[5]也认为人酵母Schiz osachar omyces p om be的第3个亚基Cdc27(54kD)在pol D4个亚基形成的双聚体复合物中起到连接的作用。从牛胸腺分离纯化的pol D经无SDS凝胶电泳后得到一条含有pol D4个亚基,分子量为520kD的蛋白质带,然而将该pol D复合物经分子筛后得到的蛋白质分子量要小于500kD,但又远大于pol D4个亚基单独的分子量总和。这表明该pol D复合物可能还含有其它与之结合紧密的蛋白质或新的亚基,还有可能该pol D是3个或4个亚基的双聚体复合物[6]。Shikata K等[7]发现虽然从细菌病毒感染的昆虫细胞中获得的重组人pol D蛋白经甘油梯度离心后计算分子量为430kD,约为pol D3个单独亚基P125、P125和P68分子量总和的2倍,但他们认为这是由于分子量计算的误差造成的,如果排除这些误差,那么人pol D的分子量为230kD,是3个亚基构成的单聚体。
真核生物DNA聚合酶D的功能
11pol D在DNA复制中的作用:真核生物DNA复制主要需要三种DNA聚合酶的参与:pol A、pol D和pol E。pol A催化DNA-RNA引物复合体的形成,pol D 和pol E催化DNA链的延伸。pol D本身不能直接和DNA结合,需要增殖细胞核抗原(proliferation cell nu-clear antigen,PCNA)和复制因子C(replication factor C,RFC)的参与来完成其催化DNA复制的功能。PCNA不能解开双链DNA,但可以自由地在DNA双链上移动,它的作用是稳定pol D与引物-模板的连接,并增加pol D的DNA聚合酶活性。在体外利用poly-dA#oligodT为底物研究从牛胸腺纯化的pol D时,发现PCNA可激活pol D的活性高达100倍以上。RFC是一种DNA依赖的ATP酶,可以被PCNA激活,它的主要作用是促使PCNA结合到引物-模板上。当pol A 催化RNA引物与DNA模板形成引物-模板复合物后,RFC取代pol A紧密连接在引物-模板复合物中起始DNA(iDNA)的3c末端,这时PCNA与DNA结合,随后pol D再结合到PCNA上形成可前进的pol D-PC-NA-RFC全酶复合物,开始催化先导链和冈崎片段的合成。当合成先导链时,pol D-PCNA-RFC全酶复合物结合到DNA模板上以后,开始沿着模板滑动,如果没有阻碍,可以合成至少5~10kD的DNA;当合成冈崎片段时,pol D-PCNA-RFC全酶复合物可以催化DNA 合成直到下一个冈崎片段的起始点,但合成冈崎片段除了pol D-PCNA-RFC全酶复合物外,还需要其它3种核酸酶RNase H、Fen-1和Dna2及连接酶的参与。
最近有报道认为pol D在催化DNA合成时,所形成的复制移动复合物还含有复制蛋白A(replication pro-tein A,RPA),它的作用是与RFC结合,使pol A-RFC 复合物分离并使pol A从DNA上解离下来,然后pol D 与RFC竞争结合RPA,最终使pol D与引物-DNA复合物结合[8]。
虽然PCNA是pol D行使复制功能所必需的,而且已知pol D催化亚基的N-末端和第3亚基的C-末端有PCNA结合区域,但pol D与PCNA之间的连接及如何相互作用仍未清楚。Zhang P等[9]利用生物素标记的PCNA overlay和PCNA单克隆抗体免疫沉淀法观察pol D的各个亚基与PCNA的连接,发现在细菌中表达并纯化的人pol D50kD小亚基与PCNA无直接作用,而从昆虫细胞中纯化的重组人pol D催化亚基可与PCNA结合。与此相反,Lu等[10]采用P50和PCNA多克隆抗体免疫沉淀法研究单个的从昆虫细胞中获得的重组人pol D催化亚基或50kD小亚基与PCNA的结合,及P125/P50两亚基复合物与PCNA 的结合时,结果表明pol D催化亚基与PCNA无直接作用,P50小亚基可与PCNA共同沉淀,还发现P50小亚基的N-末端是PCNA与之结合的区域,因此认为pol D必须通过50kD小亚基才能与PCNA连接。而酵母的单个pol D催化亚基或50kD小亚基均未发现与PCNA有直接作用。虽然pol D催化亚基本身具有DNA聚合酶和DNA3c-5c外切酶活性,但以poly-dA#oligodT为底物研究从昆虫细胞中纯化的重组人pol D催化亚基,结果表明其在体外不可以被PCNA激活。同样,重组的老鼠和酵母pol D催化亚基单独存在时也不能被PCNA激活,而重组P125/P50复合物可以被PCNA激活,这些结果表明P125和P50亚基都是pol D与PCNA结合并行使催化功能所不可缺少的。关于pol D第3亚基在DNA复制中的作用仍未清楚,虽然啤酒酵母的pol D第3亚基(pol32)可以和pol31小亚基及PCNA直接连接,但Hug hes P等[11]认为哺乳动物的P68亚基在pol D行使催化功能时并不是绝对必须的。P12亚基在DNA复制中的作用仍未见报道。
RFC也是构成pol D复制复合物的必要组分之一。RFC的P40亚基可以和pol D及PCNA直接连接而形成pol D-RFC-PCNA复合物,但pol D是通过哪个亚基与RFC结合的目前尚未清楚,RPA也可以和pol D结合。Yuzhakov A等[8]报道RPA可以和pol D P125/P50两亚基复合物直接作用;而Mo JY等[6]利用pol D p125单克隆免疫亲和层析柱和分子筛分离的pol D大分子复合物中含有RPA70kD和32kD2个亚基。
21pol D在DNA修复中的作用:研究从人细胞中提取出来的含有pol D和PCNA的复合物对紫外损伤的质粒DNA修复的作用时,用pol D和PCNA的抗体分别抑制复合物中pol D和PCNA的活性后,质粒损伤DNA的修复水平都会下降,而且pol D和PCNA的mRNA水平在紫外照射的细胞内均有显著上升。这些结果表明pol D在紫外照射的DNA损伤修复中起作用。
目前已知较高级真核生物体内的DNA碱基切除修复有两种途径:一种是依赖DNA聚合酶pol B的途径,其主要催化真核生物体内单个碱基的切除和修复,称碱基切除修复短途径;另一种是依赖PCNA的途径,在DNA链上有较多的错配碱基需要移走和替换时起作用,称碱基切除修复长途径。有研究者在体外重建人的DNA AP位点(apurinic/apy rimidinic sites)切除修复长途径模型,揭示了人的AP核酸内切酶、RFC、PCNA、pol D和/或pol E、FEN-1及DNA连接酶-I是有效完成DNA AP位点修复所必需的蛋白,缺少其中任何一种都会影响损伤DNA的有效修复。
生物体内的错配修复可以及时纠正DNA在复制过程中出现的碱基错误配对情况。对酵母体内的基因研究表明:3c外切酶FEN-1和Ex o1及5c外切酶pol D和pol E均参与DNA的错配修复。Longley MJ 等[12]在体外研究部分纯化的HeLa细胞核提取物的错配修复功能时,也认为pol D是完成错配修复所必需的。
31pol D在细胞周期中的作用:真核生物DNA复制发生在细胞周期的S期,关于真核生物DNA复制的调控机理尚未清楚。
Wu SM等[13]研究人急性淋巴细胞白血病Molt4细胞内pol D的表达水平与细胞周期的关系时发现pol D mRNA水平在G1/S期比其它时期增加了3倍,还发现pol D在S期可被磷酸化。对pol D p125催化亚基的氨基酸顺序研究表明:该亚基上有多个不同的蛋白激酶磷酸化位点。其中Ser207、Ser788、Thr83、Thr150、T hr238、Thr640这六个位点可被周期素依赖蛋白激酶(cyclin dependent kinases,CDKS)磷酸化。人酵母细胞pol D的P125亚基的各种对温度敏感突变体的出现会使酵母细胞生长出现明显的分化终止表型,这表明pol D参与酵母细胞的周期调控。在sf9昆虫细胞中共同表达人pol D P125亚基和各种周期素(Cyclin)及周期素依赖蛋白激酶,并经过P125亚基单克隆免疫亲和层析柱纯化后观察各种cyclin及cdks 对P125亚基磷酸化的影响,结果表明cdc2-cyclin E 可以使P125亚基磷酸化,而cdc2-cyclin A则不行,这表明pol D可能在G1期后期被磷酸化,催化DNA的合成。
除了P125亚基以外,pol D的P50和P68亚基上也有可被周期素依赖蛋白激酶磷酸化的位点,但目前还未有关于这两个亚基磷酸化作用的报道。
41pol D与疾病的关系:基因突变往往导致肿瘤产生。pol D P125催化亚基具有聚合酶和3c-5c外切酶活性,可以识别和切除损伤及错误配对的碱基并加以修复。P125催化亚基上有三个高度保守的具有外切酶活性的区域,当人为使小鼠体内的pol D P125催化亚基第2个外切酶活性区域Exoò上的天冬氨酸残基发生突变后,94%的小鼠在18个月内发生癌变或死亡[14]。
Wener综合征(WS)是一种遗传性疾病,其特征是患者机体产生早熟性衰老,体内基因易于突变,从而患癌几率增加。WS基因编码的蛋白WRn含有1432个氨基酸残基,其中间有一段氨基酸顺序与DNA解旋酶RecQ家族具有同源性,纯化的WRn具有3c-5c解旋酶和外切酶活性。现已发现WRn可以通过pol D的第3个亚基P68与pol D发生功能性的接合,在缺少PCNA的情况下,使pol D催化的核酸合成中碱基错配几率增高,但WRn对pol A和pol E催化的核酸合成过程没有影响[15]。
人视网膜神经胶质瘤基因产物(retinoblastom a g ene product,pRb)在控制细胞分裂、分化、凋亡和肿瘤的产生中起作用。它与E2F转录因子结合来调节E2F参与的转录过程。它本身受周期素依赖蛋白激酶的调节而发生磷酸化/去磷酸化的变化,以调控细胞的分化和增殖。与Rb结合的蛋白常具有LXCXE 的氨基酸结构域。Krucher NA等[16]采用共同免疫沉淀的方法发现pol D的P125亚基可以和Rb蛋白结合,Rb蛋白上有多个P125的结合区域,而P125上与Rb蛋白结合的区域,与其它Rb结合蛋白相似,是位于第711~715氨基酸残基上的LXCXE区,这表明pol D可能参与Rb蛋白介导的肿瘤产生。
展望
综上所述,真核生物DNA聚合酶pol D含有多个亚基,目前除了对催化亚基的功能略有了解以外,别的亚基的功能尚未清楚。关于pol D全酶的组成也有争议。在pol D的功能研究方面,现认为其不仅在真核生物的DNA复制、修复和细胞周期调控中发挥作用,还与肿瘤的发生有关[17]。此外,pol D和解旋酶及其它的在DNA复制和修复过程中发挥作用的酶和因子的关系也在研究当中。将来pol D的研究将会集中在两大方面:一方面是弄清楚真核生物pol D的亚基组成和相互作用;另一方面是pol D的功能,尤其是在肿瘤发生过程中的作用与机制需要深入的研究。
参考文献
1Byrnes JJ,Downey KM,Black VL,et al.A new mammalian DNA
pol ymerase w ith3c to5c exonuclease activity:DNA polymerase delta.
Biochemistry,1976,15(13):2817-2823.
2Liu L,M o JY,Esther M,et al.Identification of a fourth s ubunit of mammalian DNA polymerase D.J Biol Chem,2000,275:18739-18744. 3M ac-Neill SA,Baldacci G,Burgers PM,et al.A unified nomenclature for the s ubunits of eukaryotic DNA polymerase D.T rends Bioch em Sci, 2001,(26):16-17.
4Johansson E,M ajka J,Burgers PM.Structure of DNA polymerase D from saccharomyces cerevi siae.J Biol Chem,2001,276:43824-43828. 5Zuo S J,Bermudez V,Zhang G,et al.Structure and activity ass ociated w ith multiple forms of sch i zosacharomyces pom be DNA polymerase D.
J Bi ol Chem,2000,275:5153-5162.
6M o JY,Liu L,Leon A,et al.Evidence that DNA polymerase D isolated by immnoaffinity chromatography exhibits h i gh-molecular w eight char-acteristics and is associated w i th the KIAA0039protein and RPR.
Biochem,2000,39:7245-7254.
7Shikata K,Ohta S,Yamada K,et al.T he human homologue of fission yeast cdc27,p66,is a com ponent of active human DNA polymerase D.J Bi ol Chem,2001,129:699-708.
8Yuzhakov A,Kelman Z,Hurw itz J,et al.M ultiple competition reac-ti ons for RPA order the assembly of th e DNA polym erase D holoen-zyme.Embo J,1999,18:6189-6199.
9Zhang P,M o JY,Perez A,et al.Direct interaction of proliferating cell nuclear antigen w i th the p125catalytic s ubunit of mamm alian DNA pol ymerase delta.J Biol Chem,1999,274:26647-26653.
10Lu X,Tan CK,Zhou JQ,et al.Direct interaction of proliferating cell nuclear antigen w ith the small subunit of DNA polymerase D.J Biol Chem,2002,277:24340-24345.
11Hughes P,T ratner I,Ducoux M,et al.Isolati on and identification of the third subunit of mammalian DNA polymerase D by PCNA-affinity chromatography of mouse FM3A cell extracts.Nucleic Acids Res, 1999,27:2108-2114.
12Longley M J,Pierce AJ,M odrich P.DNA polymerase D is required for human mismatch repairin vitro.J Bi ol Chem,1997,272:10917-10921.
13Wu S M,Zhang P,Zeng XR,et al.Characteri zati on of the p125subunit of human DNA polym erase D an d i ts deletion mutants.J Biol Chem, 1998,273:9561-9569.
14Goldsby RE,Hays LE,Chen X,et al.H i gh incidence of epith elial can-cers in mice deficient for DNA pol ymerase delta proofreading.Proc Natl Acad Sci,2002,99(24):15560-15565.
15Kamath-Loeb AS,Johansson E,Burgers PM,et al.Fun ctional interac-tion betw een the Werner Syndrom e protein and DNA polymerase delta.Proc Natl Acad Sci,2000,97(9):4603-4608.
16Krucher NA,Zygmunt A,M azloum N,et al.Interaction of the retinoblastoma protein(pRb)w i th the catalytic s ubunit of DNA poly-merase D.Oncogene,2000,19:5464-5470.
17Li B,Lee M Y.T ranscriptional regulation of th e hum an DNA poly-merase D catalytic subunit gene pold1by p53tumor suppressor and Sp1.J Biol Chem,2001,276:29729-29739.
(收稿日期:2003-03-10)
(本文编辑:郭霞)
嗜热微生物的研究进展及应用 宜春学院化学与生物工程学院03生物教育张志刚 指导老师：姜琼 摘要嗜热微生物是一类最适生长温度高于45?C的微生物，嗜热酶是从嗜热微生物中分离得到的一类热稳定性酶，由于嗜热酶分子内部有很多氢键、二硫键及紧密而有韧性的空间结构的存在，所以嗜热酶在高温条件下具有很强的稳定性，高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，嗜热酶在许多方面都有广泛的应用。当前获得嗜热酶的方法主要有：直接从嗜热微生物中提取、利用基因工程技术在中温宿主中表达和利用定向分子进化技术筛选。目前酶的纯化主要采用层析法、高效液相色谱法和电泳法等方法。由于环境恶化,能源危机,全球变暖等原因, 嗜热酶的开发和应用将出现更加诱人的前景。 关键词嗜热微生物；嗜热酶；嗜热机制；应用 Thermophilic microorganism research progress and application Zhang Zhigang College of Chemistry and Bioengineering, Bioengineering (Biology education), YiChun University Advisor: Jiang Qiong Abstract Thermophilic microorganisms is a type of microorganisms that the most suitable growth temperature is above 45?C,the thermophilic enzyme is a type of a thermostable enzyme separated from the thermophilic microorganism, because there is a lot of hydrogen keys and two-sulphur keys in the thermophilic enzyme molecule, so the thermophilic enzyme have a very strong stability in the hot condition, as well as there is a stronger fastness to organic solvent、eradicator and denaturant,the thermophilic enzyme have an extensive application in many fields.The method which obtained the thermophilic enzyme includes three kinds at present: distilled directly from the thermophilic microorganism, expressed in the mild host making use of a genetic engineering technique and sieved with the directional molecule evolution technique. At present the enzyme purification methods are:chromatography、HPLC and electrophoresis. Due to the cause of worsening environment, energy crisis,warmer weather, the development and application of the thermophilic enzyme will appear more captivating foreground. Keywords Thermophilic microorganisms; Thermophilic enzyme; Thermophilic mechanism; Application 最适生长温度高于45?C的微生物称为嗜热微生物，是在高温环境下生存的一类微生物，它们有其自己的适应机制和特定的新陈代谢能力，具有独特的基因类型、特殊的生理机制及代谢产物，是地球上的边缘生命形式。嗜热酶是从嗜热微生物中分离得到的一类热稳定性酶，具有化学催化剂无法比拟的优点，尤其是在高温条件下保持极好的稳定性，使很多高温化学反应得以实现从而将极大的促进生物技术产业的发展。近年来，人们已从嗜热微生物中分离得到多种嗜热酶。今后，还应继续在嗜热酶的结构与功能、应用等方面作深入而全面的研究。本文主要对嗜热酶的研究进展及应用作一综述。 1 嗜热微生物的分类及其酶的种类和特点 1.1 嗜热微生物的分类 嗜热微生物是一类生长温度跨度在40～150℃之间的微生物,它可分为轻度嗜热(最适生长温度低于60℃)、中度嗜热(最适生长温度低于85℃) 和极度嗜热(最适生长温度大于85℃) ,主要分布于地热环境
产脂肪酶细菌的筛选与鉴定 姓名：范丽萍学号：0911040203 班级：生09级6班 前言 1.脂肪酶的简介 脂肪酶(Lipase，EC3．1．1．3，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶u J。在动植物体和微生物中普遍存在，它是一类特殊的酯键水解酶，催化如下反应：甘油三酯+水=甘油+游离脂肪酸。它的另一重要特征是只作用于异相系统，即在油(或脂)一水界面上作用，对均匀分散的或水溶性底物无作用即使作用也极缓慢，因此脂肪酶也可说是专门在异相系统或水不溶性系统的油(脂)一水界面上水解酯的酶。 2.微生物产脂肪酶的研究历程 脂肪酶是最早研究的酶类之一(见表1)。从1834年兔胰脂肪酶活性的报道至如今的微生物脂肪酶已有上百年的历史。微生物发酵法的应用前景要远远大于提取法及化学合成法。如今，黑曲霉、白地霉、毛霉等微生物来源的酶已制成结晶。根霉、圆柱假丝酵母、德氏根霉、多球、，粘质色杆菌等也得到高度提纯，并对它们的理化性质[1]开展进一步研究。早在60年代，假丝酵母[2]、曲霉、根霉等菌产生的脂肪酶相继在日本进入商品生产(见表2)。我国60年代也已开展脂肪酶的研究开发。1967年，中科院微生物所筛选到解脂假丝酵母(Candida lipolytica)AS2．1203并于1969年制成酶制剂供应市场。 表1 常见的产脂肪酶的徽生物 菌名 黑曲霉荧光假单胞菌 白地霉无根根霉 毛霉圆柱假丝酵母 巢子须霉德氏根霉 多球菌棉毛状酶 圆弧青霉粘质色杆菌 表2 常见商品酶 enzyme abbreviation manufacturer Candida cylindraces CC Sigina,amano Aspergillus niger AN Amino,fluka Rhisopus delemar RD amano 就微生物脂肪酶而言，虽然在产酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业应用上已研究了几十年，但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、酶的来源不足、提纯困难以及应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多。因此在微生物产脂肪酶方面还有很大的研究空间，本实验主要就是通过对微生物的培养，筛选出产脂肪酶活力高的细菌。 3.微生物产脂肪酶的用途
微生物果胶酶研究进展 果胶质广泛存在于高等植物中，是植物细胞胞间层和初生壁的重要组成成分，植物的细胞组织间起“黏合”作用。近几年来，果胶质的生物降解日益引起国内外学者的广泛关注。能够分解果胶质的酶被称作果胶酶(pectinase)，它广泛存在于各种微生物中，细菌、真菌和放线菌都能产生相关酶类。果胶酶类的应用领域非常广泛，不仅可用于食品工业如水果加工及葡萄酒生产等方面，还广泛应用于麻类脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处理和饲料等行业中。果胶酶主要分为原果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、裂解酶和果胶酯酶等几大类，研究果胶酶各组分的性质，有利于果胶酶的单一酶种的开发利用。同时微生物果胶酶的分子生物学研究将有助于更合理地利用果胶酶。 1、果胶简介 果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起[1]。它存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白(extensin)[2]相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态．果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同，其大致的结构简图如图1所示，总体可分为光滑区(smooth region)和须状区(hairy region)两部分，主要由HGA、RG-I和RG-II三个结构区域构成，其中RG-II常以二聚体的形式存在．同其它植物多糖一样，果胶也是多分子的、多分散的、多结构的、有高级空间构象的，也具有一定的相对分子质量分布。
海南大学（儋州校区）农学院 生物技术专业课程论文（设计） 题目：果胶酶高产菌种选育研究进展 学生：王鹤松 学号： B0704030 专业年级： 2007级生物技术（1）班 指导教师：朱稳 二o一o年六月二十五日
果胶酶高产菌种选育研究进展 王鹤松 （海南大学海南儋州571737 B0704030） 摘要：果胶酶是能协同分解果胶质的一组酶的总称，在生产，造纸，食品发酵等方面有广泛应用。本文对酸性果胶酶和碱性果胶酶生产菌种的特点分别进行了介绍，并从传统育种、诱变育种和基因工程育种三个方面对果胶酶产生菌的高产育种技术的研究进展进行了综述。关键词：果胶酶；微生物；选育；影响因素 Development on the Breeding of Pectinase High-yielding Strains Hesong Wang ( Hainan University, Danzhou, Hainan ，571737，B0704030 ) Abstract：For pectinase is coordinated with pectin can decompose the floorboard of a group of enzymes in production, papermaking, fermentation etc, food is widely used. Based on acid and alkaline pectic enzymes for pectinase strains of production were introduced, and from conventional breeding, mutation breeding and gene engineering to produce three aspects of bacteria for pectinase high-yielding breeding technology is reviewed. Key words：pectinases；microbe；mutafacient；influencing factor 果胶酶（pectinases）是指能协同分解果胶质的一组酶的总称，是一种复合酶（由D-半 乳糖醛酸以α-1，4糖苷键连接形成的直链状的聚合物）。它通常包括原果胶酶（PPase）、多 聚半乳糖醛酸酶（PG）、裂解酶（PL）和果胶酯酶（PE）等4类。如果从生产、应用领域 和最适用pH值环境来划分，果胶酶通常可以分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。酸性果胶酶通 常是指内聚半乳糖醛酸酶（endo-polygalacturonase，EC3.2.1.15）[1]，因为大多数的聚半乳糖 醛酸酶的最适pH值为3.5~5.5。它是以水解作用方式无规则切断果胶酸分子的α-1，4糖苷 键，主要应用于食品工业中果蔬汁和果酒的提取和澄清。碱性果胶酶一般多指聚半乳糖醛酸 裂解酶（polygalacturonate lyase，EC4.2.2.1），它是以反式消去作用方式裂解果胶酸分子的α -1，4糖苷键[1]，将复杂的果胶分解成小分子，如半乳糖醛酸。碱性果胶酶在碱性范围内具有较高活性，其主要应用于植物病毒的纯化、诱导植物抗病、纸浆漂白、棉织物处理、含果胶污水处理、咖啡和茶的发酵生产，以及榨油、木材防腐、洗涤剂和家禽饲料加工[2]等。并且，果胶酶在全世界食品酶的销售额中占25%[3]。因此，果胶酶的菌种选育尤为重要，通过对酸碱性果胶酶菌种的种群特点的深入研究，更有利于菌种进行选育，获得高产的优良菌株，并通过对影响微生物产果胶酶的各种因素进行分析，可以更深层次为果胶酶的选育提供帮助。
碱性蛋白酶是一类适宜于在碱性条件（ｐＨ９￣１０左右）下水解蛋白质肽键的酶类，是一类非常重要的工业用酶，广泛存在于动、植物及微生物体中。自１９４５年瑞士Ｄｒ．Ｊａａｇ等人［１］在地衣芽孢杆菌中发现了碱性蛋白酶以来，碱性蛋白酶的研究取得了极大的发展，有数据显示［２］，全世界工业用酶每年销售额大约为１亿美元，在所有的工业用酶制剂中，７５％是水解酶，而蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的６０％左右［３］。碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途 ［４－６］ 。由于微生物蛋白酶均为胞外 酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，且相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力，易于实现工业化生产。因此，碱性蛋白酶研究成为蛋白酶研究的热点［７－９］。本文综述了碱性蛋白酶国内外研究现状、高产菌株的选育新途径、基因结构与功能，并对碱性蛋白酶在今后的发展进行了展望。 １微生物碱性蛋白酶研究现状１．１碱性蛋白酶主要产生菌种 目前，碱性蛋白酶主要产生菌种有芽孢杆菌属细菌［１０，１１］和链霉菌（如灰色链霉菌、费氏链霉菌等）以及酵母［１２］。我国用于工业化生产的蛋白酶菌种主要有：地衣芽孢杆菌２７０９、地衣芽孢杆菌Ｃ１２１３以及短小芽孢杆菌２８９和２０９等。 １．２微生物碱性蛋白酶研究现状１．２．１国外研究现状 目前，国外碱性蛋白酶主要应用于洗涤及皮革等行业中， ９９％以上洗涤剂均添加了碱性蛋白酶，因此市场需求出现了 供不应求的现象。在国外，高产碱性蛋白酶菌株的选育主要通过基因工程技术和蛋白质工程手段进行工业微生物菌种的定向选育，目的性强。ＴｓｕｙｏｓｈｉＮｏｎａｋａ［１３］等人研究了枯草杆菌杆菌抗氧化性稳定性并期望能应用于洗涤剂行业。Ｋｕｎａｍｎｅｎｉ Ａｄｉｎａｒａｙａｎａ［１４］等人研究了枯草芽孢杆菌ＰＥ－１１的热稳定性， 发现该酶在６０℃处理了３５０ｍｉｎ酶仍保持１００％活力。Ｒａｊａ ＮｏｏｒＺａｌｉｈａＲａｊａＡｂｄＲａｈｍａｎ等人［１５］对耐有机溶剂的碱性蛋白 酶进行了酶学性质研究，利用硫酸铵盐析及层析方法纯化酶，酶活力提高了近１２４倍，分子量约为５１，０００Ｄａ。当前，极端碱性蛋白酶和高活力碱性蛋白酶工程菌构建成为国外碱性蛋白酶的热点 ［１６］ 。 １．２．２国内研究现状 目前我国在洗涤行业中添加碱性蛋白酶已有初步应用且占有率有上升趋势。我国碱性蛋白酶的研究也发展很快。邱秀宝采集３８个不同土样，从中筛选到一株产碱性蛋白酶的嗜碱性短小芽孢杆菌Ｒ１１５，经亚硝基胍和利福平处理，获得一株具有高产稳产的碱性蛋白酶变异株Ｂ４５。徐子渊等将碱性蛋白酶生产菌２７０９进行诱变育种，获得变异株Ｃ１２１３，酶产量提高了４０％。郑铁曾等对如何提高Ｃ１２１３碱性蛋白酶活力进行了研究，通过优化设计，酶活力达到２１０００Ｕ／ｍＬ，相对原始菌株 ２７０９酶活提高了１７０％。冯清平等也从土样中筛选到一株产 碱性蛋白酶的嗜碱性地衣芽孢杆菌５３－Ａ６，对其原生质体进行复合诱变处理，从中选育出了耐高温、 耐碱的碱性蛋白酶高产株。在生物技术领域中，碱性蛋白酶可作为工具酶用于核酸纯化过程中的蛋白质（包括核酸酶类）去除，因为蛋白酶作用条件温和，对ＤＮＡ的完整性不会造成破坏。刘成圣等人从海洋弧菌（Ｖｉｂｒｉｏｐａｃｉｎｉ）Ｘ４Ｂ－７分离纯化得到电泳纯碱性蛋白酶，该酶可用于解聚组蛋白，ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳证明：酶对 ＤＮＡ酶有降解作用，而对ＤＮＡ没有降解作用，该酶有望应用 于核酸的提取。此项研究为蛋白酶的应用指明了一个新发展方向。目前，我国碱性蛋白酶研究总体趋势发展较好，主要集中在高温耐碱性蛋白酶和常温碱性蛋白酶的研究，但是酶活力不高仍是当前工业化生产的一个最主要的限制因素。高产碱性蛋白酶基因的筛选、克隆及表达方面的研究将为碱性蛋白酶活力的大幅度提高做出巨大的贡献。 ２高产菌株的选育 从自然界筛选得到的碱性蛋白酶出发菌株碱性蛋白酶活力一般比较低，有些酶特性不能直接应用于工业化生产，为此，必须对产酶菌株进行定向或非定向改造以提高原始菌株产酶能力及特性以符合生产要求，目前主要采取以下方法：２．１物理、 化学因子诱变微生物源碱性蛋白酶研究进展 包巨南，兰立新，肖怀秋 （湖南化工职业技术学院，株洲４１２００４） 摘要：通过查阅国内外大量文献资料、分析，从微生物碱性蛋白酶国内外应用研究现状、高产菌株的选育方法、基因结构及功能等方面进行了综述，并对微生物碱性蛋白酶的发展提出了几点建议。关键词：微生物；碱性蛋白酶；研究进展中图分类号：Ｑ９３；ＴＱ９２５ 文献标识码：Ｂ 收稿日期：２００７－０２－０１ 作者简介：包巨南（１９６８—），男，湖南岳阳人，大学，实验师，现主要从事化学工程、生物化工教学及研究，发表论文有《含铅废渣中铅的回收利用》《枯草芽孢杆菌Ｂ．ＳＵＢＴ１２酶学性质研究》等。 文章编号：１００２－８１１０（２００７）０３－００５０－０３ 第３４卷第３期 ２００７年５月 酿酒 ＬＩＱＵＯＲＭＡＫＩＮＧ Ｖｏｌ．３４．№．３Ｍａｙ，２００７ ?５０?
食品酶学论文 题目：果胶酶高产菌种的选育研究 学生：张晨雪 学号： 20104414 专业年级：质检4班 2011年12月09日
果胶酶高产菌种的选育研究 张晨雪质检4班20104414 摘要：果胶酶是能协同分解果胶质的一组酶的总称，在生产，造纸，食品发酵等方面有广泛应用。本文对酸性果胶酶和碱性果胶酶生产菌种的特点分别进行了介绍，并从传统育种、诱变育种和基因工程育种三个方面对果胶酶产生菌的高产育种技术的研究进展进行了综述。 关键词：果胶酶；微生物；选育；影响因素 果胶酶是指能协同分解果胶质的一组酶的总称，是一种复合酶（由D-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键连接形成的直链状的聚合物）。它通常包括原果胶酶、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、裂解酶（PL）和果胶酯酶（PE）等4类。如果从生产、应用领域和最适用pH值环境来划分，果胶酶通常可以分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。酸性果胶酶通常是指内聚半乳糖醛酸酶[1]，因为大多数的聚半乳糖醛酸酶的最适pH值为3.5~5.5。它是以水解作用方式无规则切断果胶酸分子的α-1，4糖苷键，主要应用于食品工业中果蔬汁和果酒的提取和澄清。碱性果胶酶一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶，它是以反式消去作用方式裂解果胶酸分子的α-1，4糖苷键，将复杂的果胶分解成小分子，如半乳糖醛酸。碱性果胶酶在碱性范围内具有较高活性，其主要应用于植物病毒的纯化、诱导植物抗病、纸浆漂白、棉织物处理、含果胶污水处理、咖啡和茶的发酵生产，以及榨油、木材防腐、洗涤剂和家禽饲料加工[2]等。 产果胶酶的微生物种群及其特点 在微生物中,细菌、放线菌、酵母和霉菌都能代谢合成果胶酶，但主要以霉菌中的曲霉以及杆菌为主。由于真菌中的黑曲霉属于公认安全级,其代谢产物是安全的,因此目前市售的食品级果胶酶主要来源于黑曲霉，最适pH 值一般在酸性范围[4]。 1.1产酸性果胶酶的微生物种群及其特点 生产酸性果胶酶的菌种以霉菌居多，已见报道的产果胶酶的霉菌种类大约包括20个属，如曲霉属.、灰霉菌属.、镰孢菌属.、炭疽菌属.、核盘菌属.和玉圆斑菌属等。目前，黑曲霉、根霉和盾壳霉作为产果胶酶的菌株已经商品化。国内外对霉菌发酵产果胶酶的研究又主要集中在曲霉属中，而对于曲霉属中研究最多的是黑曲霉。其原因是，果胶酶被广泛应用于食品工业中，而生产食品酶制剂的菌株必须是安全菌株。黑曲霉分泌的胞外酶系较全，不仅可以产生大量果胶酶，而且黑曲霉是公认的安全菌株。另外，黑曲霉产生的果胶酶最适pH值一般在酸性范围内，这也是其被应用于食品工业行业中的原因之一。彭霞薇等人[8]对草酸青