AFLP分子标记技术及其应用
孙晓鹏
(北京师范大学生命科学学院生态学专业)
摘要:扩增片段长度多态性(AFLP,Amplified restriction fragment polymorphism),是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos 发展起来的一种检测DNA多态性的分子标记技术。文章主要讲述该技术的原理、流程及特点,并从以下三个方面讲述该技术的应用情况:动物学方面,讲述其在动物遗传学,动物系统学,性别鉴定与繁殖行为研究上的应用;植物学方面,讲述其在种质资源鉴定,作物育种上的应用;医学方面,讲述其在肿瘤,遗传病,流行病学方面的进展。文章还分析了AFLP技术的优缺点并展望了其应用前景。
关键词:AFLP,分子标记技术,应用
目前遗传标记主要有4种类型,即形态标记(Morphological Markers)、细胞标记(Cytological Markers)、生化标记(Biochemical Markers)和分子标记(Molecular Markers) [1]。分子标记一般指DNA标记。分子标记依据所用的分子生物学技术,大致分为三大类:(Ⅰ)以电泳技术和分子杂交技术为核心,其代表性技术有RFLP和DNA指纹技术(DNA Fingerprinting) 。(Ⅱ)以电泳技术和PCR技术为核心,其代表性技术有RAPD( Random amplified polymorphism DNA) 、SSLP(Simple sequence length polymorphism ,或称Sequence-tagged microsatellitesite, STMS)和AFLP。(Ⅲ)基于DNA芯片技术的分子标记,即SNP[ 2-4 ]。其中,扩增片段长度多态性(AFLP,Amplified restriction fragment polymorphism),是1993年荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的方法,已获欧洲专利局的发明专利。该技术具有多态性丰富、灵敏度高、稳定性好、可靠性高、不易受环境影响等优点,近年来广泛应用于生命科学各项研究中。
1. AFLP分子标记技术原理、流程及特点
1.1. AFLP分子标记技术原理
AFLP技术是基于PCR反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同,基因组DNA经限制性内切酶酶切后,产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板,用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增,选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性,只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性[5]。Vos等(1995)曾对AFLP的反应原理进行了验证,结果检测到的酶切片段数与预测到的酶切片段数完全一致,充分证明了AFLP技术原理的可靠性。
进行AFLP分析时,一般应用两种限制性内切酶在适宜的缓冲系统中对基因组DNA进行酶切,一种为低频剪切酶,识别位点为六碱基的rare cutter;另一种为高频剪切酶,识别位点为四碱基的frequent cutter。双酶切产生的DNA片段长度一般小于500bp,在AFLP反应中可被优先扩增,扩增产物可被很好地分离,因此一般多采用稀有切点限制性内切酶与多切点限制性内切酶相搭配使用的双酶切。目前常用的两种酶是4个识别位点的Mse I和6个识别位点的EcoR I。
AFLP接头和引物都是由人工合成的双链核苷酸序列。接头(Artificial adapter)一般长14~18个碱基对,由一个核心序列(Core sequence)和一个酶专化序列(Enzyme-specific sequence)组成。常用的多为EcoR I和Mse I接头,接头和与接头相邻的酶切片段的碱基序列是引物的结合位点。AFLP引物包括三部分:5′端的与人工接头序列互补的核心序列(core sequence,CORE),限制性内切酶特定序列(enzyme-specific sequence,ENZ)和3′端的带有选择性碱基的粘性末(selective extension,EXT)。
1.2. AFLP分子标记技术流程
AFLP分子标记技术包括3个步骤:(Ⅰ)DNA的准备。即DNA的酶切以及与人工合成的寡聚核甘酸接头(artificial oligonucleotide adapter)连接。为了使酶切片段大小分布均匀,一般采用双酶酶切,在基因组上分别产生低频切口和高频切口。(Ⅱ)选择性扩增酶切片段。AFLP引物包括与人工接头互补的核心序列(CORE)、限制性内切酶识别序列(ENZ)和3′端选择性碱基三部分。一般用不带或带1个选择性碱基的引物进行预扩增,然后用带2~3个选择性碱基的引物进行再扩增。所用引物可用放射性或荧光标记。(Ⅲ)AFLP标记的统计。AFLP产物通过聚丙酰胺变性凝胶电泳(SDS—PAGE)检测样品的多态性,可灵敏地分辨只有一个碱基差异的不同DNA片段。[6](图1)
图1. AFLP分子标记技术流程图
1.3. AFLP分子标记的特点
(1)DNA需要量少,检测效率高,理论上可产生无限多的AFLP标记。一个0.5mg的DNA样品可做4 000个反应。由于AFLP分析可采用多种不同类型的限制性内切酶及不同数目的选择性碱基,因此理论上AFLP可产生无限多的标记数并可覆盖整个基因组。
(2)多态性高。AFLP分析可以通过改变限制性内切酶和选择性碱基的种类与数目,来调节扩增的条带数,具有较强的多态分辨能力。每个反应产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测到的标记数为50~100个,能够在遗传关系十分相近的材料间产生多态性,被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。Becker等(1995)对多态性很差的大麦进行AFLP分析,仅用16个引物就定位了118个位点[7]。
(3))可靠性好,重复性高。AFLP分析采用特定引物扩增,退火温度高,使假阳性降低,可靠性增高。AFLP标记在后代中的遗传和分离中遵守孟德尔定律;种群中的AFLP标记位点遵循Hardy—Weinberg平衡。
(4)对DNA模板质量要求高,对其浓度变化不敏感。AFLP反应对模板浓度要求不高,在浓度相差1000倍的范围内仍可得到基本一致的结果。但该反应对模板DNA的质量要求较为严格,DNA的质量影响酶切、连接扩增反应的顺利进行。
2. AFLP分子标记技术的应用
AFLP作为一种较新的分子标记,近10年来,AFLP技术获得了很大进步,并展示出良好的发展前景,已经广泛应用于生命科学研究的诸多领域,如动物学、植物学、医学等方面。
2.1. 在动物学研究中的应用
2.1.1. 动物遗传学(以水生动物为例)
AFLP以其数量多、随机分布、稳定遗传、多态性丰富的优点而广泛用于水生动物遗传多样性、系统进化学等研究。Seki 等(1999)用荧光—AFLP技术对三个香鱼群体的遗传多样性进行了分析,结果显示AFLP标记为鱼类遗传变异及多样性评估提供了可靠的信息。Liu等(1998)研究了AFLP标记在斑点鮰、长鳍鮰及其F1、F2和回交后代中的应用,结果显示了AFLP 标记丰富的多态位点、稳定的孟德尔遗传方式和良好可重复性。Miller等(2000)应用AFLP及线粒体序列信息研究了两种濒危琥珀螺的遗传分化及亲缘关系。[8]
水产业是经济的一个增长点,对生物技术的依赖性越来越大。AFLP技术作为一种世代遗传标记,已经成功地应用于水产养殖,并在染色体水平上筛选所需要的鱼种。Montano-Perez等(2006)在最近一篇综述中对此作了详细地总结[9]。另外,人工雌核发育和人工诱导雄核发育可用于性别控制、快速建立家系,从而在多种经济水生动物中的相关工作已广泛展开。
在水生动物的遗传图谱构建上,AFLP技术具有其他同类技术不可比拟的优点。自1996年美国水产经济动物基因组计划启动以来,越来越多的水产动物遗产图谱得以建立。1998年,Kocher等发表了尼罗罗非鱼(Orechromis niloticus)的第一个遗传连锁图;Young等利用雄核发育双单倍体虹鳟以包括AFLP在内的多种标记,构建了一个初步的连锁图,Nichols等在原图上增加了更多的标记(其中包括700多AFLP标记),使之成为较为详细的连锁图谱。2000年,Naruse等利用633个标记构建了一个较为详尽的青鲢连锁图谱,其中包括488个AFLP标记;2002年Wilson发表了斑节对虾AFLP连锁图谱;Guo 等则构建了太平洋牡蛎的初步连锁图。[8]
2.1.2. 动物系统学(以昆虫为例)
在分类上,AFLP技术可用于种和种下阶元的鉴定。Corsini等(1999)运用AFLP技术分析了智利不同地区地中海实蝇(Ceratitis capitata)遗传多样性,并且克隆了3个富含AT标记片段,可以作为鉴别地中海实蝇属(Ceratitis)其他种类以及果蝇属
(Drosophila)昆虫之间的分子探针[10];张金卫等(2004)利用AFLP分子技术6个家蚕(Bombyx mori)品种进行了DNA指纹分析,扩增了54条多态性条带,可明确区分6个家蚕品种,并可作为6个家蚕品种鉴定的依据[11]。
动物的遗传变异在形态上很难发现,而在分子水平上很容易发现这种差异,进而可进行详细研究。Htiseyin等(2002)对土耳其Antalya省不同地区、不同寄主的8个烟粉虱(Bemisia tabaci)种群进行AFLP分析,发现8个种群的遗传变异系数变化范围为42%—81%,聚类结果表明,烟粉虱不同种群的基因变异可能由于对寄主的适应引起[12]。张丽萍等(2004)采用AFLP 技术研究了B型烟粉虱(Bemisia tabaci) 抗噻虫嗪(thiamethoxam)品系在DNA分子水平上的遗传分化,分析结果表明抗性品系在DNA分子水平上存在着明显分化[13]。
以外部形态来作为确定昆虫系统关系的依据,在解释近缘种关系上明显不足。从分子水平上来探究其进化关系近年来已经成为热点[14 ]。鲁成等(2001)利用AFLP技术和统计手段对我国具有代表性的10种野桑蚕和33种家蚕以及5种作为外群对照的柞蚕进行分析,发现不同地区野桑蚕之间的遗传距离(0.10004-0.1419)与家蚕品种之间的遗传距离(0.10004-0.1406)相似,而家蚕与野桑蚕之间的遗传距离(0.13554-0.1532)明显小于家蚕与柞蚕(0.17614-0.1865)和野桑蚕与柞蚕
(0.17764-0.1839)之间的遗传距离,说明家蚕起源于中国野桑蚕[15]。
此外,肉类产业中,遗传标记技术为肉制品的质量信息提供可靠的保证。利用AFLP技术可筛选出6种标记,并转化为单核苷酸多态标记用于高产基因型,从而准确鉴别出日本黑牛(Japanese Black)和F1杂种(Japanese Black×Holstein),可靠性达到88.2%。[16]
2.1.
3. 性别鉴定与繁殖行为研究
AFLP技术在很多的物种中已成功地筛选到了与个体性别连锁的标记。Behura等(2000)得到了一个只在亚洲毒米蚊生物型l、2、5中出现而不在生物型4中出现的AFLP标记Gm2基因,基于这个AFLP标记的序列,设计了SCAR(序列特异性扩增)引物,通过多元PCR实验可以有效地鉴别5种不同生物型。在生物型1×4和2×4杂交后代中进行遗传标记的研究显示:所有Fl雌性均能PCR扩增出这个AFLP标记,而雄性后代中该标记只出现在那些母本是Gm2无毒生物型的个体中。AFLP 标记在无毒生物型中的特异性扩增和遗传方式表明Gm2基因是和毒米蚊性别连锁的。
在繁殖行为的研究方面,Questiau等(2000)利用AFLP技术发现蓝喉颏(Luscinia svecica ramnetum)种群存在非常普遍的婚外交配现象。因此,对于很多尚无微卫星分析引物的分类单元交配系统的研究,可用AFLP标记来实现。[17]
2.2. 在植物学研究中的应用
2.2.1. 种质资源鉴定
作物种质资源遗传背景和遗传关系的确定在作物育种上具有十分重要的意义。杜金友等(2006)利用AFLP分子标记技术对55份玉米(Zea mays L.)种质材料进行了研究,结果表明,20对AFLP引物检测到清晰可见的带656条,其中多态性带487条。平均每个引物组合可以检测到24.4条多态性带。将55份玉米材料聚为6组,与材料来源基本一致,美国Pioneer 系列中有很多材料与瑞得种群有亲缘关系。结果还显示AFLP有利于玉米遗传多样性分析[18]。小麦种质资源方面,AFL广泛用于小麦遗传多样性研究、种质指纹图谱构建和遗传材料鉴定、小麦遗传连锁图谱的构建、目的基因的分子定位、分子标
记辅助选择以及基因表达调控与克隆研究等方面[19]。茶树研究方面,Wachira等(2001)同时采用RAPD与AFLP两种方法,对来源于世界各地(印度、斯里兰卡、中国及中国台湾省、日本、越南、肯尼亚等)的40个茶树品种进行遗传多样性研究,聚类分析将其划分为三个主要类群,统计分析表明,种群内个体之间的变异最大,变异程度达72%,遗传距离计算结果表明,来自不同国家的茶树品种,在种群内都存在丰富的遗传变异[20]。
Wang等(2006)运用AFLP技术对来自美国等5个国家的21种观赏性银杏属植物进行分析,考察他们的基因联系,发现8种重要种质品种,而且聚类结果显示来自同一地区的品种并不一定属于同一类[21]。
2.2.
3. 作物育种
AFLP技术在作物育种方面应用广泛,不仅在小麦、水稻、玉米、棉花和大豆等主要农作物上得以应用,而且在蔬菜(番茄、马铃薯等)以及植物基图组研究的模式植物拟南芥上广泛应用。Vantoall(1996)用AFLP技术指导大豆回交育种,比较大豆双亲与回交1代C0及回交2代C1的异质程度,平均每个AFLP引物均产生10个多态性标记,10对AFLP引物可以检测出100多个位点的纯合或异质程度。Reddy等(1996)利用AFLP技术筛选与棉花长绒及高产性状有关的分子标记,他们将长绒的海岛棉3.79与高产的陆地棉TM-1进行远缘杂交,结果表明,所使用的64对引物中.每一对引物均检测到3—10个AFLP 标记,在杂交后代F2群体中发现了300个标记与亲本的长绒及高产性状有关。AFLP标记还可以转换成SCAR (Sequence characterized amplified region)标记,这将更有利于分子标记在育种选择中的应用。[22]
在筛选作物病虫害抗性品种方面,Wang和Roberts(2006)在最近一篇综述中回顾了利用AFLP和CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)标记对棉花根癌线虫的抗性的研究,提到利用AFLP技术筛选出4个与抗性基因rkn1连锁的标记,并可以在F2代中固定下来。[23]
2.3. 在医学上的应用
AFLP技术在医学已经有了广泛的应用,并显示出其独特的优越性。
肿瘤研究方面,Fukuda等(1999)用cDNA-AFLP法克隆出与大鼠骨肉瘤转移有关的4种差异表达基因;Majima等(2000)应用同样的方法克隆出与肾癌发生相关的一种新基因-Niban。表明AFLP法适用于肿瘤相关基因的筛选与检测,是研究肿瘤发病机制的一种较为理想的方法。[24]
遗传病研究方面,俞冬熠等(2004)运用PCR—AFLP技术对唐氏综合征(Down syndrome,DS)进行研究,选择21号染色体上4个具有高度多态性的STR位点对12例胎儿进行了产前诊断。结果检出2例唐氏综合征患儿,与细胞遗传学检查结果一致,无假阴性和假阳性病例发生。说明4个STR位点具有高度的多态性,应用PCR—AFLP技术检测各位点的基因型状况,产前诊断经典型和易位型唐氏综合征胎儿,准确性高,操作简便、快速,具有极好的临床应用价值。[25]
AFLP技术还是流行病学研究和诊断的良好工具。Rob等(2000)从健康人群、疾患人群和一些动物的不同部位(如粪便、血液、脓汁、尿和腹水)分离的万古霉素抗性肠球菌(vancomycin—resistant Enterococcus faecium,VREF)菌株进行AFLP分析,结果显示万古霉素抗性肠球菌有着寄主特异性,从健康人群和疾患人群中分离的菌株明显地属于不同的AFLP聚群,而从健康人群中和从猪体内分离的菌株则形成了一个聚群,同时在动物饲养员和屠夫的粪便中发现家禽和牛所特有而在人群中
罕见的VREF,Rob等认为这充分证明了人群中的VREF主要起源于那些具有较高糖肽抗性的寄生于猪体内的VREF,且家畜和牛身上的VREF也可以向人群短暂地传播。[17]
3. 结语
AFLP技术自发明以来,作为一种重复性好、分辨力高的DNA标记,已经成为生命科学各领域,尤其是分子遗传学研究的一种重要工具和手段。近年来,随着技术的不断改进和完善,该方法更加方便和易于操作,应用范围也在不断扩展。该技术也存在着一些不足之处,如对样本DNA的质量要求很高从而易于导致偏差,设备费用较高等,但AFLP技术与microsatellites 技术、序列信息的综合分析可作为遗传变异分析的主要工具。因此,研究者应综合考虑AFLP技术的优点和局限,根据特定的研究内容和需要加以选择。
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分子标记技术的种类-标准化文件发布号:(9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础,DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP;第二类以PCR技术为核心,如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等;第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心,其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求:①具有高的多态性; ②共显性遗传;③能够明确辨别等位基因;④分布于整个基因组中;⑤选择中性(即无基因多效性);⑥检测手段简单、快速; ⑦开发成本和使用成本尽量低廉;⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前,没有任何一种分子标记均满足以上的要求,它们 均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)1974年,Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时,发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异,由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成),利用限制性内切酶酶解基因组DNA时,会产生长度不同的DNA酶切片段,通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开,通过Southern印迹法,将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上,再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交,最后通过放射性自显影显示杂交带,即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时,酶切要彻底,注意内切酶的选择,对于亲缘关系很近的物种,可增加内切酶的使用种类。目前RFLP的使用领域很广泛,其具有以下优点:①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异,理论上可覆盖整个基因组,能提供丰富的遗传信息;②标记不受组织、环境和发育阶段的影响;③呈共显性,即杂交时等位DNA片段均呈现带,能区分纯合基因型和杂合基因型,F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3],提供标记座位完全的遗传信息;④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠,重复性好。其缺点是:①操作繁琐,费时;②酶切后的DNA质量要求高;③使用放射性同位素进行分子杂交,有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD) 20世纪80年代,基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年,Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法,即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物,以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物,溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比,RAPD方便易行,DNA用量少,设备要求简单,不需DNA探针,设计引物也不需要预先进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构;合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,并且不需使用同位素,安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低,易产生错配,故实验的稳定性和重复性差,且为显性标记,不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感,这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制,即设计更长的引物。1993年,Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region,SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序,设计一对互补于原
分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用 分子标记技术 分子标记(Molecular Markers)是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比,DNA分子标记具有极大的优越性:大多数分子标记为共显性,对隐性性状的选择十分便利;基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的;在生物发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析;分子标记揭示来自DNA的变异;表现为中性,不影响目标性状的表达,与不良性状无连锁;检测手段简单、迅速[2]。 技术种类及原理 分子标记技术自诞生起已研究出数十种,尽管方法差异显著,但都具有一个共同点,即用到了分子杂交、聚合酶链式反应(PCR)、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种: 1.限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphisms,RFLP) RFLP是最早开发的分子标记技术,指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的,是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA,得到大小不等的DNA片段,所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段,就形成不同带,然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影,即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点,可靠性高,不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制,通常可检测到的基因座位数为1—4个,标记结果稳定,重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷,主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难;另外,RFLP分析工作量大,成本高,使用DNA量大,使用放射性同位素和核酸杂交技术,不易自动化,尽管结合PCR技术,RFLP仍在应用,但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA(Random Amplification Polymorphism,RAPD) RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法,其基本原理是利用随机引物(一般为8—10bp)通过PCR反应非定点扩增DNA片段,然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同,但对任一特定引物,它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物数量和大小发生改变,表现出多态性[4]。就单一引物而言,其只能检测基因组特定区域DNA多态性,但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组,因此,RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测,也可用于构建基因组指纹图谱。 与RFLP技术相比,RAPD技术操作简便快速,省时省力,DNA用量少,同时无需设计特定的引物,扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点:(1)RAPD标记是一个显
DNA分子标记技术及其应用 摘要:分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念,以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法,并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词:分子标记;应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术,在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展,其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较,DNA分子标记具有诸多优点,如:遗传稳定,多态性高,多为共显性,数量丰富,遍及整个基因组,操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面,成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式,在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在,遗传标记的发展主要经历了4个阶段,表现出了4种类型:1形态标记(Morphological Markers),指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记;2细胞标记(Cytological Markers),主要指染色体组型和带型;3生化标记(Biochemical Markers),指生物的生化特征特性,主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记;4DNA分子标记(Molecular Markers)是以生物大分子(主要是遗传物质DNA)的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较,DNA分子标记具有诸多优点,如:遗传稳定,多态性高,多为共显性,数量丰富,遍及整个基因组,操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前,被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP(限制性片段长度多态性)、RAPD(随机扩增多态性DNA)、ALFP(扩增片段长度多态性)、STS(序列标记位点)、SSR(简单重复序列)和SNP(单核苷酸多态性)等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响;
. . 生物分离的新技术——分子印迹 —创新论坛—工业生物技术专家报告会 2008级生命学院3班微生物与生化药学专业 2008001243 宋汉臣
目录 1分子印迹技术的原理与方法 (3) 1.1 MIP的制备过程 (3) 1.2制备MIP的方法 (3) 1.2.1预组装法——共价键作用 (4) 1.2.2自组装法——非共价作用 (4) 1.2.3 共价作用与非共价作用联合法 (5) 2 分子印迹技术在分离上的应用 (5) 2.1 MIP作为固定相的分离技术 (6) 2.1.1MIP作为固定相分离天然产物 (6) 2.1.2MIP作为固定相检测食品中药物的残留 (7) 2.2分子印迹膜(MIM)分离技术 (7) 3问题与展望 (8) 4 参考文献 (9)
摘要:分子印迹技术[1](Molecular Imprinting technique,MIT)是一种新的、很有发展潜力的分离技术。由于其具有选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用围广等优点,分子印迹聚合物已广泛应用于生物工程、临床医学、环境监测及食品工业等众多领域,在分离提纯、免疫分析、酶模型以及生物模拟传感器等许多方面显示出良好的应用前景,引起了人们的广泛关注,其有望在三聚氰胺的快速痕量检测上发挥作用。 关键字:分子印迹生物分离分子印迹聚合物
前言: 分子印迹技术最初出现源于 20世纪 40年代的免疫学,当时Pauling[3]首次提出抗体形成学说为分子印迹理论的产生奠定了基础, 1993年Mosbach等人有关茶碱分子印迹聚合物的研究报道,使这一技术在生物传感器、人工抗体模拟及色谱固相分离等方面有了新的发展,得到世界注目并迅速发展。基于该技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用围广等特点,因此分子印迹技术在许多领域,如色谱分离、固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析、膜分离等领域得到日益广泛的研究和开发,有望在生物工程、临床医学、天然药物、食品工业、环境监测等行业形成产业规模化的应用。目前,全世界[3]至少有包括瑞典、日本、德国、美国、中国、澳大利亚、法国在的 10多个国家、100个以上的学术机构和企事业团体在从事分子印迹聚合物的研究和开发。
分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记; (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA; (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA; (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性; (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性; (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性; (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性; (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域; (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术
. . . . 生物分离的新技术——分子印迹 —创新论坛—工业生物技术专家报告会 2008级生命学院3班微生物与生化药学专业 2008001243 宋汉臣
目录 1分子印迹技术的原理与方法 (3) 1.1 MIP的制备过程 (3) 1.2制备MIP的方法 (3) 1.2.1预组装法——共价键作用 (4) 1.2.2自组装法——非共价作用 (4) 1.2.3 共价作用与非共价作用联合法 (5) 2 分子印迹技术在分离上的应用 (5) 2.1 MIP作为固定相的分离技术 (6) 2.1.1MIP作为固定相分离天然产物 (6) 2.1.2MIP作为固定相检测食品中药物的残留 (7) 2.2分子印迹膜(MIM)分离技术 (7) 3问题与展望 (8) 4 参考文献 (9)
摘要:分子印迹技术[1](Molecular Imprinting technique,MIT)是一种新的、很有发展潜力的分离技术。由于其具有选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等优点,分子印迹聚合物已广泛应用于生物工程、临床医学、环境监测及食品工业等众多领域,在分离提纯、免疫分析、酶模型以及生物模拟传感器等许多方面显示出良好的应用前景,引起了人们的广泛关注,其有望在三聚氰胺的快速痕量检测上发挥作用。 关键字:分子印迹生物分离分子印迹聚合物
前言: 分子印迹技术最初出现源于 20世纪 40年代的免疫学,当时Pauling[3]首次提出抗体形成学说为分子印迹理论的产生奠定了基础, 1993年Mosbach等人有关茶碱分子印迹聚合物的研究报道,使这一技术在生物传感器、人工抗体模拟及色谱固相分离等方面有了新的发展,得到世界注目并迅速发展。基于该技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等特点,因此分子印迹技术在许多领域,如色谱分离、固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析、膜分离等领域得到日益广泛的研究和开发,有望在生物工程、临床医学、天然药物、食品工业、环境监测等行业形成产业规模化的应用。目前,全世界[3]至少有包括瑞典、日本、德国、美国、中国、澳大利亚、法国在内的 10多个国家、100个以上的学术机构和企事业团体在从事分子印迹聚合物的研究和开发。
分子标记技术 摘要:分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性,并借助 一些统计工具,将不同物种或同一物种的不同类群区分开来,或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系,已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域,包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面,具有重大作用。 关键词:分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用 引言 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记,是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比,DNA分子标记具有的优越性有:大多数分子标记为共显性,对隐性的性状的选择十分便利;基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的;在生物发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析;分子标记揭示来自DNA的变异;表现为中性,不影响目标性状的表达,与不良性状无连锁;检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展,DNA分子标记技术已有数十种,广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 一.常用分子标记原理 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础,DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP;第二类以PCR 技术为核心,如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等;第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心,其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求:①具有高的多态性;②共显性遗传;③能够明确辨别等位基因;④分布于整个基因组中;⑤选择中性(即无基因多效性);⑥检测手段简单、快速;⑦开发成本和使用成本尽量低廉;⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前,没有任何一种分子标记均满足以上的要求,它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1.限制性内切酶片段长度多态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP) 1974年,Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时,发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异,由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成),利用限制性内切酶酶解基因组DNA时,会产生长度不同的DNA酶切片段,通过凝
分子印迹技术及应用 林凯城1李永莲2 (1.揭阳职业技术学院化学工程系广东揭阳 522000;2.广东轻工职业技术学院科研处广东广州510300) 摘 要:分子印迹技术是构建高分子聚合物的有效方法,这种方法简便、成熟。所构建的纳米孔穴与印迹分子在空间形 状、大小以及作用点上相匹配,所以能被印迹分子高效地选择性识别出来。目前已广泛应用于各种离子、小分子、大分子等 的印迹。文中阐明了分子印迹技术的基本原理,简述了分子印迹技术的主要制备方法,并展望了光子晶体的应用前景。 关键词:分子印迹;聚合方法;应用 中图分类号:Q503文献标识码:B 文章编号:1674-4896(2012)12-0026-05 分子印迹技术最先应用于20世纪40年代Paulin首次提出抗体形成学说[1],为后来分子印迹理论的产生和发展奠定了理论基础。1972年,Wulff在分子印迹技术方面的研究取得了突破性进 展,首次成功制备出分子印记聚合物(MIPs )[2]。 1993年Mosbach开展的有关茶碱分子的分子印迹聚合物的研究也取得巨大成就,并在《Nature》上发表了相关的论文。从此,分子印迹聚合物引起了人们的广泛关注,因为其具有高度专一性和普适性,并且广泛地应用于化学和生物学交叉的新兴领域,如模拟酶、药物分析、催化剂、色谱分析与色谱分离、仿生传感器等方面,受到世界关注并迅速发展。 高分子聚合物的合成,在合成之前将印迹分子加入到功能单体之中,两者之间发生化学作用,与此同时,加入交联剂及引发剂,通过一系列的聚合反应形成一个固态高分子化合物,这个化合物是高度交联的,接着将印迹分子从高分子中移除,这个可以利用化学或物理的方法移除,经过这个步骤之后,大量的空腔结构就在高分子化合物的内部形成并存在了,通过这些空腔结构内各官能团的位置以及它们各自的形状,空腔结构可以与印迹高分子进行互补,并且还能发生具有特殊性能的作用。分子印迹技术各方面的研究也正是利 用这一原理开展工作的。功能单体和印迹分子之间存在的化学作用方式主要有两种,一是共价键,另外一个是非共价键,其中又以非共价键作用方式的应用较多,它包括离子键作用、疏水作用、氢键作用等。 图1典型的分子印迹步骤[3] 当前,利用分子印迹技术合成的聚合物,由于其具有广泛的通用性和惊人的立体专一识别性,全世界进行MIPs的研究与开发的国家至少有10多个国家,包括日本、美国、德国、中国等,另外还有企事业单位和学术机构,其总数也不少于100个。但是, 由于目前所利用的制备聚合物的分子印 收稿日期:2012-09-04作者简介:林凯城(1983-),男,广东揭阳人,助教,研究方向:化学传感材料。 第5卷第6期2012年12月清远职业技术学院学报JournalofQingyuanPolytechnicVol.5,No.6Dec.2012 26
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础,DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP;第二类以PCR技术为核心,如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等;第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心,其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求:①具有高的多态性;②共显性遗传;③能够明确辨别等位基因;④分布于整个基因组中;⑤选择中性(即无基因多效性);⑥检测手段简单、快速;⑦开发成本和使用成本尽量低廉;⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前,没有任何一种分子标记均满足以上的要求,它们均具 有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)1974年,Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时,发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异,由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成),利用限制性内切酶酶解基因组DNA时,会产生长度不同的DNA酶切片段,通过凝胶电泳将 DNA片段按各自的长度分开,通过Southern印迹法,将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上,再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交,最后通过放射性自显影显示杂交带,即检出限制性片段长度多态性。进行 RFLP时,酶切要彻底,注意内切酶的选择,对于亲缘关系很近的物种,可增加内切酶的使用种类。目前RFLP 的使用领域很广泛,其具有以下优点:①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异,理论上可覆盖整个基因组,能提供丰富的遗传信息;②标记不受组织、环境和发育阶段的影响;③呈共显性,即杂交时等位DNA片段均呈现带,能区分纯合基因型和杂合基因型,F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3],提供标记座位完全的遗传信息;④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠,重复性好。其缺点是:①操作繁琐,费时;②酶切后的DNA质量要求高;③使用放射性同位素进行分子杂交,有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD) 20世纪80年代,基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年,Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法,即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物,以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量和大小发生改变,表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物,溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比,RAPD方便易行,DNA用量少,设备要求简单,不需DNA探针,设计引物也不需要预先进行序列分析,不依赖于种属特异性和基因组的结构;合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,并且不需使用同位素,安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低,易产生错配,故实验的稳定性和重复性差,且为显性标记,不能区分纯合子和杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感,这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制,即设计更长的引物。1993年,Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region,SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆和测序,设计一对互补于原来
生物分离的新技术——分子印迹 —创新论坛—工业生物技术专家报告会 2008级生命学院3班微生物与生化药学专业 2008001243 宋汉臣
目录 1分子印迹技术的原理与方法 (3) 1.1 MIP的制备过程 (3) 1.2制备MIP的方法 (3) 1.2.1预组装法——共价键作用 (4) 1.2.2自组装法——非共价作用 (4) 1.2.3 共价作用与非共价作用联合法 (5) 2 分子印迹技术在分离上的应用 (5) 2.1 MIP作为固定相的分离技术 (6) 2.1.1MIP作为固定相分离天然产物 (6) 2.1.2MIP作为固定相检测食品中药物的残留 (7) 2.2分子印迹膜(MIM)分离技术 (7) 3问题与展望 (8) 4 参考文献 (9)
摘要:分子印迹技术[1](Molecular Imprinting technique,MIT)是一种新的、很有发展潜力的分离技术。由于其具有选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等优点,分子印迹聚合物已广泛应用于生物工程、临床医学、环境监测及食品工业等众多领域,在分离提纯、免疫分析、酶模型以及生物模拟传感器等许多方面显示出良好的应用前景,引起了人们的广泛关注,其有望在三聚氰胺的快速痕量检测上发挥作用。 关键字:分子印迹生物分离分子印迹聚合物
前言: 分子印迹技术最初出现源于 20世纪 40年代的免疫学,当时Pauling[3]首次提出抗体形成学说为分子印迹理论的产生奠定了基础, 1993年Mosbach等人有关茶碱分子印迹聚合物的研究报道,使这一技术在生物传感器、人工抗体模拟及色谱固相分离等方面有了新的发展,得到世界注目并迅速发展。基于该技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等特点,因此分子印迹技术在许多领域,如色谱分离、固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析、膜分离等领域得到日益广泛的研究和开发,有望在生物工程、临床医学、天然药物、食品工业、环境监测等行业形成产业规模化的应用。目前,全世界[3]至少有包括瑞典、日本、德国、美国、中国、澳大利亚、法国在内的 10多个国家、100个以上的学术机构和企事业团体在从事分子印迹聚合物的研究和开发。
微卫星DNA标记技术及其在遗传多样性研究中的应用 摘要微卫星DNA的高突变率、中性、共显性及其在真核基因组中的普遍性,使其成为居群遗传学研究、种质资源鉴定、亲缘关系分析和图谱构建的优越的分子标记。本研究系统介绍了微卫星DNA在结构和功能上的特点,并对微卫星DNA标记技术应用的遗传学机理和一般方法进行了扼要的阐述。另外,本研究还探讨了微卫星DNA标记技术在遗传多样性研究中的应用现状,并进一步提出其发展前景。 关键词:微卫星DNA;微卫星DNA标记;遗传多样性 大量重复序列的存在是真核生物基因组的主要特点之一,而且这些重复序列的拷贝数可高达百万份以上。真核生物的基因组中,重复序列占有很大比重(>50%)。按照重复序列在染色体上的分布方式,分为散布重复和串联重复(VNTR)两种类型。散布重复序列的拷贝数很多,在重复单位之间彼此常有序列的变化,难以用做分子标记。串联重复序列根据重复单元数目的大小又分为卫星序列(satellites)、小卫星序列(mini-satellites)和微卫星序列(microsatellites)3种类型。其中,卫星序列的重复单元大,一般分布在染色体的异染色质区,采用分子标记系统来揭示其多态性有一定的困难;小卫星序列主要存在于染色体近端粒处,通常以15~75个核苷酸为核心序列,长度从几十到几千个碱基不等;微卫星序列一般较短,属于以1~6个核苷酸为基本单元的简单串联重复。 微卫星DNA是真核生物基因组重复序列中的主要组成部分。微卫星DNA也称简单串联重复序列(SSRs)或简单串联重复序列多态性(STRP)。这些位点由非常短的串联重复DNA 片段(1-5个碱基)组成。微卫星DNA 最早是在人类基因组研究中发现的,它极其丰富,分布在整个基因组中[1] 。人类基因组最普遍的微卫星是那些含有A、AC、AAAN、AAN 或AG(这里N 代表G、C或T)的序列。这5组重复序列大约占到人类基因组微卫星总量的75%。微卫星DNA 序列在大多数的其它动、植物基因组中也先后被发现,并且 通过聚合酶链式反应可以确定其类型[2] 。(AT)n和(ATT)n 是首先于大豆中发现的在不同的株系中长度有所不同的重复序列,它们也是第一个被定位的植物微卫星座位。Wang等[3]发现微卫星序列中所有的单、双和四核苷酸重复序列都分布在DNA非编码区,而含G-C 碱基对的三核苷酸重复序列有57%位于编码区。微卫星重复序列在植物中出现的几率比动物中少得多。在植物中,约29kb中有20bp的微卫星序列[4],例如鹰嘴豆中(TAA)n、(GA)n和(CA)n 序列在平均60kb的长度中出现于12000个位点上[5];而动物中,约每6kb中就有20bp的微卫星重复序列。另外,研究还发现植物中最丰富的微卫星是(A)n,其次是(AT)n,再次是(GA)n。 Weber[6]将微卫星分为3类:完全重复(无间隔)、不完全重复(有非重复单位的碱基间隔)和复合重复(2个或更多重复单位彼此毗邻连续出现)。这些小的、串联排列的重复序列经常是通过核苷酸链的滑动错配或者其他未知的过程来改变它们的长度,从而导致微卫星在数量上的差异[7]。微卫星的突变率高:每代每个配子的每个位点有2.5×10-5~1×10-2突变,因此造成了它们的多态性。但微卫星周围的单拷贝序列一般不受其影响。Davierwala等对水稻及其近缘种利用(GATA)n和(AC)n微卫星两侧的序列合成的引物进行PCR扩增,再通过克隆、测序获得了大小不等的8个等位基因。测序分析的结果表明,不同等位基因的大小变异是由于微卫星重复数目的变异和微卫星两侧区域的序列的变异。 尽管目前对这些重复序列的功能和起源还不清楚,但许多研究已经证明,重复序列可以作为种或基因组水平的遗传标记,是分子水平上研究遗传多样性的一个有力工具。微卫星序列的重复单位小,而且这些重复单位的序列差异和数目变化能够形成丰富的多态性,因此得到了广泛的应用。微卫星通常是复等位的,代表每个微卫星位点的等位基因数目高度可变。微卫
分子标记技术原理、方法及应用 一、遗传标记的类型及发展 遗传标记(genetic marker):指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征,即可遗传性和可识别性;因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。 形态学标记:主要包括肉眼可见的外部形态特征,如:矮秆、紫鞘、卷叶等;也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点: 形态学标记简单直观、经济方便。缺点: (1)数量在多数植物中是很有限的; (2) 多态性较差,表现易受环境影响; (3)有一些标记与不良性状连锁; (4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程,周期较长 细胞学标记:植物细胞染色体的变异:包括染色体核型(染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等)和带型(C带、N带、G带等)的变化。优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育,难度很大; (2) 有些变异难以用细胞学方法进行检测 生化标记:主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。优点: 直接反映了基因产物差异,受环境影响较小。缺点: (1)目前可使用的生化标记数量还相当有限; (2)有些酶的染色方
法和电泳技术有一定难度 分子标记:主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段,它直接反映基因组DNA间的差异,也叫DNA标记。 (1)数量多,高多态性,信息量大(2)与生长发育无关,取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4)均匀分布于整个基因组(5)选择中性,不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7)成本低廉(8)稳定,重复性好(9)共显性遗传 在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种,一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类: 第一类是以分子杂交为核心的分子标记,包括RFLP、DNA指纹技术等,这类分子标记被称为第一代分子标记; 第二类是以PCR为核心的分子标记,包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等,为第二代分子标记; 第三类是一些新型的分子标记,如:SNP标记、表达序列标签EST 标记等,也以PCR技术为基础,为第三代分子标记。 几种主要的DNA分子标记
分子标记技术简介 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记,是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比,DNA分子标记具有的优越性有:大多数分子标记为共显性,对隐性的性状的选择十分便利;基因组变异极其丰富,分子标记的数量几乎是无限的;在生物发育的不同阶段,不同组织的DNA都可用于标记分析;分子标记揭示来自DNA的变异;表现为中性,不影响目标性状的表达,与不良性状无连锁;检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展,现在DNA分子标记技术已有数十种,广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求:(1) 具有高的多态性;(2) 共显性遗传,即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型;(3) 能明确辨别等位基因;(4) 遍布整个基因组;(5) 除特殊位点的标记外,要求分子标记均匀分布于整个基因组;(6) 选择中性(即无基因多效性);(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化);(8) 开发成本和使用成本尽量低廉;(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是,目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。
【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA 分子,然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交,通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术,它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理:利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA,得到大小不等的DNA片段,所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段,就形成不同带,然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影,即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制,通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷,主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难;另外,实验操作较繁锁,检测周期长,成本费用也很高。自RFLP问世以来,已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。
分子印迹技术及其研究进展 Malikullidin iz kaldurux tehnikisi wa uning tarakkiyati 分子印迹技术 近年来分子印迹学作为一门新兴的科学门类得到巨大的发展。分子印迹技术是 一种模拟抗体- 抗原相互作用的人工生物模板技术。它可为人们提供具有期望结构和性质的分子组合体,因此,分子印迹技术已成为当今化学研究领域的热点课题之一。分子印迹的出现源于免疫学,早在20世纪40年代由诺贝尔奖获得者Pauling 根据抗体与抗原相互作用时空穴匹配的“锁匙”现象,提出了以抗原为模板来合成抗体的理论。直到1972年德国科学家Wulff [18]研究小组首次成功制备出分子印迹聚合物,使这方面的研究得到了飞速的发展。1993年Mosbach[19]研究小组在美国《自然杂志》(《Nature》)上发表有关分子印迹聚合物的报道,更加速了分子印迹在生物传感器[20-24]、人工抗体模拟[25]及色谱固定相[26-30]分离等方面的发展,并由此使其成为化学和生物学交叉的新兴领域之一,得到了世界注目并迅速发展。分子印迹技术的应用研究所涉及的领域非常广泛,包括环境、医药、食品、 军事等。 1.分子印迹技术的基本原理及特点 分子印迹聚合物是具有特定功能基团以及孔穴大小和形状的新型高分子材料。是具有高度交联的结构,稳定性好,能够在高温、高压、有机溶剂以及耐酸碱的分子识别材料。它的制备是通过以下方法实现的:首先用功能单体(functional monomer)(funkissial tana)和模板分子(template)(izi kaldurlidigan malikulla)以共价键或非共价键形成复合物,再加入适当的交联剂 (cross-linker)(tutaxturguqi)和引发剂在加热、紫外光或其它射线照射的条件下聚合, 从而使模板分子在空间固定下来;最后通过一定的方法把模板分子洗脱,将模板分子从聚合物中除去, 这样就在聚合物中留下一个与模板分子在空间结构上完
分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础,DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP;第二类以PCR技术为核心,如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等;第三类以DNA序列(mRNA或单核苷酸多态性)为核心,其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求:①具有高的多态性;②共显性遗传;③能够明确辨别等位基因;④分布于整个基因组中;⑤选择中性(即无基因多效性);⑥检测手段简单、快速;⑦开发成本与使用成本尽量低廉;⑧在实验室内与实验室间重复性好。目前,没有任何一种分子标记均满足以上的要求,它们均具有各自的优点与 不足。其特点比较见表一。 1限制性内切酶片段长度多态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP) 1974年,Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时,发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异,由此首创了第一代DNA分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理就是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成),利用限制性内切酶酶解基因组DNA时,会产生长度不同的DNA 酶切片段,通过凝胶电泳将DNA片段按各自的长度分开,通过Southern印迹法,将这些大小不同的DNA片段转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上,再用经同位素或地高辛标记的探针与膜上的酶切片段分子杂交,最后通过放射性自显影显示杂交带,即检出限制性片段长度多态性。进行RFLP时,酶切要彻底,注意内切酶的选择,对于亲缘关系很近的物种,可增加内切酶的使用种类。目前RFLP 的使用领域很广泛,其具有以下优点:①RFLP标记源于基因组DNA的自身变异,理论上可覆盖整个基因组,能提供丰富的遗传信息;②标记不受组织、环境与发育阶段的影响;③呈共显性,即杂交时等位DNA片段均呈现带,能区分纯合基因型与杂合基因型,F2表现出 1∶2∶1的孟德尔分离定律[3],提供标记座位完全的遗传信息;④由于限制性内切酶的专一性使结果稳定可靠,重复性好。其缺点就是:①操作繁琐,费时;②酶切后的DNA质量要求高;③使用放射性同位素进行分子杂交,有危险性等。 2随机扩增多态性DNA标记 (Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD) 20世纪80年代,基于PCR技术的第二代分子标记技术诞生并迅速发展起来。1990年,Williams 等发表了一种不需预先知道DNA序列信息的检测核苷酸序列多态性的方法,即随机扩增多态性DNA标记(RAPD)。其原理就是以碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链(8-10bp)为引物,以组织中分离出来的基因组DNA为模板进行扩增。随机引物在基因组DNA序列上有其特定结合位点,一旦基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变,就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化,从而导致扩增产物的数量与大小发生改变,表现出多态性。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物,溴化乙锭染色后可在紫外光下显现出基因组相应区域DNA的多态性。与RFLP相比,RAPD方便易行,DNA用量少,设备要求简单,不需DNA探针,设计引物也不需要预先进行序列分析,不依赖于种属特异性与基因组的结构;合成一套引物可以用于不同生物基因组分析,用一个引物就可扩增出许多片段,并且不需使用同位素,安全性好。但因为引物较短导致退火温度较低,易产生错配,故实验的稳定性与重复性差,且为显性标记,不能区分纯合子与杂合子。 RAPD 标记技术利用单引物扩增多个基因位点使其在一定程度上对反应条件敏感,这会限制其应用。将RAPD-PCR变成经典的PCR可克服此限制,即设计更长的引物。1993年,Paran提出的序列特征化扩增区域标记(Sequenced Characterized Amplified Region,SCAR)即为以经典PCR为基础的分子标记技术[1]。SCAR标记技术通过对产生的RAPD片段克隆与测序,设计一对互补于原来RAPD片段两端序列的24聚体的引物,扩增原来模板DNA,产生SCAR-DNA片段。相对于RAPD,SCAR由于使用更长的引物与