广西工学院
毕业论文
采用DPPH清除法对肉桂油的
抗氧化活性的研究
THE RESEARCH ON ANTIOXIANT ACTIVITY OF CINNAMON OIL BY USING DPPH SCA VENGING METHOD
系别生物与化学工程系
专业化学工程与工艺，4年
班级
学号
姓名
指导教师
二○一○年五月三十日
广西工学院
毕业设计（论文）任务书
采用DPPH清除法对肉桂油的抗氧化活
性的研究
THE RESEARCH ON ANTIOXIANT ACTIVITY OF
CINNAMON OIL BY USING DPPH SCA VENGING
METHOD
系别生物与化学工程系
专业化学工程与工艺，4年
班级
学号
姓名
指导教师
二○○九年九月三日
一、课题的主要内容和基本要求
本课题采用水蒸气蒸馏法提取肉桂油油，并系统研究其油相挥发性组分及水溶性挥发性组分及肉桂油主要单体成分的抗氧化活性。
1、采用水蒸气蒸馏法提取不分蒸馏时段的肉桂油及水溶性挥发性精油；
2、配制不同浓度的肉桂油溶液、常用抗氧剂BHA溶液及DPPH自由基溶液；
3、研究不同浓度的肉桂油溶液、BHA溶液清楚自由基能力，确定各个溶液的抗清
除能力大小，并作比较确定抗氧化能力的大小。
二、进度计划与应完成的工作
1、2009年9月至2009年10月查阅文献，收集资料
2、2009年10月至2009年11月设计实验方案，完成开题报告
3、2009年12月拟定实验方案及购置化学药品，安装实验装置
4、2009年12月至2010年5月实验
5、2010年5-6月整理数据，撰写毕业论文
6、2010年6月毕业答辩
三、主要参考文献、资料
1、穆光照.自由基反应[M].北京：高等教育出版社，1985
2、赵保路．氧自由基和天然抗氧化剂[M]．北京：科学出版社，1999．
3、张清俊，吴可.生物领域自由基检测技术的研究进展及其应用[J].航天医学与医学工程，2003，
13（4）：309-312.
4、许申鸿，杭瑚.一种筛选自由基清除剂的简便方法[J].中草药，2000，31（2）：96-97.
5、武雪芬，楮叶抗氧活性初探[J].郑州：河南中医学院中药系，1995,6（2），158-159.
6、王明霞，黄凤洪，刘昌盛，王江薇，黄沁洁.天然抗氧化剂对α一亚麻酸的抗氧化效果研究
[J].武汉：中国农业科学院油料作物研究所，2007,29（4）：466-469.
7、陆志科;中国肉桂油快速分离的新工艺及设备[J];香料香精化妆品;2000年03期
8、王琳琳,陈小鹏,韦小杰;广西桂枝桂叶挥发油化学成分分析[J];企业技术开发;2003年15期
四、完成期限
2010年5月31日
摘要
采用DPPH清除法测定了不同浓度的肉桂油的抗氧化活性，并与肉桂油的主要成分肉桂酸、肉桂醛及常用抗氧剂BHA的抗氧化性能进行比较。
具有抗氧化性的样品能与DPPH自由基反应，体系中DPPH自由基所具有的紫色逐渐褪去，引起吸光度的变化，这样就可以清楚地表示清除DPPH自由基的能力。实验结果表明：肉桂油对DPPH自由基有一定的清除能力，随着提取时间的增大，对DPPH 自由基的清除率越高，清除效果越好，抗氧化能力越强。本课题研究的肉桂油及其主要成分的抗氧化活性的强弱为：肉桂挥发性油水溶性组分>肉桂挥发性油相组分>肉桂醛>肉桂酸。同时还得出结论：肉桂油的主要成分的抗氧化活性和含量不成正比。
关键词：肉桂油；抗氧化活性；DPPH
Abstract
Antioxidative Activity of Different concentrations of cinnamon oil of both ater-soluble and water-insoluble main component was investigatived by DPPH assay, and compared with the effect of TBHQ,The main components of the essential oil cinnamon of nnamaldehyde ，cinnamic acid.
Samples with antioxidant activity with DPPH free radical reaction, the system has a purple DPPH free radicals gradually fade, causing changes in absorbance, so that you can clear that the ability to clear the DPPH free radical. The re, the stronger the antioxidant capacity ,which were ranked as:Water-soluble cosults show that: cinnamon oil on DPPH free radical scavenging ability of certain, with the increase of extraction time on the higher DPPH radical scavenging rate, the better the scavenging effectmponents of volatile oil of cinnamon> Cinnamon oil phase of volatile components> Cinnamic aldehyde>Acid .It also concluded that: the main component of cinnamon oil antioxidant activity
Key words: Cinnamon oil; antioxidant activity; DPPH radical
目录
1 绪论 (1)
1.1我国肉桂油概况 (1)
1.2肉桂油的开发与利用 (1)
1.2.1 肉桂的品种 (2)
1.2.2肉桂油的利用情况 (3)
1.3 天然精油的提取方法 (4)
天然精油常用的几种提取方法[7]如下: (4)
1.4检测抗自由基氧化的分析研究机理 (5)
1.4.1自由基的定义 (5)
1.4.2 自由基的产生 (5)
1.4.3 自由基反应 (6)
1.4.4 自由基的检测 (7)
1.4.5 抗自由基氧化及抗氧化成分 (8)
1.5本实验研究的目的、意义 (9)
2 材料与方法 (10)
2.1 实验材料 (10)
2.1.1. 基本原料 (10)
2.1.2 实验主要试剂 (10)
2.1.3 实验仪器 (10)
2.2实验方法 (10)
2.2.1肉桂油的分离提取 (10)
2.2.3 清除DPPH自由基的抗氧化活性实验 (11)
3.结果与讨论 (13)
3.1 不同浓度的肉桂油的抗氧化性能分析 (13)
3.2肉桂油主要成分的抗氧化活性分析 (14)
3.3抗DPPH自由基氧化活性的比较分析 (17)
4 结论与展望 (22)
4.1 结论 (22)
4.2 展望 (22)
致谢 (23)
参考文献 (24)
1 绪论
资料表明[1]，癌症、冠状动脉硬化及中风等多种疾病与自由基对生物分子的氧化伤害有关。自由基是人体进行生命活动时所产生的一种活性分子。正常情况下，自由基具有调节细胞间的信号传递和细胞生长、抑制病毒和细菌的作用，人体内自由基的生成和清除处于动态平衡中。但体内自由基过多，可导致细胞和组织器官损伤、诱发各种疾病、加速机体衰老。鉴于此，自由基清除剂或抗自由基氧化剂的应用研究受到人们的普遍关注，由于合成抗氧化剂的毒性和致癌作用，寻找能清除体内过量自由基的外源植物活性成分成为人们研究关注的热点。天然抗氧化剂具有无毒无污染等优势，是抗氧化剂的发展趋势所在。国内外学者正积极地从事筛选具有清除氧自由基的有效药物。目前，有很多植物精油抗氧化剂已经被用于食品工业、酿造工业和饮料工业，并收到了很好的社会和经济效益。
我国是世界上肉桂出口最大的国家。目前肉桂油的利用开发情况主要应用于医药、食品及工业。因此，本文从肉桂精油着手，探讨肉桂精油对DPPH自由基的抗氧化性能效果，并对肉桂油相挥发性组分和水溶性组分的抗氧化活性作比较，确定哪个组分的抗氧化活性更强，为能否成为一种天然的抗氧化剂提供理论应用基础，同时也是为我国肉桂油科研研究加大力度，促进肉桂油的开发与利用。
1.1我国肉桂油概况
常绿乔木，芳香。树皮灰褐色，幼枝有四棱，被灰黄色茸毛。叶互生或近对生，革质，长椭圆形至近披针形，先端短尖，基产楔形，上面绿色，有光泽，离基三出脉；具叶柄。圆锥花序腋生；花被片6，白色；能育雄蕊9，3轮，内轮花丝基部有腺体2，子房卵形。浆果紫黑色，椭圆形，具浅杯状果托。花期6～8月，果期10月至次年2～3月。
分布福建、台湾、海南、广东、广西、云南等地的热带及亚热带地区均有栽培，其中尤以广西栽培为多，大多为人工纯林。在广东、广西等地有大面积栽培。
肉桂是我国特产[2]，产量占全世界总产量的80％。全国年均生产约1000多万kg，年需求量150万kg，进口约50万kg左右，近年国内产量质量不低于国外，故不需进口。1997—1998年，广西肉桂产量出现大幅度增长，正值亚洲金融风波，大量加工好的肉桂不能出口，大量积压在国内市场，市态出现走疲呆滞，价格下跌。1999年以后，随着亚洲金融风波消除和加工工序改进，质量提高，使出口量迅速回升，从而消除了国内市场的销售压力，走势明显加快，2000年达900万kg。
1.2肉桂油的开发与利用
在世界上，肉桂油生产已有上百年的历史。目前肉桂油资源十分丰富，肉桂油在
医药和食品添加剂等方面有广泛的用途。
1.2.1 肉桂的品种
肉桂油很多品种[3]，下面着重介绍几种：
企边桂：呈长片状槽状形，左右两边向内卷曲，卷边呈半筒形，槽的中心略凸起，外皮下凹，长43cm左右，宽4～6cm，外皮棕灰白色或棕褐色，两端各有5mm削去栓皮的斜面呈棕色。全体有不规则的横生皮孔和多数微突起的小瘤点。偶有略突起的横纹及灰绿色花纹(苔藓类植物着生后留下的痕迹，俗称彩皮)。内表面暗红棕色或棕色，光洁，用指甲刮划时可见深棕色油纹。气芳香浓烈，味甜辣。
板桂：呈板片状，两边稍向内弯曲，长43cm，宽13～15cm，厚0.6cm，外皮粗糙，灰褐色；内皮暗紫色，断面油层棕褐色，外层棕红色，一般油少渣多，香气及甜辣味较淡。
油桂：呈半边竹筒状槽形，两端略呈斜面，长43cm，外表呈灰棕色或棕褐色，常有灰绿色花斑(彩皮)，内表皮暗棕色，质硬而脆，断面内层油层集中分明，稍有光泽，黑色或棕褐色，外层紫红色，气味浓烈，味甜辛。
桂通：呈双圆筒形或圆筒形，长35cm，厚0.1～0.3cm，外表灰棕色，有细皱纹及小裂，皮孔椭圆形，偶有凸起横纹及灰色花纹。内表皮暗棕色。质硬而脆，断面紫红色或棕红色，气香，味甜辣。又名“桂皮”、“桂尔通”。
桂心：形态与桂通相同，只是外表的栓皮层已被刮除干净，内外皮均呈棕黄色。
桂碎：大小不规则片块状或短卷筒状，外皮灰棕色，断面和内皮呈棕色或棕褐色，气香，味甜辣。
肉桂商品中有将不能制成企边桂或板桂的老桂皮制成桂楠，多呈不规则块片状，大小不一，厚约0.4～0.8cm，皮较厚而粗糙，略扭曲，油少，嚼之渣多，味微辛辣。
进口肉桂常称为安南肉桂，国产肉桂常称为西玉桂，故分别有安企边桂、安板桂、安桂楠；西企边桂、西板桂、西桂楠之称。进口肉桂与国产肉桂性状主要区别为：进口肉桂通常较相应国产肉桂皮厚，香气浓；进口肉桂内表面颜色较深呈棕色至棕褐色(国产肉桂呈棕红或紫红色)且具细密纵纹，光滑(国产肉桂则不平坦)；进口肉桂通常栓皮比相应国产肉桂薄，且“彩皮”明显；进口肉桂断面白细胞环带不及国产肉桂明显，且味甜明显。
进口肉桂中，又有高山肉桂、低山肉桂之分；据说高山肉桂系野生品，低山肉桂系栽培品，二者区别如下：
高山肉桂：外皮表面细皱，“彩皮”明显，皮厚，体重，断面白细胞环带不明显，内表面细致光润。含油量高，香气浓，辛味淡而甜味厚。最佳者习称“绿水清化肉桂”，用开水冲泡，其水清而带绿色(有人认为绿水系加工而成)。
低山肉桂：外表粗糙，皮薄，体较轻，断面石细胞环带较明显，内表面略粗糙。台挥发油量较少，香气差，甜味淡，辛味较浓。
进口肉桂中之上品其内表皮腻滑如玉。又以越南北圻清化所产最有名，故名为“清化玉桂”。
国产肉桂中自80年代起在广东信宜及广西部分地区有类似进口肉桂的移植产品出现，商品统称为“南肉桂”。质量接近于进口肉桂。
1.2.2肉桂油的利用情况
肉桂始载于《神农本草经》，列为上品。肉桂也是我国卫生部公布的药食两用植物，肉桂油是从肉桂的皮、叶等部位提取的植物精油。肉桂油含有多种活性成分，广泛应用于食品、医药和化妆品等领域，具有有很高的应用价值。
（1）肉桂油在抑菌方面的应用[4]
肉桂油体外对大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、白色念珠菌都有明显的抑菌作用，对皮肤真菌有很强的抑制作用，其作用强度仅次于丁香[4]。唐裕芳等人采用滤纸片等方法研究了肉桂油对细菌和霉菌的抑制作用，结果发现肉桂油经固相和气相扩散对细菌和霉菌的抑制作用都很强，并且对真菌和革兰氏阳性菌的抑制更强一点。Ching-Wen Chang等人研究了十种植物精油对嗜肺军团菌的抑制作用发现从肉桂叶中提取的肉桂油对嗜肺军团菌的抑制作用最强，因此可以作为抑菌剂用于浴池、家庭家具等容易感染细菌的地方。P. Go?i等人[66]把肉桂油和丁香油在气相的条件下相混合制成一种防腐剂对阻止微生物的繁殖起到明显作用。美国堪萨斯州立大学的研究小组说，只需在苹果汁里加人浓度为0.2％的肉桂溶液，大肠杆菌、沙门杆菌、葡萄球菌甚至肠炎菌等造成食物中毒的细菌就会被杀灭。研究小组对23种香料进行实验后发现，肉桂、大蒜、丁香、薄荷和山艾(或称鼠尾草)这5种香料可杀死大肠杆菌，而肉桂则含有两种可使细菌毙命的成分[67]。肉桂油与两性霉素合用，能显著降低两性霉素对白念珠菌的MIC80％值[68]。张文平等[69]采用微量液体稀释法测定烟曲霉、黄曲霉的MIC分别为0.055 g/L、0.1 g/L，其可能通过抑制曲霉菌DNA、RNA蛋白质的合成而表现杀菌效应。郭朝晖等[70]报道肉桂挥发油对革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌均有良好的体外抑菌效果。近期的研究[71,72]也表明，肉桂醛的抗菌能力与肉桂油基本相等，这充分说明肉桂油的广谱抗菌效能主要是肉桂醛作用的结果。
利用肉桂油的抗菌作用，在实际应用中肉桂油可作为天然的食品防腐剂，特别对一些易长霉菌的馒头、糕点、面包等食品的具有防腐保鲜作用。
（2）肉桂油在抗氧化方面的应用[5]
1997年，美国FDA(Food and Drug Administration)宣布食品中禁止使用2，6一二叔丁基对甲酚(BHT)。所以，开发安全、高效、无毒的天然抗氧化剂，成为当代食品工业发展趋势，具有非常广阔的前景。肉桂油有很好的抗氧化作用。吴雪辉，黄永芳，高强，等肉桂精油对油脂有较好的抗氧化作用，发现其抗氧化能力比0.05％Vc的效果要好．但比0.01％PG稍差。
（3）肉桂油在杀虫方面的应用
肉桂油有良好的杀虫作用。肉桂油中的反式肉桂醛、丁香酚、水杨醛、反式肉桂酸及肉桂醇等物质都具有不同程度的杀灭象鼻虫之类甲虫的作用；肉桂提取物对克氏锥虫有100％的抑制活性；肉桂油熏蒸或喷雾能杀灭粉尘螨[6]；含5％肉桂油软膏及肉桂的甲醇提取物均能保护人和家畜不受埃及伊蚊的叮咬，所以利用这些特性我们可以将肉桂油开发为天然新型的杀虫剂和防蚊剂。
1.3 天然精油的提取方法
天然精油常用的几种提取方法[7]如下:
（1）水蒸气蒸馏法：对于植物性天然香料生产，水蒸气蒸馏是最常用的一种方法。精油与水不相混合，当受热后，二者蒸汽压的总和与大气压相等时，溶液即开始沸腾，继续加热则精油可随水蒸气蒸馏出来。提取时，可将植物的花、枝、叶、皮、根、茎、果等原料在蒸馏器中加水浸泡后，直接加热蒸馏，或者将原料置于有孔隔层板网上，当底部的水受热产生的蒸气通过原料时，则精油受热随水蒸气同时蒸馏出来，收集蒸馏液，经冷却后分取油层。此方法具有设备简单、容易操作、成本低、产量大等优点。除少数在沸水中主香成分容易降解、水解或分解的原料外，绝大多数芳香植物都可用水蒸汽蒸馏法生产精油。缺点就是精油中的水溶性成分不易提取出来。
（2）有机溶剂萃取法：用乙醚、石油醚、二硫化碳等有机溶剂浸提。浸提的方法可采用回流浸出法或冷浸法，减压蒸去有机溶剂后即得浸膏。得到的浸膏往往含有植物蜡类等物质，可利用乙醇对植物蜡等脂溶性杂质的溶解度随温度的下降而降低的特性，先利用热乙醇溶解浸膏，放置冷却滤除杂质，回收乙醇后即得精油。
（3）超临界流体萃取法：超临界流体萃取[8](Supercritical Fluid Extraction,SFE)是利用处于临界温度、临界压力之上的超临界流体(Supercirtical Fluid,SCF) 具有溶解许多物质的能力的性质将超临界流体作为萃取剂，从液体或固体中萃取分离出特定的成分的新型分离技术。利用超临界流体萃取提取天然产物中的活性成分一直以来都是超临界流体萃取技术研究最活跃的领域，其中对植物精油的提取占据了主导地位。用超临界流体萃取技术提取天然物中的精油时，原料一般是经过粉碎后的植物固体颗粒。超临界流体萃取技术用于植物挥发油的提取方面具有适应性广泛、萃取率高、易于调节控制、产品性能易于保持等很多优点。
（4）油脂吸收法[9]：油脂类一般具有吸收精油的性质，往往利用此性质提取贵重的精油如玫瑰油、茉莉花油。通常用无臭味的猪油3份与牛油2份的混合物，均匀地涂在面积50cm×100cm的玻璃板两面，然后将此玻璃板嵌入高5-10cm的木制框架中，在玻璃板上面铺放金属网，网上放一层新鲜花瓣，这样一个个的木框玻璃板重叠起来，花瓣被包围在两层脂肪的中间，精油逐渐被油脂所吸收，待脂肪充分吸收芳香成分后，刮下脂肪，即为“香脂”，这种方法称为冷吸收法。或者将花等原料浸泡于油脂中，与50 o C-60 o C条件下低温加热，让芳香成分溶于油脂中，称为温浸吸收法，然后加入无水乙醇共搅，醇溶液减压蒸去乙醇得精油。
（5）微波浸提技术：微波浸提(Microwave assisted extraction)是一种新的提取技术，它是利用超高频电磁波强大穿透作用，实现在颗粒内外同时均匀、迅速加热，因此具有能耗低、操作时闻短、目标组分得率高等优点，已成为植物天然产物提取的重要发展方向。
加拿大Jocelynapare研究开发的可批量连续进行微波处理的挥备已用于大量提取大蒜油和薄荷油。可见，微波提取已从实验室进入工业化生产。发油提取工艺及设备已用于大量提取大蒜油和薄荷油。可见，微波提取已从实验室进入工业化生产。
（6）热回流法[10]：热回流法是一种比较成熟的分离手段。它最大的特点在于通过溶剂的蒸发与雹流使得每次与原料相接触静溶剂都是纯溶裁，从而大大提高了萃取推动力，达到提高萃取速度和效率的目的。索式提取是热回流法的一种，影响索氏提取法提取速度的因素主要有回流速度、回流时间、溶剂的种类与浓度、原料粒度等。回流速度越快，溶剂与原料接触次数越多，对萃取越有利。索氏提取法的提取效率相对较高，但是必须加热，不利于保留中药中的热敏性有效成分，并且时间长，能耗大，生产成本篙，操住比较复杂。
1.4检测抗自由基氧化的分析研究机理
1.4.1自由基的定义
自由基含有一个或多个不成对电子的原子、分子或离子，化性大部分处于极不稳定的状态，反应性较其他分子高，会抢夺临近分子的电子形成电子对，使其达到稳定的状态，被抢夺电子的分子則会变得不稳定，若又具有高度的活动性则会造成连锁反应，促使自由基的产生[11]。
1.4.2 自由基的产生
自由基有三个明显的特征：1.化学反应活泼性强；2.由于未成对电子的存在，自由基的总自旋角动量不为零，具有磁矩，表现有顺磁性；3.寿命短。
产生自由基的方法很多，但一般都是通过分子的均裂而得到，加氢和抽氢也可以产生自由基，常用的方法有
1．光解法或光均裂法[12]
有机化合物的光解，是产生自由基的另一重要方法。许多物质在波长适当的紫外线或可见光的照射下，都发生键的均裂，生成自由基。辐射(可见光、紫外光、X射线、α射线)可以提供分子均裂所需的能量。有机化合物中的大多数键键能在250KJ/mol～450KJ/mol，采用可见或紫外线照射就能使某些分子的共价键断裂，发生光化学反映，在很多情况下，只有被分子吸收的辐射才能产生化学反应。
2．热解法或热均裂法
在自由基反应中，通常采用三类有机化合物(二烷基过氧化物、二酰基过氧化物和偶氮化合物）作为引发剂。通过提高温度，共价键可以从热能得到能量而裂解，生成自由基。应用最多的是石油裂解，生成各种自由基，这些自由基再相互结合生成各种小分子物质。
3．同金属离子偶合的氧化还原裂解
凡是能够单电子氧化还原的金属离子都可以同过氧化氢反应，使其发生分裂，产生自由基，这就是很有名的Fenton 反应[11]。
-
+
++?+→+OH
H M
O H M
221
4.加氢和抽氢产生的自由基
这在生物体内是一个非常重要的过程，最典型的例子是在线粒体呼吸链中黄素铺酶氧化还原时形成黄素半醌自由基
3
FH
FH
FH e
H
e
H ??→????→?+++
当有金属离子存在时，半醌自由基与醌和氢醌之间形成一个稳定的平衡体系
22FH FH FH
?????←+金属离子
5.诱导分解
在自由基连锁反应中，引发剂单分子分解所生成的自由基产物，可以进攻未反应的引发剂分子，从而使引发剂分解生成新的自由基，这样的分解称诱导分解，这个新的自由基可使连锁反应继续进行。这种连锁诱导分解有很大的复杂性，可以通过选用无夺取氢的引发剂和溶剂而得到改善。过氧化物和偶氮化合物由于易进行单分子分解，提供了自由基的来源，适用于研究其它自由基过程。
1.4.3 自由基反应
自由基反应[13]可以广义地分为自由基化合过程和自由基转移过程；前者包含两个自由基，并导致生成所有电子都成对的非—自由基产物；而后者的结果则产生一个新的自由基，这个新的自由基进一步和周围的分子反应，因而时常产生自—增长反应链。
(1)化合或偶联(Combination or coupling) R R R R '-→?'+?
两个自由基的化合导致键的生成，因而在能量上是有利的。已知这种过程非常迅速，仅需少量活化能或不需活化能，但是由于在溶液中，自由基的浓度非常低，因而它们之间的反应取决于它们浓度的平方，这一过程通常并不象转移反应对溶剂那么重要。
(2)歧化反应(Disproportionation)
C
C H C C H C C H C C H -+---→?--+?--
β-氢原子从一个自由基转移到另一个自由基，生成非—自由基产物称作歧化。这个过程生成两根键，断裂一根键像自由基偶联一样，在能量上是有利的。例如，两个
乙基可以歧化生成乙烷和乙烯。
（3）氧化还原反应(Redox-reactions)
正如通过单电子转移的氧化还原反应可以生成自由基那样，自由基也可相似地被破坏。自由基被过渡金屑离子还原，导致生成阴离子，而氧化就生成阳离子。
（4）置换反应(Displacement) ?+-→-+?B A R B A R
置换反应或取代反应，似象在离子置换反应中一样，除了夺氢和夺取卤原子外，取代反应在自由基化学中很少发生。
（5）加成反应(Addition)
?--→-+?C C R C C R
自由基对于不饱和化合物的加成，一般是指烯烃，但有时也同样能与炔属化合物或羰基化合物加成，生成另一个较稳定的自由基。如果这个所得的自由基加到不饱和作用物的另一个分子上去，这个过程便称作调聚反应。此外，反复加成可能消耗成百成千个作用物单元，并得到自由基聚合反应。
（6）碎裂反应(Fragmentation ）
在这个过程中，通常是自由基中心β位上的键断裂，自由基断裂的结果可以生成一个较小的自由基和一个不饱和分子。
1.4.4 自由基的检测
1 顺磁共振法(EPR)[14]
电子顺磁共振(EPR)也称电子自旋共振（ESR ），电子的顺磁共振现象是根据自由基自旋所产生磁矩的性质决定的。一般分子中，电子配对，自旋相反，产生的磁矩可以互相抵消，这种分子对外界磁场呈现反磁性。当分子中具有一个电子或多个电子独占一个轨道时，分子产生磁矩，这种物质在磁场内呈现顺磁性。ESR 实验一般采用的磁场大约为3200G ，共振吸收发生在微波区的9000MHz 左右，且ESR 光谱含有单吸收。
由于ESR 技术相对成熟稳定，对不同的自由基选择合适的自旋捕集剂就变得非常的重要。典型的自旋捕集剂是亚硝基化合物或氮氧化合物 ，常用的主要包括：5，5-二甲基1-吡咯啉N 一氧化物(DMPO)；2-甲基2一硝基丙烷(MNP 或tNB)；苯基叔丁基氮氧化合物(PBN)；α一(1氧基-4-吡啶基一N-叔丁基氮氧化合物)(4-POBN)。
2 色谱法
色谱法包括高效液相色谱法和高效气相色谱法，均可用于自由基的间接分析。高效液相色谱法（HPLC ）是一种间接测定某些自由基的较可靠的方法，其原理为：往体系中加入能捕集自由基的物质，生成较稳定的加合物，然后用色谱对体系进行分离，检测加合物的生成量，从而间接检测出自由基的含量。从理论上讲，自由基捕捉剂也可以是ESR 法中的自旋捕捉剂，若能检测较稳定的自由基加成物RS ，则此法兼有自由基捕捉技术和HLPC 的定量优势。但因色谱法本身的要求，对自由基加合物的分离检测不一定能顺利实现。从实践上看，DMPO 、PBN 等电子自旋捕捉剂尚未能应用于
HPLC法，HPLC法的捕捉剂主要是中性分子的化合物。
HPLC法测定自由基，在分离检测前需先用捕捉剂捕捉自由基，这可以说是此法中最关键的一步，不仅要求捕捉剂能捕获所需测定的自由基，反应物具有一定的稳定性，还要有利于HPLC法的分离和检测。目前，HPLC法已用于·OH[14]的测定分析。
3 化学发光法
该法要求自由基激发产物过程中伴随化学发光现象，利用高灵敏度的发光仪，如荧光分光光度计、超微弱发光仪就可以直接观察自由基氧化荧光剂的光强变化，这样就可以估计自由基的多少。为提高观察的灵敏度，常用鲁米诺（luminol）等作为发光增效剂。此法检测活性氧有灵敏、快速、操作简单等优点，目前被广泛应用于活性氧的检测和研究，用于·OH、H2O2、O2的间接分析。但此法要求自由基的产生体系不会产生强的化学发光或吸光，以免严重干扰活性氧的检测。
化学发光法检测的精度可以利用结合高效液相色谱(HPLC)连用的方法来提高。这种不同分析手段相结合来提高分析效果的方法是目前普遍看好的分析手段之一。
4 化学比色法[15]
化学比色法的基本原理是利用氧自由基的氧化或还原性质，使反应体系中的某种反应物发生氧化或还原反应，反应生成物在紫外光或可见光范围内某一特定波长下具有最大吸收峰，通过测定反应体系在该波长下透光率(AT)或吸光率(△A)的变化，间接测定出氧自由基的含量。
比色法有细胞色素C 四氮唑蓝、肾上腺素、羟基等方法，这些方法的基本原理都是利用通过黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶反应系统产生O2·，O2·与上述某种物质反应，生成有色物质；而SOD可抑制这些反应，使反应体系中有色物质生成量减少。通过检测有色物质减少的量，就能计算出被测样品中的SOD活力。
化学比色法操作简便，所用仪器较为普遍，适合于普通实验室采用，但其灵敏度及专一性有待进一步提高。
5 分光光度计法[16]
分光光度计法也属于化学比色法中的一类，它是利用某些物质的分子吸收200—800nm光谱区的辐射，发生分子轨道上电子能级间的跃迁，从而产生分子吸收光谱来进行物质的分析测定。对于某些物质的微量、痕量分析，具有准确度高，分析速度快的特点。将色谱的分离手段与光学分析仪器联用，将获得许多更有价值的信息。
因为这种方法便捷、操作简单，是一种传统的分析方法，与那些高档的色谱仪、ESR仪相比有操作的可行性。且由于实验条件和经费的限制，故本文采用分光光度法对肉桂油的抗氧化活性进行分析讨论。
1.4.5 抗自由基氧化及抗氧化成分
抗自由基氧化是指具有还原性的物质抑制启动自由基链反应，阻止自由基反应的传播，终止自由基反应。因此，自由基清除就是指直接与自由基反应，使之还原为非
自由基的化合物。抗氧化或自由基清除分析是建立在对起氧化产物的检测分析的基础上的。
抗氧化剂的抗自由基氧化作用是通过捕捉自由基来形成较稳定的物质来实现的。在人的机体生命活动中，氧气在有机体内代谢还原，共接受4个电子。在这一过程中，每接受一个电子就生成一个氧自由基或活性氧；环境污染、食品添加剂、吸烟[16]、酒精、药物自由基、富氧/缺氧、人体内黄嘌呤氧化酶等作用均可产生对人体有害的自由基。由于自由基具有很高的反应活性，它们一旦产生将很快与周围分子发生反应，伤害生物膜、酶、维生素、蛋白质及活细胞功能。现已明确许多疾病[17]衰老，如：恶性肿瘤、炎症、心脑缺血、动脉粥样硬化等与自由基有关；而在食品、医药和化工产品中，合成的抗氧化剂有一定的毒性和致癌作用，寻找能清除体内过量自由基的外源植物活性成分成为人们研究关注的热点。因此，采用一定的方法研究、筛选有良好抗氧化性的动植物资源，对积极寻求天然的抗氧化剂以代替合成的抗氧化剂具有实际的意义。
现在对肉桂油的利用仅仅集中在油相部分的研究，而对于肉桂水溶性挥发组分的研究国内外还没有报道，只有少量关于其它植物对应水溶性挥发组分研究的介绍。但这些文献也只是指出要对溶于水（或微溶于水）的这部分挥发性组分回收避免浪费，而对这部分的成分分析和应用活性并没有研究。因此，用简便的分光光度法对肉桂油的抗氧活性进行研究，具有一定的积极意义。
1.5本实验研究的目的、意义
传统的合成抗氧化剂如BHA、BHT、TBHQ等，虽然比较经济、且抗氧效果很好，但随着人类对健康水平的要求提高，临床医学证明，上述合成的抗氧化剂对人体具有一定的副作用。而一些天然抗氧化剂具有抗癌、抗衰老和防止心脑血管等作用，且对人体伤害较小。因此，开发高效的天然抗氧化剂具有极为重要的意义和市场经济价值。而肉桂油中的成分，有的抗氧化性很强，而有的很弱。本课题研究不同肉桂油不同成分的抗氧化性质。既有理论意义，又对广西肉桂油的深加工、提高肉桂的经济效益和不同成分的提取及利用有着十分重要的现实意义。
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1. 基本原料
肉桂粉，购于柳州市中药饮片厂。
2.1.2 实验主要试剂
实验所用到的药品和试剂如下表2-1：
表2-1 实验的主要试剂列表
试剂名称级别生产厂商
无水乙醇AR 广东台山粤侨实际试剂塑料有限公司
二苯代苦味肼基自由基（DPPH）含10-20％苯日本东京化成工业株式会社无水乙醚AR 广东·汕头市西陇化工厂
无水氯化钠AR 广东·汕头市西陇化工厂
无水硫酸钠AR 广东台山粤侨实际试剂塑料有限公司肉桂醛AR 国药集团化学试剂有限公司
肉桂酸AR 国药集团化学试剂有限公司
BHA AR 美国SIGMA公司
2.1.3 实验仪器
表2-2 实验所用到的仪器：
设备名称型号生产厂商
光栅分光光度计722型上海第三分析仪器厂产品
电子天平MP200B 上海精密科学仪器有限公司
干燥箱202-3型上海市仪器总厂
2.2实验方法
2.2.1肉桂油的分离提取
1 肉桂油的提取[18]：
我们采用水蒸气蒸馏法提取肉桂精油。精油的提取：将样品装进一个3000mL的配有竖直球形冷凝管和挥发油提取器（即分油管）的圆底烧瓶中，再加入2000mL水，置于加热套上通电加热，使混合液回流6h，静置一段时间至分层，然后在分油管中分离出非水溶性肉桂精油，加入无水硫酸钠清除精油的水分，即可得到实验用的精油。精油在冰箱中控制温度在40C下保存。
2 肉桂水溶性挥发油的提取：
将蒸馏非水溶性精油后剩下的废液再次蒸馏，然后往蒸馏出的溶液加入纯度95%的NaCl进行盐析，接着用无水乙醚进行萃取，往所萃取出的水溶油和乙醚的混合溶液加入少量无水硫酸钠除水后再进行蒸馏，最后蒸馏即可得到肉桂水溶性挥发油。精油在冰箱中控制温度在40C下保存。
2.2.2 肉桂挥发性成分的定性定量分析
气相色谱-质谱联用技术：
毛细管色谱柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)；采用程序升温：60℃保持1min，升至170℃(2℃/min), 继续升至270℃(8℃/min),于270℃保持5min；载气为高纯氦气，流量1.0mL·min-1；进样量1μL，分流比1:100，进样口温度280℃，接口温度230℃。分析肉桂挥发性成分是采用。
质谱条件：EI电离源，电子能量70eV，电子倍增器电压1.5KV，质量扫描范围33～550amu，全扫描方式。
按以上所述GC-MS条件分别对肉桂发性成分（油相成分和水溶性成分）进行分析，得到对应的总离子流色谱图。采用计算机对各峰的质谱图进行NIST标准谱库的检索，根据质谱裂解规律进行核对，参考标准图谱和相关文献确定其化学结构[]，并对肉桂醛、肉桂酸等主要成分采用标准品进行对照。采用峰面积归一化法[]计算各组分的相对含量。
2.2.3 清除DPPH自由基的抗氧化活性实验
在现有的自由基及抗氧化分析中，利用人工建立活性氧或自由基的发生体系，然后检测其中产生的自由基及抗氧剂或自由基清除剂对所产生自由基的抑制清除行为，作为游离基捕捉剂的DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，C18H12N5O6）,其本身也可以被抗氧化剂捕获，因DPPH具有特殊的紫色，利用其褪色效应，可利用分光光度法对其进行研究。
许申鸿[19]等研究了DPPH?的无水乙醇溶液体系显色稳定，在1×10-5mol/L—2×10-4mol/L范围内，DPPH?溶液浓度与吸光度A呈线性正相关关系。即体积质量浓度范围是：3.94μg/mL-78.86 mg/mL，吸光度太小则灵敏度不够，太大则光线无法透过，难以测准。
本实验选取2×10-2 mg/mL是因为在这个浓度范围内适合DPPH·与抗氧剂发生作用且体系的吸光度又不至于太低。具体做法[20]如下：
称0.5g各种肉桂油于25mL具塞试管中以无水乙醇为溶剂定容，配制浓度为需要的各种浓度的肉桂油溶液。准确称量DPPH固体0.5mg，放在250mL的容量瓶加无水乙醇配成浓度为2×10-2mg/mL的溶液，注意避光保存。往5.0mL具塞试管中依次加入2mLDPPH溶液，再加入2mL的不同浓度的肉桂油溶液。同时开始计时，在517nm处（最大吸收波长处）测定不同浓度的肉桂油溶液在各个时间点的吸光度。
定义肉桂油抗氧化剂为对DPPH自由基的清除率为：
S％＝[1-（Ai-Aj）/Ac]×100
式中：Ai＝2mLDPPH溶液+各个浓度肉桂油的吸光度；
Aj＝各个浓度肉桂油溶液在体系中未加DPPH溶液时的本底吸光度；
Ac＝2mlDPPH溶液+2ml无水乙醇的吸光度。
为了使实验结果具有可比较性，以同样的方法将不同浓度的典型的强抗氧化剂BHA进行实验。此外，本实验还用肉桂醛、肉桂酸进行实验比较。
3.结果与讨论
3.1 不同浓度的肉桂油的抗氧化性能分析
不同组分不同浓度肉桂油油的清除率随时间变化的关系，如图1-1、
1-2
20406080
1000
20
40
60
80
100
120
时间/min 清除率/%
图1-1 肉桂挥发性油相组分对DPPH 的清除能力
20406080
1000
20
40
60
80
100
120
清除率/%
图1-2肉桂挥发性油水溶性组分对DPPH 的清除作用
从图1-1～图1-2中可以看出，不同浓度肉桂油的抗氧化性能，对DPPH自由基的清除率随着时间的推移而增大，在同一时间下，随着浓度的增大而增大。
26mg/mL、20mg/mL、13mg/mL和6.5mg/mL的肉桂挥发性油相组分在60min之前清除率变化比较快，60min以后趋于一个稳定值，然后缓慢变化。而3.25mg/mL在实验时间120min内斗处于一个缓慢上升的过程中，这说明大于6.5mg/mL的肉桂挥发性油相组分清除自由基比较快，表现出较强的抗氧化活性。26mg/mL和20mg/mL的清除率曲线比较接近，而与其他浓度清除率曲线间隔较大，说明26mg/mL和20mg/mL的肉桂挥发性油相组分抗氧化活性比较接近，表现出较强的抗氧化活性（120min时都在90%左右），而比其它浓度大许多。说明浓度对清除率的影响较大，即浓度和抗氧化活性关系较为密切。6.5mg/mL和3.25mg/mL的清除率都比较低，都没有超过60%（6.5mg/m L56.69%、3.25mg/mL46.90%）,表现出较弱的抗氧化活性。
6mg/mL、5mg/mL、3mg/mL和2.5mg/mL的肉桂挥发性油在0-60min之间清除率曲线变化比较大，60min趋向一个稳定值，然后缓慢变化，而1.5mg/mL的清除率曲线在实验时间120min内都处于一个缓慢变化的过程，说明大于2.5mg/mL的肉桂挥发性油水溶性组分清除自由基比较快，表现出较强的抗氧化活性（都超过60%），而1.5mg/mL 相对较弱（46.81%）。
从浓度看出，水溶性组分的清除率明显比油相组分得大5mg/mL水溶性组分在120min时清除率83.03%，而6.5mg/mL的油相组分120min时才56.69%，相差较大，说明水溶性组分的抗氧化活性明显比油相组分强。
3.2肉桂油主要成分的抗氧化活性分析
本课题研究的主要是肉桂挥发性油相的主要成分之一的肉桂醛、肉桂挥发性油的主要成分肉桂醛和肉桂酸，抗氧化活性研究如图2-1和2-2：
DPPH自由基清除法 李熙灿/Xican Li （广州中医药大学） [文献] Xican Li, Jing Lin, Yaoxiang Gao, Weijuang Han, Dongfeng Chen. Antioxidant activity and mechanism of Rhizoma Cimicifugae. Chemistry Central Journal. 2012; 6(1):140. [原理] DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。 N 2 2 当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH测试液的配制 取DPPH 1mg溶于约20mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A＝1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。 1.3 预试 取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。 【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。 1.4测量 A0值的测量：取DPPH溶液2 mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加95乙醇（或无水乙醇）1mL，充分混合，测A值（519nm），此A值为A0（A0多在0.7-0.9之间）。 A值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液xμL （x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 95乙醇（或无水乙醇），混合，静置30分钟后，测A值（519nm）。如：某样品的用量梯度为40、80、120 、160、200μL，则加样表如下： 表1 加样表 1.5 正式测量
清除自由基能力的研究概况 陶涛 （西南林业大学林学院农学（药用植物）昆明 650224） 摘要：自由基及其诱导的氧化反应是导致生物衰老和某些疾病如癌症、糖尿病、一心血管疾病等的重要因素。乳酸茵作为一种高效、低毒的生物源天然抗氧化荆，正逐步受到食品、制药、化工等领域的广泛关注。就目前国内外常用的乳酸茵抗氧化活性的筛选方法、乳酸茵抗氧化机理的国内外研究进展及未来的发展趋势作一综述。 关键词：自由基；乳酸茵；抗氧化． Study on the scavenging ability of lactic acid bacteria on free radical bstract：Free radical and its inducing oxiditative reaction may CaUSe biological doat and certain diseases such as Cancers，diabetes and the cat- diovascular．The lactic acid baaeria as one ofbiological SOUrCeS oxidation inhibitor is becoming more and more popular in the fields offood．，drug manufacture and chemical industry．This article mainly reviews the screening methods for antioxidative of lactic add bacteria among domestic and foreign countries，the advance of the research progress in lactic add bacteria antioxidative and r∞earch trends in future． 引言 氧化过程可以提供能量．对大多数生物体来说，是维持生命必不可少的一个能量转化过程。但过多的氧化过程会对生物大分子引起损伤．氧化损伤主要是由于自由基和过氧化产物作用于人体而产生的。 自由基(free radicals)27．．称游离基．为人体氧化代谢过程中形成含有一个不成对电子的原子或原子团。人体的自由基主要包括超氧阴离子自由基(o2)、
DPPH?和ABTS+?自由基清除实验（含PTIO?自由基清除实验)：详细说明与疑难解答 李熙灿（广州中医药大学中药学院, 2019.7） （以下内容系来源于实验经验及三个参考文献[1]Li, X., Comparative Study of 1,1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl Radical (DPPH?) Scavenging Capacity of the Antioxidant Xanthones Family. Chemistryselect, 2018. 3,13081-13086. [2]Li, X.; Ouyang, X.; Cai, R.; Chen, D. 3’,8”-Dimerization Enhances the Antioxidant Capacity of Flavonoids: Evid ence from Acacetin and Isoginkgetin. 2019, Molecules. 24, 2039. [3]Li, X.C., 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-Oxid e (PTIO?) Radical Scavenging: A New and Simpl e Antioxidant Assay In Vitro. J. Agric. Food Chem., 2017. 65,6288-6297 【概述】DPPH?、ABTS+?、PTIO?自由基三者，都是常用的自由基。概述如下表： 1
紫色墨绿色蓝紫色 2
3
DPPH.法测定绿原酸清除自由基能力 2.1 待测液的制备 将绿原酸(纯度56%)、维生素C 和没食子酸分别配制成体积分数为0.1mg/mL 的无水乙醇溶液。 2.1.1 绿原酸母液的配制 称取 9.0 mg 绿原酸，定容到50ml ，即可得到绿原酸的母液0.1mg/mL 。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.2 Vc 母液的配制 称取 mg VC ，定容到100ml ，即可得到VC 的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.3 没食子酸母液的配制 称取 mg 没食子酸，定容到100ml ，即可得到没食子酸的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。 分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。 2.1.4 DPPH 母液的配制 称取 mg DPPH ，用无水乙醇定容到100ml ，即可得到DPPH 的母液。然后，再将所配制的母液按照要求稀释成至一定浓度的溶液。C DPPH = mg/ml 。（建议用0.025mg/mL ） 2.2 DPPH.溶液的可见光谱 以无水乙醇为对照，在分光光度计上对DPPH.溶液进行在440～600nm 下扫描。A max = nm 2.3 抗氧化活性测定 DPPH.是一种稳定的自由基，它的乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为 nm 。当DPPH.溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm 处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。因此，可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力，其能力用清除率(Scavenging Rate,SR)来表示，清除率越大，抗氧化能力越强 [4.5]。 具体实验步骤及方法： 精确吸取的DPPH.溶液2mL 与2ml 无水乙醇混合均匀后，以相对应的溶剂(4mL 无水乙醇)为对照，用分光光度计测定上述溶液在 nm 处的吸光度值(A 0)。 A 0= 2.3.1 绿原酸样品溶液的抗氧化能力测定 精确吸取上述不同浓度的绿原酸溶液2mL ，分别与浓度 mg/ml 的DPPH.溶液2mL 混合，摇匀后放置30min 。以相对应的溶剂(无水乙醇)为对照调零，用分光光度计分别测定上述溶液在 nm 处的吸光度值(A i )，分别测得A i 值。 A 1 ；A 2 ；A 3 ；A 4 ；A 5 ；A 6 ；A 7 。 精确吸取上述不同浓度的绿原酸溶液2mL ，分别与2mL 无水乙醇混合均匀后，以无水乙醇为对照，用分光光度计分别测定各混合液在波长 nm 处的吸光度值(A j )，分别测得A j 值。 A 1 ；A 2 ；A 3 ；A 4 ；A 5 ；A 6 ；A 7 。 将以上数据代入下列公式计算其清除率。 清除率SR(％)=%100A A A 10j i ???? ? ?? -- 其中， A i ：为2mL 绿原酸、维生素C 和没食子酸与 2mL 的DPPH.溶液混合后在波长 nm 处的吸光度值； A j ：为2mL 绿原酸、维生素C 和没食子酸分别与2mL 无水乙醇溶剂混合后在波长 nm 处的光值； A 0：2mLDPPH.溶液与2mL 无水乙醇溶剂混合后在波长 nm 处的吸光度值。
主要目的： ——为了测定样品清除DPPH自由基的能力。 主要原理： ——自由基清除剂与DPPH单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用酶标仪进行快速的定量分析。 实验室签章
一、试剂 ——1 ,1-二苯基-1-苦味肼基自由基（DPPH）——甲醇（分析纯） 二、仪器设备 ——96孔酶标板 ——UV-Vis可见多功能酶标仪 ——移液枪 ——200 μL量程枪头
三、实验方法 ◆前期准备 配置2 g/L 的DPPH甲醇标准溶液。 ◆DPPH自由基清除能力 参照Brand-Williams (1995)[1]报道的方法，将其稍加改动后应用在96孔酶标板中[2]。在酶标板的每孔中，依次加入不同体积（10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 μL）的样品溶液和200 μL的DPPH标准溶液（2 g/L），最后用甲醇溶液补齐至总体积300 μL。 室温反应30 min后，于515 nm下用UV-Vis可见多功能酶标仪测定其吸光度（EL 340, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA）。番茄样品消除自由基的能力表示为EC50（清除1 μg DDPH至50 %所需的样品用量（μg干重））。 EC50越小，表示抗氧化活性越高。平行测定三次，取平均值计算。 清除DPPH自由基能力用如下公式计算： 清除率%=（1- Ac Aj Ai ）×100% 其中：Ai为样品溶液加DPPH试剂混合液的吸光度，Aj为样品溶液加甲醇的吸光度，Ac为DPPH溶液加样品溶剂的吸光度。 [1] Brand-Williams W, Cuvelier M E. Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity [J]. LWT - Food Science and Technology, 1995, 28(1): 25-30. [2] Verma A R, Vijayakumar M, Rao C V. Mathela C S. In vitro and in vivo antioxidant properties and DNA damage protective activity of green fruit of Ficus glomerata [J]. Food and Chemical Toxicology, 2010, 48(2): 704-709.
一、试验方法 1、DPPH自由基清除率的测定 本实验采用1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)法测定样品清除自由基活性。 1.1实验原理 1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl(DPPH)）是一种稳定的以氮为中心的自由基，其乙醇溶液显紫色，最大吸收波长为517nm。当DPPH 溶液中加入自由基清除剂时，其孤对电子被配对时，吸收消失或减弱，导致溶液颜色变浅，显黄色或淡黄色，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线性关系，故该法可用清除率表示，清除率越大，表明该物质清除能力越强。 1.2溶液的配制 0.08mmol/L DPPH溶液的配制：精密称取DPPH8.0mg，用无水乙醇溶解并定容至200ml棕色容量瓶中，得浓度为0.004%的DPPH溶液，避光保存，备用。 1.3实验步骤：分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml离心管中，加入3.0ml的DPPH溶液，室温避光反应30min，同时以无水乙醇为空白，于517nm波长处测定吸光值。按下列公式计算DPPH自由基清除率。 DPPH自由基清除率（%）= A0-(A s-A c)/ A0×100% 公式中，A0—1.0ml蒸馏水+3.0mlDPPH溶液的吸光度值 A s—1.0ml样品溶液+3.0mlDPPH溶液的吸光度值 A c—1.0ml样品溶液+3.0ml无水乙醇的吸光度值
将实验重复三次，求得清除率的平均值。 2、总的抗氧化活性的测定 总的抗氧化活性实验采用改良后的Prieto法。 2.1实验原理：磷钼络合物测定方法的原理是Mo(VI)被抗氧化物质还原成绿色的Mo(V)络合物，其最大吸收波长为695nm。抗氧化物质活性越强，测定的吸光度值越大。此方法操作简单，所用试剂低廉、方法重现性好，非常适合抗氧化性的测定。 2.2溶液的配制 样品液:同上 磷钼试剂:0.6mol/L浓硫酸溶液、28mmol/L磷酸钠溶液和4mmol/L钼酸胺溶液混匀，即得。 2.3实验步骤 分别取不同浓度的各样品溶液（0.24,0.48,0.72,0.96,1.20mg/ml）1.0ml，置10ml 离心管中，加入3.0ml试剂溶液（试剂溶液中包括0.6mol/L的硫酸、28mmol/L 的磷酸钠、4mmol/L的钼酸铵）。混合液于95℃水浴锅中分别水浴30min，60min、90 min、120 min、150 min。 放冷至室温，695nm处测吸光度值。以蒸馏水为空白，吸光度值越大，表明抗氧化能力越强。BHT做为阳性对照。将实验重复三次，求平均值。 三、还原力的测定 3.1 实验原理 以普鲁士蓝[Fe4(Fe(CN)6)3] 之生成量作为指标，将六氰合铁酸钾[K3 Fe(CN)6] 还原成K4Fe(CN)6，再利用Fe3+形成Fe4(Fe(CN)6)3，由700nm处吸光
电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法 自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。 其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。 原理部分： 1.DPPH·法测试机理 DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。 2. 羟基自由基（·OH） 1）邻二氮菲法[70]
实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm 最大吸收峰消失。如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。 2）水杨酸法[71] 实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。 3）甲基紫-Fe2+-H2O2反应体系 测定原理：在Fenton反应的基础上加入甲基紫作显色剂，反应式如下： Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH 甲基紫在酸性溶液中呈现紫色[9],在578nm 处有强吸收。反应产生的·OH 具有高的反应活性，容易进攻高电子云密度点，会与甲基紫中具有高电子云密度的-C=C-基团发生亲电加成反应，使甲基紫褪色。通过测定甲基紫在578nm 处吸光度值的变化可间接测定出·OH 的生成量。当有清除自由基的物质存在时，会阻断甲基紫与·OH 的反应，从而使得甲基紫的颜色有所加重，因此可利用抗氧化剂加入前后溶液吸光度值的变化来评价物质的抗氧化性强弱。
1、DPPH 自由基清除实验 取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL 乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度A b。4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。 2、ABTS 自由基清除实验 20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。ABTS 溶液作空白吸光度为Ar，样品0.1 mL、乙醇5 mL 混合均匀吸光度为A0。 ABTS＋自由基清除率(%)＝[1-(At-A0)/Ar]×100 式中：At 为样品的吸光值；Ar 为空白的吸光值。 3、超氧阴离子清除实验 采用邻苯三酚自氧化法，取4 mL 0.1 mol/L pH8.2 Tris-HCl 缓冲溶液和蒸馏水2 mL，混匀后在25 ℃水浴中保温20min，然后加入样品溶液2 mL，取出后立即加入在25 ℃预热过的5 mmol/L 邻苯三酚0.5 mL(以10 mmol/L HCL 配制，空白管用10 mmol/L HCL 代替邻苯三酚的HCL 溶液)，摇匀后倒入比色皿，325 nm下每隔30 s 测定吸光度，连续测定4 min，计算线性范围内每分钟吸光度的增加。在加入一定体积样品溶液时，减少蒸馏水的体积。 抑制率(%)=(△A0-△A)/△A0×100 式中：△A0 为邻苯三酚的自氧化速率；△A 为加入样品溶液后邻苯三酚的自氧化速率。
dpph自由基清除测定 DPPH法测定黄芩黄酮的抗氧化活性 抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。 目前对自由基清除剂的研究方法主要有2类，一类是体外模型，另一类是体内模型，其中DPPH法是体外模型中最常用的方法。 DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH?，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH?的效果，来计算抗氧化能力。 [1]实验研究表明，黄芩黄酮中清除DPPH自由基活性的主要成分是黄芩苷，黄芩苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应，反应式如下: ONON22 +H+NNONNONNH22 NONO22 DPPH与抗氧化剂反应原理 材料:DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼);无水乙醇; 仪器:分光光度计 1.DPPH贮备液的制备
准确称取DPPH试剂3(5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol,L DPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。 2.试液的制备(只作参考) 准确称取5.2mg干燥的黄酮提取物(32.75%),用无水乙醇溶解，并定量转入 50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0233mmol,L试液。 3.DPPH?清除率的测定 在10mL比色管中依次加入4.0mLDPPH溶液和黄酮提取液，再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(A)，吸光值记为Ai，再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。按下式计算自由基清除率(K): K(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]*100% 试验重复三次，取其平均值作为最后结果。 [1].刘玉萍,Purusotam Basnet,小松かっ子,曹晖.黄芩清除自由基活性与黄芩苷含量的相关性研究[J].中国中药杂志,2002,27(8):575-579 药品:DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼); 推荐厂家:上海如吉生物科技发展有限公司; 北京诺博莱德科技有限公司; 报价:380元/瓶;500元/瓶; 规格:1g/瓶; 含量:99%; 产地:日本进口 DPPH稳定性不好，要用时,新鲜配制 DPPH浓度要根据样品的活性来定，一般在20-100μg/mL
DPPH法测定黄芩黄酮的抗氧化活性抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。目前对自由基清 除剂的研究方法主要有类，一类是体外模型，另一类是体内模型，其中DPPH法是体外模型中最常用的方法。DPPH又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基，他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。它的无水乙醇溶液呈紫色，在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。向其中加入自由基清除剂时，可以结合或替代DPPH·，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH·的效果，来计算抗氧化能力。实验研究表明，黄芩黄酮中清除DPPH 自由基活性的主要成分是黄芩苷[1]，黄芩苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应，反应式如下：NN+O2NO2NNO2H+NNHO2NO2NNO2 DPPH 与抗氧化剂反应原理材料：DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）；无水乙醇；仪器：分光光度计 1.DPPH贮备液的制备 准确称取DPPH试剂3．5mg，用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0178mmol／L DPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。 2.试液的制备 准确称取5.2mg干燥的黄酮提取物（32.75%）,用无水乙醇溶解，并定量转入50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容
清除自由基 摘要：自由基这种强氧化性物质，可损害机体的组织和细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应，而清除这些自由基则能有益作用于我们的身体。众多权威研究表明，负离子能够消减自由基，减缓人体衰老，增强人体免疫力。 关键词：自由基医学 在生命质量越来越受重视的今天，预防治疗各种隐患和疾病已是迫切需要，随着自由基医学、生物学等的出现，人们对自由基的认识也越来越深刻，清除自由基方面的研究也更加全面具体。现在已经研究出了各式各样的自由基清除剂，应用这些自由基清除剂清除体内多余的自由基，防止机体受损而导致疾病的产生。 一、对自由基的认识 自由基又称游离基，是具有非偶电子的基团或原子，它有两个主要特性：一是化学反应活性高；二是具有磁矩。一般情况下，生命是离不开自由基活动的。我们的身体每时每刻都从里到外的运动，每一瞬间都在燃烧着能量，而负责传递能量的搬运工就是自由基。当这些帮助能量转换的自由基被封闭在细胞里不能乱跑乱窜时，它们对生命是无害的。但如果自由基的活动失去控制，超过一定的量，生命的正常秩序就会被破坏，疾病可能就会随之而来。所以说自由基是一把双刃剑。认识自由基，了解自由基对人体的作用，对健康十分必要。自由基是无处不在的，自由基对人体攻击的途径是多方面的，既有来自体内的，也有来自外界的。当人体中的自由基超过一定的量，并失去控制时，这些自由基就会乱跑乱窜，去攻击细胞膜，去与血清抗蛋白酶发生反应，甚至去跟基因抢电子，对我们的身体造成各种各样的伤害，产生各种各样的疑难杂症。 二、自由基清除剂 自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。 其中 ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。分光光度法最常用。 三、自由基清除实验 3.1 DPPH 自由基清除实验 取0.2 mL 样品，加入4 mL 醋酸缓冲溶液、3.8 mL乙醇和2 mLDPPH，混合均匀后室温避光放置30 min，测定在517 nm 处的吸光度A。同理，取0.2 mL 样品、4mL 醋酸缓冲溶液和3.8 mL 乙醇，测定在517nm处的吸光度Ab。4 mL 醋酸缓冲溶液、4 mL 乙醇和2 mL DPPH，测定在517 nm 处的吸光度A0。 自由基的清除率=[A0-(A－Ab)]/A0。 3.2 ABTS 自由基清除实验 20 mL 的7 mmol/L ABTS 和352 μL 的140 nmol/L 过硫酸钾混合，在室温、避光条件下静置过夜，形成ABTS＋自由基储备液。该储备液在室温、避光的条件下稳定，使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求其在30 ℃、734 nm 波长下的吸光度为0.7±0.02。加入的提取液0.1 mL、ABTS 工作液5 mL，混合均匀后在室温下避光反应10 min 后，在734 nm 处测定吸光度At。ABTS 溶液作空白吸
收稿日期:2003-11-06 修回日期:2004-12-05 基金项目:福建省林业厅基金资助项目(闽林[2000]08). 作者简介:郑德勇(1966-),男,副教授.研究方向:树木提取物、林产化工工艺与设备. 竹叶提取物清除DPPH 自由基的测定方法 郑德勇1,安鑫南 2 (1.福建农林大学材料工程学院,福建福州350002;2.南京林业大学化学工程学院,江苏南京210037)摘要:确定了以光度计比色法测定天然抗氧化剂清除二苯基苦基苯肼(DPPH )自由基能力的条件.通过测定抗坏血酸、槲皮素、硫脲和芦丁的DPPH 自由基清除率曲线,提出以IC 50值作为评价试样清除DPPH 自由基能力的指标,并将此应用于21种丛生竹竹叶提取物清除DPPH 自由基能力的测定. 关键词:竹叶提取物;光度计比色法;清除能力;二苯基苦基苯肼 中图分类号:Q946文献标识码:A 文章编号:100627817(2005)0120059204D eterm i n i n g m ethod of D PPH free rad i ca l scaveng i n g acti v ity of bam boo leaf extracti ves ZHENG De 2yong 1,AN Xin 2nan 2 (1.College of Materials Engineering,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou,Fujian 350002,China;2.College of Che m ical Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing,J iangshu 210037,China ) Abstract:A s pectr ophot ometric method f or deter m ining 1,12di phenyl 222p icryl 2hydrazyl (DPPH )free radical scavenging activity of natural anti oxidants was put f or ward .The evaluating criteri on of DPPH free radical scavenging activity was regarded as “I C 50”by deter m ining the scavenging rate curves of ascorbic acid,quercetin,thi ocarba m ide and rutin .The DPPH free radical scavenging ac 2tivity of extractives fr om 21s pecies of cluster 2ba mboo ′s leaf were deter m ined by this method . Key words:leaf extractive of cluster 2ba mboo;s pectr ophot ometry;scavenging activity;1,12di phenyl 222p icryl 2hydrazyl 植物抗氧化剂广泛应用于食品、医药、保健品和化妆品等行业 [1-4].竹叶抽提物含有黄酮、苷类、活性多糖及特种氨基酸等[5,6],具有显著的抗氧活性、防腐性能和抑菌作用 [7-9].竹叶提取物中的抗氧化有效成分主要是水溶、醇溶性物质,可通过测定二苯基苦基苯肼(DPPH )自由基的清除能力进行抗氧化活性研究.清除自由基的检测方法有许多种[10,11],体内试验比较灵敏、繁琐,周期较长,费用高,不适于大量样品 的测定.大量样品的抗氧化活性筛选需采用体外实验法[12-15],其中电子自旋共振波谱法(ESR )是测定自 由基的最直接而有效的体外试验技术,但需要昂贵的仪器和复杂的自由基捕集技术.DPPH 检测法 [16,17]是通过DPPH 分子中1个稳定的自由基与抗氧化剂提供的1个电子配对结合,使DPPH 的特征紫色消失,因 此可用于抗氧化剂清除自由基能力的评价.1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 HP1100高效液相色谱仪(DAD 检测器)为美国安捷伦公司产品;UV2000型紫外分光光度计为上海光 谱仪器厂产品.DPPH 的质量分数≥95%(Sig ma 产品).配制6.5×10-4mol ?L -1乙醇贮备液,置于冰箱, 临用前用体积分数为50%的乙醇稀释.槲皮素、芦丁的质量分数≥95%.其他试剂均为分析纯. 1.2 试样的制备 竹叶采集于福建农林大学南平校区校园和南平市城郊林场丛生竹种源地.取约500g 竹叶,用清水洗净晾干,用微波炉加热30s 杀青,取出风干,破碎,并过20-80目筛,备用.取2份各5.0g 竹叶试样,分别经20mL 石油醚脱脂处理后,加入100mL 体积分数为60%的乙醇50℃提取10h (2次),倒出提取液,抽福建农林大学学报(自然科学版) 第34卷第1期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Editi on )2005年3月
DPPH 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，别名1,1-二苯基-2-苦肼基（自由基）；1,2-二苦基-2-三硝基苯亚肼；1,2-二苯基-2-苦肼基。是一个稳定的自由基，为暗紫色棱柱状结晶，熔点127～129℃（分解）。最大吸收波长528nm。可用于光度测定生育酚和脂肪族硫醇类、还原物质的分析试剂，也是常用的阻聚剂。 本品应密封于0℃保存。 DPPH有两个主要的应用，都用于实验室研究中：一是在含有自由基的化学反应中作为一种监测反应的物质，典型的用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价[1]；还可以作为电子顺磁共振信号位置和强度的标准物质。 DPPH性质应用 编辑 DPPH具有几个不同结晶形态，它们的晶格对称性和熔点（m.p.）存在差异。商品化的粉末是不同晶相的混合物，熔点在130℃附近。DPPH-Ⅰ（m.p. 106℃）是正交晶系，DPPH-Ⅱ(m.p. 137℃)是无定形态，DPPH-Ⅲ（m.p. 128-129℃）是三斜晶系。 DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基，DPPH可以捕获（“清除”）其他的自由基。因此通过加入DPPH后观察某一化学反应的速率是否减慢，来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。由于DPPH自由基在以520nm为中心处具有强烈的吸收，因此在溶液中呈现深紫色，并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。利用这一特性可以直观地检测反应的过程，通过记录DPPH在在520nm 吸光度值或者EPR信号的变化可以得到初始自由基的量。 由于DPPH是十分有效的自由基捕获剂，因此它在自由基调控的聚合反应中是一种很强的抑制剂（阻聚剂）。 作为一种稳定和良好定性的固体自由基的来源，DPPH可能是最为广泛使用的电子顺磁共振信号位置（g-marker）和强度的标准物质----通过称量可以确定新鲜配置的样品自由基的数目，DPPH的EPR分裂因子校正在g=2.0036。DPPH的信号一般聚合为单一的线，在更宽的功率范围内，信号强度与微波功率的平方根呈线性关系，因此用DPPH作为校正的标准物质十分方便。DPPH的稀释特性（每41个原子含一个不成对自旋）导致它具有一个相对小的线宽(1.5–4.7Gauss)。但是若溶剂分子保持在结晶状态并且在高频率的EPR设定下测定，线宽可能会增加。 DPPH清除测试 DPPH原理 DPPH法于1958年被提出[2]，广泛用于定量测定生物试样和食品的抗氧化能力。此法是根据DPPH自由基有单电子，在517nm处有一强吸收，其醇溶液呈紫色的特性。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因而可用分光光度计进行快速的定量分析。 DPPH实验步骤 1.用无水乙醇配置0.1mmol/L 的DPPH溶液，避光保存。配置0.5mg/mL 的Vc溶液（作为对照）。将测试样品稀释至不同浓度。 2.将2mL测试样品溶液及2mL DPPH 溶液加入到同一试管中，摇匀，室温下暗处静置30min 后测定其吸光度A sample,同时测定2mL DPPH溶液与2mL 溶剂（蒸馏水或者相应的缓冲溶液）混合后的吸光度A control,以及2mL测试样品溶液与2mL无水乙醇混合后的吸光度A blank。
DPPH自由基清除法 [文献] Xican Li, Jing Lin, Yaoxiang Gao, Weijuang Han, Dongfeng Chen. Antioxidant activity and mechanism of Rhizoma Cimicifugae. Chemistry Central Journal. 2012; 6(1):140. [原理] DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。 N 2 2 当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。 [实验步骤] 1.1 DPPH测试液的配制 取DPPH 1mg溶于约20mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A＝1.2-1.3之间最佳。该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。 1.2 样品液的配制 样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。 1.3 预试 取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。 此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。 【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则100μL为该样品液的最大用量。其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。 1.4测量 A0值的测量：取DPPH溶液2 mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加95乙醇（或无水乙醇）1mL，充分混合，测A值（519nm），此A值为A0（A0多在0.7-0.9之间）。 A值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液xμL （x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 95乙醇（或无水乙醇），混合，静置30分钟后，测A值（519nm）。如：某样品的用量梯度为40、80、120 、160、200μL，则加样表如下： 表1 加样表 1.5 正式测量 方法大致与1.4相同，只不过，每测一个用量需要测三个平行数据。而且在每测一个用量的三个平行数据后，都要重测一次A0.
DPPH实验步骤 一、原理： DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用 及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。作为一 种稳定的自由基，DPPH可以捕获("清除")其他的自由基。因此通过加入DPPH后观察某一化 学反应的速率是否减慢，来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。由于DPPH自由 基在以520nm为中心处具有强烈的吸收，因此在溶液中呈现深紫色，并且在被中和之后会 变为无色或浅黄色。 DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，且需低温避光储藏，具有 单一电子，故能接受一个电子或氢离子，在波长为517nm下具有最大吸收。有自由基清除 剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且 下降程度呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧 化能力。此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性越强。 二、实验步骤： 1.配制0.1mM的DPPH溶液：配两次，每次取0.002gDPPH溶于50mL乙醇，避光保存。 2.配制0.5mg/mL的Vc溶液，至少2mL（设为阳性对照，选择性做） 3.配制一定浓度的样品溶液，至少2mL母液（也可以配制不同溶度梯度样品，计算IC50） 4.上板（避光操作，上完板后，室温避光30分钟，测吸光度） 96孔板，三组，每组设3个复孔，每孔加入量及96孔板分布如下：sample（样品组）：样品溶液100uL+ DPPH醇溶液100uL (每个浓度3个孔) blank（空白组）：样品溶液100uL+无水乙醇100uL （每个浓度3个孔） 样品VC 浓度 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 sample blank control 5.检测并计算清除率 测517nm处的吸光度，取平均値，计算每个浓 度的DPPH清除率，做出折线图。 清除率=（1 -（A sample - A blank）/ A control）X 100%
DPPH 实验步骤 一、原理： DPPH 是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的共振稳定作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。作为一种稳定的自由基，DPPH 可以捕获("清除")其他的自由基。因此通过加入DPPH 后观察某一化学反应的速率是否减慢，来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标。由于DPPH 自由基在以520nm 为中心处具有强烈的吸收，因此在溶液中呈现深紫色，并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。 DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈紫色，且需低温避光储藏，具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，在波长为517nm 下具有最大吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH 的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系，吸光度水平的降低表明抗氧化性的增加，从而以评价试验样品的抗氧化能力。此抗氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化性越强。 二、实验步骤： 1.配制0.1mM 的DPPH 溶液：配两次，每次取0.002gDPPH 溶于50mL 乙醇，避光保存。 2.配制0.5mg/mL 的Vc 溶液，至少2mL （设为阳性对照，选择性做） 3.配制一定浓度的样品溶液 ，至少2mL 母液（也可以配制不同溶度梯度样品，计算IC50） 4.上板（避光操作，上完板后，室温避光30分钟，测吸光度） 96孔板，三组，每组设3个复孔，每孔加入量及96孔板分布如下： sample （样品组）：样品溶液100uL+ DPPH 醇溶液100uL (每个浓度3个孔) blank （空白组）：样品溶液100uL+无水乙醇100uL （每个浓度3个孔） 5.检测并计算清除率 测517nm 处的吸光度，取平均値，计算每个浓 度的DPPH 清除率，做出折线图。 清除率=（1 -（A sample - A blank ）/ A control ）X 100%