*基金项目：江苏省“333”工程人才培养基金资助。许金俊：男，1972生，博士研究生。
**通讯作者。Author for correspondence.E-mail ：
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12(3):273~277
·研究论文
·奶牛γ-干扰素基因的克隆及其在COS-1细胞中的表达*
许金俊秦爱建**金文杰刘岳龙
（扬州大学畜牧兽医学院，
扬州225009）摘要：应用RT-PCR 技术从经体外植物血凝素（PHA ）刺激诱导的奶牛外周血淋巴细胞的总RNA 中扩增出牛γ-干扰素（bovine interferon-γ，）基因。将扩增出的
克隆到PMD18-T 载体中，经过限制性酶切分析筛选正向插入
的克隆。测序结果表明，所克隆到的基因编码区序列与已报道基因存在3个核苷酸的差异。将该基因片段从PMD18-T 载体中
用
d Ⅲ和
H Ⅰ双酶切后克隆到真核表达载体pcDNA3.1/zeo c （+）中，构建真核表达载体pcDNA-，通过脂
质体转染COS-1细胞，用鼠抗BovIFN-γ高免血清和FITC 标记的羊抗鼠IgG 进行间接免疫荧光实验（IFA ）检测，结果表明，在COS-1细胞的细胞膜和胞浆内均有rBovIFN-γ表达，细胞病变抑制实验证实，转染后细胞培养上清液具有一定的干扰素活性，转染后72h 细胞培养上清液在MDBK 细胞上抑制VSV 病毒的效价可达到128IU/mL 。研究结果为进一步筛选稳定表达
基因细胞系、开发奶牛疾病预防控制的新产品以及开展奶牛疾病的基因治疗奠定了基础。关键词：奶牛；γ-干扰素基因；真核表达
Cloning of Bovine Interferon-gamma Gene and
Its Expression in COS-1Cells*
XU Jin-Jun
QIN Ai-Jian**JIN Wen-Jie LIU Yue-Long
(College of Animal Science and Veterinary Medicine,Yangzhou University,Yangzhou
225009,China)interferon-gamma(
)gene with signal peptide encoding region was amplified by reverse transcription
polymerase chain reaction (RT-PCR)from total RNA of bovine peripheral blood lymphocytes stimulated with phytohemagglutinin (PHA).The products of RT-PCR were cloned into PMD18-T vector.Postive recombinant clone named -T4was identified
by restriction enzyme digestion and sequencing.The fragment of γin the PMD18-T vector was subcloned into mammalian expression vector pcDNA3.1,which was named with pcDNA-.Eukaryotic expression plasmid pcDNA-
were
transfected into COS-1cells by lipofectin,rBovIFN-γexpression was identified in the cytoplasms and cytomembranes of COS-1cells in IFA at 72h posttransfection.The interferon titer in the supernatant of transfected COS-1cells was up to 128IU/mL.These results suggested that pcDNA-could be used to establish a cell line expressing rBovIFN-γstably,and rBovIFN-γcould be served
as a new product in the control of bovine
diseases.
bovine ；interferon-γ
gene ；eukaryotic expression
γ-干扰素（γ-interferon,IFN-γ）又称Ⅱ型干
扰素，是一种由CD4+Th1型、CD8+T 细胞以及NK 细
胞产生的细胞因子，它不仅具有Ⅰ型IFN （α-干扰素、
β-干扰素）
的抗病毒和抗肿瘤活性，更重要的是它还具有促进MHC Ⅱ类抗原表达、
增强APC 细胞与T 细胞的相互作用、增强T 细胞辅助抗体产生和细胞毒T
细胞产生的能力等诸多免疫调节活性，不仅能单独作
为生物制剂应用于一些疾病的防治，而且可作为免疫
佐剂，增强疫苗的免疫效果，
还能与一些病原微生物的保护性抗原基因共表达，从而加强和改善疫苗的免疫效果[1]。Cerretti 等[2]1986年首先克隆出
基因后，国外学者在利用基因工程技术生产重组牛
农业生物技术学报2004年
γ-IFN（rBovIFN-γ）的研究也开始兴起，先后在大肠杆菌[3]、酵母[4，5]、牛I型疱疹病毒载体[6]、昆虫细胞[7]中表达出了rBovIFN-γ,并对其免疫学和生物学活性进行了一些研究[8，9]。
本研究采用RT-PCR技术从奶牛外周血淋巴细胞中克隆出了基因编码区cDNA，并利用真核表达载体pcDNA3.1在COS-1细胞中表达出了有活性的BovIFN-γ，为进一步探讨其生物学活性、作用机理，筛选稳定表达rBovIFN-γ细胞系和开发奶牛疾病预防控制的新产品奠定了基础。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1实验动物健康初生犊牛，由扬州大学试验农牧场提供。
1.1.2质粒、宿主细菌、细胞及病毒大肠杆菌（）TG1由本室保存；克隆用Vector PMD18-T购自宝（大连）生物工程公司；表达用载体pcDNA3.1/zeo C（+）由本实验室保存；牛肾细胞MDBK（Mardin-Darby bovine kidney，MDBK）购自中国兽医监察所；SV40转化的非洲绿猴肾细胞COS-1由本实验室保存；水泡性口炎病毒VSV （Vesiculovirus，VSV）由南京农业大学陈溥言教授惠赠。
1.1.3主要试剂DMEM培养基、TRIZOL Reagent、Lipofectin脂质体转染试剂为Gibco/BRL 公司产品；植物血凝素PHA（phytohemagglutinin，PHA）为上海医学检验中心产品；淋巴细胞分层液为上海华精生物科技公司产品；AMV反转录酶、T4DNA连接酶为Promega公司产品；RNA酶抑制剂RNAsin为华美生物工程公司产品；dNTP、DNA聚合酶、各种限制性内切酶为上海生物工程公司产品；QIAquick琼脂糖回收试剂盒和QIAquick 质粒纯化试剂盒为QIAGEN公司产品；用于间接免疫荧光实验的FITC标记的羊抗鼠IgG为Sigma公司产品，鼠抗rBovIFN-γ高免血清由本实验室自制[10]，系用大肠杆菌表达的GST-BovIFN-γ融合蛋白经常规SDS-PAGE电泳后切取目的条带，冻干后碾碎，PBS稀释后腹腔注射Balb/c小鼠，10d免疫1次，5次后采血分离血清所得，其ELISA效价为1∶5000，其具体制备和测定过程见参考文献[10]；用于RT-PCR的试剂用DEPC处理超纯水配制，玻璃器皿经180℃干烤8h以上。
1.2方法1.
2.1引物设计及合成参照Cerretti等[2]（GenBank编号M29867）发表的全长cDNA序列设计1对引物：
上游引物P1：5'-ACTACTCCGGCCTAACTCTCTCC-3'；
下游引物P2：5'-GCAGGCAGGAGGACCATTACGTTGA-3'。
预计扩增片段长度为540bp左右，包括BovIFN-γ信号肽的整个ORF，引物由宝（大连）生物工程公司合成。
1.2.2淋巴细胞的分离培养、诱导及总RNA的提取无菌采集初生犊牛外周抗凝血，缓慢滴加在等量淋巴细胞分层液上，1000r/min离心20min后，小心吸取血清与分层液之间的黄白色细胞层，PBS 洗涤2次后，用含10%小牛血清的DMEM液37℃5%CO2培养。培养1h后，弃去贴壁的单核细胞，调整细胞浓度为2.5×106/mL，加入500μg/mL PHA，于37℃5%CO
2培养10h后收集细胞，按Gibco公司TRIZOL试剂提供的程序提取总RNA，取2μL 用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，取5μL用于甲醛变性凝胶电泳观察其完整性，其余置于－70℃保存备用。
1.2.3RT-PCR扩增cDNA合成：在PCR管加入总RNA5μL和1μL P2引物（50pmol），70℃作用5min后冷却到0℃，依次加入9.5μL超纯水、5μL5×AMV缓冲液、10mmol/L2.5μL dNTP、1μL RNAsin和1μL AMV反转录酶，于42℃反转录60 min，95℃5min灭活反转录酶。PCR扩增：在PCR 管中依次加入超纯水34μL、10×PCR缓冲液5μL、反转录产物2μL、10mmol/L dNTP1μL、引物P1和P2各1μL（50pmol）、25mmol/L MgCl25μL、DNA聚合酶1μL，PCR循环条件为95℃5 min，然后94℃1min→55℃1min→72℃1.5min30个循环，72℃7min，4℃10min，反应结束后取5μL 产物1%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.4基因的克隆和测序RT-PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用QIAquick琼脂糖回收试剂盒进行回收，按常规与PMD18-T Vector进行连接，常规转化大肠杆菌TG1感受态细胞，进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落转接种含Amp的LB培养液中37℃摇荡过夜，采用碱裂解法提取质粒，经dⅢ和HⅠ进行双酶切鉴定。由于基因在与PMD18-T Vecto连接过程中存在正反两个方向插入外源片段的可能，为方便下一步将基因通过dⅢ和HⅠ双酶切插入真核表达质粒pcDNA3.1，必须筛选正向插
274
第3期许金俊等:奶牛γ-干扰素基因的克隆及其在COS-1
细胞中的表达
入的克隆，利用cDNA 编码区第375bp 处和PMD18-T Vector 多克隆位点中TA 插入位点上游均具有一个Ⅰ酶切位点的特点，用Ⅰ单酶切鉴定插入片段的方向，若为正向插入则切下420bp 的片段，若为反向插入则切下140bp 的片
段，挑取正向插入
基因的阳性重组质粒送宝（大连）生物工程公司进行测序。1.2.5真核表达质粒pcDNA-的构建及COS-1细胞的转染将含正向插入片段的阳性质粒和真核表达质粒pcDNA3.1分别用d Ⅲ和H Ⅰ双酶切，回收后按常规连接，转化宿主菌TG1，通过氨苄青抗性和d Ⅲ和H Ⅰ双酶切筛选阳性质
粒pcDNA-。挑取经鉴定为阳性的克隆接种含Amp 的LB 培养液中37℃摇荡过夜，按QIA-GEN 公司质粒纯化试剂盒的步骤进行质粒的提取和纯化，并电泳定量，按Gibco/BRL 公司脂质体转染程序对COS-1细胞进行转染，转染72h 后进行
基因表达检测，
同时设立不含插入片段的空载体pcDNA3.1转染COS-1细胞的阴性对照。1.2.6间接免疫荧光实验检测COS-1细胞中
基因的表达取转染后72h 的COS-1
细胞，用冷丙酮：乙醇固定5min 后，PBS 洗涤2次，
风干后加入1∶50稀释的鼠抗rBovIFN-γ高免血清，37℃作用45min ，PBS 洗涤3次，加入1∶100稀释的FITC 标记的羊抗鼠IgG ，37℃作用45min ，PBS 洗涤3次后，于荧光显微镜下进行观察并拍照，同时设立空载体pcDNA3.1转染COS-1细胞和正常未转染COS 细胞、正常ICR 血清代替鼠抗rBovIFN-γ高免血清3个阴性对照。
1.2.7rBovIFN-γ抗病毒活性测定pcDNA-质粒转染24、48、72和96h 后的细胞培养上清液、空载体pcDNA3.1转染COS-1细胞培养上清液以及正常未转染COS-细胞上清液，在VSV-MDBK 细胞系统上通过细胞病变抑制实验按常规测定其干扰素抗病毒效价，步骤如下：向生长于96孔板上的MDBK 细胞单层加入倍比维持液稀释的细胞培养上清液，每个稀释度2孔，于37℃作用24h ，吸去上清液，每孔接种100TCID50的VSV ，37℃吸附2h ，弃去病毒液，加入1%维持液继续培养至病毒对照孔出现100%病变，观察各孔细胞病变，以能抑制50%细胞病变的样品的最高稀释度定义为1单位干扰素。
2结果
2.1RT -PCR 扩增结果
利用TRIZOL Reagent 提取的外周血淋巴细胞总RNA ，经测定，260/280均在1.7～2.0之间，260/
230均在2.0以上，
说明所提取的总RNA 纯度高，无蛋白质和异硫酸氰胍的污染。甲醛变性凝胶电泳结果显示总RNA 无降解。采用上述条件从PHA 刺激10h 的奶牛外周血淋巴细胞总RNA 中扩增出了540bp
特异性片段，片段大小与预期结果相符（图1）。
图1.
RT-PCR
扩增产物电泳分析Fig.1.Electrophoresis analysis of
fragment amplified by RT-PCR
M ，1kb DNA maker ；1、2，
基因
RT-PCR 产物(540bp 的特异性片段)。M ，
1kb DNA ladder ；1and 2，RT-PCR
products of
gene （a 540bp specific fragment ）。
2.2
基因的克隆、酶切鉴定和测序结果
从挑取的4个白色菌落中通过Ⅰ单酶切筛选到1个正向插入的阳性克隆，命名为
γ-T4。图2为阳性克隆-γ-T4酶切鉴定结果，
经Ⅰ单酶切后出现1条约2.7kb 的载体片段和1条420bp 左右的目的片段，大小与预计相符；经d Ⅲ和H Ⅰ双酶切后出现1条约2.7kb 的载体片段和1条560bp 左右的目的片段，大小与预计相符。通过正反两个方向的测序证实，所
克隆到的
编码区基因与Cerretti 等[2]报道的存在3个位点的核苷酸差异，分别是35位T →C ，214和432位A →G ，其推导的氨基酸序列与
Cerretti 相比具98.2%的同源性，克隆到的核甘酸
-γ编码区核苷酸序列序列如图3所示。
图2.重组质粒
-T4酶切鉴
定结果
Fig.2.Electrophoresis results of recombinant plasmid
-T4
digested with restriction enzymes
M ，1kb DNA maker ；1，Ⅰ单酶切；2，d Ⅲ和
H 玉双酶切。M ，1kb DNA
ladder ；1，plasmid -T4digested
by
Ⅰ；2，plasmid
-T4digested by
d Ⅲ和
H Ⅰ
.
275
农业生物技术学报2004年
2.3pcDNA真核表达质粒的构建
将含正向插入片段的阳性质粒-T4和真核表达质粒pcDNA3.1分别用dⅢ和H Ⅰ双酶切，回收后按常规连接，转化宿主菌TG1，通过氨苄青抗性dⅢ和HⅠ双酶切筛选阳性质粒，共挑取4个克隆，经酶切鉴定有4个克隆均为阳性，将其中1个阳性质粒命名为pcDNA-。图4为pcDNA-的dⅢ和HⅠ双酶切鉴定结果，出现1条约5.0kb的载体片段和1条580bp的目的片段，大小与预计相符。
图4.重组表达质粒的酶切鉴定结果
Fig.4.Electrophoresis results of recom-
binant plasmid pcDNA-digested
with restriction enzymes
M，1kb DNA maker；1,dⅢ和HⅠ双酶
切。M，1kb DNA ladder；1，plasmid
pcDNA-digested by
dⅢand HⅠ.
2.4间接免疫荧光实验证明在COS-1细胞中表达
为了证实基因能否体外在真核动物细胞得以表达，初步探索基因治疗的可行性，我们将构建好的真核表达质粒转染了COS-1细胞，用IFA技术对基因的表达情况进行了鉴定。实验结果表明，转染后72h，在部分COS-1细胞胞浆内和细胞膜上均有基因的表达，有时可见阳性细胞分裂后形成的细胞集落中细胞均为阳性（图5），而空载体pcDNA3.1转染COS-1细胞（图6）、正常未转染COS-1细胞、正常ICR血清代替鼠抗rBovIFN-γ高免血清3个对照均为阴性。
图5.pcDNA3.1-
转染COS-1后72h的间接
荧光检测结果
(×400）
Fig.5.COS-1cells tansfected
with plasmid pcDNA-
at72h posttransfection in
IFA(×400）
图6.pcDNA3.1转染COS-1
后72h的间接免疫荧光检
测结果(×400）
Fig.6.COS-1cells tansfected
with plasmid pcDNA3.1at72
h posttransfection in IFA(×
400）
No fluorescence was observed.
2.5rBovIFN-γ具有抗病毒活性
由于所克隆的基因含信号肽，为了验证所表达的rBovIFN-γ能否分泌到细胞外，我们通过细胞病变抑制实验对转染上清液中的rBovIFN-γ的生物学活性进行了检测。结果表明，转染后24、48、72和96h的COS-1细胞培养上清液中均可检测到干扰素活性，72h时的干扰素效价最高，为128IU/mL，而空载体pcDNA3.1转染COS-1细胞培养上清液以及正常未转染COS-细胞上清液中检测不到干扰素效价。这一结果证实，rBovIFN-γ可以分泌到细胞外，并具有一定的抗病毒生物学活性。
3讨论
3.1本研究通过两步法RT-PCR技术从奶牛外周血淋巴细胞总RNA中克隆出含信号肽的全编码区基因，测序和体外表达结果进一步证实了该基因正确
。
ATGAAATATACAAGCTATTTCTTAGCTTTACTGCCCTGTGGGCTTTTGGGTTTTTCTGGTTCTTATGGCCAGGGCCAATTTTTTA GAGAAATAGAAAACTTAAAGGAGTATTTTAATGCATGTAGCCCAGATGTAGCTAAGGGTGGGCCTCTCTTCTCAGAAATTTT GAAGAATTGGAAAGATGAAAGTGACAAAAAAATTATTCAGAGCCAAGTTGTCTCCTTCTACTTCAAACTCTTTGAAAACCTC AAAGATAACCAGGTCATTCAAAGGAGCATGGATATCATCAAGCAAGACATGTTTCAGAAGTTCTTGAATGGCAGCTCTGAGA AACTGGAGGACTTCAAAAAGCTGATTCAAATTCCGGTGGATGATCTGCAGATCCAGCGCAAAGCCATAAATGAACTCATCAA AGTGATGAATGACCTGTCGCCAAAATCTAACCTCAGAAAGCGGAAGAGAAGTCAGAATCTCTTTCGAGGCCGGAGAGCATC AACGTAA
图3.编码区cDNA的核甘酸序列
Fig.3.cDNA nucleotide sequence of translated region
Underlined regions indicate different nucleotides compared with published
sequence. 276
第3期许金俊等:奶牛γ-干扰素基因的克隆及其在COS-1细胞中的表达3.2BovIFN-γ是一种由活化的T细胞或NK细
胞分泌的一种多功能调节因子，能有效激活巨噬细
胞和NK细胞，维持CTL和B细胞的增殖分化，增强MHCⅡ类分子的表达，促进APC细胞向Th细胞递呈抗原，激活嗜中性白细胞，对于免疫系统有着重要的调节功能[1]。由于BovIFN-γ既可以单独作为生物制剂用于奶牛疾病如乳房炎的预防控制[8]，也可以作为免疫佐剂增强疫苗如乳房炎疫苗的免疫效果[9]，利用基因工程技术体外生产高效、价廉的rBovIFN-γ已成为一大热点，本实验室已经利用PGEX载体在大肠杆菌中成功地表达出了具有生物学活性的BovIFN-γ与谷光甘肽的融合蛋白[10]，并进行了一些临床应用实验。与天然干扰素和真核表达产物相比，原核表达产物由于不能正确进行装配、磷酸化和糖基化，其生物学活性不可避免的将受到不同程度的影响,而且大肠杆菌的表达产物易形成包涵体，纯化复杂，步骤烦琐，内毒素难以去除，其临床应用往往受到一定的限制，而真核表达系统由于其表达产物的天然性、无毒性和易于纯化而越来越得到重视，国外学者也已经对酵母系统、疱疹病毒载体和杆状病毒载体进行了尝试并获得了成功[4~7]。鉴于人cDNA的pcDNA真核表达载体的构建成功及在肝癌细胞中的成功表达[11]，我们利用RT-PCR技术将含信号肽的基因从奶牛外周血淋巴细胞中克隆出来，并构建了pcDNA真核表达载体，转染COS-1细胞后成功地表达出了有生物学活性的rBovIFN-γ，并能分泌到细胞外，为进一步筛选表达rBovIFN-γ的细胞系，获得大量有较高活性的rBovIFN-γ奠定了坚实的基础，目前，稳定表达细胞系的筛选鉴定工作正在进行之中。3.3近年来随着现代免疫学和分子生物学技术的快速发展，基因免疫和基因治疗成为疾病防治研究中的热点之一，由于IFN-γ对于免疫系统具有极其重要的免疫调节功能以及对肿瘤细胞的杀伤和抑制效应，因此，IFN-γ成为最受关注的目的基因之一，医学上已经对通过IFN-γ基因治疗肿瘤性疾病进行了初步探索。IFN-γ能够激活局部免疫细胞的活性，在局部分泌表达量的多少能够直接影响疫苗的免疫效果，本研究所获得的真核表达质粒，既可以和多种DNA疫苗配合使用，增强和改善DNA疫苗的免疫效果，也可试用于奶牛疾病特别是肿瘤性疾病和耐药性结核病的基因治疗，具有很好的应用前景。
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Expression of exogenous interferon-gamma gene in human hepatocellular carcinoma cells mediated by liposome.
Chinese J General Surgery(中国普通外科杂志)，2002，11: 26~28（in Chinese with English abstract）
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2017届人教版基因的表达单元测试题 (40分钟100分) 一、选择题(共10小题，每小题5分，共50分) 1.(2016·模拟)同一物种的两类细胞各产生一种分泌蛋白，组成这两种蛋白质的各种氨基酸含量相同，但排列顺序不同，其原因是参与这两种蛋白质合成的( ) A.tRNA种类不同 B.mRNA碱基序列不同 C.核糖体成分不同 D.同一密码子所决定的氨基酸不同 【解析】选B。同一物种的两类细胞遗传物质相同。各产生一种分泌蛋白，是基因选择性表达的结果，产生的mRNA不同。在两种蛋白质合成过程中，tRNA种类、核糖体成分、同一密码子所决定的氨基酸均相同。 2.美国科学家安德鲁·菲尔和克雷格·梅洛发现了RNA干扰现象，这是一个有关控制基因信息流程的关键机制。下列有关RNA的叙述中错误的是( ) A.有的RNA具有生物催化作用 B.tRNA、rRNA和mRNA都是基因转录的产物 C.mRNA上有多少个密码子就有多少个tRNA与之对应 D.分化后的不同形态的细胞中mRNA的种类和数量有所不同 【解析】选C。有的RNA是酶，具有生物催化作用；RNA(包括tRNA、rRNA和mRNA)是基因转录的产物；mRNA上的终止密码子没有与之对应的tRNA；细胞分化形成不同形态的细胞是基因选择性表达的结果，其中mRNA种类和数量有所不同。
3.(2014·高考)研究发现，人类免疫缺陷病毒(HIV)携带的RNA在宿主细胞不能直接作为合成蛋白质的模板。依据中心法则(下图)，下列相关叙述错误的是( ) A.合成子代病毒蛋白质外壳的完整过程至少要经过④②③环节 B.侵染细胞时，病毒中的蛋白质不会进入宿主细胞 C.通过④形成的DNA可以整合到宿主细胞的染色体DNA上 D.科学家可以研发特异性抑制逆转录酶的药物来治疗艾滋病 【解题指南】(1)题干关键信息：人类免疫缺陷病毒(HIV)携带的RNA在宿主细胞不能直接作为合成蛋白质的模板。 (2)图示信息：②是转录，③是翻译，④是逆转录。 (3)关键知识：人类免疫缺陷病毒(HIV)寄生在人的T淋巴细胞中。 【解析】选B。本题考查中心法则的信息传递。人类免疫缺陷病毒(HIV)主要攻击人体的T淋巴细胞，在侵染过程中HIV整体进入T淋巴细胞，然后释放出RNA，故B选项是错误的。HIV属于逆转录病毒的一种，它的遗传物质RNA先经逆转录形成DNA，然后形成的DNA整合到患者细胞的基因组中，再通过病毒DNA的转录形成HIV的RNA，最后通过翻译，形成HIV的蛋白质，并组装成大量的子代HIV，由被感染的细胞裂解释放出来；根据题图中的中心法则可知病毒DNA是通过逆转录过程合成的，故可以研发抑制逆转录酶的药物来治疗艾滋病。故A、C、D 选项均正确。 4.(2016·模拟)一个转运RNA的一端三个碱基的排列顺序是GCU，那与之相配对
第四章基因的表达单元练习题 学校：班级：姓名：总分： 4.1 习题巩固： 1 在下列的转录简式中有核苷酸（） DNA: --A--T--G--C-- ， RNA：—U--A--C--G-- A. 4 种 B . 5 种C．6 种 D ．8种 2. DNA转录形成的mRNA从细胞核中出来进入细胞质中，穿过（）磷脂双分子层。 A. 6 层 B . 0 层C．2 层 D ．4 层 3.已知一段mRNA含有30个碱基，其中A和G有12个, 转录该段mRNA勺DNA分 子 中应有C和T的个数是（ A. 12 . 24 . 18 30 4. DNA解旋发生在 A. 复制与转录中.转录中 C .翻译中.复制中 5. 转移RNA的功能是（ A. 决定mRNA勺排列顺序.完全取代DNA C. 合成特定勺氨基酸.运输氨基酸，识别mRNAt的遗传密码 6. 有一核酸分子，其碱基比是A＋G/T＋C=1. 5，试推断该核酸是（ A. 信使RNA B .转运RNA C .单链DNA D .双链DNA 7. 信使RNA中核苷酸的顺序是由下列哪项决定的（） A. 转运RNA中的核苷酸的排列序列B .蛋白质分子中的氨基酸的排列序列 C.核糖体RNA中核苷酸的排列序列 D . DNA分子中的脱氧核苷酸的排列序列 8 mRNA勺核苷酸序列与（） A. DNA分子的两条链的核苷酸序列互补B . DNA分子的一条链的核苷酸序列互补
C.某一一tRNA分子的核苷酸序列互补 D .所有的tRNA分子的核苷酸序列互补
9. （多选题）下列关于转录的叙述不正确的是（ C. DNA勺两条链都可做模版 D .边解旋边转录 10. 如果DNA分子一条链的碱基排列顺序是…… ACGGATCTT-,那么，与它互补的 另一条DNA链的碱基排列顺序是___________________________ ;如果以已知的DNAS为 模板，转录出的信使RN/碱基顺序应该是_____________________________ o 11. 已知多数生物的DNA是双链的，但也有个别生物的DNA是单链的，有人从三种生物中 生物A G U T C 甲2524——2319 乙232427——25 丙3119——3119 （1）这表明：_________ 的核酸是RNA ________________ 的核酸是双链DNA （2）从碱基比例看，双链DNA的特点是________________________ o 12. 下图为某真核生物细胞内DNA专录示意图，请据图回答： （1）在图中方框内用“T”或“T”标出转录的方向 （2）b与c在结构组成上相同的化学基团 为__________________________________________ o ⑶在马蛔虫体细胞中，上述过程发生在____________________ 中，若在人的胃黏膜上 皮细胞中，还可出现______________________ 中。 4.2习题巩固： 1、组成mRNA^子的4种核苷酸能组成多少种密码子（） A . 20 B . 59 C . 61 D . 64 2、某DNA分子片段中碱基为2400对，则由此片段所控制合成的多肽链中，最多有氨 基酸多少种（） A. 800 B . 400 C. 200 D . 20 3、不是由DNA分子中的遗传信息直接控制合成的物质是（） A.酶 B. 多肽 C. 胰岛素 D.性激素 4、在人体中，由A T、C三种碱基参与构成的核苷酸共（） A. 2种B . 4种C . 5种D . 6种 5、人的胰岛素基因的存在部位和表达部位分别是（） A.体细胞、胰岛细胞中 B .胰岛细胞、体细胞 C.均位于胰岛细胞中 D .体细胞、核糖体 6、某信使RNA中有碱基40个，其中C+U为15个，那么转录此RNA的DNA中G+A为 （） A. 15 B . 25 C . 30 D . 40 A.在细胞核中发生.以脱氧核糖核苷酸为原料
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，
移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
基因的表达单元测试 学校:___________姓名：___________班级：___________考号：___________ 注意事项： 1．答题前填写好自己的姓名、班级、考号等信息 2．请将答案正确填写在答题卡上 一、单选题 1．下列有关遗传信息的翻译的叙述，不正确的是 A. 翻译过程是在细胞质中进行的，其场所在核糖体 B. 翻译过程以mRNA为模板，以各种氨基酸为原料 C. 一种氨基酸可能有多个密码子，体现了遗传密码的简并性 D. 翻译过程需要tRNA的转运，一种tRNA可转运一种或几种氨基酸 【答案】D 【解析】试题分析：翻译过程是以mRNA为模板合成蛋白质的过程，场所是核糖体，故A正确；氨基酸为蛋白质的基本组成单位，故B正确；一种氨基酸对应一种或多种密码子，这属于密码子的简并性，故C正确；翻译过程的运输工具为tRNA，一种tRNA只能转运一种氨基酸，故D错误。 考点：本题考查基因控制蛋白质的合成的有关知识，意在考查考生理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。 2．下图表示中心法则中部分遗传信息的流动方向示意图，有关说法正确的是 A. 图1过程①、③、⑤一般发生于烟草花叶病毒的体内 B. 图1过程①?⑤不可能同时发生于同一个细胞内 C. 图2过程需要DNA连接酶参与，复制起点A先于B复制 D. 图2、3过程均可能发生在真核细胞内，均具有双向复制的特点 【答案】D 【解析】试题分析：A．图1中①是逆转录、②⑤是转录、③是DNA复制、④是翻译。烟草花叶病毒的遗传物质是RNA，但是其RNA不能逆转录，只能进行RNA自我复制和翻译，A错误；B．图1可表示逆转录病毒在宿主细胞内发生的过程，B错误；C．图2表示DNA的复制是多起点进行，即A和B是不同的起点，经过A和B处复制后，形成的两段DNA需要DNA连接酶连接。由图可知，B所复制的DNA长度比A的长，故B 先于A复制，C错误；D．图2是线状DNA的复制，图3是环状DNA的复制，图2和图3过程可能发生在真核细胞中，如酵母菌。由图中箭头可知，图2和图3均具有双向复制的特点，D正确。 考点：本题考查中心法则和DNA复制的相关知识，意在考查考生分析图片信息解决问题的能力。 3．下列关于tRNA的叙述，正确的是（） A．在转录和翻译过程中发挥作用 B．能识别mRNA上的密码子 C．每种tRNA能识别并转运多种氨基酸
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
2019届人教版基因的表达单元测试 一、选择题 1．下列有关DNA和RNA的叙述，正确的是( ) A．生物的遗传信息只存在于DNA分子中 B．真核生物的遗传物质是DNA，而原核生物的遗传物质是DNA或RNA C．原核生物的DNA上不存在密码子，密码子只存在于mRNA上 D．在进行正常生命活动的真核生物细胞内，既能以DNA为模板转录形成RNA，也能以RNA为模板逆转录形成DNA 解析：选C 生物的遗传信息也可以存在于RNA分子中；真核生物和原核生物的遗传物质都是DNA；正常情况下真核生物细胞内的RNA不能发生逆转录。 2．下列关于RNA功能的叙述，错误的是( ) A．可以在细胞内运输物质 B．能在某些细胞内催化化学反应 C．能在细胞内传递遗传信息 D．可以是某些原核生物的遗传物质 解析：选D RNA的种类有三种，mRNA、tRNA、rRNA。mRNA在细胞核与细胞质之间传递遗传信息，tRNA将氨基酸运输到核糖体上，有利于蛋白质的合成，rRNA是组成核糖体的成分之一；少数酶的本质为RNA，具有催化功能；原核生物与真核生物的遗传物质均是DNA。 3．(2018·西安模拟)基因沉默是指生物体中特定基因由于种种原因不表达。某研究小组发现染色体上抑癌基因邻近的基因能指导合成反义RNA，反义RNA可以与抑癌基因转录形成的mRNA形成杂交分子，从而阻断抑癌基因的表达，使细胞易于癌变，据图分析，下列叙述正确的是( ) A．邻近基因指导合成的反义RNA是通过逆转录过程完成的 B．与完成过程Ⅱ直接有关的RNA有两种，即mRNA、rRNA
C．与邻近基因和抑癌基因相比，组成图中杂交分子的碱基有A、G、C、T、U五种 D．细胞中若出现了杂交分子，则抑癌基因沉默，此时过程Ⅱ被抑制 解析：选D 分析题图，由邻近基因指导合成反义RNA的过程是转录过程；图中过程Ⅱ为翻译过程，有关的RNA有mRNA(模板)、rRNA(核糖体的组成成分)、tRNA(搬运氨基酸的工具)，共三种；从图中可以看出反义RNA可以与mRNA杂交形成杂交分子，故碱基有A、G、C、U四种；细胞中若出现了杂交分子，mRNA不能翻译，即抑癌基因不能表达，过程Ⅱ被抑制。 4．(2018·北京东城区调研)如图为原核生物某基因控制蛋白质合成的示意图，下列叙述正确的是( ) A．①过程DNA分子的两条链可分别作模板以提高合成蛋白质的效率 B．①过程需要RNA聚合酶参与，此酶能识别RNA中特定的碱基序列 C．①②过程都发生碱基互补配对，配对方式均为A和U、G和C D．不同密码子编码同种氨基酸可减少由于基因中碱基的改变而造成的影响解析：选D ①过程为转录，转录以DNA分子的一条链的部分片段(基因的模板链)为模板转录合成mRNA；转录过程需要RNA聚合酶的参与，RNA聚合酶能识别DNA分子中特定的碱基序列(启动子)，并与之结合驱动转录过程；①过程碱基互补配对方式为A－U、T－A、G－C、C－G，②为翻译过程，碱基互补配对方式为A－U、U－A、G－C、C－G；不同种密码子编码同种氨基酸，增加了遗传密码的容错性，可减少因基因中碱基的改变而造成的影响。 5．(2018·洛阳一模)假设一段mRNA上有60个碱基，其中A有15个，G有25个，那么转录该mRNA的DNA分子区段中，“C＋T”的个数以及该mRNA翻译成的蛋白质所含氨基酸的个数分别是(不考虑终止密码子)( ) A．60、20 B．80、40 C．40、20 D．40、30 解析：选A 该mRNA上有60个碱基，则转录该mRNA的DNA分子区段中有120个碱基。根据碱基互补配对原则，在双链DNA中，A＝T、C＝G，所以C＋T
基因的表达单元练习题 It was last revised on January 2, 2021
第四章基因的表达单元练习题 学校：班级：姓名：总分： 习题巩固： 1在下列的转录简式中有核苷酸（） DNA: --A--T--G--C--， RNA：—U--A--C--G-- A．4种 B．5种 C．6种 D．8种 2．DNA转录形成的mRNA从细胞核中出来进入细胞质中，穿过( )磷脂双分子层。A．6层 B．0层 C．2层 D． 4层 3．已知一段mRNA含有30个碱基，其中A和G有12个，转录该段mRNA的DNA 分子中应有C和T的个数是（） A．12 B．24 C．18 D．30 4．DNA解旋发生在（） A．复制与转录中 B．转录中 C．翻译中 D．复制中 5．转移RNA的功能是（） A．决定mRNA的排列顺序 B．完全取代DNA C．合成特定的氨基酸 D．运输氨基酸，识别mRNA上的遗传密码 6．有一核酸分子，其碱基比是A＋G/T＋C=1．5，试推断该核酸是（） A．信使RNA B．转运RNA C．单链DNA D．双链DNA 7．信使RNA中核苷酸的顺序是由下列哪项决定的（） A．转运RNA中的核苷酸的排列序列 B．蛋白质分子中的氨基酸的排列序列 C．核糖体RNA中核苷酸的排列序列 D．DNA分子中的脱氧核苷酸的排列序列
8． mRNA的核苷酸序列与（） A．DNA分子的两条链的核苷酸序列互补 B．DNA分子的一条链的核苷酸序列互补C．某一tRNA分子的核苷酸序列互补 D．所有的tRNA分子的核苷酸序列互补9．（多选题）下列关于转录的叙述不正确的是（） A．在细胞核中发生 B．以脱氧核糖核苷酸为原料 C．DNA的两条链都可做模版 D．边解旋边转录 10．如果DNA分子一条链的碱基排列顺序是……ACGGATCTT-…，那么，与它互补的另一条DNA链的碱基排列顺序是；如果以已知的DNA链为模板，转录出的信使RNA碱基顺序应该是。 11. 已知多数生物的DNA是双链的，但也有个别生物的DNA是单链的，有人从三种生物中提取出核酸，经分析，他们的碱基比率如下： 生物 A G U T C 甲25 24 —23 19 乙23 24 27 —25 丙31 19 —31 19 （1）这表明：的核酸是RNA。的核酸是双链DNA。（2）从碱基比例看，双链DNA的特点是。 12．下图为某真核生物细胞内DNA转录示意图，请据图回答： (1)在图中方框内用“→”或“→”标出转录的方向 (2)b与c在结构组成上相同的化学基团 为。 (3)在马蛔虫体细胞中，上述过程发生在中，若在人的胃黏膜上皮细胞中，还可出现中。 习题巩固： 1、组成mRNA分子的4种核苷酸能组成多少种密码子（） A．20 B．59 C．61 D．64 2、某DNA分子片段中碱基为2400对，则由此片段所控制合成的多肽链中，最多有氨基酸多少种（） A．800 B．400 C．200 D．20
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
第4章基因的表达单元测试 一、选择题(每小题2分,共50分) 1.关于基因控制蛋白质合成的过程,下列叙述正确的是( ) A.以一个含n个碱基的DNA分子为模板,转录的mRNA分子的碱基数最多是n/2个 B.细菌的一个基因转录时两条DNA链可同时作为模板,提高转录效率 C.DNA聚合酶和RNA聚合酶的结合位点分别在DNA和RNA上 D.在细胞周期中,mRNA的种类和含量均不断发生变化 解析:不具遗传效应的DNA片段不转录,不会形成mRNA,所以mRNA分子的碱基数小于n/2个。转录是指以DNA的一条链为模板,按照碱基互补配对原则,合成RNA的过程。RNA聚合酶的结合位点也在DNA上。在细胞周期中,基因选择性表达,mRNA的种类和含量均不断发生变化。答案:D 2.对于一个动物个体来说,几乎所有的体细胞都含有相同的基因,但细胞与细胞之间存在结构和功能上的差异,这是因为它们合成不同的( ) A.tRNA B.mRNA C.组蛋白 D.核糖体 答案:B 3.下列说法正确的是( ) A.原核生物的遗传物质由裸露的DNA组成,不与蛋白质结合成染色质 B.真核生物在转录时以基因中的任意一条链为模板链 C.DNA分子一条链上相邻的碱基A与T通过两个氢键相连 D.起始密码子决定转录的起点 解析:真核生物的遗传物质在进行转录时,是以基因中的某一条单链为模板,但不是任意一条;在DNA分子的一条链上,相邻的碱基A与T通过磷酸二酯键相连;起始密码子位于mRNA上,不可能决定转录的起点,决定的是翻译的起点。 答案:A 4.在遗传信息的传递过程中,不可能发生的是( ) A.DNA转录和翻译都进行碱基互补配对 B.mRNA穿过核孔在细胞质中进行翻译 C.DNA复制和转录都以DNA的一条链为模板 D.核糖核苷酸和氨基酸依次参与转录和翻译 解析:转录是以DNA的某一条链为模板,但DNA的复制以两条链为模板。 答案:C 5.下列有关基因控制蛋白质合成的叙述,正确的是( ) A.转录和翻译都发生在细胞核内 B.转录和翻译的原料分别是脱氧核苷酸和氨基酸 C.转录和翻译的模板分别是DNA的一条链和mRNA D.一种tRNA只转运一种氨基酸,一种氨基酸只由一种tRNA转运 答案:C 6.密码子存在于( ) A.DNA B.mRNA C.tRNA D.核糖体 解析:遗传密码存在于mRNA上,mRNA上决定氨基酸的三个相邻碱基叫密码子;反密码子存在于tRNA上。 答案:B
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.doczj.com/doc/aa18064419.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.doczj.com/doc/aa18064419.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.doczj.com/doc/aa18064419.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.doczj.com/doc/aa18064419.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.doczj.com/doc/aa18064419.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.doczj.com/doc/aa18064419.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006