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棉花DNA的提取及其SSR分子标记体系的建立

第25卷第2期2007年4月

石河子大学学报(自然科学版)

JoumalofShiheziUIliversity(Natu瑁lScience)

V01.25No.2

Apr.2007

文章编号:100r7.7383(2007)02-015m03

棉花DNA的提取及其SSR分子标记体系的建立

田海燕1一,田新惠1.一,李艳军2,孙杰2

(1新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子832003;2石河子大学农学院,新疆石河子832003)

摘要:针对棉花富含酚类、多糖等次生物质的特点,建立了一种简便、快速的提取高纯度棉花基因组DNA的方法。

同时建立了适合棉花ssR标记的体系和实验方案,并对所构建的QrL定位群体进行了ssR-PcR检测,得到了清晰的多态性SsR标记,为sSR分子标记技术在棉花育种中的应用打下了基础。

关键词:棉花;DNA提取;SsR

中图分类号:S562文献标识码:A

简单重复序列(siH耐e洲畔q)eat,SsR)又称微卫星DNA(MicIosatelliteDNA),是一种由2~5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列,它广泛分布于整个真核生物基因组的不同座位上,每个座位重复单位的数量可能不完全相同,因而形成多态性。SSR可用于分子标记。由于SsR标记为共显性标记,具有遗传方式简单、多态性好、不需要大量的DNA、且具有操作简便、重复性好、稳定可靠等特点¨oJ,近年来,此方法已发展成为一种技术成熟、程序标准的分子标记方法,被广泛用于遗传作图、种质鉴定、分子标记辅助选择等研究领域。

棉花是我国重要的经济作物之一,由于其基因组复杂、遗传背景不清晰和DNA提取困难等因素,棉花分子标记的研究明显滞后。本实验以棉花为试材,通过对不同植物基因组DNA提取方法的比较分析,针对棉花富含酚类、多糖、单宁等次生物质的特点,采用C1’AB法并加以改进,获得了一种简便、快速的提取高纯度棉花DNA的方法,在此基础上建立了适合棉花SSR标记的体系和实验方案,为棉花SsR分子标记研究奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1供试材料

试验于石河子大学农学院试验站进行,供试材料为陆地棉石l<5与新陆早24号的F2:3家系,供试土壤为灌耕灰漠土,土壤肥力中等。(30cm+50cm+30cm+60cm)宽窄行配置,地膜覆盖,膜上点播,株距13cm。F2:3家系分别于2005年和2006年4月播种,田问管理同大田常规方法。3~4片真叶期分别取各单株幼嫩叶片,液氮速冻后保存于一70℃的低温冰箱中备用。

1。1.2主要试剂

DNA提取缓冲液成分为:0.35mol?L一葡萄糖,O.1n10L?L一1Tris.HCL(pH8.0),0.0D5瑚lol?L一1EDTA(pH8.0),2%PvP加(W/V),0.1%抗坏血酸(W/V),1.0%的8-巯基乙醇(V/V),0.1%的DIECA(W/V)。

核裂解缓冲液:0.1II札?L一%s.HCL(pH8.O),1.4moL?L一1NaCL,0.02埘loL?L一’EDTA(pH8.0),2%C1’AB(W/V),2%PⅥ‰(W/V)。

丙烯酰胺、PVP柏购自上海生物工程公司;两酶、dN|IPs等购白天为时代。其它试剂均为国产分析纯。1.2方法

1.2.1DNA的提取及纯化

自一70℃的冰箱中取出冷冻材料约O.39,立即放人加有液氮的研钵中,快速研磨成粉末,待液氮挥发后装入1.5mL的离心管中,加入4℃预冷的DNA提取缓冲液1Ⅱ1L轻轻混匀。4℃,3000r/rIlin离心1IIlin。弃去上清液,保留沉淀。加入500皿65℃预热过的核裂解缓冲液,用无尖的枪头抽提使其混匀,

收稿日期:200r7舵.10

基金项目:新疆生产建设兵团科技局博士资金资助项目(04BszJ∞)

作者简介:田海燕(1979.)女,硕士生,从事作物遗传育种研究。e-IIlail:lianllajy册一92l@126.c咖。通讯简介:孙杰,副教授,博士。从事作物遗传育种研究。e.Ⅱlail:smljiezh@yahoo.corn。

第2期田海燕,等:棉花DNA提取及其ssR分子标记体系的建立15l65℃水浴30~50IrIin,每隔lOIllin轻轻翻转1次,使其混匀。加等体积约500汕的氯仿:异戊醇(24:l,V/v),上下轻轻混匀。12000r/IrIin离心10rnin,用无尖的枪头取上清液于1.5—IlL离心管中,用等体积氯仿:异戊醇(24:1,v/V)继续抽提2次。加0.6倍体

积的冰冷异丙醇,缓慢颠倒离心管,直至有絮状沉淀集结,放在一20℃的冰箱中使其沉淀30IIlin。10000r/min离心10rnin,弃去上清液,加入500止70%的乙醇洗DNA2次,空气中干燥10111in,加入200吐TE后放人65℃的水浴中30IIlin,10000r/rnin离心5min。加入2汕RNA酶A,37℃温育1h。加等

体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1,V/V)抽提,取上

清。加o.1倍体积的3m01.L.1NaAc(pH5.2),混匀

后,缓慢加入2倍体积的冰冷的无水乙醇,缓慢摇

动,放入一20℃冰箱中静置30min,将絮状沉淀轻轻

钩出,转到1.5mL离心管中。再用70%乙醇洗1

次,空气干燥,溶于100皿的,IE中,于一20℃的冰箱

中保存备用。1.2.2DNA的检测取5乩DNA溶液在含溴化乙锭(EB)的0.8%的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定,电泳缓冲液为l×TAE,泳动速率为7V/伽,紫外灯下观察实验结果。1.2.3SSR分析反应体系为l雌L,其中10×buifer1皿,2.ommoL?L一1M孑+l肛L,o.2姗oL?L一1dNTP§1弘L,程莲板DNA1驰,引物2止,Taq酶0.5U,加ddH20至10止。反应体系各样品依次加好后,加1滴石蜡油。扩增反应条件:95℃预变性2rnin;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸lmin,30个循环,72℃延伸7“n。反应完

毕,加2止加样缓冲液,取1.2止扩增产物经10%的聚丙稀酰胺电泳,电泳缓冲液为1×,I’BE,170V,60“n。ssR标记PcR扩增产物,文献[9]中的方法进行银染。

2结果与分析

2.1总DNA完整性检测

如图1所示,用本方法提取的棉花基因组DNA电泳谱带明亮清晰,无拖尾降解现象,无残留。说明该方法提取的基因组纯度高、分子量大。

l~8:部分F2单株叶片的DNA;

M:标准分子量I舢bda

DNA/HindⅢ

图1总DNA完整性凝胶电泳分析

2.2SSR_PCR扩增结果

上述方法提取的作图群体棉花基因组DNA,用不同ssR引物进行了SsR.PCR扩增,扩增产物经非

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),银染检测。结果表明:利用此方法提取的DNA进行SSR分析,条带清晰,多态性好(图2)。由此可见,本研究所采用的提取棉花组DNA的方法能满足ssR分析,同时进行sSR.PCR扩增的反应条件和反应体系也较理想。图2SSR标记(JESPRl90)在作图群体中的分离

3讨论君冀戛茎罢鬣篇笔黼嚣淼慧

3.1棉花总DNA的提取难以提取的主要原因。而且棉花中的单宁和色素类

在棉花的DNA提取中,多酚和多醣类物质是影物质还能直接影响Taq酶的活性,导致ssR扩增的响DNA提取的主要障碍。由于在细胞破碎时其自失败‘1

0|。针对上述问题,我们在C1’AB法的基础上

152石河子大学学报(自然科学版)第25卷

通过下述方法解决这个问题。首先是在提取缓冲液中加入酚氧化酶抑制剂Dm队和抗坏血酸,从而阻止酚类物质的氧化,避免其与DNA的不可逆结合,这样不但可以提高DNA的纯度,而且可以得到较多DNA;其次是在提取液中通过加入高浓度的酚结合剂PV%,去除棉花中富含的酚类物质。同时利用在乙醇的盐溶液中DNA的沉淀速度远远大于色素、多糖和酚类等其它物质的原理,在加入乙酸钠、无水乙醇使DNA沉淀出现后,立即将其挑出,进一步排除多糖、色素等其它杂质。另外,为了获得高质量的DNA,不可过分追求简化步骤、快速,除了方法上的选择外,还应在操作技术上严格要求。

通过上述方法提取的DNA,其唰OD280值一般为1.8—2.0。琼脂糖凝胶电泳表明DNA完整,质量较好,无RNA的存在。SsR分析的结果表明,其纯度完全可以满足PCR等分子生物学的要求。3.2ssR标记体系的建立

SSR标记信息含量高,可用来高效、准确的分析生物体中的遗传变异,在农作物研究中具有良好的应用前景。SsR标记是基于的PCR技术,它不仅有利于标记分析的自动化,而且对基因组DNA的质量要求相对较低,DNA用量较少,利用与目标性状紧密连锁的分子标记可在生育早期阶段进行选择,从而大大提高育种效率,加快育种进程。

为了使SsR标记技术在棉花遗传研究中发挥更大的作用,保证其稳定性与高效性,需要研究各个环节的适宜条件,以获得最佳结果。在大量试验的基础上通过比较研究得到了优化的SsR体系,该体系稳定性好,分辨率和效率高。研究发现影响棉花sSR体系效果的首先是DNA纯度,高纯度的DNA是该技术的基本保证;其次是退火温度,合适的退火温度条带清晰、特异性好,非特异性带会相应减少。在此扩增体系中,M孑+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响,在本实验的PCR反应中,M孑+浓度为O.2聊110L?L-1为宜。另外,在电泳与染色过程中,胶的质量好坏以及染色过程中冲洗时间的长短同样也影响结果的优劣。

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Isolati伽of‰ticm忱andEstaMishment0fSSRR昀Icti伽syst咖iIlCo洳n

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CTAB(cetyltri啪nlyl删唧i啪bmnlide)

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Keywords:cotton;DNAext瑚lction;SSR

棉花DNA的提取及其SSR分子标记体系的建立

作者:田海燕, 田新惠, 李艳军, 孙杰, TIAN Hai-yan, TIAN Xin-hui, LI Yan-jun,SUN Jie

作者单位:田海燕,田新惠,TIAN Hai-yan,TIAN Xin-hui(新疆兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子,832003;石河子大学农学院,新疆石河子,832003), 李艳军,孙杰,LI Yan-jun,SUN

Jie(石河子大学农学院,新疆石河子,832003)

刊名:

石河子大学学报(自然科学版)

英文刊名:JOURNAL OF SHIHEZI UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)

年,卷(期):2007,25(2)

被引用次数:1次

参考文献(10条)

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本文是一种适合于棉花这样高含酚类植物进行DNA提取的方法,提取程序中增加了DIECA、PVP40等对棉花酚类物质氧化有抑制作用的试剂,简化并改进了本实验室常用的棉花总DNA提取方法的步骤,使棉花总DNA能够快速高质量提取,避免了以往的棉花总DNA提取过程中棉酚的氧化对DNA提取质量的影响,提取的DNA能很好地进行SSR-PCR分析.本法提取的棉花总DNA呈乳白、疏松的丝状、干后为透明状,能很好的溶解在TE或ddH2O中.用本方法提取的棉花总DNA作为模板用JESPR系列SSR标记对其进行SSR-PCR扩增,可以扩增出清晰的条带.

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对棉花DNA提取程序和SSR反应体系进行了研究.利用正交设计对模板DNA、引物、Taq酶和Mg2+浓度4种成分以3个梯度进行优化和选择,结果表明,最优反应体系为15 μL,其中含有:10×Taqbuffer 1.5 μL、Mg2+(25 mmol/μL)1.5μL、dNTPs(25 mmol/μL)2.0 μL、引物 (20 pmol/μL) 各2.0μL、Taq酶(2.0U/μL)0.15μL、DNA模板(25 ng)3.0 μL、ddH2O补至15 μL.采用建立的反应体系,利用8对引物对3个品种进行扩增,6%的变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测结果显示该体系扩增结果清晰稳定.

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,从而简单快速的获得高质量棉种基因组DNA.紫外检测与琼脂糖凝胶电泳检测结果均表明,所得DNA纯度高,完整性好.另外,SSR分析结果也显示,扩增带型清晰易辨,重复性与稳定性好.相比常规的以棉花幼苗叶片为材料的DNA提取法,本方法在降低实验成本的同时大大提高了工作效率.

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,OD260nm/OD280nm平均值达到1.900,OD260nm/OD230nm平均值1.659,琼脂糖电泳检测表明所提取的DNA较完整,RNA含量少;通过对重要参数进行摸索和优化试验,建立一套稳定可靠、扩增效果好、可重复性强的适用于棉花的SRAP反应体系:25μL的反应体系中,模板DNA量30ng、2.5mmolm/LMg2+浓度、

0.80μmol/L的上下游引物、200μmol/L的dNTPs以及Taq酶1U.

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10.学位论文刘学堂棉花黄萎病菌gDNA的RAPD分析、RG克隆及分子生物学鉴定1998

本文链接:https://www.doczj.com/doc/be1470741.html,/Periodical_shzdxxb200702005.aspx

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