利用基因工程酵母生产抗疟疾药物前体--青蒿酸
Dae-Kyun Ro1*, Eric M. Paradise2*, Mario Ouellet1, Karl J. Fisher6, Karyn L. Newman1, John M. Ndungu3, Kimberly A. Ho1, Rachel A. Eachus1, Timothy S. Ham4, James Kirby2, Michelle C. Y. Chang1, Sydnor T. Withers2,Yoichiro Shiba2, Richmond Sarpong3 & Jay D. Keasling1,2,4,5
（杨豫鲁翻译）
摘要：疟疾这种疾病威胁着全球三至五亿人的健康，并且每年杀死超过一百万的人口。抗药疟原虫突变系Plasmodium falciparum2,3的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。虽然人工合成的抗疟药以及相关疫苗已经出现，但其针对疟疾的治疗效果仍需经受严格的临床检验4，5。而青蒿素，一种从Artemisia annua L（菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来的倍半萜内酯环内过氧化物（C-15倍半萜），对抗药性疟原虫Plasmodium spp的抑制效果非常明显。可惜的是其供给量受自然因素等各方面限制，疟疾患者大都难以承受其昂贵的价格6。青蒿素的人工全合成也非常困难，而且花费很大7。不过利用微生物工程发酵合成其前体青蒿酸（一种合成青蒿素的可靠来源）,却是一个相对来说比较廉价、环保和高效的办法8，9。这里我们将介绍如何通过基因工程途径改造啤酒酵母使其高效合成青蒿酸（最高可达100ug/L）：对其甲羟戊酸途径进行调控，并且转入编码amorphadiene（等价于amorpha-4,11-diene，合成青蒿酸及青蒿素的最直接的前体原料）合酶和一种特异的细胞色素P450酶(CYP71AV1)的基因。这两种酶均源自青蒿，而且后者经过三步氧化作用将amorpha-4,11-diene转变成青蒿酸。青蒿酸合成后被转运到胞外并附着在酵母外表面上，这意味着通过简单且廉价的纯化过程就可以获得目标产物。尽管这种基因工程酵母合成青蒿酸的能力相对于青蒿来说已经十分显著，仍需急切解决问题的是如何提高其生产效率从而扩大至工业规模生产，以便可以生产出足够多的青蒿酸来降低现有青蒿素的价格，让青蒿素综合疗法可以广泛地被应用到对疟疾的治疗中去。
内容:我们通过三个步骤构建能合成青蒿酸的基因工程酵母：（1）改造酵母焦磷酸法尼酯（FPP）生物合成途径中的相关基因，增加FPP的合成并且设法减少它作为固醇类物质的前体去合成固醇；（2）将青蒿中的amorphadiene合酶基因ADS转入到高FPP生产株中，从而转化FPP为amorphadiene；（3）克隆青蒿中特异的细胞色素P450酶基因（这种酶通过三步氧化将amorphadiene氧化成青蒿酸）并使其在amorphadiene生产株内表达（见图1）。青蒿素生物合成的第一步反应由ADS10催化，它已经被鉴定并且用于在大肠杆菌
图1| 图中所示为同时表达CYP71AV1和CPR的基因工程啤酒酵母菌株EPY224中青蒿酸的合成途径。蓝颜色显示的是啤酒酵母甲羟戊酸合成途径中被直接正调节的基因；紫色显示的是因upc2-1表达被间接正调节的基因；红线指示菌株EPY224中被抑制的ERG9；绿色箭头指示从焦磷酸法呢酯到青蒿酸的生物合成途径，这条途径已经从青蒿被完全引入到啤酒酵母当中，在CYP71AV1和CPR共同作用下经过三步氧化将amorphadiene转变为青蒿酸。途径中间产物IPP, DMAPP和GPP分别代表异戊烯焦磷酸酯、二甲基丙烯焦磷酸酯和焦磷酸牻牛儿酯。
中合成amor phadiene11。为了确定对是否要促进细胞内FPP的合成，我们将ADS基因插入由GAL1
启动子控制转录的pRS425质粒中，然后在酵母细胞中表达，结果显示单独转入ADS基因的酵
母只合成少量的amorphadiene（图2，菌株EPY201，4.4mg/L）。
图2 |柱状图显示基因改造过程不同阶段啤酒酵母菌株的amorphadiene合成能力，这些菌株的详细介绍请见正文。为减小实验误差，均在同一条件下培养144小时后取样测定，amorphadiene合成水平也被定量化。纵坐标表示总产量，为平均值±标准差(n =3)。
所以，为了提高啤酒酵母合成amorphadiene的能力，我们对FPP合成途径进行了总共五次的基因工程改造。几个与FPP合成相关的基因的表达被正调控，而另外几个促使FPP转变成固醇的基因被负调控。同时为了保证宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修饰都是通过染色体融合进行的。具体过程如下：首先，将一种截短的水溶性酶3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（我们所学生化书中为译为β-羟基-β-甲基-戊二酰辅酶A还原酶，简称HMGCoA还原酶，又简称tHMGR12，是固醇合成的限速酶）过表达，可提高amorphadiene的合成产量近五倍（图2，菌株 EPY208）；其次，利用一个methioninerepressible启动子(PMET3)13，通过对编码鲨稀合酶（固醇生物合成途径中FPP合成后第一步）的ERG9基因进行负调控，可将amor phadiene的合成量再增加两倍（图2，菌株EPY225）；然后，尽管upc2-1, 一个可以加强UPC２（啤酒酵母中调节固醇合成的一个的通用转录因子）14活性的半显性突变体等位基因，在已有菌株 EPY208背景下过表达（图2，菌株EPY210）对amorphadiene合成的提高起的作用并不显著，但结合对ERG9基因的负调控，其过表达可将amorphadiene的合成量提高到105mg/L（图2，菌株EPY213）；再次，在酵母染色体更远处在转进一个tHMGP拷贝可以将将其合成量再增加50%达到149mg/L（图2，菌株 EPY 219）；最后，虽然编码FPP合酶的
基因（ERG20）过表达对amorphadiene合成总量（图2，菌株 EPY224）的提高效果非常小，但在细胞密度降低的情况下其合成量却可增加10%。将所有这些对基因的修饰综合在菌株EPY224上，amorphad iene的合成量已经达到了153mg/L , 是之前所报道这种倍半萜(烯)最大合成水平的几乎500倍15。
（王易龙翻译）
现在我们已经得到了可以高效合成amorphadiene的酵母菌株，但为能将amor phadiene 转变成青蒿酸，我们还需要找到并分离出青蒿中编码催化amorphadiene转变成青蒿酸的酶的基因。青蒿素是一种倍半萜内酯衍生物，这些衍生物在菊科植物中普遍存在，是一类十分有特性的细胞次级代谢产物。我们假定菊科植物在半倍半萜内酯的合成的前几步中利用的是源于同一祖先的合成酶，据此对菊科植物进行了一次基因组比较分析。由于先前已经有文章报道过对青蒿的无细胞化验，并且证明在青蒿中是一种特异的细胞色素P450酶17对amorphadie ne进行专一性羟化（图1）。我们直接从由向日葵和莴苣这两种菊科作物提供的基因数据构建的已表达序列标志（EST）数据库中检索得到细胞色素P450已表达序列标志（ESTs）。然后通过使用针对CYP71和CYP82家族（P450酶在菊科植物中最多的两个家族）高度特异的简并引物，从青蒿毛状体细胞的互补DNA库中分离出几个特定的P450片段。接着利用BLAST分析法18将这些片段与向日葵和莴苣的ESTｓ比对，我们惊奇地发现有一个青蒿P450基因片段与来自以上两种植物的未知功能ESTs序列非常相似（氨基酸水平上达相似度达85-88%），而同其他非菊科植物的P450序列相似度较低（氨基酸水平上小于50%）。这表明相对于非菊科植物，P450基因在这三个亲缘关系较远的菊科植物属中是高度保守的。因此，从青蒿中分离出的这段P450基因是编码菊科保守性倍半萜内酯生物合成酶一个非常好的候选者。
随后相应的完整P450cDNA（CYP71AV1），一个编码495个氨基酸的开放阅读框，成功从青蒿中分离获得。系统进化分析法显示CYP71AV1和其他的P450s（像催化类单萜羟化的CYP71 D13/1819、催化倍半萜羟化的CYP71D2020以及二萜类化合物羟化的CYP71D1621）有很近的亲缘关系。这进一步表明从青蒿中获得的P450在萜类化合物代谢中存在的潜在作用。为了保证异源表达的CYP71AV1可以发挥正常功能，协同它进行氧化还原反应的天然配体，NADPH：细胞色素P450氧化还原酶（CPR），同样从青蒿中成功分离，并且其生化活性已经在体外被证实。(细胞色素c 和 NADPH 的米氏常数(Km)分别为4.3±0.7 μM 和 23.0±4.4 μM (平均值
±标准差, n ＝3 ))。
在配体分子CPR的参与下，我们研究了在活细胞体内CYP71AV1是否可以催化amorphadie
ne转变为多级氧化产物：转基因酵母株EPY224中被转入了一个整合有CPR和CYP71AV1基因并且由半乳糖诱导启动子调控的基因载体，经半乳糖的诱导表达后，用醚对酵母细胞体和培养基分别进行抽提，并对馏分进行气象色谱—质谱联合分析(GC–MS)。分析结果显示，在同时表达CYP71AV1 和 CPR的细胞株EPY224细胞体及其培养基中，一个独特的单色谱峰被检测出，但是在只表达CPR的EPY224中并未检测到这个峰，并且，几乎95%的这种特异化合物是来源于细胞体的。而且这种化合物的电子碰撞质谱和保留时间与从青蒿中提取的青蒿酸的完全吻合（图 3）。在摇瓶培养条件下，同时表达CYP71AV1 和CPR的EPY224菌株青蒿酸产量为32 ± 13 mg/L (平均数±标准差, n＝7)。更为重要的是，其中间代谢产物，青蒿醇和青蒿醛在细胞体和培养基中被检测到的量几乎可以忽略（青蒿醇的量比青蒿素酸的5%还少，并且根本没有青蒿醛被检测出）。
我们证实，通过用碱性缓冲液（pH为9的Tris-HCL缓冲液中添加1.2M的山梨醇）清洗胞体沉淀物，绝大部分合成的青蒿酸（>96%）可以而被分离出，而且冲洗之后细胞体和培养基中的残留量仅为2%。青蒿酸不仅可以被高效的转移到细胞外，且在酸性条件下经过质子化后会被束缚在细胞表面。利用这个特点制定了一种便捷提纯方法：用醚对清洗缓冲液进行抽提，然后经过一步简单的凝胶柱层析分离抽提物，就可以得到纯度高于95%的青蒿酸。在一个一升发酵罐中，青蒿酸的产量为115mg，而通这种方法的，我们可以得到76mg的提纯产物。最重要的是，经 1H and13C原子核磁共振检测显示，这种酵母合成青蒿酸与从青蒿中直接提取的青蒿酸分子结构完全一样，并且同先前的文献报道十分吻合22，23。因此，可以确定我们所得到的这株转基因酵母能够直接合成结构功能上完全正确的青蒿酸。
（周景峰翻译）
转基因酵母在生产青蒿酸时需要的生物量与青蒿相比，其细胞体干重的4.5%相当于青蒿中1.9%的青蒿酸和0.16%的青蒿素，但是所需的时间非常短（酵母4-5天，而青蒿则需要几个月的时间）。因此，转基因酵母菌珠的单位生产效率比青蒿高了近两个数量级。
P450酶三步氧化法曾在植物赤霉素生物合成途径中有过报道24，25。我们通过体外酶法检测CYP71AV1是否在amorphadiene转化为青蒿酸的三个过程中都起到催化作用。从啤酒酵母菌株YPH499中分离微体，这些微体仅表达CPR或者同时表达CPR和CYP71AV1。将微体在不同的合成途径中间体（amorphadiene，青蒿醇，青蒿醛）条件下进行培养（图4）。对照组微体仅表达CPR，没有催化任何合成途径中间体以到更高级的氧化产物。但是我们发现包含CYP71AV1和CPR的微体将amorphadiene、青蒿醇和青蒿醛更加高效地转化成了青蒿酸。这
些体外实验毫无疑问地证明：重组CYP71AV1可以在amorphadiene的C12位置催化三次氧化反应。虽然先前已经有报道，使用青蒿蛋白提取物的体外酶法测定证明可溶性的醇醛脱氢酶和一种C11，13双键还原酶（作用于醛）参与青蒿素的生物合成 17。我们不排除在青蒿中存在其他的醇醛脱氢酶参与的催化反应，但是体外实验中重组的CYP71AV1将amorpha-4, 11-diene高效转化为青蒿酸，完全显示出膜结合、多功能的CYP71AV1是青蒿素的生物合成中的关键促成因素。
图3：气相层析质谱法（GC-MS）分析从青蒿蒿和转基因酵母中获得的青蒿酸
a．表达CPR或者CPR和CYP71AV1的啤酒酵母菌株细胞体使用碱性缓冲液冲洗后，经酸化和醚抽提提纯。青蒿酸用乙烷从青蒿的叶子里提取。在进行GC-MS分析之前，每个样品的甲酯化产物需经三甲基硅烷-重氮甲烷提前处理。内标物（IS）是4-辛基苯甲酸的甲酯化物。
b，c．从酵母（b）和青蒿（c）中得到的青蒿酸的质谱和保留时间。RT表示保留时间，以分钟计。
图4：体外酶法测定CYP71AV1的活性。从啤酒酵母菌株YPH499中分离获得的微体表达CPR（对照组）或者CPR和CYP71AV1(CYP71AV1组)。
a-c．每一种酶的测定分别加入（a）10μM amorphadiene，（b）25μM 青蒿醇，或者（c）25μM 青蒿醛。底物的色谱峰用星号标出。醚提取物经过衍生，并用GC-MS在不同的粒子模式下分析（mlz：121，189，204，218，220和248）。酶反应的产物按照预期得到：1，青蒿醇（保留时间13.20分钟）；2，青蒿醛（保留时间11.79分钟）；3，青蒿酸（保留时间13.58分钟，甲酯化后检测）
总的来说，我们采用改造FPP生物合成途径的方法获得了能高水平生产青蒿酸的啤酒酵母菌株。该方法通过表达amorphadiene合成酶，一种新型的细胞色素P450和与之相关的来自青蒿的氧化还原酶来提高青蒿酸的产量。据了解，相关转化青蒿酸到青蒿素或其他派生物的化学方法可能还有许多待改进之处8，9，但微生物法生产青蒿酸是获得此类高效抗疟疾药物切实可行的方法。保守分析证明，在使产品效价最优化的情况下，青蒿素结合治疗法将会远远降低于现在用于疟疾治疗的价格。除了节省费用之外，这种生物合成方法不会受到像天气和政治气候等因素的影响，但这些因素可能会对植物的培育造成影响。进一步说，从微生物里得到的青蒿酸可以采用对环境友好的方式提取，而不用担心像植物能够产生其他的萜烯致
使产物受到污染，从而减少了纯化的费用。
方法：
对于啤酒酵母的增殖与鉴定、CYP71AV1和 CPR基因的克隆以及青蒿醇和青蒿醛的半合成等实验过程中所使用的手段方法的详细描述请见补充信息。
化学和植物材料：青蒿酸标准品购买于Apin Chemicals公司或者直接用己烷从青蒿叶片萃取。青蒿植株被栽培在加州大学伯克利分校的温室当中，并且都是从种子开始培育的。GC—MS法分析Amorphadiene：用GC—MS对不同株系的啤酒酵母的Amorphadiene合成量进行测定，使用十二烷阻止Amorphadiene的挥发。为了定量衡量Amorphadiene产量水平，用于测定标准曲线的Amorphadiene（90%纯）是通过大肠杆菌菌株发酵制备的。
青蒿酸的胞内发酵，纯化及化学分析：将经过预培养的在600nm（A
）下吸光度达到0.05的
600
EPY224菌株（已经被转入pESCURA::CPR 或者 pESCURA::CPR/CYP71AV1）接种到25ml合成培养基中。该培养基不含组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和尿嘧啶，但是添加有0.2%的葡萄糖、1.8%的半乳糖以及1mMol定量的甲硫氨酸。300C下恒温培养120小时，然后将培养混合物进行离心，留下细胞体。再用50mM Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）冲洗细胞体，加入2M的HCl将缓冲液的pH 调至2.0，用混入4-烷基苯甲酸（10ug/ml）的乙酸乙酯进行萃取。萃取馏分经50ul 2M的四甲基硅烷-重氮甲烷和10%的甲醇衍生。在进行GC-MS分析前，产物还要经过以（1：1）的醚和戊烷为洗脱剂的凝胶色谱提纯。
（阳震翻译）
最后，提纯的产物经气相色谱质谱仪（70eV，Agilent Technologies）分析，毛细管柱为DB5（0.25毫米内径×0.25μ×30m，J&W Scientific）。气相色谱的加热程序从80℃（保持2分钟），以每分钟20℃的梯度递增到140℃。产品分离时由5℃/min的速度增加到220℃。采用火焰电离色谱检测标准品时为了定量，没有使用相同的气相加热程序对柱子进行净化。发酵及产物的核磁共振分析:使用1升的生物反应器（New-Brunswick Scientific），在30℃的条件下，培养酵母菌93个小时。2%的半乳糖的诱导酵母细胞，600nm下测OD值为1.7，最终的细胞浓度OD值A
达到5.0。搅拌速度从100rmp变到500rmp，每分钟通氧0.5L，使
600
得溶氧量始终保持在40%，青蒿酸使用碱洗的方法从细胞沉淀物中提取出来，再使用含有78%的乙烷，20%的乙酸乙酯和2%的乙酸的硅胶管柱提纯。分离得到的青蒿酸（纯度大于95%）的结构采用College of Chemistry NMR Facility at the University of California提供的1H和13C NMR500MHz核磁共振仪进行分析。
体外酶法测定:用重组质粒pESCURA::CPR或者pESCURA::CPR/CYP71AV1与1升的啤酒酵母
YPH499培养物，加入2%的半乳糖转化24小时。微体使用聚乙二醇法沉淀，然后超高速离心去除前面提到的细胞里的蛋白质杂质26。取大约500μg的微体蛋白，100mM pH 7.5的磷酸加缓冲液, 10或者25μM 的培养基，100μM NADPH和一个NADPH的重建体系（5mM 葡萄糖-6-磷酸和2个单位的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）。反应在24℃下轻微搅拌作用24小时。反应完成之后加酸至pH 为2，然后使用乙醚抽提。产物采用与上面所述相同的气相加热程序。使用包含了相对于产物典型的六种离子（121，189，204，220和248）的固定离子检测（SIM）法进行检测。
更过补充信息请查阅在线网页https://www.doczj.com/doc/b4206894.html,/nature.
致谢：
感谢提供官方CYP数据的Nelson教授，进行从青蒿中提纯青蒿酸工作的Ockey教授和McPhee教授的。感谢提供pδ-UB的N.A.Da.Silva, 提供pRH127-3和pRH973的R.Y.Hampton,提供 pBD33 和 pBD36的 J. Rine。感谢菊科基因组计划的R. Michelmore和其他成员对本项目的支持。最后感谢梅林达-比尔盖茨基金会、美国农业部、美国国家科学基金会、Institute for OneWorld Health、Akibene Foundation、University of California Discovery Grant、the Diversa Corporation 提供资金支持。
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药物的专属鉴别试验是证实某一种药物的依据，它是根据每一种药物化学结构的差异及其所引起的物理化学特性不同，选用某些特有的灵敏的定性反应，来鉴别药物的真伪。 氧瓶燃烧法系将有机药物放入充满氧气的密闭的燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或测定含卤素有机药物或含硫、氮、硒等其它元素的有机药物。 比旋度——偏振光透过长1d m 并每1ml含有旋光性物质1g的溶液，在一定的波长与温度下测得的旋光度称之。（符号[ ]） 准确度是指用特定方法测得的生物样品浓度与真实浓度的接近程度，可用相对回收率表示，即采用“回收率”或“加样回收率”得到的药物自样品中回收率。 微生物检定法─以抗生素对微生物的杀伤或抑制程度为指标来衡量抗生素效价的一种方法。其测定方法有稀释法、比浊法、管碟琼脂扩散法生物药物：利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物。 基因工程药物：先确定对某种疾病具有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因进行分离、纯化或人工合成，利用重组DNA 技术加以改造，最后将该基因导入可以大量生产的受体细胞中不断繁殖或表达，并能进行大规模生产具有预防和治疗这种疾病的蛋白质，通过这种方法生产的药物称为基因工程药物。 效价测定：采用国际或国家参考品，或经国家检定机构认可的参考品，以体内或体外法测定其生物学活性，并标明其活性单位。 电泳法是指带电微粒如蛋白质、核苷酸、其他微粒分子或离子在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度泳动而使组分分离，再进行检测或计算百分含量的方法。 中药指纹图谱中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标定该中药材或中药制剂特性的共有峰的图谱。
原创抗疟疾新药青蒿素发现及改造历程与启示 抗疟疾新药青蒿素发现及改造历程与启示作者：李兵 摘要：文章回顾了我国独创抗疟新药青蒿素的发现历程和开发改进的历史。另一方面对我国痛失青蒿素类抗疟药复方制剂国际专利权的过程和教训做了总结：GMP实施不到位和专利制度和知识产权理念的缺失，最后就近期国内外学者对青蒿素类抗疟药的后续研究做了回顾与展望。关键词：青蒿素类抗疟疾药GMP 知识产权专利制度Discovery &Developing Process ofNovel Anti-malarial Drug Artemisinin and the Revelation Abstract：The article reviews the history of the discovery and structural elucidation for china novel antmalarial drug artemisinin，on the other hand，our country lost artemisinin-based ant malarial compound preparation of the international patent，for this we learned that we didn’t have the GMP or the patent system and intellectual property concept。Finally is retrospect of the recent domestic and foreign scholars on Artemisia annual the follow-up study of the prime antmalarial and Prospect。
基因工程药物发展的历史及启示 吴岚晓1,郭坤元1,秦 煜2 (11第一军医大学珠江医院血液科,广东广州510282;21第一军医大学南方医院创伤骨科,广东广州510282) 摘要:基因工程诞生20余年,运用于医药行业,研制和开发基因工程药物,已取得长足进展。迄今为止,已有近100 个基因工程新药上市,并有数百种正在研制和开发中。可以预计,基因工程药物的发展具有无比强大的生命力。 就基因工程药物发展史进行概述,会从中得到许多启示。 关键词:基因工程;药物;科学;技术 中图分类号:R-02 文献标识码:A 文章编号:1002-0772(2002)12-0011-03 Developing History and the E nlightenment of G enetic E ngineering Drug W U L an-xiao,GUO Kun-yuan,QIN Y u (1.Depart ment of Hem atology,Zhujiang Hospital,First Military Medical U niversity,Guangz hou510282,China;2. N anf ang Hospital,First Military U niversity,Guangz hou510282,China) Abstract:G enetic engineering has made remarkable development in the area of drug production and research since it ap2 peared twenty years ago.More than100new geneitc engineering drugs have been used in clinic,and more drug-projects are undergoing.It can be predicted that genetic engineering drug will make more and more influence in people’s life.A perspective view about genetic engineering drug developing history was made in this article and some philosophic opinions inspired from it were discussed. K ey Words:genetic engineering;drug;science;technology 1 基因工程原理和技术 基因工程是在分子水平上人工改造生物遗传性,创造世间新的生物物种技术,亦称DNA重组或分子克隆,包括基因和载体的制备、切割和连接,重组DNA的转移、表达及产物分离等。基因的制备方法有,多聚酶链反应、互补文库、基因组文库、染色体DNA的酶切分离、酶合成法和化学合成法等,迄今为止,已制备人胰岛素、人尿激酶、人生长激素、人α-干扰素及生长因子等多种药物的基因。载体是能将外源性目的基因运输至宿主细胞的小分子DNA,目前大抵有细菌质粒、嗜菌体DNA及病毒DNA构建人工载体,如pBR322、Charon系列、Cos2 mid、反转录病毒、腺病毒及其相关病毒的DNA,此外,尚有酵母人工染色体DNA,及哺乳动物人工染色体DNA等。载体和含目的基因的DNA分别经限制性内切酶切割后,两者混合通过连接酶连接构成重组DNA,经转化、转导、转染、激光打孔、微注射或基因枪等技术,可转移至宿主内,获得基因工程细胞,后者经培养和表达,即可产生相应的基因工程药物。近年来还发现不用载体也不重组,将编码完整的DNA片段或mRNA直接注射内实现完全表达,表明非重组DNA和mRNA可被细胞直接吸收和表达,既简化了基因操作程序,也修正了基因工程基本概念,又促进了基因工程药物的发展,同时还为基因治疗提供了新理论和新途径。 2 基因工程药物发展的历史 应用基因工程技术,研制和开发的药物称为基因工程药物。它是通过重组DNA技术将治疗疾病的蛋白质、肽类激素、酶、核酸和其他药物基因转移至宿主细胞进行繁殖和表达,最终获得相应药物。包括蛋白质类生物大分子、初级代谢产物,如苯丙氨酸及丝氨酸等以及次生代谢产物抗生素等。自20世纪70年代初基因工程药物诞生以来,基因工程药物发展十分迅速。 ? 1 1 ? 医学与哲学2002年12月第23卷第12期总第259期
[医学类试卷]抗疟疾药练习试卷1 1 某女，29岁，记者，因采访任务需进入疟原虫发病疫区，可作病因性疟疾预防的首选药物是 （A）伯氨喹 （B）奎宁 （C）青蒿素 （D）氯喹 （E）乙胺嘧啶 2 某疟疾病患者突然出现昏迷，给予二盐酸奎宁静滴抢救，抢救过程中，病人又出现寒战，高热，血红蛋白尿，应改下列哪药继续抢救 （A）氯喹 （B）甲氟喹 （C）伯氨喹 （D）乙胺嘧啶 （E）青蒿素 3 关于抗疟药，下列哪一项叙述是正确的 （A）氯喹对阿米巴痢疾有效 （B）氯喹可根治间日疟 （C）青蒿素治疗脑型疟疾效果良好
（D）伯氨喹可用作疟疾病因性预防 （E）乙胺嘧啶能引起急性溶血性贫血 4 用于防止疟疾复发及传播的药物是 （A）氯喹 （B）奎宁 （C）青蒿素 （D）伯氨喹 （E）乙胺嘧啶 5 进入疟区时，作为病因性预防的常规用药是（A）伯氨喹 （B）氯喹 （C）乙胺嘧啶 （D）周效磺胺 （E）奎宁 6 久用可致高铁血红蛋白血症的药物是 （A）氯喹 （B）奎宁 （C）伯氨喹 （D）乙胺嘧啶
（E）青蒿素 7 根治间日疟最好选用 （A）伯氯喹+乙胺嘧啶 （B）氯喹+乙胺嘧啶 （C）伯氨喹+奎宁 （D）伯氨喹+氯喹 （E）青蒿素+乙胺嘧啶 8 主要用于控制疟疾症状的药物是（A）氯喳 （B）伯氨喹 （C）乙胺嘧啶 （D）甲氟喹 （E）SMP 9 主要用于病因性预防疟疾的药物是（A）氯喹 （B）乙胺嘧啶 （C）青蒿素 （D）伯氨喹
（E）磺胺嘧啶 10 氯喹 （A）可杀灭疟原虫红内期裂殖体 （B）抗疟作用起效慢，作用强，持续时间久（C）对疟原虫的原发性红外期裂殖体有效（D）对疟原虫的继发性红外期裂殖体有效（E）可杀灭血中疟原虫配子体 11 关于抗疟药，下列哪项叙述是正确的（A）氯喹对阿米巴痢疾有效 （B）氯喹可根治间日疟 （C）青蒿素治疗疟疾最大缺点是复发率高（D）伯氨喹可用作疟疾病因性预防 （E）乙胺嘧啶能引起急性溶血贫血 12 对奎宁的叙述哪项是错误的 （A）最早用于治疗疟疾的药物 （B）对红细胞内期滋养体有杀灭作用（C）主要用于耐氯喹或耐多药的恶性疟（D）每周服药一次，用于病因性预防（E）可出现心肌抑制作用
基因工程制药
(一) 概述 (二) 基因工程药物生产的基本过程 (三) 目的基因的获得 (四) 基因表达 (五) 基因工程菌的稳定性 (六) 基因工程菌生长代谢的特点 (七) 基因工程菌发酵 (八) 基因工程药物的分离纯化 (九) 基因工程药物的质量控制 (十) 基因工程药物制造实例
表达系统：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导 剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。 表达载体：包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因 等。表达菌株：不同的表达载体对应有不同的表达菌 株。
组成型表达：：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一 组成型表达 直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。这类表达载体通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。 诱导型表达：：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存 诱导型表达 在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于解决有毒蛋白或者过量表达对细胞的影响。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。
融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。 分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。 可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag 有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 青蒿素与疟疾防治 青蒿素与疟疾防治青蒿素与疟疾防治 9 月 12 日，2019 年度拉斯克奖的获奖名单揭晓，中国中医研究院的屠呦呦获得临床医学奖，获奖理由是因为发现青蒿素―一种用于治疗疟疾的药物，挽救了全球特别是发展中国家的数百万人的生命。 这也是迄今为止，中国生物医学界获得的世界级最高大奖。 疟疾与人类相伴青蒿素是与疟疾联系在一起的，因为它是疟疾的克星。 人患疟疾后会产生周期性高烧和寒战的症状，所以也俗称为打摆子。 中国古人把疟疾称为烟瘴，认为是飘浮的雾气导致人们中毒。 1880 年，在阿尔及利亚工作的法国医生夏尔#8226; 拉韦朗在疟疾病人体内发现了一种单细胞寄生虫，并确定它是导致疟疾的直接原因，这种致病原便是疟原虫。 为此，拉韦朗获得了 1907 年的诺贝尔生理学或医学奖。 1897 年，英国医生罗纳德#8226; 罗斯证明疟疾是由蚊子传播给人的，为此，他获得 1902 年诺贝尔生理学或医学奖。 这两项发现奠定了人类抗击疟疾的基础。 疟原虫是跨宿主成长的病原虫。 它在脊椎动物体内进行无性繁殖，再到蚊子体内发育到性成熟阶段，进行有性生殖。 1 / 10
迄今人们发现了 4 种疟原虫，其中最常见最有代表性的是恶性疟原虫。 疟疾由称为按蚊的雌蚊传播，公蚊以植物汁液为生，与疟疾没有关系。 人被按蚊的雌蚊叮咬之后 5～10 分钟，疟原虫孢子就会到达人体肝脏，既可躲过人体免疫系统的攻击，又可利用肝细胞的营养来大量分裂繁殖。 约一星期后，疟原虫孢子胀破肝细胞逸出，把数以百万计的新孢子释放入血液。 新孢子马上入侵红细胞，再次逃过免疫系统的追杀。 它们以血红蛋白为食，继续繁殖，大概两天后破坏红细胞，产生更多的孢子入侵其他红细胞。 如此往复，不久患者 2/3 的红细胞被疟原虫占领。 而疟原虫在血液里的这种周期性的繁殖过程便导致病人三天两头地发高烧、打寒战。 此外，一些孢子在红细胞里发育成大小不同的雌雄细胞，蚊子叮咬患者时，雌雄细胞就进入蚊子体内，在蚊子的消化道里生存，发育成熟后彼此结合，进行有性繁殖。 两个星期之后，新产生的孢子进入蚊子的唾液腺，在蚊子叮咬其他人时，把疟原虫孢子传播给他人。 受到美洲部落金鸡纳树皮可以治疗疟疾的启发， 1826 年法国药师佩雷蒂尔和卡文顿从金鸡纳树皮中提取出了治疗疟疾的药
基因工程药物 周长征 第一部分概述 一、基因工程药物 （一）基因工程药物的概念 基因工程药物是以基因组学研究中发现的功能性基因或基因的产物为起始材料，通过生物学、分子生物学或生物化学、生物工程等相应技术制成的、并以相应分析技术控制中间产物和成品质量的生物活性物质产品，临床上可用于某些疾病的诊断和治疗。基因药物类型广泛，包括重组蛋白质药物、人源化单克隆抗体、基因治疗药物、重组蛋白质疫苗、核酸药物等10多种类型。 生产基因工程药物的基本方法是：将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白类药物或疫苗。若目的基因直接在人体组织靶细胞内表达，就称为基因治疗。 例如，乙肝表面抗原（HBSAg）的产生也受DNA 调控。利用基因剪切技术，用一种“基因剪刀”将调控HBSAg的那段DNA剪裁下来，装到一个表达载体中（所谓表达载体，是因为它可以把这段DNA的功能发挥出来）再把这种表达载体转移到受体细胞内，如大肠杆菌或酵母菌等；最后再通过这些大肠杆菌或酵母菌的快速繁殖，生产出大量我们所需要的HBSAg（乙肝疫苗）。把一定量的HBSAg注射入人体，就使机体产生对HBV抗衡的抗体。机体依靠这种抗体，可以清除入侵机体内的HBV。过去，乙肝疫苗的来源，主要是从HBV 携带者的血液中分离出来的HBSAg，这种血液是不安全的，可能混有其他病原体的污染。此外，血液来源也是极有限的，使乙肝疫苗的供应犹如杯水车薪，远不能满足全国的需要。基因工程疫苗解决了这一难题。 干扰素具有广谱抗病毒的效能，是一种治疗乙肝的有效药物，国际上批准唯一一种治疗丙型病毒性肝炎的药物。通常情况下人体内干扰素基因处于休眠状态，血中一般检测不到。只有在发生病毒感染或受到干扰素诱导物的诱导时，人体内的干扰素基因才会产生干扰素，但其数量微乎其微。即使经过诱导，从人血中提取1mg 干扰素，需要人血8000ml，其成本高得惊人。获取1磅（453g）纯干扰素，其成本高达200亿美元。1980年后，采用基因工程进行生产，其基本原理及操作流程与乙肝疫苗十分类似。现在要获取1磅纯干扰素，其成本不到1亿美元。 （二）基因工程药物的发展 1973年，Cohen等人首次将带有Tet r基因和链霉素抗性基因（Str r）的两种大肠杆菌质粒成功地进行了重组，获得了可以复制并只有双亲质粒遗传信息的重组质粒，拉开了基因工程研究的序幕。1974年他们对具有Amp r和红霉素抗性基因（Emp r）的金黄色葡萄球菌质粒
青蒿素的发现及其获奖启示 摘要：青蒿素的发现被国际社会认为是中国继麻黄素之后的第二大医学贡献，屠呦呦研究员由于在青蒿素的发现中作出重大贡献而获得2011年度美国拉斯克临床医学研究奖。通过对青蒿素的发现过程和化学结构确定的简单介绍谈几点教学思考。 关键词：青蒿素化学结构发现过程化学教学天然产物 世界上影响人数最多的疾病并非现在深受关注的艾滋病，而是一种堪称“历史悠久”的疾病——疟疾，也就是俗称的“打摆子”，同时，它也是当今除艾滋病外，上升趋势最为显著的一种传染病，每年2～3亿人感染此病，200多万人死亡。19世纪从南美洲金鸡纳树皮中得到的奎宁曾成为最有效的药物，治愈了众多的疟疾患者。20世纪第二次世界大战后模仿奎宁基本结构而合成的一批新药如氯喹、伯喹也曾救治过无数的病人。但是20世纪60年代出现抗药性疟原虫后，以往常用的抗疟药（如氯喹、磺胺、奎宁等）的效果便不复存在，以至于造成了无药可医的局面，特别在东南亚、非洲地区情况更为严重。青蒿素类药物的出现以其副作用低且不易产生抗药性而被誉为“治疗疟疾的最大希望”。 2011年的9月23日，我国81岁高龄的女药学家屠呦呦被授予2011年度美国拉斯克临床医学研究奖，获奖理由是“因为发现青蒿素——一种用于治疗疟疾的药物，挽救了全球特别是发展中国家的数百万人的生命。”站在奖台上的屠呦呦说：“青蒿素的发现是中国传统医学给人类的一份礼物。” 1.青蒿素发现与获奖意义 1.1青蒿素的发现 青蒿是传统中药，在长沙马王堆汉墓中就有青蒿作为药物的文字记载。青蒿为常用中药，是一年生菊科植物黄花蒿的干燥地上部分。中药青蒿具有清虚热、除骨蒸、解暑热、截疟、退黄之功效，在中国有两千多年的沿用历史。青蒿素又名黄蒿素，是我国药学工作者1971年从菊科植物黄花蒿叶中提取分离到的一种具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物。20世纪60年代疟原虫对原有的药物产生抗体而使这些药物失效，我国政府临时组织“523”工作组，专门寻找新的抗疟药，但没有找到有效药物。1969年原本处于科研停顿状态的中医研究院应“523”办公室的请求，中途加入了这一研究行列，屠呦呦研究员临危受命，承担抗疟新药研究的重任，终于在1971年成功用乙醚提取出青蒿素。 1.2青蒿素的获奖意义 青篙素被国际社会认为是中国继麻黄素之后的第二大医学贡献，其突出贡献是突破了60多年来“抗疟药化学结构不含氮（原子）就无效”的传统医学观念，发现了迥异于以前的新型化学结构，其快速、高效、无抗药性、低毒的特征令全
基因工程药物的发展前景 周先建2003年4月12日 一、概况 自从DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展。1982年美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界第一个基因工程药物的诞生。目前，世界各国都将基因工程及其逐渐加速的产业化进程视为国民经济的新增长点，展开了激烈的市场竞争。到1999年底为止，全球至少已有近 3000家生物工程公司在从事生物药品与基因产品研究与开发。据不完全统计，在欧美诸国，已经上市的基因工程药品接近一百种，大约还有超过300种以上的药物处于临床试验阶段，约2000种在研究开发中，形成了一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。 基因工程药物的定义：将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上，然后将载体导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。这就称为基因工程药物。若目的基因直接在人体组织靶细胞内表达，就成为基因治疗，但目前尚没有基于基因治疗技术的药物被正式批准。 基因工程药物因为其疗效好，副作用小,应用范围广泛而成为各国政府和企业投资研究开发的热点领域，大量的基因工程药品连续问世，年产值达数十亿美元。自1982年问世以来，基因工程药物成为制药行业的一支奇兵，每年平均有3-4个新药或疫苗问世，开发成功的约五十多个药品已广泛应用于治疗癌症、肝炎、发育不良、糖尿病、囊纤维变性和一些遗传病上，在很多领域特别是疑难病症上，起到了传统化学药物难以达到的作用。其原因在于，基因工程制药物的研究与开发多是以对疾病的分子水平上的有了解为基础的，往往会产生意想不到的高疗效。 基因工程制造药行业在近二十年中的飞速发展是以分子遗传、分子生物、分子病理、生物物理等基础学科的突破，以及基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程和蛋白质工程等基础工程学科的高速进展为后盾的。基因工程药物的开发时间为5-7年，比开发新化学单体（10-12年）要短一些，当然这也与各国政府的支持有关。据报道，开发活性蛋白生物创新药的成功率按开发的5个阶段大致是：临床前的成功率为15%，一期临床为27%，二期临床为40%，三期临床为80%，注册登记为90%，总体成功率大大高于化学药。适应症不断延伸也是蛋白类药物的一大特点。例如，rhG-CSF，91年上市时批的适应症是化疗并发中性粒细胞减少，到95年11月13日止，又增加了骨髓移植，严重慢性中性粒细胞减少及外周及外周血干细胞移植等适应症。因此，基因工程生物药物发展包括新品种和新适应症两个方面。 二、美国基因工程药物的发展前景
2016年全国高考热点透视之——青蒿素 Daniel高考研究院命题 青蒿素与双氢青蒿素 注意选择题为不定项选择 1．2015年，中国科学家屠呦呦因发现治疗疟疾的药物青蒿素获得了诺贝尔奖。青蒿素的结构如图所示，下列有关青蒿素的说法中正确的是 A．分子式为C15H22O4B．具有较强的还原性 C．可用蒸馏水提取植物中的青蒿素D．碱性条件下能发生水解反应 2．85岁中国女药学家屠呦呦因创制新型抗疟药青蒿素和双氢青蒿素而获得2015年诺贝尔生理学医学奖。颁奖理由是“因为发现青蒿素——一种用于治疗疟疾的药物，挽救了全球特别是发展中国家数百万人的生命。”下列关于青蒿素和双氢青蒿素(结构如图)说法错误 ．．的是 A．青蒿素和双氢青蒿素互为同分异构体 B．青蒿素和双氢青蒿素均能发生取代反应 C．青蒿素的分子式为C15H22O5 D．青蒿素在一定条件下能与NaOH溶液反应
3．青蒿琥酯是治疗疟疾的首选药，可由青蒿素两步合成得到。下列有关说法正确的是 A．青蒿素分子式为C15H22O5 B．青蒿素不能与NaOH溶液反应 C．反应②原子利用率为100％ D．青蒿琥酯能与氢氧化钠溶液反应可生成青蒿琥酯钠 4．中国女药学家屠呦呦因发现青蒿素对疟疾的治疗作用而成为2015年诺贝尔生理医学奖获得者之一。下列说法不正确 ．．．的是 A．从青蒿中提取青蒿素的方法是以萃取原理为基础，萃取是一种化学变化 B．青蒿素的分子式为C15H22O5，它属于有机物 C．人工合成青蒿素经过了长期的实验研究，实验是化学研究的重要手段 D．现代化学分析测试中，可用元素分析仪确定青蒿素中的C、H、O元素 5．某种药物青蒿素结构如右图所示，则下列说法正确的是 A．青蒿素易溶于水 B．青蒿素的晶体为原子晶体 C．青蒿素能与NaOH溶液反应 D．青蒿素不能与NaOH溶液反应 6．2011年我国女科学家屠呦呦因“发现青蒿素——一种用于治疗疟疾的药物，挽救了全球特别是发展中国家的数百万人的生命”而获得有诺贝尔奖“风向标”之誉的拉斯克临床医学奖。青蒿素结构式如图所示。已知一个碳原子上连有4个不同的原子或基团，该碳原子称“手性碳原子”。下列有关青蒿素的说法不正确的是
基因工程药物的研究及进展 摘要：20世纪70年代，随着DNA重组技术的成熟，诞生了基因工程药物，高产值、高效率的基因药物给医药产业带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展，医药产业进入了新的历史时期。本文以基因工程药物的发展为导向，简要的介绍了国内外基因工程药物的发展概况、研究现状、研究方向、发展方向。 关键词：基因工程，药物，现状，发展 1 基因工程药物的发展概况 20世纪70年代，随着DNA重组技术的成熟，诞生了基因工程药物，高产值、高效率的基因药物给医药产业带来了一场革命，推动了整个医药产业的发展，医药产业进入了新的历史时期。 基因药物经历了三个阶段：第一阶段是把药用蛋白基因导入到大肠杆菌等细菌中，通过大肠杆菌等表达药用蛋白，但这类药物往往有缺陷，人类的基因在低等生物的细菌中往往不表达或表达的蛋白没有生物活性。第二阶段是人们用哺乳动物的细胞代替细菌，生产第二代基因工程药物。但由于哺乳动物细胞培养条件相对苛刻，生产的药物成本居高不下。第一、二代基因药物的研制和生产已经成熟。从第一个反义核酸药物Vitrovene于1998年和1999相继在美国和欧洲上市以来，发展迅速。第三阶段是到了80年代中期，随着基因重组和基因转移技术的不断发展和完善，科学家可以将人们所需要的药用蛋白基因导入NN-~L动物体内，使目的基因在哺乳动物身上表达，从而获得药用蛋白。携带外源基因并能稳定遗传的这种动物，我们称之为转基因动物。由于从哺乳动物乳汁中获取的基因药物产量高、易提纯，因此利用乳腺分泌出的乳汁生产药物的转基因动物称为“动物乳腺生物反应器”。90年代中后期，国际上用转基因牛、羊和猪等家畜生产贵重药用蛋白的成功实例已有几十种，一些由转基因动物乳汁中分离的药物正用于临床试验，但还没有一例药品成功上市。 2 基因工程药物的研究现状 2.1国外基因工程药物研究现状 随着1971年第一家生物制药公司Cetus公司在美国的成立，1973年重组DNA技术的出现，生物医药即已显示出巨大的应用价值和商业前景。1976年，世界第一家应用重组DNA 技术开发新药的公司Genentech建立，l982年第一个基因重组药物——基因重组人胰岛素在美国投放市场以来，生物医药产业以一种前所未有的速度迅猛发展。如在基因重组制药产业中做出过卓越贡献的Genentech和Amgen公司，早期的几个“重型炸弹”的基因重组
屠呦呦获医学诺奖给中学化学教育的几点启示 启示1：学科方法胜于学科知识 青蒿素的成功发现可以说运用化学进行物质研究的成功范例。化学研究物质的一般思路为：哪些物质中含所要提取的物质；如何获得纯净的该物质；该物质的结构如何；该物质可能有哪些性质；能否在关键的点位植入需要的基团；工业上如何大规模生产该物质，等等。青蒿素的发现遵循了这个思路。评审委员会称屠呦呦的获奖是为了奖励她对药物的一种孜孜不倦地寻找过程。 启示2：观念的渗透是学科方法的核心 传统提取青蒿素的煎熬法致使有效成分在高温下被破坏了。屠呦呦一改传统的煎熬法，改用沸点较低的乙醚进行提取实验，她在60摄氏度下制取了青蒿提取物，取得了较好的效果。我们知道，条件的控制是化工生产的核心思想，屠呦呦改用乙醚的成功，说明化学的一些观念在她的心里深深地扎下了根。正是这一观念的运用是她获得诺奖的关键。评审委员会认为，屠呦呦提出用乙醚来提取，对于发现青蒿素的抗疟疾作用和进一步研究青蒿素起了很关键的作用。 启示3：失败是学生最大的权利，但失败能否成功在于坚持和反思 “也是1971年10月4日，那是第191号样品。”在190次失败之后,1971年屠呦呦课题组在第191次低沸点实验中发现了抗疟效果为100%的青蒿提取物。190次失败的痛楚才换来成功的喜悦。所以，在学科教学中要允许学生犯错，给学生机会犯错，但也要让学生悟错、知错、改错。 启示4：任务驱动不可或缺 1967年，一个由全国60多家科研单位、500多名科研人员组成的科研集体，悄悄开始了一项特殊的使命，代号“523”，志在帮助北越政府“打击美帝”，研究的指向正是——防治疟疾新药，因为1960年代的东南亚战场上，疟原虫已经对奎宁类药物产生了抗性。如果没有这场“政治任务”，也许青蒿素的发现与使用要延后许多年。现在，对于抗癌药物的研制是否也来一场“任务驱动”呢？是否也可以集中几十个有实力的研究机构进行集中研究呢？青蒿素的研究是针对病毒，抗癌药的研制也是针对“癌细胞”这种病毒。这些研究机构是否从青蒿素的研究发现史得到一些启示呢？
基因工程药物研发的差不多过程 基因工程药物的研发分为上游和下游两个时期： 上游时期：要紧是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最要紧的确实是目的基因的表达。选择基因表达系统要紧考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。现在期的工作要紧在实验室内完成。 下游时期：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量操纵。现在期是将实验室的成果产业化、商品化，要紧包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化操纵，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化操纵等。 血管抑制素(angiostatin ,简称AGN) 是纤溶酶原 的一个酶解片段,相当于其1～4 Kringle 区,具有抑 制内皮细胞增殖、抑制血管生成及抑制多种类型肿 瘤生长和转移的生物功能,是一种新型血管生成抑 制因子[1 , 2 ] ,关于操纵肿瘤、糖尿病视网膜病变、消
化道溃疡、关节炎等病理性血管生成具有重要的研 究价值和应用前景. PCR产物的T载体克隆 （一）重组T质粒的构建 一．原理 外源DNA与载体分子的连接确实是DNA重组，如此重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分不经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步：首先，T4 DNA 连接酶与辅因子ATP
基因工程药物 蛋白质是生命活动最重要的物质之一，很多蛋白质与人类的疾病密切相关。大家所熟悉的侏儒症与病人缺少生长激素有关；一些糖尿病人则是由胰岛素合成不足引起的。在DNA重组技术出现之前，大多数的人用蛋白质药物主要是从人(如血液、尿液)或动物的组织或器官中提取的，成本特别高、产率和产量都很低，供应十分有限。并且由人体来源的材料进行提取，很难保证这种蛋白质药物不被某些病原体，如肝炎病毒、艾滋病病毒的污染，所以存在不安全因素。 1972年DNA重组技术诞生，直到 1982年出现世界第一个基因工程药物。基因工程药物开始进入人们的视线并逐渐得到重视。 基因工程药物是先确定对某种疾病有预防和治疗作用的蛋白质，然后将控制该蛋白质合成过程的基因取出来，即目的基因。将目的基因用DNA重组技术的方法连接在载体DNA上，然后将载体导入可以大量生产的靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂，从而成为蛋白类药物或疫苗。 目前基因工程药物主要分为四类：激素类及神经递质类药物；细胞因子类药物；酶类药物与凝血因子；基因工程活疫苗。这里就只做简单介绍，有兴趣的同学可以去详细了解。 我们来看一下基因工程药物合成的步骤：首先是目的基因DNA的取得——构建DNA重组体——构建工程菌——目的基因的表达——外源基因表达产物的分离纯化——最后是进行产品的检验。经临床试验才可投入市场。 我们来了解一下基因工程药物的发展历程 自1972年DNA重组技术诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展。1982年美国Lilly公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着世界第一个基因工程药物的诞生。到1996年美国已拥有1300多家专门从事生物公司，70%从事生物医药开发。 我国基因工程药物的研究和开发起步较晚，1989年我国批准了第一个在我国生产的基因工程药物——重组人干扰素α1b，标志着我国生产的基因工程药物实现了零的突破。重组人干扰素α1b是世界上第一个采用中国人基因克隆和表达的基因工程药物，也是到目前为止唯一的一个我国自主研制成功的拥有自主知
青蒿素类抗疟药研究进展 谭佳佳2009072114 药剂一班 摘要：本文叙述了疟疾的危害性，详细介绍了青蒿素的抗疟疾机制，青蒿素的联合用药，以及青蒿素的复方制剂及其出现的抗药性。 关键词：青蒿素抗疟疾抗药性 疟疾在夏秋季流行。在热带亚热带地区，一年四季都可发病。经疟蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染。疾病的病原体是疟原虫(plasmodium，spp)。疟原虫有130余种，主要寄生于人和哺乳动物，少数寄生在鸟类和爬行类动物。疟原虫有严格的宿主选择性。侵袭人类的疟原虫有4种：间日疟原虫(plasmodi—um vivax)、三日疟原虫(plasmodium malariae)、恶性疟原虫(plas—modium falciparnm)和卵圆疟原虫(plasmodium ovale)。恶性疟原虫是东南亚和非洲流行疟疾的主要病原体，是造成患者死亡的主要杀手。疟原虫生活史可分为有性生殖和无性生殖两个阶段，前者在雌性按蚊体内进行，后者在人体内完成。人体内无性生殖又分原发性红细胞外期、继发性红细胞外期和红细胞内期(红内期)等阶段[1]。疟疾主要流行地区是在非洲中部、南亚、东南亚和南美NJk部地区，其中非洲的疫情最为严重[2]。在我国疟疾主要流行在华南华中的丛林多山地区，但疫情远较非洲为轻。儿童、孕妇、旅游者和新移民是易患疟疾的高危人群。恶性疟疾患者如果没有得到及时有效的治疗，病死率非常高。在热带亚热带地区，恶性疟疾是一种十分可怕的疾病。 全世界有40％左右的人口受到疟疾的威胁，目前治疗疟疾的一线药物首选青蒿素(世界卫生组织推荐)。黄花蒿(Artemisia annua L．)属菊科草本植物，俗名青蒿，在我国已经有2000余年的药用历史，是提取青蒿素的唯一原料药材。我国黄花蒿种质资源丰富，种植面积和青蒿素产量占全世界的90％以上。其中，重庆市是全国黄花蒿的优质产区，种植面积和青蒿素产量分别占全国的70%和80%，是当地的主要经济作物。据重庆市海关统计，2009年1至9月我国青蒿素成药出口634t，70%出口非洲，30%出口美洲、亚洲和欧洲，为人类防治疟疾做出了巨大贡献。[3]青蒿素是我国药学工作者在1971年从菊科植物黄花蒿叶中提取分离得到的一种具有过氧桥结构的倍半萜内酯类化合物，它是我国在世界上首次研制成功的一种抗疟新药。在青蒿素的基础上，经过结构改造，又得到蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯等衍生物。青蒿素类药物以其能快速有效地杀灭各种红细胞内期疟原虫和低毒性而成为抗疟首选药。国内外有大量论文报导该类化合物的化学、药学、药理和临床研究结果。本文对青蒿素类药物抗疟机制、联合用药予以综述。 1 青蒿素抗疟机制 青蒿素及其衍生物被全世界公认为是一种很有效的抗疟新药，但其抗疟作用机制至今仍然不十分明确。青蒿素的作用机制在早期认为是对红细胞阶段的恶性疟原虫有直接杀死作用。但后来发现青蒿素及其衍生物的浓度比产生抗疟活性浓度高很多才显示细胞毒作用[4]。随着对青蒿素抗疟机制进一步研究，发现青蒿素类化合物抗疟作用属于氧化性机制，与疟原虫体内的铁有重要关系。当青蒿素被疟原虫体内的铁催化，其结构中的过氧基团环分裂产生有破坏生理作用的氧化性自由基[5]。氧化性自由基与疟原虫蛋白络合形成共价键，使疟原虫蛋白失去功能，从而导致虫体死亡。近年来，又有很多学者在基因水平上研究，认为青蒿素可能通过阻断疟原虫的PfA TP6酶活性而产生抗疟作用。PfA TP6酶原本通过将钙离子排出细胞，来调节人体钙平衡。当它停止工作时，细胞内钙水平升高，细胞随之凋亡，继而达到抗疟效果。Eckstein—Ludwig等[6]通过荧光实验证明青蒿素通过阻断疟原虫所在细胞PfA TP6
基因工程药物研究与应用新进展 郭小周 生物技术药物(biotech drugs) 或称生物药物(biopharmaceutics) 是集生物学、医学、 药学的先进技术为一体，以组合化学、药学基因(功能抗原学、生物信息学等高技术为依托，以分子遗传学、分子生物、生物物理等基础学科的突破为后盾形成的产业。现在，世界生物制药技术的产业化已进入投资收获期，生物技术药品已应用和渗透到医药、保健食品和日化产品等各个领域，尤其在新药研究、开发、生产和改造传统制药工业中得到日益广泛的应用，生物制药产业已成为最活跃、进展最快的产业之一。 摘要：自20世纪70年代基因工程诞生以来，以DNA重组技术为核心的现代生物技术一直是人们研究的热点，本文主要介绍了基因药物的定义、获得途径、一些前沿技术以及基因药物的应用与发展前景。 关键词：生物技术药物基因工程药物基因发展前景 1.引言 近年来1953年Waston和Crick发现遗传物质DNA的双螺旋结构，给整个生物学乃至整个人类社会带来了一场革命。此后，一系列有关遗传信息即基因研究的成果很快的向应用和开发拓展。1972年，美国斯坦福大学P.Berg博士研究小组使用EcorR I , 第一次在体外获得了包括SV40 DNA和入噬菌体DNA的重组DNA分子。1973年，S.Cohen等将两中分别编码卡那霉素和四环素的抗性基因相连，构建出重组的DNA分子，然后转化大肠杆菌，获得了既抗卡那霉素又抗四环素的转化子菌落，这是第一次成功的基因克隆实验，标志着基因工程的诞生。1977年Boyer首次获得生长激素抑制因子的克
隆，1982年第一个基因工程重组产品一一人胰岛素被批准应用，进入市场。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态。基因工程药物已经形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益，由于基因药物的出现，可以大大改善人类的生命质量，对于一些重大疾病的治疗将会有新的突破。 2基因工程 2.1基因 基因是脱氧核糖核酸（DNA ）分子上的一个特定片段。不同基因的遗传信息，存在于各自片段上的碱基排列顺序之中。基因通过转录出的信使使核糖核酸（mRNA），知道合成特定的蛋白质，使基因得以表达。 2.2基因工程 基因工程是利用重组DNA技术，在体外对生物的基因进行改造和重新组合，然后 导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出需要的基因产物。 3基因药物 基因工程药物又称生物技术药物，是根据人们的愿望设计的基因，在体外剪切组合, 并和载体DNA连接，然后将载体导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞）, 使目的基因在靶细胞中得到表达，最后将表达的目的蛋白质纯化及做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。 基因工程药物的本质是蛋白质，生产基因工程药物的方法是：将目的基因连接在载 体上，然后将导入靶细胞（微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞），使目的基因在靶细胞中的到表达，最后将表达的目的蛋白质提纯做成制剂，从而成为蛋白类药或疫苗。若目的基因直接在人体组织靶细胞表达，就称为基因治疗。
第25卷 增刊大学化学2010年4月 青蒿素 中药奇葩疟疾克星 吴毓林 (中国科学院上海有机化学研究所生命有机化学国家重点实验室 上海200032) 1 疟疾和抗疟药 疟疾是一种很古老的疾病,我国远在公元前的黄帝内经!素问?中即有记载,而疟(瘧)字则在更早的甲骨文中就已存在。疟疾也是全球流行最广泛的传染病之一,迄今虽已主要局限于东南亚、非洲等一些热带地区,但每年仍有2~3亿人感染,约100万人死亡。19世纪末才搞清楚疟疾是一种由蚊子传播疟原虫而引起的寄生虫病,但是在病因清楚之前人类社会一直在和疟疾进行抗争,在我国的很多中医医籍中都可以看到多种多样的截疟、治疟的处方,而在南美洲的印第安原住民则用当地特有的金鸡纳树(c i n chona)的树皮来治疗疟疾,这一树皮在17世纪传入了欧洲,解救了当时欧洲众多的疟疾患者。处于现代化学萌芽期的欧洲在利用树皮作药的同时,开展了对其有效成分的分离,1820年分离得到了其中主要的抗疟成分奎宁(quinine),1922年最终确定了它的结构,之后基于应对奎宁的来源问题和探索更有效的抗疟药物,第二次世界大战后基本上是模仿奎宁的结构而设计发展了一批新的药物如氯喹(ch l o r o quine)、伯喹(pri m aquine)等,从而形成了现在可称之为第一代的一线抗疟药物(图1)。 图1 奎宁和奎宁类抗疟药 2 中药青蒿和青蒿素的发现 奎宁和氯喹这类药物对疟疾治疗的成功没有延续太久,20世纪60年代开始出现了抗药性的疟原虫,尤其是在东南亚和非洲地区,甚至已到了无有效药物可用的地步。而当时的越南战争则更凸显这一问题的严重性,热带丛林地区疟疾肆虐,成为部队大量减员的主要原因。越南方面向中国提出了协助解决疟疾困扰的要求,中国领导人接受了这一要求,确立了由全国多部门参加,以疟疾防治药物研究为主要任务,代号为#523?的紧急军工项目。为解决抗药性问题,该项目除注意合成新化合物外,更期望从中药中发现新的抗疟有效成分。在#523?项目的
基因工程药物研发的基本过程 基因工程药物的研发分为上游和下游两个阶段： 上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室完成。 下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 血管抑制素(angiostatin ,简称AGN) 是纤溶酶原 的一个酶解片段,相当于其1～4 Kringle 区,具有抑 制皮细胞增殖、抑制血管生成及抑制多种类型肿 瘤生长和转移的生物功能,是一种新型血管生成抑 制因子[1 , 2 ] ,对于控制肿瘤、糖尿病视网膜病变、消 化道溃疡、关节炎等病理性血管生成具有重要的研 究价值和应用前景. PCR产物的T载体克隆 （一）重组T质粒的构建 一．原理 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双