In-Fusion ?
HD Cloning Kit
操作手册
PT5162-1 (072012) Cat. Nos. Many
United States/Canada
800.662.2566
Asia Pacific
+1.650.919.7300
Europe
+33.(0)1.3904.6880
Japan
+81.(0)77.543.6116
Clontech Laboratories, Inc. A Takara Bio Company 1290 Terra Bella Ave. Mountain View, CA 94043 Technical Support (US) E-mail: tech@https://www.doczj.com/doc/ae18514368.html, https://www.doczj.com/doc/ae18514368.html,
In-Fusion? HD Cloning Kit User Manual
目录
I.简介 (3)
II.组分列表 (5)
III.需要的其他材料 (5)
IV.PCR和实验准备 (6)
V.您应该遵循哪一个操作流程? (9)
VI.操作流程I：In-Fusion克隆流程w/离心柱化 (9)
VII.操作流程II：In-Fusion克隆流程w/Cloning Enhancer处理 (10)
VIII.转化流程 (11)
IX.预期结果 (11)
X.疑惑解答指南 (12)
XI.附录A：In-Fusion克隆快速操作流程 (14)
XII.附录B：pUC19 Linearized Vector Information (15)
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In-Fusion? HD Cloning Kit User Manual I.简介
In-Fusion HD Cloning Kits是一款简便高效的克隆试剂盒，能够将单个或者多个DNA片段快速定向克隆到任意载体中。In-Fusion克隆技术的基础是Clontech的In-Fusion专利酶，此酶通过识别DNA片段和线性化载体末端15 bp同源序列将DNA片段和线性化载体高效精确地融合在一起。15 bp同源序列是通过扩增目的片段所设计的引物来获得的。升级后的In-Fusion HD Kits的克隆效率高于之前的In-Fusion Kits，尤其表现在长片段、短核苷酸片段和多重片段克隆上。
?克隆任意片段到您选择的任意载体中的任意位臵
?可有效克隆的片段大小范围非常宽泛
?通过单次反应将多重DNA片段克隆到任意载体中
?无需进行限制性酶切处理、磷酸化处理或者连接反应
?最终的重组载体不附加任何冗余或者不需要的碱基序列
以下列表是In-Fusion HD Cloning Kits操作流程总体概述。操作流程会在Figure 1做进一步的说明。每一步操作细节请参考详细说明页面。
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In-Fusion? HD Cloning Kit User Manual
I.简介，续
*如果获得的PCR产物具有非特异性背景，首先通过凝胶抽提分离靶基因片段，然后利用spin-column进行纯化。
Figure 1. In-Fusion HD 操作流程概要
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In-Fusion? HD Cloning Kit User Manual II.组分列表
In-Fusion HD Cloning Kits有10次，50次和100次规格可供使用。也可以购买附有Stellar? Competent Cells、NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up、和/或者Cloning Enhancer的试剂盒。
所有组分储存于–20°C。
III.需要的其他材料
本试剂盒不提供克隆实验所需要的以下材料：
?Ampicillin (100 mg/ml储存液)或者In-Fusion反应液铺板所需要的其它抗生素
?LB (Luria-Bertani)培养基(pH 7.0)
?LB/antibiotic平板
?SOC培养基
?感受态细胞
我们建议采用Stellar感受态细胞。如果您决定采用其他的商品化感受态细胞(比如DH10B、DH5α)，请确保其转化效率≥ 1.0 x 108cfu/μg。很多In-Fusion HD Cloning Kits附有Stellar感受态细胞，您也可以单独购买不同规格的感受态细胞。
?Cloning Enhancer (Cat. Nos. 639613, 639614 & 639615) [可选]
Cloning Enhancer在部分In-Fusion HD Cloning Kits中附带，也可以单独购买。Cloning Enhancer用于移除模板DNA背景和PCR残留物，当PCR产物单一时（比如没有背景）无需在克隆前进行插入片段纯化操作。
?离心柱——NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up (Cat. Nos. 740609.10, 740609.50 & 740609.250) [可选]
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up在部分In-Fusion HD Cloning Kits中附带。如果琼脂糖凝胶电泳结果显示非特异性背景或者多重条带，可以采用离心柱纯化PCR产物。我们推荐NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up 离心柱。
?CloneAmp HiFi PCR Premix (Cat. No. 639298)
CloneAmp HiFi PCR Premix是便捷的2X预混合酶试剂，由于CloneAmp HiFi Polymerase的高敏感度、高特异性、高引发效率和高延伸效率，CloneAmp HiFi PCR Premix具备极其精确和高效的DNA扩增性能。另外，此酶含有热启动抗体，能够抑制非特异性扩增。CloneAmp HiFi PCR Premix包含高保真PCR所需要的全部试剂，包括CloneAmp HiFi Polymerase、dNTPs和优化后的缓冲液。这便于快速建立PCR反应并且适用于高通量应用。
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In-Fusion? HD Cloning Kit User Manual
IV.PCR和实验准备
A.通过限制性酶切制备线性化载体
想要成功实现In-Fusion反应，您必须首先获得线性化载体。线性化载体可以通过限制性内切酶酶切处理（单酶切或者双酶切）或者PCR扩增获得。
由于酶切效率不同，不同的限制性内切酶会引起不同程度的背景。一般来讲，双酶切比单酶切更有利。
酶切位点之间离得越远酶切效率就越好。另外，延长酶切时间和扩大酶切反应体系可以降低背景。
建议采用限制性内切酶酶切处理来获得线性化载体：
1.按照限制性内切酶供应商的指导来孵育限制性酶切反应。对于大多数酶，孵育3小时至过夜会提高线性
化效率并降低背景。
2.酶切之后，采用任意可用的PCR纯化试剂盒纯化线性化载体。我们推荐采用NucleoSpin Gel and PCR
Clean-Up Kit 进行胶纯化。
3.[对照] 取5–10 ng纯化后的线性化载体转化感受态细胞确定载体背景。
如果背景较高，添加适量限制性内切酶后继续进行更长时间的酶切反应。孵育2小时至过夜。胶纯化酶切产物并再一次进行转化。
B.PCR扩增目的片段
对于大多数DNA扩增酶，100 pg–1 ng质粒DNA通常足够作为PCR模板的用量。然而，如果您以cDNA库作为扩增模板，所需要的模板DNA的数量取决于mRNA群中靶片段的相对丰度。
In-Fusion方法不会受A-悬挂的有无所影响，因此您可以采用任意热稳定DNA聚合酶进行扩增，包括校正读码酶。想要获得最好的实验结果，我们推荐采用我们的CloneAmp? HiFi PCR Premix (Cat. No. 639298)。
由于CloneAmp HiFi Polymerase的高敏感度、高特异性、高引发效率和高延伸效率，CloneAmp HiFi PCR Premix 可以提供极其精确和高效的DNA扩增。另外，此酶含有热启动抗体以抑制非特异性扩增。CloneAmp HiFi PCR Premix也包含dNTPs和优化后的缓冲液，便于快速建立PCR反应。延伸步骤需要的时间已经标准化，可以实现对难扩增的模板DNA进行大量扩增。
1.CloneAmp HiFi PCR Premix所需要的模板量(以25 μl 反应体系为例, 基因组DNA、λ DNA、质粒DNA模
板的延伸时间为5 sec/kb，cDNA模板的延伸时间为5–10 sec/kb)。
?Human genomic DNA 5 ng–100 ng
? E.coli genomic DNA 100 pg–100 ng
?λDNA 10 pg–100 ng
?Plasmid DNA 10 pg–1 ng
?cDNA ≤相当于25–125 ng total RNA
2.CloneAmp HiFi PCR Premix可获得的产物大小(基因组DNA、λ DNA模板的延伸时间为5 sec/kb，cDNA模
板的延伸时间为5–10 sec/kb)
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3.PCR产物分析：当PCR循环结束时，采用琼脂糖凝胶电泳确认是否获得了单一的DNA片段并评估PCR
产物浓度。将已知浓度的或者梯度浓度的DNA与PCR产物同时进行凝胶电泳，通过比较对PCR产物进行定量。
VI.PCR和实验准备, 续
C.PCR引物设计
引物设计和引物质量对于In-Fusion反应的成功是至关重要的。In-Fusion可以同时连接2个或者多个片段，例如载体和插入片段（或者多重片段），只要其末端具备15个同源碱基就可实现。因此，In-Fusion PCR引物必须以获得的PCR产物包含与载体同源的末端的原则进行设计。Figure 2是引物设计概要，Figure 3是In-Fusion PCR引物设计实例演示。
设计In-Fusion PCR引物时，遵循以下原则：
1.每个In-Fusion引物必须包含两个部分：引物5’端必须包含与将要连接的DNA片段（比如载体或者另外一
个片段）末端完全同源的15个碱基。引物3’端必须包含靶基因特异引物序列。
2.每个引物3’端应该：
?具有基因特异性
?长度为18–25之间，GC含量为40–60%
?退火温度(T m)为58–65°C。正向和反向引物的T m值差别应≤ 4°C，否则扩增效果不理想。注意：评估T m值应该基于引物3’（基因特异性）端，而不是基于整个引物。如果T m过低，可以适当延长引物基
因特异性部分直到T m达到58–65°C。
?不包含连续相同核苷酸。每条引物3’端最后5个核苷酸不应该包含多于2个鸟嘌呤(G)或者胞嘧啶(C)。
3.避免引物内部及引物间互补序列，以防止引物自身产生发夹结构或者引物与引物之间产生引物二聚体。
4.您可以进行BLAST搜索以确定每一条引物的3’端是高度特异的(https://www.doczj.com/doc/ae18514368.html,/BLAST/).
5.Clontech提供在线支持工具(https://www.doczj.com/doc/ae18514368.html,/infusion/)简化了In-Fusion PCR引物设计操作。您
只需要提供您的载体序列，线性化载体所采用的限制性酶切位点（如果线性化载体方式为酶切处理），及扩增目的基因区域所需要的引物序列，就可以利用In-Fusion在线支持工具轻松设计引物了。
6.我们通常采用脱盐处理的寡核苷酸引物进行PCR反应。然而，不同供应商和不同批次间的引物质量是不
尽相同的。如果您的引物质量特别差（例如，引物纯度较低），或者您的引物长度超过45个核苷酸，那么引物需要采用PAGE纯化；通常情况下这是不必要的。
D.对照反应
当首次使用In-Fusion试剂盒时，我们强烈建议进行In-Fusion克隆反应的同时平行进行阳性和阴性对照反应。阳性对照反应应该为已知浓度的环状质粒（感受态细胞效率应>2 x 108 cfu/μg），阴性对照应为已知量的线性化载体(预期结果见Section IX)。对照反应是为了验证体系是可正常运行的。In-Fusion HD Cloning Kits 中的2 kb对照插入片段已经经过纯化，因此在进行克隆反应之前无需做进一步处理。
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VI.PCR和实验准备, 续
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In-Fusion? HD Cloning Kit User Manual V.您应该遵循哪一个操作流程?
PCR反应之后，采用琼脂糖凝胶电泳对扩增获得的目的片段进行确认。如果在预期位臵获得了单一条带，您可以进行离心柱纯化（遵循Protocol I），或者采用Cloning Enhancer处理PCR产物(遵循Protocol II)。然而，如果琼脂糖胶电泳结果显示具有非特异性背景或者多重条带，您需要通过凝胶提取分离目的片段然后进行离心柱纯化(遵循Protocol I)。如果您采用PCR扩增载体和插入片段，并且PCR扩增获得的载体和片段均没有非特异性背景，您可以采用Appendix A提供的快速In-Fusion克隆操作流程。
VI.操作流程I：In-Fusion克隆流程w/离心柱纯化
A.PCR片段离心柱纯化流程
1.如果琼脂糖胶电泳可见非特异性背景，通过凝胶提取分离目的片段然后进行离心柱纯化；如果在相应大
小位臵获得单一条带，直接进行离心柱纯化。
2.采用基于硅胶基质的纯化系统进行PCR产物离心柱纯化，例如NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit。在纯
化过程中应避免核酸污染并且避免DNA在UV灯下长时间暴露。
3.纯化后，继续进行PCR片段离心柱纯化In-Fusion克隆流程(Section VI.B)。
B.PCR片段离心柱纯化In-Fusion克隆流程
通常情况下，无论片段大小，载体和插入片段分别添加50-200 ng就可达到较高的克隆效率。如果PCR 片段小于0.5 kb，片段添加量少于50 ng有助于达到最高的克隆效率。建议插入片段和载体的摩尔比例为2，也可采用In-Fusion在线支持工具(https://www.doczj.com/doc/ae18514368.html,/infusion/)进行计算。
1.建立In-Fusion克隆反应体系：
*对于载体和PCR插入片段反应体系较大时(载体+插入片段> 7 μl)，预混合酶用量加倍，并补加dH20至总体积为20 μl。
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2. 补加去离子水至总体积10 μl 并混合均匀。
3. 将反应体系臵于50°C 孵育15 min ，然后臵于冰上。
4.
接下来进行转化流程(Section VIII)。您也可以将克隆反应液储存于–20°C 直至完成准备工作。
VII. 操作流程II ：In-Fusion 克隆流程w/Cloning Enhancer 处理
欢迎登陆宝日医生物技术（北京）有限公司网站https://www.doczj.com/doc/ae18514368.html, 观看实验操作视频。
A.
Cloning Enhancer 处理未被纯化的PCR 片段操作流程
建立In-Fusion 克隆反应体系前按照如下操作处理未被纯化的PCR 产物（例如片段）:
1. 添加2 μl Cloning Enhancer 至5 μl PCR 反应液中。
2.
臵于37°C 孵育15 min ，然后将其臵于PCR 仪中80°C 孵育15 min 。如果您以100 ng DNA 作为PCR 反应模板，将37°C 孵育时间延长至20 min 。如果采用水浴或者加热块而不是PCR 仪，将每一步的孵育时间延长至20–25 min 。
3. 继续进行Cloning Enhancer 处理PCR 片段In-Fusion 克隆流程(Section VII.B)。如果您不能立即进行下一步实验，将PCR 反应液储存于–20°C 直至完成准备工作。
B.
Cloning Enhancer 处理PCR 片段In-Fusion 克隆流程
1.
建立In-Fusion 克隆反应：
* 50–200 ng 线性化载体
** 1–2 μl Cloning Enhancer 处理过的PCR 片段。每10 μl
反应液中最多只能包含4 μl Cloning Enhancer 处理过的PCR 片段。如果您PCR 反应获得产物量较低，我们建议进行PCR 片段纯化而不采用Cloning Enhancer 处理。
2. 补加去离子水至总体积10 μl 并混合均匀。
3. 将反应体系臵于50°C 孵育15 min ，然后臵于冰上。
4. 接下来进行转化流程(Section VIII)。您也可以将克隆反应液储存于–20°C 直至完成准备工作。
In-Fusion? HD Cloning Kit User Manual VIII.转化流程
A.采用Stellar?感受态细胞转化操作流程
以下转化操作流程已经采用Stellar感受态细胞进行过优化。如果您使用的In-Fusion试剂盒不包含Stellar感受态细胞，Clontech可单独销售不同规格的Stellar感受态细胞。如果您使用的感受态细胞不是Stellar感受态细胞，您可能需要在转化前稀释In-Fusion反应液以提高克隆效率(详见Table III，疑惑解答指南)。我们强烈建议采用转化效率>1 x 108 cfu/μg的Stellar感受态细胞。
1.遵循此操作流程转化
2.5 μl In-Fusion反应液至Stellar感受态细胞。如果您使用的是其他感受态细胞，请
遵循所使用细胞的转化操作流程。
2.将1/100th–1/5th转化液添加到一管感受态细胞中并添加SOC培养基补齐至100 μl。将稀释后的转化液涂布
在一个包含与克隆载体相对应的抗生素的LB平板上（例如，试剂盒中包含的对照载体所需氨苄抗生素浓度为100 μg/ml）。
3.剩余转化液以6000 rpm离心5 min。弃去上清，以100 μl新鲜的SOC培养基重悬。将每一个样品涂布在单
独的含有相应抗生素的LB平板上。37°C过夜孵育。
4.次日，从每个实验平板上挑取单克隆。采用您选择的方法分离质粒DNA（例如小量提取）。通过酶切处
理或者PCR筛选确定插入片段成功与否。
IX.预期结果
感受态细胞最小转化效率为1 x 108 cfu/μg时，阳性对照平板通常生长几百个白斑。阴性对照平板应该只有很少的几个克隆。
实验平板克隆数取决于应用In-Fusion克隆反应的PCR产物和线性化载体的数量和纯度。
?两个平板上数量的克隆都很少时——尤其是只有几十个时——表明转化液使用量过多或者DNA/引物质量较差。
?阴性对照平板上出现很多（上百个）克隆说明载体线性化不充分。
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X.疑惑解答指南
如果您没有获得预期的实验结果，请根据以下指南修订实验。为了验证本试剂盒体系可正常运行，请平行进行对照反应。
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XI.Appendix A：In-Fusion克隆快速操作流程
A.PCR扩增获得的载体&片段In-Fusion克隆流程
1.建立In-Fusion克隆反应:
* 10 μl反应体系中PCR载体&片段总体积应不超过4 μl。
2.补加去离子水至总体积10 μl并混合均匀。
3.将反应体系臵于37°C孵育15 min，然后50°C孵育15 min，然后臵于冰上。
4.接下来进行转化流程(详见Section VIII)。如果您不能马上进行转化实验，您也可以将克隆反应液储存于
–20°C 直至完成准备工作。
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